PROCESO DE SÍNTESIS- CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención está relacionada con la ingeniería de tejidos y más particularmente está relacionada con una estructura reticular para la regeneración e ingeniería de tejido y su proceso de síntesis.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION

La ingeniería de tejidos se refiere a la práctica de combinar andamios, células y moléculas biológicamente activas para crear tejidos funcionales y su objetivo es recopilar los conocimientos, técnicas y métodos de base biotecnologica que permitan diseñar, generar, restaurar, mantener o mejorar los tejidos dañados e incluso órganos completos. Actualmente, en la ingeniería de tejidos, existe la problemática de obtener un material que cuente con un alto grado de hinchamiento, hidratación, plasticidad, flexibilidad, rigidez y dureza, además de ser biocompatible, biodegradable; y permitir la adhesión, el crecimiento, la diferenciación y regeneración de células, tejidos y órganos que a su vez se puedan elaborar de diferentes formas y tamaños para uso médico. Otra limitante importante actualmente de los materiales existentes es la falta de control en la formación de una estructura reticular porosa que tenga una porosidad consistente con el tejido natural que se pretende imitar.

En general, los materiales utilizados en la ingeniería de tejidos son cerámicos, polímeros naturales o sintéticos y compuestos formados por varios materiales. Los más empleados son los polímeros por las características y versatilidad de los mismos. Dentro del grupo de los polímeros, los hidrogeles son materiales de enorme interés, pues son de base heteropolimérica con redes tridimensionales con una extraordinaria capacidad para absorber agua y diferentes fluidos. Los hidrogeles basados en polímeros naturales, tales como los hechos a partir de proteínas y polisacáridos, son ampliamente utilizados en ingeniería de tejidos de cartílago articular porque además de ser biocompatibles, son comúnmente degradables, capaces de promover la adhesión celular y la proliferación, y son inmunológicamente inertes.

En el estado de la técnica existen hidrogeles a base de polisacáridos. Por ejemplo, la solicitud de patente WO2014128354 se refiere a hidrogeles de nanofibras hechos de polisacáridos para uso en la prevención y el control de la cicatrización en relación con la curación de heridas o la reparación de tejidos.

Otro ejemplo se encuentra en la solicitud de patente WO2015101711, que describe una membrana modelada que comprende polisacáridos con nanofibras y composiciones para mejorar la curación de heridas, así como su fabricación y uso.

También en Tovar-Carrillo Karla L. et al (2013), Fibroblast Compatibility on Scaffold Hydrogels Prepared from Agave Tequilana Weber Bagasse for Tissue Regeneration, Ind. Eng. Chem. Res., 52 (33), pp 11607-11613; se describe un método para hacer hidrogeles a base de celulosa de Agave tequilana Weber azul con propiedades probadas de citocompatibilidad y biocompatibilidad, obtenidos por inversión de fases de la solución de DMAc con LiCI.

Por otro lado, hidrogeles basados en carboximetil-celulosa (CMC) e h id roxieti I -ce I u losa (HEC), han sido utilizados para obtener películas delgadas y transparentes para su uso en ingeniería de tejidos. La CMC es un derivado de la celulosa, la cual esta compuesto por grupos carboximetil enlazados a algunos grupos hidroxilo. La presencia de CMC de sodio en un hidrogel modula la capacidad de absorción de agua y proporciona al hidrogel un hinchamiento aumentado. Por otro lado, la HEC es un polímero derivado de la celulosa en la que sobre los grupos hidroxilo han sido adicionados grupos óxido de etileno. En términos generales, La HEC promueve la reticulación intermolecular en lugar de intramolecular, lo que contribuye a la estabilización de la red química. Sin embargo, los hidrogeles que contienen CMC, HEC o combinaciones de los mismos que se han desarrollado hasta la fecha no tienen totalmente las características adecuadas para la ingeniería de tejidos.

Un ejemplo de hidrogel que utiliza CMC se encuentra en la solicitud de patente US2008070997, que describe un método de preparación de un gel a partir de CMC de sal de metal alcalino, mediante el uso de un ácido o solución acida. Sin embargo, tiene la desventaja de que para aumentar la resistencia y la elasticidad del gel es necesario añadir un compuesto de metal insoluble en agua o refuerzo orgánico cuando se mezcla.

Otro ejemplo, se describe en el artículo de Demitri Christian et al (2008), Novel superabsorbent cellulose based hydrogels crosslinked with citric acid, Journal of Applied Polymer Science, 110(4), 2453 - 2460; en el cual se describe un método para elaborar hidrogeles de CMC y HEC reticu lados con ácido cítrico, pero que sin control alguno del tamaño de poro en su producto final.

Por otra parte, también existen en el estado de la técnica hidrogeles a base de hemicelulosa, la cual es un heteropolisacárido no celulósico, estando compuesto de hexosas, pentosas y en la mayoría de los casos, de ácidos uránicos. La hemicelulosa tiene numerosas ventajas inherentes, incluyendo la no toxicidad, la biocompatibilidad y la biodegradabilidad y sugeridos efectos contra el cáncer (Ying Guan et al, en 2014 (Nanoreinforced hemicellulose-based hydrogels prepared by freeze-thaw treatment).

Al respecto, la solicitud de patente WO2013112491 se refiere a una composición de hidrogel hecho a partir de un polisacárido que se selecciona a partir de celulosa, hemicelulosa, xilano, pectina, alginato, quitina, y ácido hialurónico, una proteína no desnaturalizada y un agente de reticulación que comprende iones metálicos y agua, para su uso en una variedad de aplicaciones, incluyendo el cultivo de células.

Por su parte, la solicitud de patente EP2688914 describe un método para hacer hidrogeles a partir de ésteres de celulosa con hemicelulosa de xilosas reticuladas entre sí a partir de desperdicios orgánicos, pero estos hidrogeles no tienen las características adecuadas para la adecuada ingeniería de tejidos.

En Ying Guan et al. (2014), Nanoreinforced hemicellulose-based hydrogels prepared by freeze- thaw treatment, Cellulose, 21(3), 1709-1721; se describe la formación de hidrogeles a base de hemicelulosas de bambú, polivinil alcohol (PVA) y nanotubos de quitina, por el método de congelación- descogelación sin reticulación química. Aunque la invención declara poseer redes tridimensionales y buenas propiedades mecánicas y térmicas, con posibles aplicaciones en la ingeniería de tejidos y campos médico-biológicos, la no reticulación de los polímeros hace que la posible red tridimensional que se forma sea poco estable y reversible al estado de hidrogel, por lo que no es adecuado como estructura reticular porosa que sea consistente con el tejido natural que se pretende imitar.

Finalmente, en la solicitud de patente WO2015069634 se describen micropartículas esencialmente esféricas de un gel reticulado de polisacárido que comprende uno o más polisacáridos lineales, que tienen al menos una dimensión de medición de aproximadamente 5 a aproximadamente 200 μιτι. Sin embargo, a pesar de que este documento describe el uso de polisacáridos lineales que forman redes, en este documento no se genera una estructura reticular porosa adecuada para la ingeniería de tejidos.

De acuerdo con lo previamente descrito, en el estado de la técnica actual en materia de ingeniería de tejidos no existe un material que prevea una estructura reticular porosa adecuada que sirva de prótesis y relleno de tejidos que por su comportamiento físico-químico, principalmente su capacidad de enlace y su comportamiento visco-elástico, tenga las características apropiadas de grado de hinchamiento, hidratación, plasticidad, flexibilidad, rigidez y dureza; además de ser biocompatible, biodegradable, y permitir la adhesión, el crecimiento, la diferenciación y regeneración de células, tejidos y órganos.

Por consecuencia de lo anterior, se ha buscado suprimir los inconvenientes que presentan los hidrogeles poliméricos fabricados a partir de celulosa para ingeniería de tejidos utilizados en la actualidad, desarrollando una estructura reticular para la regeneración e ingeniería de tejido que, además de resolver la falta de una estructura que estimule el crecimiento del tejido, es decir, una estructura reticular porosa que tenga una porosidad consistente con el tejido natural que se pretende imitar, permita controlar o dirigir la integración del tejido en dicha estructura, y tener la capacidad para mantener la vida de las células permitiendo el paso de fluidos vitales y nutrientes.

OBJETOS DE LA INVENCIÓN

Teniendo en cuenta los defectos de la técnica anterior, es un objeto de la presente invención proporcionar una estructura reticular para la regeneración e ingeniería de tejido formada por polímeros de origen natural con un tamaño de poro consistente con el tejido natural que se pretende imitar.

Asimismo, es un objeto de la presente invención proporcionar una estructura reticular para la regeneración e ingeniería de tejido formada por polímeros de origen natural y sustentable que estimule el crecimiento del tejido.

Otro objeto de la presente invención proporcionar una estructura reticular para la regeneración e ingeniería de tejido formada por polímeros de origen natural que permita controlar o dirigir la integración del tejido en dicha estructura.

Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un proceso de síntesis de una estructura reticular para la regeneración e ingeniería de tejido a partir de polímeros de origen natural.

Estos y otros objetos se logran mediante una estructura reticular para la regeneración e ingeniería de tejido y su proceso de síntesis de conformidad con la presente invención. BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a una estructura reticular para la regeneración e ingeniería de tejido que comprende hemicelulosa, carboximetil-celulosa (CMC) e h id roxieti l-celulosa (HEC). El uso de ésta permite que las células puedan entrar, migrar y crecer a lo largo y ancho de la estructura, por lo que el curso de regeneración de células, tejidos y órganos se acelera, la tasa de curación de estos se mejora, el tiempo de la neogénesis se acorta, y la resolución se incrementa aún más.

Otro aspecto de la presente invención se refiere a un proceso de síntesis de una estructura reticular para la regeneración e ingeniería de tejido que comprende: solubilizar en frío a los polímeros de hemicelulosa, carboximetil-celulosa (CMC) e h id roxieti l-celulosa (HEC); adicionar un agente reticulante; calentar a una temperatura entre 30°C y 120°C durante 1 a 8 horas para que se lleve a cabo la reacción de reticulación; enfriar para formar un hidrogel; congelar y descongelar repetidamente el hidrogel para la formación controlada de poros; y secar para obtener una estructura reticular para la regeneración e ingeniería de tejido. BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Los aspectos novedosos que se consideran característicos de la presente invención, se establecerán con particularidad en las reivindicaciones anexas. Sin embargo, algunas modalidades, características y algunos objetos y ventajas de la misma, se comprenderán mejor en la descripción detallada, cuando se lea en relación con los dibujos anexos, en los cuales:

La figura 1 es una fotografía de un ejemplo de la estructura reticular de conformidad con la presente invención en una forma circular de conformidad con una modalidad específica de la presente invención.

La figura 2 es una fotografía de un ejemplo de la estructura reticular de conformidad con la presente invención en una forma rectangular de conformidad con una modalidad específica de la presente invención.

La figura 3 es una fotografía de la ultraestructura de porosidad y tamaños de poros interconectados de la estructura reticular de conformidad con la presente invención.

La figura 4 es una gráfica comparativa de porcentaje de hinchamiento (%S) contra tiempo en minutos de la estructura reticular de conformidad con una modalidad específica de la presente invención. La figura 5 es una gráfica comparativa de resistencia de tracción (MPa) de la estructura reticular de conformidad con una modalidad específica de la presente invención .

La figura 6 es una gráfica comparativa de porcentaje de alargamiento a la rotura de la estructura reticular de conformidad con una modalidad específica de la presente invención.

La figura 7 es una gráfica comparativa de porcentaje de viabilidad celular que demuestra la citocompatibilidad de la estructura reticular de conformidad con una modalidad específica de la presente invención. La figura 8 es una fotografía microscópica de la estructura reticular de conformidad con una modalidad específica de la presente invención recubierta en su totalidad por células de mamífero que se adhirieron.

La figura 9 es una fotografía de la colocación de un implante comercial de colágeno en el lugar de piel removida de grosor completo de un cerdo.

La figura 10 es una fotografía de la colocación de la estructura reticular de conformidad con una modalidad específica de la presente invención, con una capa exterior de silicona en el lugar de piel removida de grosor completo de un cerdo.

La figura 11 es una fotografía de los resultados de cicatrización del estudio de biocompatibilidad y eficacia in vivo en un cerdo, utilizando un control en el que no se utilizó un implante.

La figura 12 es una fotografía de los resultados de cicatrización del estudio de biocompatibilidad y eficacia in vivo en un cerdo, utilizando un implante comercial de colágeno.

La figura 13 es una fotografía de los resultados de cicatrización del estudio de biocompatibilidad y eficacia in vivo en un cerdo usando la estructura reticular de conformidad con una modalidad específica de la presente invención.

La figura 14 es una fotografía de un riñon de una rata al que le fue removido un tercio del mismo. La figura 15 es una fotografía de los resultados del estudio de implantabilidad en órganos de mamífero in vivo a las 12 semanas de haber removido un tercio de riñon de rata mediante cirugía e implantado en su lugar la estructura reticular de conformidad con una modalidad específica de la presente invención.

La figura 16 es una ampliación de la zona señalada como (112) en la figura 15.

La figura 17 es una gráfica de concentración de urea en sangre (mg/dl) de los resultados del estudio de implantabilidad en órganos de mamífero in vivo en ratas sanas, es decir sin cirugía, y a las 12 semanas de haber removido un tercio de riñon de rata mediante cirugía (resectadas) e implantado en su lugar la estructura reticular (resectadas implantadas) de conformidad con una modalidad específica de la presente invención.

La figura 18 es una gráfica de concentración de creatinina en sangre (mg/dl) de los resultados del estudio de implantabilidad en órganos de mamífero in vivo en ratas sanas, es decir sin cirugía, y a las 12 semanas de haber removido un tercio de riñon de rata mediante cirugía (resectadas) e implantado en su lugar la estructura reticular (resectadas implantadas) de conformidad con una modalidad específica de la presente invención.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Se ha encontrado soprendentemente que una estructura reticular para la regeneración e ingeniería de tejido formada por al menos de hemicelulosa, carboximetil-celulosa (CMC) e h id roxieti l-celulosa (HEC) de la presente invención puede tener una porosidad adecuada para que las células de distintos tejidos puedan entrar, migrar y crecer a lo largo y ancho de la estructura, por lo que el curso de regeneración de células, tejidos y órganos se acelera, la tasa de curación de estos se mejora, el tiempo de la neogénesis se acorta.

La estructura reticular de la presente invención, puede ser utilizada para inducir el crecimiento y diferenciación celular in vitro e in vivo con aplicación en la medicina regenerativa y la ingeniería de tejidos, órganos y prótesis, ya que la estructura es biocompatible, biodegradable y con poros interconectados de tamaño adecuado, que permiten la adhesión, el crecimiento y la diferenciación de células de mamífero, el flujo de nutrientes y la aceptación sin rechazo de los individuos implantados o en bioreactores con células adherentes.

De acuerdo con lo anterior, un aspecto de la presente invención se refiere a una estructura reticular para la regeneración e ingeniería de tejido que comprende hemicelulosa, carboximetil-celulosa (CMC) e hidroxietil-celulosa (HEC).

La estructura reticular de conformidad con la presente invención es una estructura porosa con un tamaño de poro de entre 30 y 500 μιτι interconectados. Preferiblemente, el tamaño de poro de la estructura reticular para la regeneración e ingeniería de tejido es de entre 30 y 300 μιτι interconectados.

En una modalidad preferida de la presente invención, la estructura reticular para la regeneración e ingeniería de tejido comprende hemicelulosa, CMC y HEC en una proporción de 1:5:0.5 hasta 2:2: 1 respectivamente, con la condición de que la hemicelulosa no puede sobrepasar el 7% (p/p) respecto al peso total de la estructura y la CMC no puede sobrepasar el 20% (p/p) respecto al peso total de la estructura.

La hemicelulosa puede tener un origen diverso ya sea natural o sintético. De forma natural, la hemicelulosa usualmente se encuentra en las paredes de las células vegetales. En una modalidad preferida de la presente invención, la hemicelulosa se obtiene de fuentes naturales como plantas, madera, células madre vegetales y tallos de plantas. De manera más preferida, la hemicelulosa se obtiene de la planta de agave y de manera aún más preferida, la hemicelulosa se obtiene como un desecho del proceso de obtención de celulosa a partir de la planta de agave.

La hemicelulosa mejora las propiedades mecánicas de la estructura reticular permitiendo que la regeneración de tejido se acelere y además aporta una mayor estabilidad de la estructura a diferentes intervalos de temperatura. La hemicelulosa de agave es preferida ya que brinda estabilidad a temperaturas superiores a la de esterilización por calor (130°C).

La CMC y la HEC son derivados de la celulosa, las cuales se obtienen mediante un tratamiento químico. En una modalidad preferida de la presente invención, la CMC y HEC son obtenidas mediante tratamiento químico en medio alcalino de la celulosa, la cual se encuentra presente en las paredes celulares vegetales. De manera aún más preferida, la CMC y la HEC se obtienen a partir de celulosa de la planta de agave. La CMC y la HEC obtenidas a partir de celulosa de Agave son preferidas para la formación de la estructura reticular por sus características adecuadas para la regeneración e ingeniería de tejido y para aprovechar el desperdicio de bagazo de agave en la industria tequilera y del mezcal.

Es importante mencionar que la CMC modula la capacidad de absorción de agua y proporciona a la estructura reticular cargas electrostáticas ancladas a la red, que tienen un doble efecto sobre la capacidad de hinchamiento. Por un lado, la repulsión electrostática que se establece entre las cargas del mismo signo obliga a las cadenas de polímero a un estado más alargado de la que se encuentra en una red neutral, aumentando así la hinchazón y controlando el tamaño de porosidad. Por el otro lado, los iones de carga opuesta que están presentes en el gel garantizan la neutralidad eléctrica macroscópica e inducen que más agua entre en la red. Por otro lado, la HEC promueve la reticulación intermolecular en lugar de intramolecular, lo que contribuye a la estabilización de la estructura reticular. La estructura reticular de la presente invención, se puede obtener de diferentes tamaños y formas, desde láminas de 0.3 cm de grosor y 0.5 cm de ancho hasta 10 cm de grosor y 100 cm de ancho con largos desde 0.5 cm hasta varios metros. Algunos ejemplos se muestran en las figuras 1 y 2. Un ejemplo de una estructura reticular de forma circular (100) se muestra en la figura 1 y una forma rectangular (101) se muestra en la figura 2.

Además se pueden obtener figuras tridimensionales como cilindros, conos, esferas, prismas triangulares, prismas cuadrángula res, prismas rectangulares, prismas pentagonales, prismas hexagonales y pirámides o figuras tridimensionales irregulares. Cualquier forma tridimensional que resulte por molde o por corte o fresado. Los tamaños pueden ir desde 0.3 cm ³ hasta 15 cm ³ .

Las formas y tamaños se adecúan a la estructura que se quiera implantar en un tejido u órgano. Por ejemplo, un sustituto dérmico se obtiene en forma de malla o membrana de 0.3 cm de grosor y hasta 15 a 20 cm de ancho por lado; como relleno de hueso se obtienen cubos desde 0.5 cm ³ hasta 2 a 4 cm ³ ; como relleno de pulpa dental se obtiene en forma de gránulos de 0.2 a 0.3 cm ³ ; como relleno subcutáneo en láminas de 0.2 cm de grosor y diferentes largos y anchos en cm. Se puede obtener prácticamente cualquier forma y tamaño dependiendo de su aplicación.

La estructura reticular de la presente invención tiene valores de resistencia a la tracción/tensión (flexibilidad, rigidez, y dureza) óptimas para su uso en medicina. Estos valores son necesarios para reflejar la verdadera naturaleza y las características biomecánicas de las partes anatómicas de tejidos y órganos a reemplazar en una parte del cuerpo, cuyas propiedades estructurales están representadas por una relación entre la fuerza y la deformación y el estrés y la tensión. Los valores encontrados de resistencia a la tracción en la estructura reticular de conformidad con la presente invención, son incluso superiores a los valores de 21.6 MPa de piel de humano estudiados por Aisling Ni Annaidh et al. (2012, Characterising the Anisotropic Mechanical Properties of Excised Human Skin. Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials. 5: 139-148) y de 27.2 MPa encontrados por Gallagher AJ et al. (Dynamic Tensile Properties of Human Skin http://researchrepository.ucd. ie hand!e/10197/4772) o incluso con resistencia a la tracción superior a órganos blandos como estómago (<20Mpa), hígado (<15Mpa), corazón (<12Mpa) y pulmón (<25Mpa) estudiados por Saraf H et al. (2007, Mechanical properties of soft human tissues under dynamic loading. Journal of Biomechanics 40:1960-1967) y similares al cartílago articular (40 MPa) estudiado por Triona McCormack y Joseph M. Mansour (1998, Reduction in tensile strength of cartilage precedes surface damage under repeated compressive loading in vitro. Journal of Biomechanics 31:55-61). Otro aspecto de la presente invención se refiere a un proceso de síntesis de una estructura reticular para la regeneración e ingeniería de tejido que comprende: solubilizar en frío a los polímeros de hemicelulosa, carboximetil-celulosa (CMC) e h id roxieti l-celulosa (HEC); adicionar un agente reticulante; calentar a una temperatura entre 30°C y 120°C durante 1 a 8 horas para que se lleve a cabo la reacción de reticulación; enfriar para formar un hidrogel; congelar y descongelar repetidamente el hidrogel para la formación controlada de poros; y secar para obtener una estructura reticular para la regeneración e ingeniería de tejido.

En una modalidad preferida de la presente invención, la etapa de solubilizar en frío a los polímeros de hemicelulosa, CMC y HEC, se lleva a cabo entre 0 y 8°C agitando vigorosamente en agua hasta que se disuelvan por completo. La temperatura fría mantiene estables los enlaces hidrógeno formados entre las distintas cadenas de azúcares, permitiendo la estructuración porosa deseada para obtener un tamaño de poro de entre 30 a 500 μιτι interconectados, preferiblemente entre 30 a 300 μιτι interconectados.

En una modalidad preferida de la presente invención, el agente reticulante se adiciona a la mezcla de hemicelulosa, CMC y HEC, en una proporción desde 0.5 y hasta 20% (p/p) en relación con la mezcla.

Para fines de la presente invención, se entiende por agente reticulante a cualquier compuesto químico o mezcla de compuestos químicos que lleva a cabo la formación de enlaces químicos entre cadenas moleculares para formar una red tridimensional. En una modalidad preferida de la presente invención, el agente reticulante es un agente reticulante covalente no tóxico y biocompatible seleccionado preferiblemente entre ácidos carboxílicos, o compuestos con grupos carbonilos, o cualquiera de las sales de los mismos. Más específicamente, el agente reticulante es ácido cítrico, un ácido trica rboxíl ico, que en temperaturas entre 0 y 30°C se comporta como un triácido y en temperaturas arriba de los 100°C se comporta como un diácido.

En una modalidad preferida de la presente invención, en la etapa de enfriamiento para la formación del hidrogel la mezcla se deja enfriar hasta temperatura ambiente. Una vez que la mezcla se encuentra a temperatura ambiente, ésta se vierte en moldes de un tamaño adecuado consistente con el tejido que requiera regenerarse con la estructura reticulante.

En una modalidad preferida de la presente invención, en la etapa de congelar y descongelar repetidamente el hidrogel para la formación controlada de poros, el hidrogel obtenido en la etapa de enfriamiento se congela entre -20 y -80°C durante un periodo de 8 a 24 horas, y posteriormente se descongela durante 1 a 3 horas a temperatura ambiente. Preferiblemente, este ciclo de congelación- descongelación se repite al menos una vez.

Al repetir este paso de congelamiento y descongelamiento se puede optimizar la formación de poros de un tamaño deseado y se estabiliza la estructura por resiliencia del biomaterial.

Los polímeros de hemicelulosa, CMC y HEC tienen varios grupos hidrófilos, tales como grupos hidroxilo, lo que los hace tener una interacción fuerte con el agua. Las propiedades térmicas de estos polímeros y el agua son marcadamente influidas a través de esta interacción. Así que el agua estrechamente asociada con la matriz del polímero es generalmente llamada agua de no congelación, mientras que las fracciones de agua menos estrechamente asociadas exhiben una fusión/cristalización de considerable sobreenfriamiento y entalpia significativamente menor que la del agua común. Estas fracciones de agua estrechamente asociada con la matriz del polímero se denominan agua unida de congelación. En cada ciclo de congelación se forman cristales de agua de diferentes tamaños. El agua menos estrechamente unida al polímero formará primero estos cristales, mientras que el agua estrechamente asociada lo hace a tiempo posterior. Por lo tanto, en cada ciclo de congelamiento- descongelamiento el hidrogel aumenta su densidad por desplazamiento de las fracciones de agua primeramente congeladas (cristales). Así a medida que se realizan ciclos de congelamiento- descongelamiento se alcanza el equilibrio de hinchamiento/densificación y también se incrementa la fuerza y rigidez del hidrogel y se generan cristales de menor tamaño y por lo tanto poros de menor tamaño. Entonces el número de ciclos de congelamiento-descongelamiento a usar dependerá de qué tan rígida se quiere la estructura y el tamaño de poro. Se observa que después de 5 a 6 ciclos se alcanza el equilibrio, es decir, ya no se modifican las propiedades mecánicas ni el tamaño de poro. De esta manera, en una modalidad específica de la presente invención, 2 ciclos de congelamiento-descongelamiento son adecuados para que la estructura reticular de la presente invención sea adecuada como sustituto dérmico o implante en órganos blandos. En otra modalidad específica de la presente invención, de 4 a 5 ciclos de congelamiento-descongelamiento es lo adecuado para que la estructura reticular obtenida de conformidad con los principios de la presente invención sea adecuada para ser usada como sustituto o implante de tejido óseo.

En una modalidad preferida de la presente invención, en la etapa de secado para obtener una estructura reticular para la regeneración e ingeniería de tejido, el hidrogel congelado se deshidrata por secado en frío (sublimación o liofilización) o por cambio de fases con acetona, dejándola evaporar en cámara de vacío a temperatura ambiente. Lo anterior da como resultado la obtención de una estructura reticular de conformidad con la presente invención.

La presente invención será mejor entendida a partir de los siguientes ejemplos, los cuales se presentan únicamente con fines ilustrativos para permitir la comprensión cabal de las modalidades preferidas de la presente invención, sin que por ello se implique que no existen otras modalidades no ilustradas que puedan llevarse a la práctica con base en la descripción detallada arriba realizada.

EJEMPLOS

En los siguientes ejemplo se utilizan las siguientes abreviaturas de mezclas:

CMC-HH : carboximetilcelulosa-hidroxietilcelulosa-hemicelulosa

CMC-HE: carboximetilcelulosa-hidroxietilcelulosa

CMC: carboximetilcelulosa

Ejemplo 1. Obtención de hemicelulosa de agave

Para fines ilustrativos, se muestra como es posible obtener hemicelulosa a partir de la planta de agave para posteriormente utilizar dicha hemicelulosa en la preparación de una estrucutra reticular de conformidad con los principios de la presente invención.

La hemicelulosa de agave se obtiene mediante un preacondicionamiento de las fibras de agave que consiste en lavado, corte y remoción de ceras. Después las fibras se lavan de 3 a 5 veces con agua destilada a una relación 10: 1 vol/wt aproximadamente por 10 minutos cada una para eliminar los restos de azúcares, posteriormente se escurren y se secan en un horno de vacío a 50°C aproximadamente. Se sumerge de lOg a lOOg aproximadamente de fibras secas de agave en 1000 mL de solución de NaOH del 10 al 20% aproximadamente en peso a 100°C por un tiempo promedio de 5 a 12 horas o con una solución de NaOH del 0.1 a 0.6 M a 45°C por un tiempo promedio de 1 a 3 horas hasta que se obtenga un licor negro.

La hemicelulosa y las fibras de celulosa son obtenidas por separado mediante filtración, la lignina obtenida se desecha. Las fibras obtenidas de celulosa y hemicelulosa se procesan de la misma forma por separado simultáneamente. Las fibras se lavan varias veces con agua destilada a una relación de 5 a 10: 1 aproximadamente para eliminar los restos de NaOH, después se sumergen en 1000 mi de solución de NaOH 0.1 M a 45°C por 3 horas aproximadamente. A continuación, se les dan tratamientos sucesivos a las fibras con H ₂ 0 ₂ al 0.5%, 1%, 2%, 3% sucesivamente durante 3 horas cada uno a 45°C con un pH de 11,5. Las fibras se lavan varias veces sumergiéndolas en 1000 mL de agua destilada a una relación 5:1 vol/wt para eliminar los restos de H ₂ 0 ₂ agitándose a temperatura ambiente hasta obtener un pH 7. Por último se escurren y se dejan secar a temperatura ambiente a presión de vacío. A partir de este momento se ha obtenido fibras puras de hemicelulosa útiles en el proceso de obtención de la estructura reticular de la presente invención. Además, se obtienen las fibras de celulosa que se procesaron por separado.

Ejemplo 2. Obtención de Carboximetil-celulosa (CMC) de agave

Para fines ilustrativos, se muestra como es posible obtener CMC a partir de la planta de agave para posteriormente utilizar dicha CMC en la preparación de una estrucutra reticular de conformidad con los principios de la presente invención.

Para el proceso de síntesis de CMC de agave, se añaden las fibras de celulosa obtenidas en el ejemplo anterior a 1000 mL de solución al 4% de H ₂ S0 ₄ y se agita durante 2 horas a 100°C. Se lavan 5 veces con agua destilada a una relación de 10: 1 vol/wt por 10 minutos cada vez para eliminar los restos de H ₂ S0 ₄ . Se escurren y se secan en horno de vacío a 50° C por 3 días. Se mezclan de 5 a 15g de la pasta seca de celulosa de agave con 400 mL de alcohol isopropílico. El sistema se agita tratando de homogeneizar la suspensión. A continuación se adicionan 50mL de NaOH agitando vigorosamente durante 30 minutos a temperatura ambiente. Posteriormente se añaden poco a poco 18g de ácido mono- cloroacético durante un periodo de 30min. En seguida se inicia la circulación de agua caliente dentro de la camisa del reactor dejando que ocurra la reacción a una temperatura de 55 a 70°C durante un periodo de tiempo promedio de 3.5 a 5 horas. Transcurrido este tiempo, la mezcla se enfría y se filtra, el material fibroso obtenido se mezcla en el mismo reactor con 300 mL de metanol al 70% v/v y se neutraliza con ácido acético al 90%. Las fibras se vuelven a separar por filtración y se mezclan con 300 mL de etanol al 70% v/v agitándose durante 10 minutos y se deja reposar la mezcla durante 10 minutos para facilitar la separación. La filtración y agitación con etanol se repite al menos 1 vez y finalmente el producto se lava con metanol absoluto y se seca en una estufa a una temperatura de 60°C. Ejemplo 3. Obtención de hidroxietil-celulosa (HEC) de agave

Para fines ilustrativos, se muestra como es posible obtener HEC a partir de la planta de agave para posteriormente utilizar dicha HEC en la preparación de una estrucutra reticular de conformidad con los principios de la presente invención.

Para la síntesis de hidroxietil-celulosa (HEC) de agave, se enfría paulatinamente una solución 1:6 de Urea:NaOH en agua destilada a una temperatura de 12°C y se adicionan inmediatamente de 5 a lOg de las fibras de celulosa de agave obtenidas del ejemplo 1, secas con agitación vigorosa durante 1 hora a temperatura ambiente. Para obtener el aditivo de celulosa transparente, la celulosa alcalina formada se filtra hasta que la relación entre la solución de hidróxido de sodio y celulosa llega a 1:3 en peso. Una cantidad de 5 mL de 2-cloroetanol se añade gota a gota a la solución de celulosa mencionada anteriormente, y la mezcla se agita a 25°C aproximadamente por un periodo de 1 hora, después se aumenta la temperatura a 50°C durante 8 horas. El producto de reacción obtenido se neutraliza con ácido acético, se dializa con agua y finalmente se liofiliza.

Ejemplo 4. Obtención de una estructura reticular de conformidad con la presente invención.

Para fines ilustrativos se llevó a cabo una prueba para obtener una estructura reticular de conformidad con los principios de la presente invención a partir de la hemicelulosa, CMC y HEC de agave obtenidas en los ejemplos anteriores.

Se preparan 100 mL de una solución acuosa con 2g de hemicelulosa con 6g de CMC, y con 3g de HEC de agave, agitando vigorosamente (mín 100 rpm) en frió a una temperatura de 4 °C. La disolución de CMC es lenta, por lo que ésta se agrega al final. Una vez que se obtiene una solución clara con un ligero aumento de la viscosidad, se adicionan 5g de ácido cítrico como agente reticulante. La mezcla se calienta hasta una temperatura de 60 °C, la cual se mantiene por un tiempo de 6 horas. Después de enfriar la mezcla a temperatura de la habitación, ésta se vierte en moldes para que se forme el hidrogel. Posteriormente se congela hasta una temperatura de -20 °C, la cual se mantiene por un tiempo de 8 horas. Una vez transcurrido este tiempo, el hidrogel se descongela durante 3 horas a temperatura ambiente. Este ciclo de congelación y descongelación se repite 2 veces. Finalmente el hidrogel se congela nuevamente hasta una temperatura de -40 °C y se deshidrata por secado en frío mediante liofilización por 24 a 48 horas para obtener una estructura reticular con un tamaño de poro promedio de 200 μιτι interconectados. La liofilización, utiliza un enfriamiento rápido para producir inestabilidad termodinámica dentro de un sistema y causa separación de fases. El agua se elimina entonces por sublimación (de hielo a vapor) mediante alto vacío (0.133 mBar) dejando huecos en las regiones que previamente había ocupado. Ejemplo 5. Obtención de una estructura reticular de conformidad con la presente invención utilizando una proporción de hemicelulosa, CMC y HEC distinta al ejemplo 4.

Para fines ilustrativos se llevó a cabo una segunda prueba para obtener una estructura reticular de conformidad con los principios de la presente invención a partir de la hemicelulosa, CMC y HEC de agave obtenidas en los ejemplos anteriores.

Se preparan 100 mL de una solución acuosa con 0.5g de hemicelulosa con 3g de CMC, y con lg de HEC de agave, agitando vigorosamente (mín 100 rpm) en frió a una temperatura de 4 °C. Se adicionan 3g de ácido cítrico como agente reticulante. La mezcla se calienta hasta una temperatura de 100 °C, la cual se mantiene por un tiempo de 3 horas. Después de enfriar la mezcla a temperatura de la habitación, ésta se vierte en moldes para que se forme el hidrogel. Posteriormente se congela hasta una temperatura de -20 °C, la cual se mantiene por un tiempo de 8 horas. Una vez transcurrido este tiempo, el hidrogel se descongela durante 3 horas a temperatura ambiente. Este ciclo de congelación y descongelación se repite 4 veces. Finalmente el hidrogel se congela nuevamente hasta una temperatura de -40 °C y se deshidrata por cambio de fases con acetona durante 24 horas, dejándola evaporar en cámara de vacío a temperatura ambiente por 48 horas.

En la figura 3 se muestra una fotografía de la ultraestructura de porosidad y tamaños de poros interconectados de la estructura reticular obtenida en el presente ejemplo, en donde se muestra un poro de 300 μιτι (110) de diámetro, un poro de 50 μιτι (120) de diámetro interconectados y una pared de la estructura reticular (130).

Ejemplo 6. Prueba de hinchamiento e hidratación.

Para fines ilustrativos se llevó a cabo una prueba para determinar el porcentaje de hinchamiento e hidratación de la estructura reticular obtenida en el ejemplo anterior de conformidad con los principios de la presente invención.

La estructura reticular preparada en el ejemplo 4 (CMC-HH), se comparó con una estructura reticular a base de CMC y HEC (CMC-HE) y con otra estructura reticular a base de CMC (CMC).

Primero se cortaron las estructuras reticulares en muestras de 0.5 x 0.5 cm y se registró el peso inicial (Md). Después se introdujo cada muestra en un frasco por separado y se adicionaron 5 mL de medio DMEM con pH 7.4 a 37°C y se taparon herméticamente. Los frascos se colocaron en una estufa a 37°C y se removieron cada 2 minutos los primeros 10 minutos para pesarlos y después se repitió el procedimiento cada 10 min hasta que cada muestra alcanzó un peso constante. Al menos tres muestras se analizaron para comprobar repetibilidad. El agua superficial en cada estructura reticular fue tomada con la ayuda de papel de filtro. Las estructuras reticulares hinchados se pesaron y el porcentaje de la capacidad de absorción de agua se midió mediante la siguiente ecuación:

Ms— Md

5% =———

Md z i donde S es la capacidad de absorción de agua en equilibrio (%);

Ms es el peso de la estructura reticular hinchada (g)

Md es el peso de la estructura reticular seca (g)

En la figura 4 se muestra una gráfica comparativa de porcentaje de hinchamiento (S%) contra tiempo en minutos de la estructura reticular de la presente invención (CMC-HH); de una estructura reticular a base de CMC y HEC (CMC-HE); y de una estructura reticular a base de CMC (CMC). Se puede ver el comportamiento mejorado de la estructura reticular de conformidad con la presente invención.

Ejemplo 7. Resistencia a la tracción/tensión (flexibilidad, rigidez, y dureza).

Se realizó una prueba para determinar la resistencia a la tracción/tensión de la estructura reticular obtenida en el ejemplo 4 de conformidad con los principios de la presente invención.

La estructura reticular preparada en el ejemplo 4 (CMC-HH), se comparó con una estructura reticular a base de CMC y HEC (CMC-HE) y con otra estructura reticular a base de CMC (CMC).

Los valores de resistencia a la tracción de las estructuras reticulares se midieron con un medidor de tracción Hounsfield H10KS Velocidad: 50 mm / min, Temperatura: 25 ° C y humedad relativa: 60%. Al menos tres muestras se analizaron para comprobar repetibilidad. En la figura 5 se muestra la gráfica comparativa de resistencia de tracción (MPa) de la estructura reticular de la presente invención (CMC- HH), de una estructura reticular a base de CMC y HEC (CMC-HE) y de una estructura reticular a base de CMC (CMC). En la fig 6 se muestra la gráfica comparativa de porcentaje de alargamiento a la rotura de la estructura reticular de la presente invención (CMC-HH), de una estructura reticular a base de CMC y HEC (CMC-HE) y de una estructura reticular a base de CMC (CMC). En ambas gráficas se puede observar el mejor desempeño que presentan las estructuras reticulares de conformidad con la presente invención. Estos valores reflejan las características biomecánicas de las partes anatómicas de tejidos y órganos a reemplazar y los valores obtenidos por la estructura reticular de la presente invención son adecuados para su uso en distintos órganos y tejidos.

Ejemplo 8. Biocompatibilidad in vitro con fibroblastos de humano (HFF-1).

Se realizó una prueba para determinar la biocompatibilidad in vitro con fibroblastos de humano (HFF-1) de la estructura reticular obtenida en el ejemplo 4 de conformidad con los principios de la presente invención.

La estructura reticular preparada en el ejemplo 4 (CMC-HH), se comparó con una estructura reticular a base de CMC y HEC (CMC-HE), y con otra estructura reticular a base de CMC (CMC).

La biocompatibilidad de las estructuras reticulares se midió in vitro a través de la medición de viabilidad de células de piel de humano (fibroblastos; HFFl ATCC SCRC-1041) cultivadas sobre los materiales. Las reducción de sales de tetrazolio (MTT) a cristales de formazan (púrpura e insoluble) se utilizó para determinar el porcentaje de células vivas solamente, ya que las células muertas no reducen el MTT. Se usó como referencia del 100% al cultivo de las células (HFFl) en las mismas condiciones pero sin materiales de estructuras reticulares. Se cortaron círculos de las estructuras reticulares con una perforadora de papel y se esterilizaron por plasma de peróxido de hidrógeno y se depositaron en pozos de placas de cultivo celular de 96 pozos, una por pozo. Posteriormente se sembraron 75,000 fibroblastos en medio DMEM pH 7.4 y se incubaron a 37°C por 7 días. Después de 7 días de incubación, se lavaron los pozos dos veces con PBS y se adicionó la solución de MTT y se dejó incubar por 24 h. Pasado el tiempo de reducción, se fijaron las células con etanol al 70% y los cristales de formazan se disolvieron con isopropanol. Se realizó la medición del color a 550 nm y a 690 nm para restar el fondo de lectura. Los valores de las muestras se expresan como porcentajes de la absorbancia de la muestra control (100% de células viables). Porcentajes mayores a 90% se consideran biocompatibles.

Los porcentajes de viabilidad celular que demuestra la citocompatibilidad de las estructuras reticulares utilizadas se muestran en la figura 7, en donde la estructura reticular de la presente invención es (CMC-HH), una estructura reticular a base de CMC y HEC es (CMC-HE) y una estructura reticular a base de CMC es (CMC). Todas las estructuras reticulares analizadas resultan biocompatibles, pero la estructura reticular preparada en el ejemplo 4 (CMC-HH) de conformidad con los principios de la presente invención es la que tiene el mayor porcentaje de viabilidad.

En la figura 8 se muestra una fotografía microscópica de la estructura reticular preparada en el ejemplo 4 de conformidad con los principios de la presente invención tomada durante el proceso de epitelización con los fibroblastos de piel de humano (HFF-1), en la cual se observa que la estructura reticular se encuentra recubierta en su totalidad por estas células que se adhirieron, diferenciaron y produjeron matriz extracelular. En esta figura 8, la estructura reticular (100) se muestra como un material fibroso de tono más claro y las células de piel de humano (200) que han recubierto la estructura se muestran como elementos de forma semiesférica o esférica de tono ligeramente más oscuro. Las partes más oscuras de la fotografía corresponden a los poros de la estructura reticular (100). Ejemplo 9. Biocompatibilidad y eficacia ¡n vivo en cerdos.

Se realizó una prueba para determinar la biocompatibilidad y eficacia in vivo de la estructura reticular obtenida en el ejemplo 4 de conformidad con los principios de la presente invención.

Para la realización del estudio se utilizaron seis cerdos; cada uno se consideró como una unidad experimental. En cada cerdo, se efectuaron tres incisiones de 8 por 8 cm, a partir de la columna vertebral con cuatro centímetros entre incisiones ipsolaterales y cuatro centímetros a partir del cuello del animal. La piel y el tejido subcutáneo fueron retirados a nivel del panículo adiposo. Los tres tratamientos para cada incisión en cada cerdo fueron los siguientes:

1) Implante comercial de colágeno (Integra® Dermal Regeneration Témplate, obtenido en 2016), el cual comprende una capa inferior conformada de colágeno obtenido de vacas y glicosaminoglicano obtenido de cartílago de tiburón, y una capa exterior de silicona

2) Cicatrización de segunda intención (Sin tratamiento).

3) Estrucutra reticular obtenida en el ejemplo 4 de conformidad con los principios de la presente invención con una capa exterior de silicona. El sitio de tratamiento se alternó en cada cerdo para evitar sesgo por sitio de implante. Cada sitio de tratamiento se recubrió con una lamina de contacto con la lesión, porosa y transparente (Mepitel™ Mólnlycke Healthcare AB, obtenido en 2016) con propiedades adherentes para reducir el trauma de los cambios de los apositos, un aposito de plata nanocristalina (Acticoat™ Smith &Nephew Ltd, obtenido en 2016) para el tratamiento de heridas infectadas para minimizar la infección, una película de poliuretano recubierto con un poliacrilato (Hypafix™, obtenido en 2016) para cubrir los bordes y un vendaje para mantenerlo en su lugar durante el tiempo del estudio.

En la figura 9 se muestra la implantación del implante comercial (300) en el lugar de piel removida de grosor completo de uno de los cerdos (la piel del cerdo se observa amarilla por la colocación de un antiséptico). En la figura 10 se muestra la implantación de la estructura reticular (100) de conformidad con los principios de la presente invención obtenida en el ejemplo 4 en el lugar de piel removida de grosor completo del mismo cerdo.

Se realizó revisión clínica, evolución de la herida (toma de fotografías de alta resolución/termográficas), consumo de alimento y al fin de experimentación se tomó biopsia de los injertos.

Los resultados del estudio se pueden observar en las figuras 11, 12 y 13. En la figura 11 en el recuadro (410) se muestra el resultado de la cicatrización natural por segunda intención sin uso de implante; en la figura 12 en el recuadro (420) se muestra el resultado de cicatrización usando el implante comercial de colágeno ; y en la figura 13 en el recuadro (430) se muestra el resultado de cicatrización de primera intención usando la estructura reticular de conformidad con los principios de la presente invención. En los tre casos no hubo efectos adversos asociados por los implantes y los parámetros fisiológicos no se alteraron. El rendimiento clínico de los cerdos se reafirmó como ausencia de alteraciones, identificadas en función de su consumo de alimentos y agua y su aumento de peso corporal.

El análisis macro y micro mostró una regeneración bien establecida en el caso de ambos sitios de tratamiento com implante en comparación con el control sin tratamiento. Sin embargo, la estrucutra reticular obtenida en el ejemplo 4 de conformidad con los principios de la presente invención mostró un mejor desempeño en la regeneración de tejido de la estrucutra reticular comercial en términos de recuperación final (4/6 vs 2/6 animales). Sólo para el caso de la estrucutra reticular de conformidad con los principios de la presente invención (figura 13), se observa la completa integración, cierre completo de la herida y regeneración completa de piel (grosor, pigmento, pelo) de la estructura reticular de la presente invención.

Ejemplo 10. Estudio de implantación en riñon de rata

Se realizó una prueba para determinar la biocompatibilidad y eficacia in vivo de la estructura reticular obtenida en el ejemplo 4 como un implante de riñon de rata de conformidad con los principios de la presente invención.

Se resecó 1/3 del riñon izquierdo en ratas Wistar de 4 semanas de edad y en su lugar se implantó la estructura reticular de la presente invención con la forma del tejido retirado. Se mantuvieron los animales en condiciones controladas por 6 semanas y se midió la producción de urea y creatinina durante el estudio y se evaluó la improntación del implante en el tejido por medios histológicos y macroscópicos.

En la figura 14, se muestra un riñon de rata sin implante (510) que fue utilizado como control de no regeneración del estudio de implantabilidad en órganos de mamífero in vivo a las 12 semanas de la resección del riñon sin regeneración y en la figura 15 se muestra un riñon de rata (520) con la estructura reticular (100) de la presente invención obtenida en el ejemplo 4 implantada. La figura 16 muestra una ampliación de la sección (521) del riñon (520) de la figura 15, en la que se observa la completa integración, vascularización e irrigación de la estructura reticular de la presente invención sin alteraciones del tejido que recibió el implante. Además en las figuras 17 y 18 se muestran gráficos de los resultados de concentraion de urea y creatinina respectivamente en sangre al final del estudio en ratas sanas, ratas con un tercio de resección de riñon y ratas con un tercio de resección de riñon implantadas en su lugar con la estructura reticular de la presente invención obtenida en el ejemplo 4. De acuerdo con los resultados, la estructura reticular de la presente invención fue bien tolerada y se implantó permitiendo las funciones renales normales.

De acuerdo con lo anteriormente descrito, será evidente para un técnico en la materia que las modalidades de estructura reticular para la regeneración e ingeniería de tejido y su proceso de síntesis arriba ilustradas se presentan con fines únicamente ilustrativos, pues un técnico en la materia puede realizar numerosas variaciones a la misma, como puede ser mezclas con otros polímeros o moléculas que son utilizados en la regeneración de tejidos y órganos. Por consecuencia de lo anterior, la presente invención incluye todas las modalidades que un técnico en la materia puede plantear a partir de los conceptos contenidos en la presente descripción.