Eine wichtige Aufgabe in der Biotechnologie, Medizin und Phar- makologie besteht in der Handhabung biologischer Zellen, um an diesen z. B. Messungen oder Analysen durchzuführen. Biologi- sche Zellen sind hochempfindliche Systeme, die in der Regel im lebenden Zustand ständig sich verändernde Zustände und Eigen- schaften durchlaufen. Zellen sollen nach ihrer Gewinnung z. B. durch Abnahme aus einem Organismus möglichst unverändert blei- ben. Ferner soll die Handhabung, z. B. ein Sortieren der Zel- len ohne Veränderung von deren Eigenschaften erfolgen können.

Des Weiteren besteht ein Interesse, Zellen einzeln, in Gruppen oder nach Typen geordnet verfügbar zu halten und je nach Be- darf im Zeitverlauf bereitzustellen.

Zur Lagerung und Bereitstellung biologischer Zellen wurden verschiedene Techniken zur Kryokonservierung oder Kryofixie- rung entwickelt. Eine Kryokonservierung umfasst ein unverän- dertes Erhalten insbesondere biologischen Materials im gefro- renen Zustand. Es ist bspw. bekannt, biologische Zellen, die in einer Nährstofflösung suspendiert sind, auf kalte Oberflä- chen aufzusprühen, wo sie gefrieren (z. B. US 5 780 295). Diese Sprühtechnik besitzt mehrere Nachteile. Erstens werden die Zellen beim Aufsprühen in unkontrollierter Weise mechanisch belastet. Zweitens sind die konservierten Proben auf der Ober- fläche unregelmäßig und nicht reproduzierbar angeordnet. Die weitere Handhabung der kryokonservierten Proben ist erschwert.

Die Anwendung der Sprühtechnik ist auf besonders kleine Pro- bentropfen (kleiner Materialdurchsatz) und niedrigviskose Sus- pensionen beschränkt.

Aus WO 96/13159 ist bekannt, biologische Objekte zur Kryokon- servierung in Tropfenform mit einer Mikrotropfenschusseinrich- tung auf ein gekühltes Substrat aufzuschießen. Durch Verwen- dung der Mikrotropfenschusseinrichtung kann die Position der Kryo-proben reproduzierbar eingestellt werden. Mit dieser Technik können Kryoproben sortiert werden. Nachteilig ist je- doch wiederum die Belastung der Proben bei der Ablage auf dem Substrat und die Fixierung der Proben am Substrat, solange der gefrorene Zustand anhält. Die Kryokonservierung biologischen Materials auf gekühlten Substraten wird auch in US 4 531 373 und US 4 580 416 beschrieben.

Ein generelles Problem der herkömmlichen Kryokonservierung durch Auffrieren auf einer Oberfläche besteht darin, dass die Kryoproben im Falle einer vorübergehenden Erwärmung auf der Oberfläche keine wesentliche Formänderung erfahren. Es kann nur mit aufwendigen messtechnischen Mitteln geprüft werden, ob die Kryoprobe im Verlauf der Lagerung zeitweilig geschmolzen war. Gegenwärtig ist bei der Ablage von Kryoproben auf Ober- flächen kein praktikabler Marker verfügbar, mit dem die Dauer- haftigkeit des Kryozustandes geprüft werden kann. Dies stellt ein besonderes Problem bei Langzeitanwendungen der Kryokonser- vierung dar, bei denen es weniger auf das vorübergehende Fi- xieren des Zustands einer Probe ankommt, sondern vielmehr auf eine z. B. mehrjährige Lagerung.

Es ist auch bekannt, biologische Zellen durch Immersion in ei- nem flüssigen Kühlmedium einzufrieren (z. B. US 4 578 963). Bei dieser Technik besteht jedoch die Gefahr, dass die Proben durch das Kühlmedium kontaminiert werden. Dieses Problem be- steht auch bei der Kryofixierungstechnik, die in DE-OS 39 30 605 beschrieben wird. Bei dieser Technik werden suspendierte biologische Materialien in ein flüssiges Kühlmedium einge- sprüht, um besonders hohe Kühlgeschwindigkeiten zu erzielen.

Die Anwendung der Sprühtechnik ist wiederum auf besonders kleine Probentropfen und auf versprühbare, d. h. niedrigviskose Suspensionen beschränkt. Des Weiteren ist an der Sprühtechnik von Nachteil, dass diese wegen der kleinen Probenvolumen mit einem geringen Materialdurchsatz verbunden ist.

Mit der Immersionstechnik werden zwar mechanische Belastungen der Proben beim Auffangen der Proben vermieden. Nachteilig ist jedoch, dass die Proben in einen Lagerbehälter ohne eine defi- nierte Lagebeziehung fallen. Eine selektive Sammlung der ge- frorenen Proben, z. B. nach bestimmten Probeneigenschaften o- der Zelltypen, kann nicht erfolgen.

Die Aufgabe der Erfindung ist es, verbesserte Verfahren und Vorrichtungen zur Herstellung gefrorener Proben, insbesondere zur Kryokonservierung biologischer Proben bereitzustellen, mit denen die Nachteile herkömmlicher Kryokonservierungstechniken überwunden werden und die es insbesondere ermöglichen, einzel- ne Proben, insbesondere mit biologischen Zellen, Zellgruppen oder Zellbestandteilen geordnet und reproduzierbar im gefrore- nen Zustand zu lagern und ggf. zu manipulieren.

Diese Aufgabe wird durch Verfahren mit den Merkmalen gemäß An- spruch 1 und Vorrichtungen mit den Merkmalen gemäß Anspruch 19 gelöst. Vorteilhafte Ausführungsformen und Anwendungen der Er- findung ergeben sich aus den abhängigen Ansprüchen.

Eine Grundidee der Erfindung ist es, die Kryokonservierung von Proben durch Abkühlung in einer Kühleinrichtung mit einem Kühlmedium und anschließender Sammlung der Proben in einer Aufnahmeeinrichtung dahingehend weiterzuentwickeln, dass die Proben in der Kühleinrichtung durch unmittelbare Einwirkung eines gas-oder dampfförmigen Kühlmediums gefroren werden. Das Gefrieren erfolgt vorzugsweise in einem Zustand, in dem die Proben unter der Wirkung der eigenen Oberflächenspannung eine vollständige oder abgeplattete Sphäroidform bilden. Das Kühl- medium kann allseitig oder nahezu allseitig auf die Proben- oberfläche einwirken, bis die Proben zumindest an ihrer Ober- fläche gefroren sind. Die Proben werden zumindest auf ihrer Oberfläche gefroren. Ein vollständiges Gefrieren kann in der Aufnahmeeinrichtung folgen. Die erfindungsgemäße Kryokonser- vierung im Wesentlichen sphärischer Proben in gas-oder dampf- förmigen Kühlmedien besitzt den Vorteil, dass erstmalig ein mechanisch schonender Einfriervorgang im schwebenden, suspen- dierten oder nahezu frei getragenen Zustand der Proben er- folgt. Sowohl die Lagerung der Proben, die Überprüfung der Kryobedingungen als auch die weitere Handhabung der Proben wird dadurch erheblich erleichtert.

Die Sphäroidform oder sphärische Tropfenform umfasst bei- spielsweise eine Form eines sphärischen Rotationskörpers (z.

B. Kugelform, Ellipsoidform), der ggf. bei der Bewegung im Kühlmedium oder durch die Wirkung der Oberflächenspannung ab- geplattet oder deformiert ist (z. B. Strömungsprofilform). Die sphärische Tropfenform ist, abgesehen von einer möglicherweise vorgesehenen Kontaktfläche, vollständig konvex. Die Probe bil- det die Sphäroidform im entspannten und mechanisch relaxierten Zustand, in dem das Einfrieren erfolgt. Der Einfriervorgang erfolgt im wesentlichen durch Wärmeabtransport über die freie Oberfläche der Probentropfen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung durch- laufen die Proben von einem Tropfengenerator zu der Kühleinrichtung und/oder durch die Kühleinrichtung eine vorbestimmte Bewegungsbahn. Der Tropfengenerator ist zur unidirektionalen Tropfenabgabe eingerichtet. Diese Maßnahme kann Vorteile in Bezug auf den Aufbau der Kühleinrichtung und eine geordnete Ablage gefrorener Proben in einer Aufnahmeeinrichtung besitzen. Des weiteren werden im Vergleich zu herkömmlichen Sprühtechniken größere Tropfen und damit ein erhöhter Materialdurchsatz selbst bei Suspensionen mit erhöhter Viskosität (z. B. Blut) realisierbar.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung kann vorgesehen sein, dass die Proben vor der Sammlung eine Ablenkeinrichtung durchlaufen, mit der einzelne Proben selek- tiv in verschiedene Kompartimente der Aufnahmeeinrichtung ge- lenkt werden können. Erfindungsgemäß wird vorgeschlagen, die Proben zunächst im fluiden Kühlmedium (gasförmig oder dampf- förmig) einzufrieren und dann im gefrorenen Zustand selektiv in den Kompartimenten zu sammeln. Die Bereitstellung der Ab- lenkeinrichtung besitzt den Vorteil, dass eine probenspezifi- sche Sammlung und Ablage der Proben ermöglicht wird. Die ge- ordnet abgelegten Proben sind nicht mehr an bestimmte Substra- te fixiert.

Die Proben durchlaufen die Ablenkeinrichtung entsprechend ver- schiedenen Ausführungsformen der Erfindung vor, während oder nach der Abkühlung in der Kühleinrichtung. Die Kühleinrichtung bildet einen Raum, in dem das Kühlmedium und die Proben zum zumindest teilweisen Einfrieren sind. Die Ablenkung der Proben auf verschiedene Bahnen hin zu den Kompartimenten vor oder während der Abkühlung besitzt den Vorteil, dass die gefrorenen Proben nach der Ablenkung unmittelbar in die Auffangeinrich- tung überführt werden können. Die Ablenkung von Proben in die verschiedenen Kompartimente nach der Abkühlung besitzt den Vorteil, dass die Kühleinrichtung mit dem Kühlmedium mit einem relativ geringeren Volumen gebildet werden kann. Des Weiteren kann vorteilhaft sein, dass die Proben im gefrorenen Zustand durch die Ablenkkräfte lediglich eine Änderung der Bewegungs- richtung, nicht jedoch eine Änderung von Probeneigenschaften erfahren.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung bewegen sich die Proben durch das Kühlmedium in der Kühlein- richtung fallend unter der Wirkung von Gravitationskräften.

Die Erfinder haben festgestellt, dass Kühleinrichtungen, z. B. in Form von Fallrohren mit praktikablen Dimensionen von weni- ger als z. B. 1 m verwendet werden können, um eine Probe zu- verlässig in den gefrorenen Zustand überführen zu können. Die Bewegung der Probe wird ggf. noch durch eine zusätzliche Druckkraft beim Ausstoß aus einem Tropfengenerator unter- stützt.

Gemäß einer alternativen Ausführungsform der Erfindung können die Proben streckenweise gegen die Wirkung der Gravitations- kraft durch das Kühlmedium bewegt werden. Von einem Tropfenge- nerator ausgehend werden die Proben entlang ballistischen Bah- nen durch die Kühleinrichtung in die Aufnahmeeinrichtung über- führt. Bei dieser Gestaltung kann ggf. die Ablenkeinrichtung durch eine Neigungseinrichtung des Tropfengenerators und eine Stelleinrichtung zur relativen Positionierung der Aufnahmeein- richtung gebildet werden. Kryoproben mit verschiedenen Massen oder Tropfengrößen durchlaufen verschiedene ballistische Bah- nen und können entsprechend in verschiedene Kompartimente ge- lenkt werden.

Gemäß einer weiteren Abwandlung kann eine horizontale Bewegung der Proben mit einem Trägerfluid durch die Kühleinrichtung vorgesehen sein. Das Trägerfluid kann selbst das Kühlmedium bilden. Bei dieser Ausführungsform können sich Vorteile in Be- zug auf den Aufbau der Kryokonservierungsvorrichtung ergeben.

Weitere Vorteile können sich ergeben, wenn die Proben vor oder in der Kühleinrichtung mit einem Tropfenmanipulator beein- flusst werden, um bspw. bestimmte Tropfengrößen oder Tropfen- zusammensetzungen zu erzielen. Ein Tropfenmanipulator kann bspw. eine Tropfenmaske, mit der eine Probe in Teiltropfen zerlegt wird, und/oder eine Tropfenhalterung umfassen, mit der die Probe mit akustischen Kräften in der Kühleinrichtung ge- haltert und einer Beschichtung unterzogen wird. Die erfin- dungsgemäße Kryokonservierungstechnik ermöglicht somit einen erweiterten Anwendungsbereich und eine zusätzliche Bearbeitung der Proben vor oder während der Kryokonservierung.

Gemäß einer vorteilhaften Gestaltung der Erfindung können die Proben im Tropfengenerator vorgekühlt werden. Damit kann der Gefriervorgang in der Kühleinrichtung beschleunigt werden.

Dies ermöglicht einen kompakten Aufbau der Kryokonservierungs- vorrichtung.

Die Vorteile der Erfindung können sich auch entfalten, wenn die Proben beim Einfrieren unter der Wirkung der Oberflächen- spannung keinen vollständigen Sphäroid mit freier Oberfläche, sondern eine abgeplattete Sphäroidform bilden. Dies ist bei- spielsweise bei Ablage von Probentropfen auf einer Substrat- oberfläche mit hydrophoben Eigenschaften der Fall. Auf der hydrophoben Oberfläche, die z. B. durch Parylene, Polykarbonat oder PTFE gebildet wird, bilden mindestens 50% des Tropfenvo- lumens, vorzugsweise jedoch ein größerer Anteil des Tropfenvo- lumens die Sphäroidform, die an der Kontaktfläche mit der Sub- stratoberfläche eine Einschnürung aufweist. Die Kontaktfläche ist kleiner als die maximale Querschnittsfläche des Tropfens.

Auch bei dieser Gestaltung kann die Abkühlung mit dem gas-o- der dampfförmigen Kühlmedium erfolgen. Das Einfrieren ist wie bei schwebenden Probentropfen mechanisch schonend. Die Kon- taktfläche mit der hydrophoben Oberfläche ist relativ klein (z. B. 10 % der gesamten Probenoberfläche oder weniger, z. B.

1), so dass die gefrorenen Proben von der Oberfläche leicht abgetrennt und mit mechanischen Mitteln in eine Aufnahmeein- richtung verschoben werden können.

Die Erfindung besitzt die folgenden weiteren Vorteile. Die er- findungsgemäße Vorrichtung ermöglicht eine quantitative Ein- stellung des in einer tropfenförmigen Probe enthaltenen biolo- gischen Materials. Beispielsweise ist die Zellzahl in einem Probentropfen von einer Zelle bis zu einigen 100 000 Zellen oder mehr definiert einstellbar. Die Kryokonservierung basiert auf dem Sortieren von Festkörpern auf mechanischem oder berüh- rungslosen Wege, wobei in jedem Falle die Eigenschaften des biologischen Materials nicht nachteilig beeinflusst werden.

Die gefrorenen Proben sind reproduzierbar auf Substraten, z.

B. mit Mikrostrukturen oder nanostrukturierten Oberflächen po- sitionierbar. Die abgelegten Proben können leicht im gefrore- nen Zustand aus der Aufnahmeeinrichtung entnommen werden, da sie nicht an einer Oberfläche der Aufnahmeeinrichtung anhaf- ten. Die Erfindung ermöglicht eine einfache Langzeitlagerung und eine übersichtliche Deposition von Kryoproben, und die Vorrichtung ist automatisiert betätigbar. Die erfindungsgemäße Kryokonservierung liefert automatisch eine Temperaturkontrol- le. Nach einer Langzeitlagerung muss eine gefrorene Probe in der Form vorliegen, wie sie ursprünglich beim Einfrieren ge- bildet wurde. Ein in der Aufnahmeeinrichtung ausgeweitetes oder an dieser anhaftendes Gebilde würde auf eine Erwärmung hinweisen.

Besondere Vorteile der Erfindung ergeben sich beim Auftauen einer Probe nach der Kryokonservierung. Gewöhnlich wird die Probe in einer Nährlösung gefroren, die auch ein Gefrier- schutzmittel (Kryoprotektivum) enthält. Für ein sicheres Ein- frieren wird das Kryoprotektivum mit einer bestimmten, ggf. toxischen Konzentration zugesetzt. Diese toxische Konzentrati- on ist jedoch während der relativ kurzen Zeit vor dem Einfrie- ren und im kryokonservierten Zustand unkritisch. Zum Auftauen kann der Kryoprobe nun eine Nährlösung zugesetzt werden, durch die bereits während des Auftauens das Kryoprotektivum auf ei- nen unkritischen Wert verdünnt wird. Die Nährlösung zum Auf- tauen kann mit der erfindungsgemäßen Technik problemlos im tiefgefrorenen Zustand in die Aufnahmeeinrichtung zugefügt werden. Eine Vermischung mit der Kryoprobe erfolgt erst beim Auftauen. Dieses schonende, selektiv wirkende Prinzip war mit herkömmlichen Konservierungstechniken nicht oder nur be- schränkt realisierbar.

Ein weiterer besonderer Vorteil der Erfindung besteht in der Möglichkeit, einzelne gefrorene Proben (Tropfen) durch Tief- temperaturdeposition (Beschichtung) zum Transportschutz als Wärmeisolation oder zur Erzielung eines veränderten Mediums beim Auftauen zu umhüllen. Die Manipulierbarkeit einzelner Kryoproben war mit den herkömmlichen Kryotechniken ebenfalls nicht oder nur beschränkt möglich.

Weitere Vorteile und Einzelheiten der Erfindung werden aus der folgenden Beschreibung der beigefügten Zeichnungen ersicht- lich. Es zeigen : Fign. 1 bis 9 : verschiedene Ausführungsformen erfindungs- gemäßen Kryokonservierungsvorrichtungen, Fign. 10 und 11 : weitere Einzelheiten von Ausführungsformen einer Kryokonservierungsvorrichtung gemäß Figur 1, Figur 12 : weitere Einzelheiten einer Kryokonservie- rungsvorrichtung gemäß Figur 2, Figur 13 : Einzelheiten der erfindungsgemäßen Krykon- servierung auf einer hydrophoben Oberflä- che, Figur 14 : eine schematische Illustration der Handha- bung einer Kryoprobe mit einer Kapillar- spitze, und Figur 15 : eine schematische Illustration eines er- findungsgemäßen Kryoprobenaggregats.

In den Figuren 1 bis 7 sind verschiedene Ausführungsformen er- findungsgemäßer Kryokonservierungsvorrichtungen schematisch illustriert, bei denen mindestens eine Probe die Strecke von einem Tropfengenerator zur Aufnahmeeinrichtung im Wesentlichen vertikal unter der Wirkung der Gravitationskraft oder ggf. ei- ner zusätzlichen Druckkraft durchläuft. Allgemein ist bei den Ausführungsformen ein Aufbau aus einem Tropfengenerator 10, einer Kühleinrichtung 20, ggf. einer Ablenkeinrichtung 30 und einer Aufnahmeeinrichtung 40 vorgesehen. Die Komponenten 10-40 sind jeweils schematisch mit gleichen Symbolen illustriert.

Bei der ersten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Kryokon- servierungsvorrichtung gemäß Figur 1 werden flüssige Proben in Tropfenform mit dem Tropfengenerator 10 abgegeben und in der Kühleinrichtung 20 mit einem gas-oder dampfförmigen Kühlmedi- um gefroren. Nach Durchlauf durch die Kühleinrichtung 20 wer- den die Proben in der Aufnahmeeinrichtung 40 gesammelt.

Der Tropfengenerator 10 besitzt mindestens eine Düse 11, die an einer Generatoreinheit 12 angebracht ist. Die Generatorein- heit 12 enthält insbesondere ein Probenreservoir, eine Steuer- einrichtung zur Probenfreigabe durch die Düse 11 und ggf. ei- nen Druckerzeuger. Die Düse 11 ist an der Generatoreinheit 12 vertikal nach unten gerichtet angeordnet. Die Düse 11 besitzt bspw. die Form eines sich verjüngenden Rohres mit einer Aus- trittsöffnung, deren Durchmesser bspw. 10 um bis 5 mm beträgt.

Der Tropfengenerator 10 ist allgemein für einen unidirektiona- len Betrieb ausgelegt. Dies bedeutet, dass tropfenförmige Pro- ben, die vom Tropfengenerator 10 abgegeben werden, eine fest- gelegte Bewegungsrichtung besitzen. Die Bewegungsrichtung wird je nach dem Funktionsprinzip des Tropfengenerators 10 und der Ausrichtung der Düse 11 festgelegt. Der Tropfengenerator 10 wird beispielsweise durch eine Pipette, einen piezoelektri- schen Tropfengeber oder einen Tropfengeber gebildet, der mit dem von Tintenstrahldruckern bekannten"Bubblejet"-Prinzip ar- beitet.

Unterhalb der Düse 11 ist die Kühleinrichtung 20 angeordnet.

Diese umfasst insbesondere einen Kühlraum 21, der mit einer Kühlmediumquelle 22 verbunden ist (jeweils schematisch illust- riert). Der Kühlraum 21 umfasst bspw. einen Zylinder oder ein Rohr aus einem gut wärmeleitenden Material (z. B. Metall). Ei- ne charakteristische Querschnittsdimension (z. B. Innendurch- messer) des Kühlraums 21 beträgt bspw. 0.5 bis 3 cm. Der Kühl- raum 21 ist mit dem Kühlmedium gefüllt. Je nach Anwendungsfall wird als Kühlmedium bspw. Dampf des flüssigen Stickstoffs, ge- kühlte Luft, ein anderes gekühltes Gas, Dampf von CO2-Eis oder Dampf von flüssigem Helium verwendet. Die Kühlmediumquelle 22 ist mit dem Kühlraum 21 verbunden und zur direkten Kühlung (Einspeisung von Kühlmedium) oder zur indirekten Kühlung (Kon- vektionskühlung) eingerichtet. Die Länge der durch den Kühl- raum 21 gebildeten Fallstrecke beträgt je nach Volumen des Kühlraums und Art einer ggf. vorgesehenen Vorkühlung bei mobi- len Geräten bspw. 10 cm bis 50 cm und bei stationären Geräten bspw. 2 m bis 10 m. Die Temperatur im Kühlraum 21 liegt im we- sentlichen bei der Siede-oder Sublimationstemperatur des Kühlmittels und beträgt zum Beispiel-30°C bis-170 °C. Bei Kühlung im Dampf von flüssigem Helium kann die Temperatur we- sentlich niedriger liegen (bis rd.-260 °C). Vorteilhafterwei- se kann dabei die Kühlstrecke wesentlich verkürzt werden.

Am Ende der Fallstrecke in der Kühleinrichtung 20 ist die Auf- nahmeeinrichtung 40 vorgesehen. Diese umfasst einen Sammelbe- hälter, wie z. B. eine Wanne. Die Aufnahmeeinrichtung 40 ist vorzugsweise mit einem Kühlgerät ausgestattet, mit dem eine Kryokonservierungstemperatur einstellbar ist.

Wenn die gefrorenen Proben beispielsweise je nach ihren Eigen- schaften oder in Abhängigkeit vom Betriebszustand des Tropfen- generators 10 sortiert werden sollen, kann erfindungsgemäß ei- ne Ablenkeinrichtung 30 vorgesehen sein, wie dies schematisch in den Figuren 2 bis 7 illustriert ist. Beispielsweise ist ge- mäß Figur 2 die Ablenkeinrichtung 30 am Ende der Fallstrecke vorgesehen. Die Ablenkeinrichtung 30 ist allgemein zur Aus- übung mechanischer, elektrischer, magnetischer, akustischer und/oder optischer Ablenkkräfte auf die Proben eingerichtet, die durch die Kühleinrichtung. 20 hindurchtreten. Mechanische Ablenkkräfte werden bspw. durch eine Rutsche (siehe auch Figur 12), Rolle oder Wippe oder aerodynamisch mit einem Gasstrom erzeugt. Die Stärke der Ablenkung wird bspw. durch die Neigung der Rutsche oder Rolle, die Kraft bei Betätigung der Wippe o- der die Strömungsgeschwindigkeit des Gasstroms bestimmt. E- lektrische oder magnetisch Ablenkkräfte werden mit elektri- schen oder magnetischen Felder erzeugt. Dies ist vorzugsweise bei sehr kleinen Proben (im Sub-um-Bereich) vorgesehen. Zur Ausübung magnetischer Ablenkkräfte werden Proben verwendet, die magnetische Partikel enthalten. Zur Ausübung akustischer Ablenkkräfte ist die Ablenkeinrichtung 30 mit einer Ultra- schallquelle ausgestattet, mit der je nach Schallamplitude Proben verschieden stark abgelenkt werden können. Schließlich kann zur Ausübung optischer Ablenkkräfte eine Laser- Lichtquelle vorgesehen sein, mit der die Proben wie mit einem sog. Laser-Tweezer manipuliert werden.

Die Ablenkeinrichtung 30 kann, insbesondere bei Ausübung me- chanischer Ablenkkräfte, selbst gekühlt sein, um die Proben nicht zu erwärmen. Des Weiteren kann vorgesehen sein, dass die Ablenkeinrichtung 30 eine Fraktioniereinrichtung enthält, mit der gefrorene Probentropfen in Teilvolumen zerlegt werden.

Dies würde vorteilhafterweise trotz der hierzu erforderlichen mechanischen Kräfte kein Problem für die meisten kryokonser- vierten Zellen darstellen, die in einem Probentropfen enthal- ten sind.

Beispielsweise würde ein Probentropfen mit einem Durchmesser von 3 mm rund 105 Zellen enthalten, die bei einer Fraktionie- rung in beispielsweise fünf Bruchstücke zum größten Teil unbe- einflusst blieben.

Unterhalb der Ablenkeinrichtung 30 ist die Aufnahmeeinrichtung 40 mit einer Vielzahl von Kompartimenten 41 vorgesehen. Die Kompartimente 41 bilden je nach Anwendungsfall Gefäße mit Vo- lumen im ul-bis pl-Bereich oder Strukturen, die in eine Sub- stratoberfläche integriert sind. Allgemein ist die Aufnahme- einrichtung 41 vorzugsweise ein Kryosubstrat, wie es an sich in Zusammenhang mit Kryokonservierungstechniken bekannt ist.

Die Aufnahmeeinrichtung 40 umfasst ferner einen temperierbaren Träger 42, mit dem die Aufnahmeeinrichtung 40 relativ zum da- rüberliegenden Aufbau aus den Komponenten 10 bis 30 beweglich ist (siehe z. B. Figur 12).

Zur Durchführung der erfindungsgemäßen Kryokonservierung wird der Tropfengenerator 10 betätigt, so dass von der Düse 11 min- destens ein Probentropfen, vorzugsweise jedoch eine Folge von Probentropfen nach unten in die Kühleinrichtung 20 abgegeben wird. Jeder Tropfen bildet eine Probe 1, die zur erfindungsge- mäßen Kryokonservierung biologischer Materialien mindestens eine Zelle, Zellgruppe oder Zellbestandteile, eine Nährstoff- lösung und ggf. ein Kryoprotektivum umfasst. Der Durchmesser der Probe 1 liegt im Bereich von z. B. 500 um bis 5 mm, insbe- sondere bei 3 mm.

Der Tropfengenerator 10 kann mit Vorteil mit einer gekühlten Düse 11 betrieben werden. Die Vorkühlung kann bspw. so einge- stellt werden, dass die Probe beim Verlassen der Düse 11 eine Temperatur unterhalb von 0°C, vorzugsweise im Bereich von-3°C bis-10°C oder darunter besitzt. Da die Probe 1 in der Regel eine salzhaltige Nährstofflösung enthält, ist die vorgekühlte Probe noch flüssig.

Im Kühlraum 21 wird die Probe 1 weiter abgekühlt. Die Abküh- lung führt zu einem Einfriervorgang, der allseitig von der Oberfläche der Probe 1 ausgeht und in deren Inneres fort- schreitet. Vorteilhafterweise können Einfriergeschwindigkeiten von bis zu 20°C/s erzielt werden. Alternativ können geringere Einfriergeschwindigkeiten eingestellt werden. Nach Durchlauf des Kühlraums 21 ist die Probe 1 zumindest teilweise gefroren.

Dies bedeutet, dass zumindest die Oberfläche der Probe 1 ge- froren ist, so dass ein nach außen festes Gebilde entsteht, auf das die Ablenkeinrichtung 30 einwirkt.

Die Ablenkeinrichtung 30 wird so betätigt, dass Proben in vor- bestimmter Weise in einzelne Kompartimente 41 abgelenkt werden (siehe zum Beispiel gestrichelte Pfeile). Beispielsweise wer- den Proben nach ihren Eigenschaften sortiert (siehe auch Figur 6) oder in bestimmten quantitativen Verhältnissen in die Kom- partimente 41 gefüllt. Diese Einstellung bestimmter Mengenver- hältnisse in den Kompartimenten kann für Anwendungen bei der Zellkultivierung oder beim sog. Tissue Engineering von Vorteil sein.

Gemäß den Figuren 3 und 4 können Ausführungsformen der erfin- dungsgemäßen Kryokonservierungsvorrichtung dahingehend abge- wandelt sein, dass die Ablenkeinrichtung 30 zwischen der Düse 11 und der Kühleinrichtung 20 (Figur 3) oder in der Kühlein- richtung 20 angeordnet ist. Im letzteren Fall kann sich vor- teilhafterweise ein kompakterer Aufbau der Vorrichtung erge- ben. Im Übrigen können die Komponenten 10 bis 40 und deren Teile aufgebaut sein, wie dies oben unter Bezug auf die Figu- ren 1 und 2 beschrieben wurde.

Figur 5 illustriert eine weitere Abwandlung der Erfindung, bei der die Ablenkeinrichtung 30 einen Sammelbehälter 31 und einen Sortierer 32 umfasst. Bei dieser Ausführungsform dient der Sammelbehälter 31 als Depot, in dem die Proben nach dem Ein- friervorgang in der Kühleinrichtung 20 zunächst gemeinsam fal- len. Aus dem Sammelbehälter 31 werden die Proben mit dem Sor- tierer 32 in die Kompartimente der Aufnahmeeinrichtung 40 überführt. Der Sortierer arbeitet vorzugsweise auf einem me- chanischen Sortierprinzip. Es ist bspw. ein Rüttelsieb vorge- sehen, mit dem gefrorene Proben je nach Größe aus dem Sammel- behälter 31 in die Aufnahmeeinrichtung 40 überführt werden.

Alternativ kann der Sortierer 32 durch ein Kapillarwerkzeug (siehe auch Figur 14) gebildet werden, mit dem gefrorene Pro- ben einzeln oder in Gruppen in die Aufnahmeeinrichtung über- führt werden.

Eine erfindungsgemäße Kryokonservierungsvorrichtung kann des Weiteren gemäß den Figuren 6 und 7 mit einem Tropfenmanipula- tor 50, einem Strömungsgenerator 60 und/oder einer Detektor- einrichtung 70 ausgestattet sein. Diese Komponenten dienen insbesondere der weiteren Gestaltung oder Analyse der Kryopro- ben während des Kühlvorgangs und/oder der selektiven, geordne- ten Ablage in der Aufnahmeeinrichtung.

Der Tropfenmanipulator 50 umfasst eine Tropfenmaske 51 und/oder eine Depositionseinrichtung 52. Die Tropfenmaske 51 bildet in der Bewegungsbahn der Probe von der Düse 11 zur Kühleinrichtung 20 ein teildurchlässiges mechanisches Hinder- nis, z. B. in Form von mindestens einem Steg, mindestens einer Kante oder einem Netz. Die Tropfenmaske 51 kann verschiedene Funktionen einzeln oder in Kombination erfüllen. Erstens kann sie der Zerlegung eines zunächst gebildeten Tropfen 2 in eine Vielzahl einzelner Tropfen 3 dienen, wie es in der unveröf- fentlichten deutschen Patentanmeldung DE 101 29 243.0 be- schrieben ist. Diese Patentanmeldung wird in Bezug auf den Aufbau und die Funktion der Tropfenmaske vollständig durch Be- zugnahme in die vorliegende Patentanmeldung einbezogen. Zwei- tens kann die Tropfenmaske 51 einer weiteren Vorkühlung der Proben dienen. Durch Berührung der Tropfenmaske, die zusätz- lich gekühlt ist, kann den Proben Wärme entzogen werden, so dass sie bei Eintritt in die Kühleinrichtung 20 eine Tempera- tur geringfügig über dem jeweiligen Gefrierpunkt besitzen.

Drittens ist es möglich, dass die Tropfenmaske 51 als Ablenk- einrichtung arbeitet. Die einzelnen Proben 3 können so auf ge- trennte Flugbahnen umgelenkt werden, dass sie in verschiedene Kompartimente der Aufnahmeeinrichtung 40 fallen. In diesem Fall kann ggf. die Ablenkeinrichtung 30 weggelassen werden.

Der Strömungsgenerator 60 (Figur 6) dient einem Abbremsen der mindestens einen Probe 3 in der Kühleinrichtung 20. Der Strö- mungsgenerator 60 umfasst eine oder mehrere Düsen 61, mit de- nen ein Gasstrom durch die Kühleinrichtung 20 aufwärts ge- strömt wird. Der Gasstrom umfasst vorzugsweise das fluide Kühlmedium, das auch zur Kühlung der Proben verwendet wird.

Mit dem Strömungsgenerator 60 können vorteilhafterweise die Fallge- schwindigkeiten der Proben bis zum Stillstand vermindert wer- den. Der Strömungsgenerator 60 kann ferner die Funktion der o. g. Ultraschallhalterung 54 zur Positionierung von Proben vor einer Beschichtungsquelle übernehmen. Mit dem Strömungsge- nerator 60 kann ferner ein kühlender Gasgegenstrom gebildet werden.

An der Kühleinrichtung 20 kann die Detektoreinrichtung 70 vor- gesehen sein, die schematisch in Figur 6 illustriert ist. Die Detektoreinrichtung 70 umfasst einen oder mehrere Sensoren 71, 72, wie z. B. Lichtschranken zur Erfassung der Anwesenheit o- der der Größe von Probentropfen.

Die Depositionseinrichtung 52 (Figur 7) kann zur zusätzlichen Beschichtung der Probe 4 in der Kühleinrichtung 20 vorgesehen sein. Die Depositionseinrichtung 52 umfasst eine Beschich- tungsquelle 53 mit einer Düse, durch die Beschichtungsmaterial auf die Probe 4 gesprüht werden kann. Das Beschichtungsmateri- alkann auch als Gas eingeführt werden, das sich auf der Pro- benoberfläche als Kondensat niederschlägt. Zur zielgenauen Be- schichtung wird die Probe 4 in Höhe der Beschichtungsquelle 53 mit einer Ultraschallhalterung 54 zeitweilig festgehalten (schwebend gehalten). Die Ultraschallhalterung 54 umfasst vor- zugsweise einen an sich bekannten Ultraschalllevitator, mit dem stehende Wellen erzeugt werden, in deren Knoten sich je- weils Proben anordnen können. Als Beschichtungsquelle 53 ist bspw. eine piezoelektrisch betriebene Dosiereinrichtung vorge- sehen. Es können alternativ mehrere Beschichtungsquellen oder Düsen an der Kühleinrichtung 20 vorgesehen sein. Der Strö- mungsgenerator und die Depositionseinrichtung können funktio- nell kombiniert als eine gemeinsame Komponente bereitgestellt werden.

Gemäß Figur 7 kann der Tropfengenerator 10 vorteilhafterweise mit einer Mehrfachdüse 11, 13 ausgestattet sein. Die Mehrfach- düse enthält eine innere Düse 11 zur Bereitstellung von Proben entsprechend den oben beschriebenen Prinzipien. Die äußere, koaxial angeordnete Düse 13 dient der zusätzlichen Zuführung einer Umhüllungsflüssigkeit. Mit dieser wird beim Einfrieren in der Kühleinrichtung 20 bspw. eine zusätzliche Außenschicht 9 erzeugt, wie dies in Figur 14 illustriert ist.

Die Umsetzung der erfindungsgemäßen Kryokonservierung ist nicht zwingend an eine ausschließlich vertikale Probenbewegung gebunden. Dies ist schematisch in den Figuren 8 und 9 illust- riert. Gemäß Figur 8 sind die Düse 11 des Tropfengenerators 10 und der Kühlraum 21 der Kühleinrichtung 20 geneigt, ausgerich- tet und angeordnet, dass die Proben gekrümmte Bewegungsbahnen bilden können. Die Proben werden vom Tropfengenerator 10 unter Druck z. B. unter einem Winkel von 45° schräg nach oben ge- schossen, so dass sie einer ballistischen Flugbahn folgen.

Vorteilhafterweise kann in diesem Fall eine Sortierung der Kryoproben nach der Tropfengröße oder-masse erfolgen. Größere Tropfen fliegen bei gleichem Betriebsdruck des Tropfengenera- tors 10 eine geringere Strecke als kleinere Tropfen, so dass sie entsprechend in verschiedenen Kompartimenten, z. B. 41,42 der Aufnahmeeinrichtung 40 landen. Bei dieser Ausführungsform wird die Ablenkeinrichtung 30 durch (nicht dargestellt) mecha- nische Stelleinrichtungen zur Einstellung der Neigung der Düse 11 und der Kühleinrichtung 20 gebildet.

Gemäß Figur 9 kann alternativ einen horizontale Bewegung von Proben von dem Tropfengenerator 10 durch die Kühleinrichtung 20 zur Aufnahmeeinrichtung 40 erfolgen. Zur Einstellung der Bewegungsbahn (gestrichelte Linie) ist eine Düse 62 vorgese- hen, aus der ein Trägerfluid ausströmt (Pfeil), das ein Absin- ken von Proben verhindert. Das Trägerfluid ist vorzugsweise mit dem Kühlmedium in der Kühleinrichtung 20 identisch. Alter- nativ kann ein flüssiges Trägerfluid vorgesehen sein. Die Ab- lenkeinrichtung 30 umfasst eine Vielzahl von Barrieren, von denen beispielhaft nur eine Barriere 33 beim Kompartiment 43 illustriert ist. Jede Barriere 33 umfasst eine Wand oder einen vom Kühlmedium durchströmbaren Gegenstand (z. B. ein Netz), mit dem gefrorene Proben aus der Bewegung vom Trägerfluid in das Kompartiment 43 ablenkbar sind. Die Barriere 33 ist bspw. entsprechend dem Doppelpfeil beweglich. Die Funktion der Bar- rieren kann alternativ durch zusätzliche Gasströme zum Auslen- ken von Kryoproben in die Kompartimente gebildet werden.

Die Figuren 10 bis 12 illustrieren verschiedene Ausführungs- formen erfindungsgemäßer Kryokonservierungseinrichtungen, die je nach Anwendung (z. B. mobil oder stationär) oder Aufgabe verschieden aufgebaut sein können. Beispielsweise ist die Vor- richtung gemäß Figur 10 besonders vorteilhaft als mobiles Ge- rät, z. B. in der Sammlung von Zellen in der klinischen Medizin oder in der Viehwirtschaft (Veterinärmedizin) anwendbar.

Die erfindungsgemäße Kryokonservierungsvorrichtung gemäß Figur 10 umfasst den Tropfengenerator 10, die Kühleinrichtung 20 und die Aufnahmeeinrichtung 40 (siehe schematischer Aufbau in Fi- gur 1). Der Tropfengenerator 10 umfasst eine Düse 11 (z. B. Pi- pettenspitze), die mit einem Trichter 12 verbunden ist. Im Trichter 12 ist eine Suspension 6 (Nährstofflösung, Kryopro- tektivum) mit biologischem Material 5 (z. B. Zellen) angeord- net. Der Trichter 12 sitzt in einer Fassung 14, an deren unte- ren Ende ein Fallrohr 15 befestigt ist, das durch die Kühlein- richtung 20 ragt. Der Tropfengenerator 10 kann des Weiteren mit der schematisch illustrierten Vorkühleinrichtung 16 aus- gestattet sein, mit der eine Thermostatierung oder Vorkühlung bei der Tropfenerzeugung erfolgt. Die Vorkühleinrichtung 16 kann mit kaltem Wasser oder bereits mit flüssigem Stickstoff betrieben werden.

Die Kühleinrichtung 20 umfasst den Kühlraum 21, der durch das Fallrohr 15 umgrenzt wird, und die Kühlmediumquelle 22. Die Kühlmediumquelle 22 ist ein Behälter für flüssigen Stickstoff, der das Fallrohr 15 umgibt. Die Kühlmediumquelle 22 ist nach Art eines Dewar-Gefässes mit einem Vakuummantel 23 und Iso- liermaterial 24 thermisch von der Umgebung isoliert. Die Kühl- mediumquelle 22 ist mit mindestens einem Verbindungsrohr 25 ausgestattet, über das flüssiger Stickstoff in den Behälter einfüllbar oder Stickstoffdampf austreten kann.

Die Aufnahmeeinrichtung 40 umfasst ein einzelnes Kompartiment 41, das als Aufnahmebehälter für die Kryoproben dient. Das Kompartiment 41 wird beispielsweise mit festem Kohlendioxid oder einem weiteren Vorrat aus flüssigem Stickstoff gekühlt und gegenüber der Umgebung mit Isolationsmaterial thermisch isoliert.

Zum mobilen Einsatz in der Medizin oder Tiermedizin wird bei- spielsweise eine Blutprobe suspendiert und in den Trichter 12 eingeführt. Von der Düse 11 löst sich eine Tropfenfolge. Die herabfallenden Tropfen 1 gefrieren auf ihrem Weg durch das Fallrohr, das beispielsweise eine Länge von 50 cm besitzt. In diesem Fall ist das gasförmige Kühlmedium die durch Konvektion und Wärmeaustausch mit der Kühlmediumquelle 22 gekühlte Luft im Kühlraum 21. Die gefrorenen Kryoproben werden in Sphäroid- form (z. B. im wesentlichen Kugelform) im Kompartiment 41 ge- sammelt. Wenn die gesamte Suspension durchgelaufen ist, kann das Kompartiment 41 von der Kühleinrichtung 20 getrennt (z. B. abgeschraubt), verschlossen und einer weiteren Nutzung zuge- führt werden. Es kann beispielsweise eine Verschickung im ge- kühlten Zustand erfolgen. Für ein störungsfreies Gefrieren des fallenden Tropfens 1 muss das Fallrohr vertikal ausgerichtet sein, so dass der Tropfen nicht die Wand des Fallrohrs 15 be- rührt. Die Ausrichtung erfolgt je nach Art eines verwendeten Haltegestells z. B. mit einer Wasserwaage oder durch Selbstjus- tierung. Als Haltegestell kann beispielsweise ein Dreibein verwendet werden, in dessen Mitte die Kryokonservierungsvor- richtung an einem einzelnen Punkt aufgehängt ist, so dass sie lotrecht vertikal ausgerichtet ist.

Eine alternative Ausführungsform einer Kryokonservierungsvor- richtung mit einem Tropfengenerator 10, einer Kühleinrichtung 20 und einer Aufnahmeeinrichtung 40 ist in Figur 11 in schema- tischer Schnittdarstellung gezeigt. Die Kryokonservierungsvor- richtung gemäß Figur 11 ist ebenfalls für den mobilen oder stationären Einsatz geeignet.

Der Tropfengenerator 10 umfasst gemäß Figur 11 eine Düse 11 (z. B. geformt wie eine Pipettenspitze) und einen Trichter 12 zur Aufnahme einer Suspension mit dem biologischen Material.

An der Oberseite der Kühleinrichtung 20 kann eine Heizeinrich- tung vorgesehen sein, mit der ein Einfrieren der Düse 11 ver- hindert wird.

Die Kühleinrichtung 20 umfasst einen Kühlraum 21, der aus ei- ner Vielzahl zylinderförmiger Segmente zusammengesetzt ist, deren Durchmesser sich im Verlauf der vertikal gebildeten Fallstre- cke nach unten hin verringert. Die Kühlmediumquelle 22 wird durch ein Reservoir für flüssigen Stickstoff gebildet, das ge- mäß einer ersten Variante in thermischem Kontakt mit dem Kör- per der Kühleinrichtung 20 steht. Dieser besteht aus einem Ma- terial mit hoher Wärmeleitung, z. B. Kupfer. Gemäß einer zwei- ten Variante kann eine direkte Kühlung z. B. mit Dampf des flüssigen Stickstoffs erfolgen, indem der Dampf in den Kühl- raum 21 geleitet wird.

Die Kühleinrichtung 20 ist ferner mit einem Strömungsgenerator ausgestattet (siehe Figur 6), der eine Druckgasquelle 62 und eine Vielzahl von Düsen 61 aufweist, die ringförmig an den Segmenten des Kühlraums 21 angebracht sind. Aus Übersichtlich- keitsgründen sind die Düsen 61 nur beim obersten Segment ge- zeigt. Von der Druckgasquelle 62 wird über Düsenleitungen 63 ein Träger-oder Prozessgas zu den Düsen 61 geleitet. Die Dü- senleitungen 63 sind im Körper der Kühleinrichtung 20 gebil- det, so dass das Träger-oder Prozessgas in den Düsenleitungen 63 gekühlt wird und zum Einfriervorgang beiträgt. Mit der Druckgasquelle 62 wird beispielsweise als inertes Trägergas Stickstoff bei Raumtemperatur und einem erhöhten Druck (z. B.

50 mbar bis 100 mbar) bereitgestellt.

Durch die Düsen 61 des Strömungsgenerators wird im Kühlraum 21 ein nach oben gerichteter Gegenstrom gebildet, der vorteil- hafterweise ein Strömungsprofil besitzt. Am äußeren Rand der Segmente ist die Strömungsgeschwindigkeit besonders hoch, wäh- rend entlang der mittleren Achse des Kühlraums 21 eine gerin- gere Gegenstromgeschwindigkeit herrscht.

In den oberen Segmenten wird ein stärkerer Gegenstrom als in den unteren Segmenten eingestellt. Dieser bewirkt erstens eine starke Abkühlung der tropfenförmigen Proben. Wenn an der Düse 11 Tropfen mit einer Größe abgegeben wurden, für die ein Ge- frieren beim Durchlauf der Kühleinrichtung nicht sicherge- stellt ist, ergibt sich zweitens durch den Gegenstrom die zu- sätzliche Wirkung, dass die Tropfen in kleinere Teiltropfen zerfallen.

Gemäß einer abgewandelten Ausführungsform kann der Strömungs- generator 60 auch aus zwei Teilsystemen bestehen. Das erste Teilsystem erzeugt in den oberen Segmenten den Gegenstrom. Das zweite Teilsystem bildet eine Depositionseinrichtung (siehe Figur 7). Beispielsweise kann im untersten Segment des Kühl- raums 21 als Prozessgas CO2 eingeführt werden, das auf den ge- frorenen Probenkugeln kondensiert und gefriert. Es wird eine CO2-Beschichtung erzielt, die einer zusätzlichen Qualitätssi- cherung bei der Überwachung der Lagerungsbedingungen dient.

Ferner ist es möglich, die Ausrichtung der Düsen 61 relativ zur vertikalen Mittelachse des Kühlraums 21 verschieden steil auszubilden, um dem Gegenstrom in den verschiedenen Teilen des Kühlraums 21 verschieden starke Wirkungen zu verleihen.

Die am Ende der Fallstrecke angeordnete Aufnahmeeinrichtung 40 umfasst mindestens ein Kompartiment 41 und ist vorzugsweise abtrennbar und verschließbar am unteren Ende der Kühleinrich- tung 20 angebracht.

Figur 12 zeigt eine erfindungsgemäße Kryokonservierungsvor- richtung, wie sie dem schematischen Aufbau gemäß Figur 2 ent- spricht, mit weiteren Einzelheiten. Die Düse 11 mit einem flüssigen Probenreservoir aus biologischem Material 5 und Sus- pension 6 (Nährstofflösung, Kryoprotektivum) ragt bei dieser Gestaltung in die Kühleinrichtung 20 hinein. Der Kühlraum 21 wird durch ein oben und unten offenes Rohr gebildet. Die Kühl- mediumquelle 22 ist auf der Außenseite des Rohres angeordnet.

Die Kühlung der Probe 1 erfolgt ausschließlich konvektiv über das im Rohr befindliche Gas (z. B. Luft). Die Ablenkeinrich- tung 30 wird durch eine mechanische Rutsche 31 am unteren En- des des Kühlraums 21 gebildet. Die Rutsche 31 ist mit einer (nicht dargestellten) mechanischen Stelleinrichtung so ver- stellbar, dass eine auf ihr abrollende Kryoprobe 7 jeweils in einem vorbestimmten Kompartiment 41 der Aufnahmeeinrichtung 41 landet.

Die Aufnahmeeinrichtung 40 umfasst ferner den temperierbaren Träger 42, der eine Halterung für die Kompartimente 41 bildet, und eine Steuereinrichtung 43 zur Bewegung der Aufnahmeein- richtung 40 relativ zur Kühleinrichtung 20. Die Stelleinrich- tung 43 kann mit der Stelleinrichtung der Rutsche 33 zusammen- wirken, um das geordnete Ablegen von Kryoproben in bestimmten Kompartimenten 41 sicherzustellen. Die Stelleinrichtung 43 kann ferner zur Rotation der Aufnahmeeinrichtung 40 um eine vertikale Achse eingerichtet sein. Der Träger 42 kann einen Heiz-oder Kühltisch bilden, der die weitere Kühlung der ge- ordnet abgelegten Kryoproben oder nach einer Lagerung ein de- finiertes Auftauen ermöglicht.

Die Kompartimente 41 sind bspw. die Reservoire einer gekühlten Mikro-oder Nanotiterplatte, die mit dem Träger 42 temperier- bar ist. Alternativ können die Kompartimente 41 und der Träger 42 integral als strukturiertes Substrat gebildet sein, auf dem die Probenablage erfolgt.

Erfindungsgemäß kann eine Modifizierung der inneren Oberflä- chen der Kompartimente 41 vorgesehen sein, um ein Anhaften der gefrorenen Proben zu vermindern oder auszuschließen. Vorteil- hafterweise können dann die Proben leichter aus den Komparti- menten 41 entnommen werden. Die Oberflächenmodifizierung um- fasst bspw. die Aufbringung einer molekularen Schicht aus ei- ner Substanz, die beim Auftauen hydrophob ist, oder einer Na- no-oder Mikrostrukturierung.

Figur 13 zeigt eine Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Kryokonservierungsvorrichtung, mit der gefrorene Probentropfen mit einer abgeplatteten Sphäroidform hergestellt werden. Die Kryokonservierungsvorrichtung umfasst entsprechend den oben erläuterten Prinzipien einen Tropfengenerator 10, eine Kühl- einrichtung 20, eine Ablenkeinrichtung 30 und eine Aufnahme- einrichtung 40. Im Unterschied zu den oben erläuterten Ausfüh- rungsformen besitzt die Kühleinrichtung 20 ein plattenförmiges Substrat 26 mit einer hydrophoben Oberfläche. Der Halbraum über dem Substrat 26 bildet den Kühlraum, in den von einer Kühlmediumquelle (nicht dargestellt) das gas-oder dampfförmi- ge Kühlmedium geleitet wird. Die Ablenkeinrichtung 30 wird durch ein mechanisches Werkzeug, z. B. einen mechanischen Schieber 32 gebildet.

Zur Kryokonservierung von Suspensionsproben werden mit dem Tropfengenerator 10 auf der Oberfläche des Substrats 26 ein- zelne Tropfen abgelegt. Wegen der hydrophoben Oberfläche be- halten die Tropfen unter der Wirkung der eigenen Oberflächen- spannung im Wesentlichen eine Sphäroidform bei. Lediglich im Bereich der Kontaktfläche mit der Oberfläche des Substrates 26 ist eine Abplattung gebildet. Unter der Wirkung des Kühlmedi- ums gefrieren die Suspensionstropfen im ruhenden, entspannten Zustand. Anschließend werden die gefrorenen Proben mit der Ab- lenkeinrichtung 30 an die verschiedenen Kompartimente 41 der Aufnahmeeinrichtung 40 überführt.

Die in Figur 13 illustrierte Ausführungsform besitzt eine Rei- he von besonderen Vorteilen. So kann die Funktion der Kühlein- richtung (direkte Kühlung mit Kühlmedium) mit einer Kühlung durch das Substrat 26 kombiniert werden. Die Proben werden auch dann durch unmittelbare Einwirkung des Kühlmediums (z. B.

Luft) in einem Zustand gefroren, in dem die Proben unter der Wirkung der eigenen Oberflächenspannung eine abgeplattete Sphäroidform bilden. Eine Fallstrecke wie bei den oben be- schriebenen Ausführungsformen kann vermieden werden. Den Pro- bentropfen können noch vor dem Gefrieren Zusatzstoffe beige- fügt werden. Dies erfolgt beispielsweise mit einem piezoelekt- rischen Dosiersystem. Als Zusatzstoff wird beispielsweise als Kryoprotektivum konzentriertes DMSO (Dimethylsulfoxid) zuge- setzt. Ein weiterer Vorteil besteht in der geringen Kontakt- fläche zwischen gefrorener Probe und Substrat 26, die ein Trennen vom Substrat erleichtert.

Die in Figur 13 illustrierte Ausführungsform kann in Bezug auf die Gestalt des Substrats 26 modifiziert werden. Als Substrat kann eine Düsenplatte mit einer regelmäßigen Anordnung von Gasaustrittsdüsen vorgesehen sein, durch die ein gasförmiges Trägerkissen für die Probentropfen gebildet wird. Auf dem Trä- gerkissen erfolgt die Kryokonservierung unter Einwirkung eines gas-oder dampfförmigen Kühlmediums. Das Kühlmedium kann eben- falls über die Düsenplatte eingeleitet werden.

Figur 14 illustriert ein Beispiel für den Transport und die Manipulation einer gefrorenen Probe 8 mit einem Kapillarwerk- zeug 80. Die Probe 8 umfasst einen Flüssigkeitstropfen mit biologischem Material 5 und einer Suspensionsflüssigkeit 6 (Nährstofflösung, Kryoprotektivum), die jeweils gefroren sind.

Bei Bildung einer mehrkomponentigen Probe ist des Weiteren ei- ne äußere Beschichtung 9 vorgesehen. Die Beschichtung 9 um- fasst eine Umhüllung zur Immobilisierung der Probe nach dem Auftauen, z. B. aus einem Alginat oder Chelat, wie dies aus der Implantationsmedizin bekannt ist.

Das Kapillarwerkzeug 80 umfasst eine Kapillare 81 mit einem Hohlraum 82, der mit einem Unterdruck beaufschlagt werden kann. Unter der Wirkung des Unterdrucks wird die Probe 8 am Ende der Kapillare 81 festgehalten. Das Kapillarwerkzeug 80 erlaubt eine zielgenau Aufnahme und Ablage von Proben insbe- sondere in automatisierten Geräten. Die gefrorene Probe 8 kann mit Vorteil durch eine Atmosphäre mit einer vorbestimmten che- mischen Zusammensetzung bewegt werden, um das Objekt durch Sublimation des Beschichtungsmaterials 9 in die Atmosphäre oder durch Deposition von Materialien aus der Atmosphäre auf die Oberfläche der Probe 8 zu verändern. Damit können durch Abscheiden von Material auf der Probenoberfläche ein weiterer Schutz für den Transport oder bestimmte mechanische Eigen- schaften nach dem Auftauen erzielt werden.

Figur 15 illustriert, dass mit der erfindungsgemäßen Kryokon- servierungsvorrichtung gefrorene Probentropfen 8 direkt oder über eine Koppelflüssigkeit 10 zu Aggregaten verknüpft werden können. Die Aggregate werden bspw. in der Kühleinrichtung oder in Kompartimenten 41 der Aufnahmeeinrichtung gebildet. Diese Kopplungen ermöglichen vorteilhafterweise die Festlegung von bestimmten Zellkombinationen.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Zeichnungen und den Ansprüchen offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in Kombination für die Verwirklichung der Er- findung in ihren verschiedenen Ausgestaltungen von Bedeutung sein.