Asimismo permite la visualización del fenómeno de cristalización y los fenómenos de birrefringencia utilizando polarizadores cruzados y facia acceso a la disolución para recoger los cristales.

ESTADO DE LA TECNICA La cristalización de compuestos biológicos, inorgánicos y sintéticos es un requisite importante para muchas líneas de investigación en la industria <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> química, farmacéutica, biomédica y biotecnológica. Esta cristalización suele hacerse a partir de sus disoluciones sobresaturadas. Para conseguir la sobresaturacion, se utilizan distintos mecanismos tales como la evaporación, la variación de temperatura, el cambio de solubilidad, el cambio de presion, etc. Mediante esos mecanismos se incrementa la sobresaturación de la disolución hasta que se produce la precipitación de la fase solda.

Sin embargo, lo importante para disminuir la densidad de nucleación de cristales y el tamaño y calidad de los mismos es la velocidad a la que la sobresaturación es incrementada (J. M. García-Ruiz, Counterdiffusion methods for protein crystallisation. Methods in Enzimology 368 (2003) 130- 154). Dicha velocidad no se puede controlar con los dispositivos de cristalización existentes en el mercado.

Actualmente la cristalización de monocristales de macromoléculas biológicas se Ileva a cabo en dispositivos disponibles comercialmente a tal fin, entre ellos :

1) Cajas Limbro y tipo Limbro, que son una placas de material plástico (poliestireno o policarbonato) que tienen entre 24, 96 o más pocillos de varios mililitros de volumen que se cierra por medio de una tapa de ! mismo material plástico. En cada pocillo se puede introducir una disolución del compuesto a cristalizar o de un reactive y cada pocillo puede cubrirse individualmente mediante un cubre de vidrio (A. Ducruix and R. Giege, in "Crystallisation of Nucleic Acids and Proteins : A Practical Approach" (A.

Ducruix and R. Giege, eds), p. 121, IRL Press at Oxford University, 1999) 2) Cajas de tipo Nextal que tienen 24 pocillos de varios mililitros de volumen que se cierran mediante rosca. Todo el conjunto está realizado en plastic.

3) Dispositivos de cristalización conocidos como Granada Crystallization Box (patentes ES-2 172 363 y ES-2 164 032 y J. M. García-Ruiz, L. A. González- Ramirez, J. A. Gavira and F. Otálora. Granada Crystallisation Box : a new device for protein crystallisation by counter-diffusion techniques. Acta Crystallographica D58 (2002) 1638-1642.

4) Botones de diálisis (A. McPherson,"Crystallisation of Biological Macromolecules"Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999).

El problema técnico que pretende resolver la presente invention es que no existen actualmente dispositivos comericiales específicos para la cristalización de compuestos de pequeñas moléculas.

EXPLICACION DE LA INVENCION EI objeto de la presente invención es un dispositivo (botón) de cristalización formado por los siguientes elementos : a) cuerpo macho de geometría cilíndrica, prismática o piramidal fabricado en un material químicamente inerte a cualquier disolvente que pueda utilizarse en cristalización de proteins con un extreme cerrado que presenta una superficie plana de vidrio de calidad óptica soldada al cuerpo de material inerte y otro extreme abierto proviso de un remate roscado con una junta de estanqueidad ("0-ring") b) cuerpo hembra de geometría cilíndrica, prismática o piramidal fabricado en un material químicamente inerte a cualquier disolvente que pueda utilizarse en cristalización de proteins con un extreme abierto proviso de un remate roscado que se copia con el correspondiente extreme roscado del cuerpo macho y otro extreme cerrado que presenta, soldada al cuerpo de material inerte, una superficie plana de vidrio de calidad óptica sobre la cual se sitúan al menos dos válvulas u orificios que permien comunicar el interior del bouton con la atmósfera cuando el cuerpo macho y hembra roscados forman un conjunto estanco.

Los cuerpos macho y hembra estran fabricados en materiales químicamente inertes a todo tipo de disolventes tanto polares próticos como agua, metanol o ácido acético, ó dipolares apróticos como el nitrobenceno o el acetonitrilo, o apolares apróticos como el hexano o el benceno. En particular, los cuerpos macho y hembra están fabricados en teflon o también puede el cuerpo macho estar fabricado en vidrio.

Constituye asimismo objeto de la presente invención un procedimiento de utilización de dicho botón de cristalización que comprende las siguientes etapas :

a) disolución del compuesto a cristalizar en un disolvente apropiado formando una disolución aproximadamente saturada. b) Colocación de una gota de la disolución preparada en la etapa anterior en la superficie plana de vidrio de calidad óptica del cuerpo macho del botón. c) Cierre de ! cuerpo macho con el cuerpo hembra dey bouton mediante roscado. d) Apertur de al menos una de las válvulas u orificios situados en el cuerpo hembra del botón para permitir la evaporación de la disolución. e) Seguimiento del proceso de nucleación cristalina mediante observación del botón al microscopio. f) Cierre de las válvulas u orificios abiertos en las etapas anteriores cuando se comienza a observar la nucleación cristalina. g) Una vez alcanzado el equilibrio y se ha detenido el crecimiento cristalino, apertur del botón y recogida de los monocristales.

Cuando se utiliza la técnica de cambio de temperatura, el procedimiento de utilización del botón de cristalización comprende las siguientes etapas : a) disolución del compuesto a cristalizar en un disolvente apropiado formando una disolución aproximadamente saturada a temperatura ambiente To. b) Colocación de una gota de la disolución preparada en la etapa anterior en la superficie plana de vidrio de calidad óptica del cuerpo macho del boton. c) Cierre del cuerpo macho con el cuerpo hembra del botón mediante roscado. d) verre de las válvulas situadas en el cuerpo hembra del botón para impedir la evaporación de la disolución.

e) Colocación del dispositivo a una temperatura T1 menor que la ambiente durante u tiempo suficiente para que la disolución alcance dicha temperatura T1 f) Seguimiento del proceso de nucleación cristalina mediante observación del botón al microscopio. g) Una vez alcanzado el equilibrio y se ha detenido el crecimiento cristalino, apertur del botón y recogida de los monocristales.

En todos lo casos, los disolventes utilizados pueden ser de cualquier tipo, tanto polares próticos como agua, metanol o ácido acético, ó dipolares apróticos como el nitrobenceno o el acetonitrilo, o apolares apróticos como el hexano o el benceno.

BREVE DESCRIPCION DE LA FIGURA Figura 1 : Representación de un bouton de cristalización en la cual : (1) corresponde a las superficies de vidrio piano de calidad óptica tanto en el cuerpo macho como en el cuerpo hembra.

(2) corresponde a las válvulas u orificios de evaporacion.

(3) corresponde a los cuerpos macho y hembra fabricados en un material químicamente inerte.

(4) corresponde a la junta de estanqueidad colocada en el cuerpo macho.

(5) corresponde a los roscados tanto en el cuerpo macho como en el hembra.

DESCRIPCION DETALLADA Y MODO DE REALIZACI#N DE LA INVENCION El objeto de la presente invención es un dispositivo (botón) de cristalización que permite controlar el grado de sobresaturación de una disolución de pequeño volumen mediante el control active de su temperatura y de la evaporación de la misma.

El botón está diseñado para la cristalización de compuestos de pequeñas moléculas pero que también puede ser usado para la cristalización de macromoléculas. El concepto se basa en las siguientes propiedades : 1. Este dispositivo permite ei use de cualquier tipo de solvente, sea polar o polar.

2. Este dispositivo permite usar la técnica de mezcla directa 3. Este dispositivo permite usar la técnica de evaporación 4. Este dispositivo permite usar la técnica de cambio de temperatura 5. Este dispositivo permite combinar las tres técnicas anteriores 6. Este dispositivo permite la visualización del fenómeno de cristalización y los fenómenos de birrefringencia utilizando polarizadores cruzados.

7. Este dispositivo permite ex facia acceso a la disolución para recoger los cristales El dispositivo (botón) consta de dos cuerpos macho y hembra que se enroscan entre ellos (ver Figura 1). Cada cuerpo tiene una superficie plana de vidrio de calidad óptica (1) que esta soldado al cuerpo en si (3) fabricado de teflon o de un material que sea químicamente inerte a disolventes ácidos o básicos, polares o no polares, alcoholes, cetonas, dimetilsulfoxido, y en general cualquier disolvente que pueda utilizarse en cristalización de proteins. La soldadura o union entre la pieza de teflon y el vidrio de calidad optic debe ser tal que se asegure la estanqueidad del cuerpo. La estanqueidad de los dos cuerpos una vez enroscados se asegura con una junta de estanqueidad (4) (O-ring) colocada en el cuerpo macho. Ei cuerpo hembra Ileva colocadas en la parte de teflón al menos dos válvulas u orificios (2) que permien comunicar el interior del dispositivo con la atmósfera de tal forma que se pueda producir evaporación del disolvente interior si se desea.

Ei cuerpo macho puede ser también sólo de vidrio siempre y cuando pueda unirse al cuerpo hembra asegurando la estanqueidad del dispositivo y tenga

de base una superficie de calidad óptica para permitir la observación microscopica.

Se indican a continuación ejemplos de utilización de los botones de cristalización : Ejemplo de utilización 1 para un compuesto inorganic de molécula pequeña : 1. Se prepara una disolución acuosa saturada de sulfato cálcico a temperatura de 50 °C mediante cualquiera de los procedimientos habituates.

2. Se toma unos microlitros de la disolución anterior con una micropipeta, pipeta o jeringa o cualquier aparato adecuado para ello.

Se vierte entre 10 nanolitros y 100 microlitros de la disolución saturada en el macho del dispositivo.

3. Se cierra el dispositivo herméticamente con la hembra.

4. Se traslada el dispositivo al microscopio o lupa binocular a temperatura ambiente y se observa que no se ha producido precipitacion.

5. Se abren las válvulas situadas en la hembra para que se evapore la disolución saturada y se sobresature.

6. Cuando se observa con ei microscopic o lupa binocular que se comienza a producir la cristalización se cierra las válvulas.

Ejemplo de utilización 2 para un compuesto organic de molécula pequeña : 1. Se prepara una disolución aproximadamente saturada de ecteinascidin-743 a temperatura ambiente disolviendo 15 mg de ecteinascidin-743 en 1 mililitro de una mezcla de isopropanol/agua a una proporción en volumen de 19/1.

2. Se toma unos microlitros de la disolución anterior con una micropipeta, pipeta o jeringa o cualquier aparato adecuado para ello.

Se vierte entre 10 nanolitros y 100 microlitros de la disolución saturada en el macho del dispositivo.

3. Se cierra el dispositivo herméticamente con la hembra.

4. Se traslada el dispositivo al microscopio o lupa binocular a temperatura ambiente y se observa que no se ha producido precipitacion.

5. Se abren las válvulas situadas en la hembra para que se evapore la disolución saturada y se sobresature.

6. Se traslada el dispositivo a una nevera o refrigerador a una temperatura de 4°C.

7. Se observa periódicamente si la solución ha precipitado.

8. Cuando se observa con ei microscopic o lupa binocular o a simple vista que se comienza a producir la cristalización se cierran las valvulas.

Ejemplo de utilización 3 para un compuesto macromolecular : 1. Se prepara una disolución aproximadamente saturada de lisozima de huevo de gallina a temperatura ambiente disolviendo 25 mg de lisozima en 350 microlitros de una disolución tampón de acetate sódico (pH=4. 7) a la que se panade 350 microlitros de una solucion de NaCl al 10% en peso/volumen.

2. Se toma unos microlitros de la disolución anterior con una micropipeta, pipeta o jeringa o cualquier aparato adecuado para ello.

Se vierte entre 10 nanolitros y 100 microlitros de la disolución saturada en el macho del dispositivo.

3. Se cierra el dispositivo herméticamente con la hembra.

4. Se traslada el dispositivo al microscopio o lupa binocular a temperatura ambiente y se observa que no se ha producido precipitacion.

5. Se abren las válvulas situadas en la hembra para que se evapore la disolución saturada y se sobresature.

6. Cuando se observa con el microscopio o lupa binocular que se comienza a producir la cristalización se cierran las válvulas.