PISCIRICKETTSIA SALMONIS

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se enmarca dentro del campo de la biotecnología y corresponde a un nuevo medio de cultivo líquido libre de células. El medio de cultivo permite el crecimiento de la bacteria Piscirickettsia salmonis en un menor periodo de tiempo, a través del aporte nutricional de componentes mínimos definidos con concentraciones ajustadas a su demanda. Lo anterior, permite alcanzar una alta concentración de biomasa con un mayor rendimiento. El fenotipo bacteriano obtenido en el medio definido libre de células conserva los niveles de virulencia observada en los sistemas tradicionales de cultivo. Por tanto, esta tecnología sustenta el desarrollo de un nuevo proceso más rápido, menos costoso y con un producto de igual o mejor calidad, que los sistemas actuales, para obtener la biomasa requerida para las formulaciones de vacunas tanto orales como inyectables.

ESTADO DEL ARTE

La alta expansión espacial y lo intensivo de los cultivos de salmones ha propiciado la propagación de enfermedades que han mermado gravemente la producción. El confinado espacio de los sectores de cultivo, las lentas dinámicas de recambio de agua en los sistemas de canales, la cercanía entre centros de cultivos, las altas densidades de peces cultivados por jaula y la depresión inmunológica que se producen en los peces sometidos a estas condiciones, explican en gran medida los explosivos episodios etiológicos en la salmonicultura. Entre los organismos patógenos de alta incidencia en la acuícultura encontramos a virus, bacterias, algunos hongos y parásitos, destacándose entre estos: el Virus de la Necrosis Pancreática Infecciosa-IPN, el Virus de la Anemia del Salmón-ISAV (Kibenge, F. S. B., Godoy, M. G., Fast, M., Workenhe, S., & Kibenge, M. J. T. (2012). Countermeasures against viral diseases of farmed fish. Antiviral Research, 95(3), 257-281), el hongo Saprolegnia parasítica (Zaror, L, Collado, L., Bohle, H., Landskron, E., Montaña, J., & Avendaño, F. (2004). Saprolegnia parasítica en salmones y truchas del sur de Chile. Archivos de Medicina Veterinaria, 36(1), 71-78), así como bacterias Gram-negativas como Aeromonas salmonicida (Balcázar, J. L, Vendrell, D., de Blas, I., Ruiz-Zarzuela, I., Gironés, O., & Múzquiz, J. L. (2007). Quantitative detection of Aeromonas salmonicida in fish tissue by real-time PCR using self-quenched, fluorogenic primers. Journal of Medical Microbiology, 56(3), 323-328), Vibrio ordalii (Bohle, H., Kjetil, F., Bustos, P., Riofrío, A., & Peters, C. (2007). Fenotipo atípico de Vibrio ordalii, bacteria altamente patogénica aislada desde salmón del Atlántico cultivado en las costas marinas del sur de Chile. Archivos de Medicina Veterinaria, 39(1), 43-52), Flavobacterium columnare (Bader, J. A., & Shotts Jr, E. B. (1998), Identification of Flavobacterium and Flexibacter species by species-specific polymerase chain reaction primers to the 16S ribosomal RNA gene, Journal of Aquatic Animal Health, 10(4), 311-319) y últimamente la aparición de la bacteria Francisella piscicida, anteriormente conocida como UA2 (Birkbeck, T. H., Bordevik, M., Fraystad, M. K., & Baklien, A. (2007), Identification of Francisella sp. from Atlantic salmón, Salmo salar L, in Chile. Journal of Fish Diseases, 30(8), 505-507), además de la Gram-positiva Renibacterium salmoninarum (Sanders, J. E., & Manuel José, B. R. (1986), Evidence by the fluorescent antibody test for the occurrence of Renibacterium salmoninarum among salmonid fish in Chile, Journal of Wildlife Diseases, 22(2), 255-257). Pero sin lugar a dudas el patógeno de mayor relevancia que ha mostrado una mayor agresividad y persistencia desde su aparición es la bacteria Piscirickettsia salmonis (Fryer, J. L, & Hedrick, R. P. (2003), Piscirickettsia salmonis: a Gram-negative intracellular bacterial pathogen of fish, Journal of Fish Diseases, 26(5), 251-262; Marshall, S. H., Conejeros, P., Zahr, M., Olivares, J., Gómez, F., Cataldo, P., & Henríquez, V. (2007), Immunological characterization of a bacterial protein isolated from salmonid fish naturally infected with Piscirickettsia salmonis, Vaccine, 25(11), 2095-2102. doi:http://dx.doi.org/10.1016/j.vaccine.2006.11.035), al cual se le atribuye un 94 y un 88% de las mortalidades por patologías en salmón del atlántico y trucha arcoíris respectivamente durante el año 2013 en Chile (SERNAPESCA. (2014). Informe sanitario de salmonicultura en centros marinos año 2013. http://www.sernapesca.cl/index.php?option=com_remository& ;ltemid=246&func=fileinfo&id=8 014). En Chile el Síndrome Ricketsial del salmón (SRS), causado por la bacteria Piscirickettsia salmonis, ha generado pérdidas económicas que han superado los US$ 150 millones debido a la aparición de constantes brotes y se estima que la mortalidad asociada al SRS bordea el 15% de la biomasa de la industria nacional (Sánchez, V., (2003). Piscirickettsiosis: El desafío de mantener el control. Aquanoticias Internacional 80: 57-62). También la enfermedad se ha registrado en países como Escocia, Irlanda, Noruega y en la Costa del Pacífico de Canadá (Kuzyk, M. A., Thorton, J. C, & Kay, W. W. (1996), Antigenic characterization of the salmonid pathogen Piscirickettsia salmonis, Infection and Immunity, 64(12), 5205-5210), donde las pérdidas económicas han sido bastante considerables, pero nunca en el nivel en que se ha visto afectada la producción en Chile (Almendras, F. E., Fuentealba, I. C, Jones, S. R. M., Markham, F., & Spangler, E. (1997), Experimental infection and horizontal transmission of Piscirickettsia salmonis in freshwater-raised Atlantic salmón, Salmo salar L. Journal of Fish Diseases, 20(6), 409-418). De esta manera, no solamente especies salmonídeas se han visto afectadas por la presencia de P. salmonis, sino que también se ha detectado la presencia de este patógeno en especímenes de Corvina Blanca (Atractoscion nobilis) en la costa del sur de California (Arkush, K. D., McBride, A. M., Mendonca, H. L, Okihiro, M. S., Andree, K. B., Marshall, S., Hedrick, R. P. (2005). Genetic characterization and experimental pathogenesis of Piscirickettsia salmonis isolated from white seabass Atractoscion nobilis, Diseases of Aquatic Organisms, 63(2), 139-149). Especímenes de Lubina europea (Dicentrarchus labrax) en Grecia, se han visto afectados por un patógeno muy similar a P. salmonis (Athanassopoulou, F., Groman, D., Prapas, T., & Sabatakou, O. (2004), Pathological and epidemiológica! observations on rickettsiosis in cultured sea bass (Dicentrarchus labrax L) from Greece, Journal of Applied Ichthyology, 20(6), 525-529) y asimismo, se ha reportado que en Hawai, poblaciones de Tilapia (Oreochromis mossambicus y Sarotherodon melanotheron), tanto de vida libre como de cultivo, han sufrido una enfermedad tipo-Piscirickettsiosis (Mauel, M. J., Miller, D. L, Frazier, K., Liggett, A. D., Styer, L, Montgomery-Brock, D., & Brock, J. (2003). Characterization of a piscirickettsiosis-like disease in Hawaiian tilapia. Diseases of Aquatic Organisms, 53(3), 249-255); lo que sugiere la expansión de este agente a otras especies de peces de importancia comercial (Marshall y cois., 2007). En Chile, como medidas de control para la expansión de las patologías, se han formulado y adoptado nuevas medidas productivas que propician mejores y más estrictas prácticas de manejo en los centros de cultivo, esto luego que se produjera un punto de inflexión productiva por la irrupción del ISAV el año 2008. Fue así como los mecanismo preventivos y de monitoreo, tomaron mayor importancia en la salmonicultura. Dentro del conjunto de estrategias preventivas adoptadas esta la intensificación del uso de estimulantes del sistema inmune así como también, el acondicionamiento inmunológico frente a las patologías de mayor incidencia. En este último punto, las vacunas juegan un rol importante, pues estimulan inmunológicamente a los peces frente a patologías existentes y persistentes en los sistemas de cultivo. Es por esta razón que la industria veterinaria productora de vacunas, se le plantea buscar alternativas eficientes y de bajo costo que permitan soportar la demanda y responder con productos efectivos a los requerimientos de la industria acuícola. En particular, las vacunas contra la bacteria Piscirickettsia salmonis presentan un proceso productivo dificultoso y complicado operacionalmente, debido a que el sistema involucra varias etapas y periodos extensos de cultivo. Esto se debe principalmente al proceso implementado para producir la biomasa de P. salmonis requerida para generar la vacuna, el cual consiste en el cultivo de una línea celular eucarionte a la cual se debe nutrir y hacer proliferar hasta una densidad determinada, para luego infectarla con P. salmonis. Este proceso inicia la etapa de cultivo de P. salmonis dentro de la célula hospedadora (célula eucarionte). Terminado el cultivo de P. salmonis, los distintos tipos celulares deben ser separados, lo cual representa una dificultad técnica que incide directamente en la calidad de la vacuna. Este es el procedimiento general actual para obtener biomasa de P. salmonis, para producir las vacunas usadas en el control de la enfermedad y estimulación inmunológica de peces SRS. Desde una perspectiva industrial, este proceso usado para cultivar a P. salmonis es la única operación unitaria actualmente escalable a nivel industrial, que ha permitido obtener de forma confiable biomasa para la producción de vacunas contra el patógeno.

Respecto del cultivo libre de células, el año 2008 Mauel y col. (Mauel, M. J., Ware, C, & Smith, P. a. (2008). Culture of Piscirickettsia salmonis on enriched blood agar. Journal of Veterinary Diagnostic Investigation, 20(2), 213-214. doi:10.1177/104063870802000211), así como Mikalsen y cois. ( ikalsen J, Skjaervik O, Wiik-Nielsen J, Wasmuth MA, Colquhoun DJ.,(2008), Agar culture of Piscirickettsia salmonis, a serious pathogen of farmed salmonid and marine fish, FEMS Microbiol Lett. 2008 Jan;278(1):43-7) de modo independiente, lograron el cultivo axénico (libre de células hospederas) de este microorganismo en medio sólido y líquido, el cual contiene sangre de cordero y cisteína. Sin embargo, en este caso, se sigue presentado la dificultad que los medios de cultivo son difícilmente escalables a nivel industrial, aun cuando correspondan a medios axénicos, pues se obtiene en esta condición una baja densidad bacteriana comparado con los sistemas de infección de células eucariontes, anteriormente descritos.

En cuanto a las solicitudes de patentes actualmente presentadas para la prevención del SRS, existen algunas relacionadas con la formulación de vacunas tanto a partir de bacterinas, como de proteínas recombinantes antigénicas.

La Patente US 7.707.970 de Novartis AG, plantea el uso de una vacuna de cepa no virulenta de Anthrobacter (RENOGEN) o de proteínas antigénicas de Anthrobacter para la prevención del SRS. Las vacunas a partir de Anthrobacter fueron originalmente diseñadas para prevenir la enfermedad bacteriana del riñon, pero se postula que tendrían la capacidad de prevenir SRS resultado que no ha sido comprobado.

La Patente US 6.887.989 indica que secuencias de ADN y de aminoácidos de Piscirickettsia salmonis se encuentran disponibles y han sido consideradas también para la formulación de vacunas contra el SRS.

La patente chilena 50237, sugiere que el fragmento de ácido nucleico que codifica la lipoproteina de superficie externa de 17 kda (OspA) de Piscirickettsia salmonis puede ser utilizada como vacuna para proteger a los peces poiquilotermos contra la infección por P. salmonis.

Las patentes chilenas 46351 , 46115, 46227, -46059, indican que diferentes proteínas de shock térmico tales como HSP10; HSP16 y HSP60 o ChaPs y, HSP70; pueden ser utilizadas como proteínas que permiten generar respuesta inmune contra Piscirickettsia salmonis en vertebrados.

Sin embargo, ninguna de estas patentes, permite mejorar el nivel de producción y eficacia para la elaboración de vacunas según lo esperado por la industria, por lo que amerita buscar nuevas y más eficientes alternativas.

La Publicación Internacional WO2008002152 reporta un medio de cultivo complejo, basado en extracto de levadura y caseína. Estos sustratos se componen de múltiples moléculas en una proporción relativa e incluso indefinida, lo cual hace inespecífico el medio formulado para el crecimiento de Piscirickettsia salmonis. Adicionalmente, se evaluó un tercer sustrato (glicerol o sacarosa o maltosa) para el crecimiento. La máxima Densidad Óptica (OD), medida a 600 nm (OD ₆₀ onm), alcanzada por las formulaciones propuestas en este documento llega a 2.85 a las 144 horas de cultivo. Se reporta también aquí que en condiciones de cultivo sin control de pH se alcanza una OD ₆₀ onm ~8 y en condiciones de pH controlado en 6.5 se logra una OD ₆₀ o _nm ~13 a las 120 horas. Estas condiciones fueron evaluadas utilizando el medio comercial SF900II™ de Life Technologies para líneas celulares de Spodoptera frugiperda. El medio comercial SF900II™ no posee liberada la información de su formulación. Por tanto, no es posible realizar aproximaciones del rendimiento de los cultivos de P. salmonis en este medio, ni derivar una formulación a partir del mismo.

La Publicación Internacional WO2013084169, en cambio describe nuevos medios de cultivo libre de sangre para uso en sólido y en líquido para el cultivo de la bacteria Piscirickettsia salmonis. En relación al medio de cultivo líquido de este documento se utilizan 19 de los 20 aminoácidos existentes en la naturaleza (tabla 2), además de un número importante de sales inorgánicas y otros componentes, que lo hacen económicamente poco viable. En el mismo sentido, el medio utiliza una cantidad no menor (100ml) de Suero Fetal bovino (FBS), que como es reconocido en el estado de la técnica, posee una serie de vitaminas, aminoácidos y factores de crecimiento (no cuantificados) que estimulan el crecimiento de organismos, lo que lo hace no reproducible, aumentando la inespecificidad como medio de crecimiento y además encarece la preparación de un medio de cultivo potencialmente escalable. Se informa además en la misma publicación que el crecimiento de la bacteria en unidades formadora de colonias (UFC) óptima para ser utilizado en la producción de vacunas, se alcanza sólo luego de 144 horas de cultivo.

Los inventores de la presente invención han logrado desarrollar exitosamente una tecnología cultivo de P. salmonis escalable a nivel industrial que consta de tres etapas 1) propagación, 2) cultivo en biorreactor y 3) recuperación. El estado del arte no reporta medios de cultivo para P. salmonis evaluados a escala de biorreactor. RESUMEN DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a un medio mínimo esencial definido para el cultivo de una bacteria perteneciente al género Piscirickettsia, como por ejemplo Piscirickettsia salmonis, en el que dicha bacteria se cultiva en un medio líquido libre de células, con componentes mínimos, que asociado a parámetros particulares, permite el crecimiento de la bacteria en un menor tiempo, manteniendo su virulencia.

Un aspecto relacionado con la invención, es el procedimiento específico de producción de la bacteria del género Piscirickettsia, que utiliza el medio líquido libre de células.

Otro aspecto de la invención se relaciona con el medio líquido libre de células que corresponde a un medio mínimo esencial definido, que permite obtener biomasa de una bacteria que pertenece al género Piscirickettsia, dicha bacteria es caracterizada como estable en sus propiedades de virulencia e infectividad.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la biomasa de la bacteria del género Piscirickettsia, en la producción de una o varias formulaciones de vacunas que comprenden Piscirickettsia.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso de la bacteria del género Piscirickettsia para uso en medicina veterinaria.

Otro aspecto de la invención, se refiere al uso de la bacteria del género Piscirickettsia o una subunidad de dicha bacteria en la fabricación de un medicamento para la prevención de las infecciones causada por bacterias del género Piscirickettsia.

El objetivo de la presente invención es proporcionar un medio de cultivo mínimo esencial, para obtener un máximo rendimiento de la biomasa de Piscirickettsia, manteniendo su virulencia e infectividad, con la que es posible formular vacunas de uso veterinario, para la prevención de infecciones en peces con bacterias del género Piscirickettsia.

Otro objetivo de la presente invención comprende el cultivo de la bacteria Piscirickettsia, el aumento de su biomasa, la formulación de vacunas y la administración a los peces de una o varias vacunas de acuerdo con la invención.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

FIGURA 1 : Cinética de crecimiento de P. salmonis en MD1 expresada como biomasa (mg/L) obtenida en el tiempo (h).

FIGURA 2: Cinética de crecimiento de P. salmonis en MD1 expresada como densidad celular (N° células/mL) obtenida en el tiempo (h). FIGURA 3: Cinética de crecimiento de P. salmonis en MD1 expresada como densidad óptica (OD) medida a 600 nm, obtenida en el tiempo (h).

FIGURA 4: Cinética de crecimiento de P. salmonis en MD2 expresada como biomasa (mg/L) obtenida en el tiempo (h).

FIGURA 5: Cinética de crecimiento de P. salmonis en MD2 expresada como densidad celular (N° células/mL) obtenida en el tiempo (h).

FIGURA 6: Cinética de crecimiento de P. salmonis en MD2 expresada como densidad óptica (OD) medida a 600 nm, obtenida en el tiempo (h).

Figura 7: Etapas de la nueva tecnología de cultivo en medio definido libre de células para P. salmonis. (P) Propagación de P. salmonis a nivel de matraz para generar el inoculo para el cultivo en biorreactor. (CB) Cultivo en biorreactor. (R) Recuperación de la biomasa mediante centrifugación.

Figura 8: Características del proceso de cultivo de P. salmonis en línea celular a nivel industrial. (P1) Propagación de la línea celular eucarionte para el cultivo en biorreactor. (P2) Propagación de P. salmonis en línea celular eucarionte para el proceso de infección. (CB) Cultivo en biorreactor de la línea celular eucarionte. (I) Infección de línea celular eucarionte cultivada en biorreactor con P. salmonis. (R) Recuperación en dos etapas de la biomasa bacteriana mediante centrifugación.

Figura 9: Mortalidad acumulada atribuible a P. salmonis producto de los ensayos de desafío en Salmo salar en estadio pre-smolt. (Control) peces no desafiados e inyectados con una solución inocua para determinar la mortalidad por manejo. La concentración de desafío de mayor a menor es: Directo > Dil-1 > Dil-2 > Dil-3.

Figura 10: Nivel de protección de las vacunas formuladas con biomasa de P. samonis cultivada en MD-2, visualizada como la mortalidad acumulada en los ensayos de desafíos con Salmo salar. (Control) peces no vacunados.

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Los inventores de la presente invención han desarrollado una tecnología de cultivo que consta de tres etapas generales: 1. Propagación; 2. Cultivo en biorreactor; 3. Recuperación.

La presente invención corresponde a la formulación específica de un medio de cultivo líquido definido para el cultivo de P. salmonis, basado en los requerimientos nutricionales fundamentales de esta bacteria que además posee características tales como bajo costo en su confección y es escalable a nivel industrial.

Previo a la etapa de propagación es necesario descongelar la cepa almacenada a - 80°C y propagarla en cultivo en matraces. Este proceso involucra la criopreservación, y activación de la bacteria del género Piscirickettsia, como por ejemplo las cepas EM-90, Cl- 95, Nor-92, ATL-4-91 , SGLO-94, más específicamente la cepa LF-89 y sus variantes de la bacteria especie P. salmonis, que se utiliza para inocular los cultivos con medio mínimo esencial de la invención.

La conservación, es decir la criopreservación de las cepas de la bacteria del genero Piscirickettsia, EM-90, CI-95, Nor-92, ATL-4-91 , SGLO-94, más específicamente la cepa LF-89 se realiza mediante la generación de un banco celular para su criopreservación en condiciones de bajas temperaturas entre -20 y -196°C, más específicamente entre -30° y - 100°C, más específicamente entre -50°C y 90°C, más específicamente entre -70°c y -80°C. La solución criopreservante corresponde a una solución de glicerol entre 10% y 00%, entre 20% y 100%, entre 30% y 100%, entre 40% y 100%, entre 50% y 100%, entre 60%y 100%, entre 70% y 100%, entre 80 % y 100%, entre 90% y 100%, al 100% y una solución Molar (M) de sacarosa entre 0.1 M y 1 M, entre 0.2M y 0.9M, entre 0.3M y 0.8M, entre 0.4M y 0.7M, entre 0.5M y 0.6M, en una relación preferentemente de 1 :1 , 1 :2, 1 :3, más preferentemente de 1 :4, en el cual se dispone un pellet de bacteria del genero Piscirickettsia, como por ejemplo Piscirickettsia salmonis. De esta manera, se provee de un stock de trabajo con las cepas descritas.

Cabe destacar que el proceso de almacenamiento de P salmonis fue desarrollado por el grupo de investigación de los inventores de la presente invención.

La activación se realiza traspasando las bacterias del genero Piscirickettsia criopreservadas, a en matraces con medio complejo según lo reportado por Henríquez M y cois. (2013) (Henríquez, M., González, E., Marshall, S. H., Henríquez, V., Gómez, F., Martínez, I., & Altamirano, C. (2013). A novel liquid médium for the efficient growth of the salmonid pathogen Piscirickettsia salmonis and optimization of culture conditions. PloS One, 8(9), e71830. doi:10.1371/journal.pone.0071830) que corresponde a una agitación de 150 RPM, pH inicial 6 y una temperatura controlada a 23 °C.

Propagación

Posterior a la activación, la biomasa bacteriana es traspasada a un matraz con el medio de la presente invención en iguales condiciones de agitación, pH y temperatura, para generar el inoculo de los cultivos escalables.

Con la cepa de P. salmonis acondicionada, se procede a su propagación en dos medios definidos formulados, denominados MD1 y MD2, los cuales se detallan en la tabla I. El medio mínimo esencial definido (MD) está compuesto por cuatro grupos de compuestos: aminoácidos, sales, minerales y vitaminas (micronutrientes). Los compuestos son suministrados individualmente. La formulación desarrollada se detalla a continuación en la Tabla I.

Tabla I: Composición específica de los medios de cultivo líquido para la bacteria Piscirickettsia salmonis. (MD) medio definido.

Las formulaciones indicadas en la tabla I como MD1 y MD2, corresponden a un detalle específico que atiende a las necesidades nutricionales específicas de la bacteria del género Piscirickettsia. Esto fue posible, ya que estas formulaciones se obtuvieron tras la caracterización de P. salmonis a nivel genómico y metabólico. Los resultados obtenidos no tienen precedentes en literatura específica para este organismo. Con respecto a la formulación del medio MD1 , este fue diseñado al determinar los nutrientes esenciales (auxotrofias) requeridos para el crecimiento de P. salmonis, mientras que la formulación MD2 fue diseñada tras determinar los perfiles de demanda nutricionales específicas en el tiempo, lo cual permitió ajustar las concentraciones de cada componente descritos inicialmente en el medio MD1.

Los medios de cultivo MD1 y MD2 fueron desarrollados para cultivos por lotes. También se realizó un tercer medio para cultivo por lote alimentado (CLA) basado en el medio MD2 (MD2-CLA).

Los análisis realizados permitieron determinar que las fuentes de carbono y energía necesarias para el crecimiento de P. salmonis son ácido glutámico, treonina y arginina. Esta información hasta la fecha no ha sido reportada en literatura.

Además, se determinaron en el estudio los componentes esenciales de estos medios tales como, histidina, cisteína, fenilalanina, valina, leucina, isoleucina, metionina y lisina, los que en su conjunto son requeridos para el crecimiento relacionado con la síntesis de proteínas y bíomasa de la bacteria del género Piscirickettsia. Estos aminoácidos se encuentran en la formulación descrita en la solicitud de patente WO2013084169, pero sin distinguir su condición de esencial, especificidad y cantidad propicia para el crecimiento bacteriano. Todos estos aspectos se han evidenciado y determinado en los ensayos experimentales de la presente invención. Ello evita el uso inespecífico de otros aminoácidos citados en WO2013084169, los cuales no son utilizados por la bacteria para aumentar su biomasa. Es importante destacar este punto, ya que la reducción en el número y cantidad de aminoácidos utilizados, no es una condición obvia, ya que la ausencia de alguno al azar, puede determinar la ineficiencia o retraso en el crecimiento de la biomasa de la bacteria del género Piscirickettsia.- Sin embargo, la determinación de los aminoácidos específicos, permite el crecimiento de la bacteria en forma rápida (en un tiempo menor), eficiente y a bajo costo.

En la literatura (Mauel, Ware & Smith, 2008) se indica que el aminoácido cisteína es un componente esencial para el crecimiento de P. salmonis. Sin embargo, en esta investigación se ha determinado que otros siete aminoácidos son esenciales y deben ser suministrados para suplir las auxotrofias de la bacteria para permitir su crecimiento.

El medio de cultivo MD2 se ajustó en función de los requerimientos nutricionales fundamentales de la bacteria del género Piscirickettsia, en particular a la especie P. salmonis, ajuste realizado de acuerdo a los requerimientos específicos de fuentes de carbono y energía evidenciadas como preferentes. También se ajustó la concentración de los componentes que suplementan carencias metabólicas de la bacteria y de los micronutrientes y sales minerales requeridas para su crecimiento. En esta formulación no se adicionan otros componentes como carbohidratos, glicerol, lípidos, aminoácidos no esenciales, minerales traza, sustratos complejos (extracto de levadura, peptona, suero, sangre), incluidos en las formulaciones publicadas con anterioridad para las bacterias del genero Piscirickettsia en particular P. salmonis.

En la presente invención se demuestra que algunos de los sustratos detallados anteriormente para el crecimiento de P. salmonis, no son asimilados por la bacteria, pues no posee la capacidad metabólica para su utilización en medios de cultivo libre de células. También se determinó que otros componentes descritos en el estado del arte no suplen los requerimientos nutricionales de P. salmonis, y son en algunos casos inhibidores del crecimiento.

La presente invención provee de una formulación que es más específica y simple en su composición que los medios de cultivo del estado del arte. El medio de cultivo específico de la presente invención permite generar un mayor rendimiento de biomasa por cantidad de nutrientes en menor tiempo (rendimiento MD2 0.82 g/g; Tabla III, descrita posteriormente).

Estos resultados permiten montar una línea de producción industrial más económica, con características revolucionarias en el cultivo de bacterias del género Piscirickettsia en particular P. salmonis. Las diferencias entre componentes de los medios descritos en el estado del arte y los medios MD1 y D2 son comparados en la Tabla II.

Tabla II: Comparación entre los medios de cultivos del estado del arte y los MD 1 y MD2.

WO2013084169 WO2008002152 MD1 MD2

Componentes

g/L g/L g/L g/L

^■ Sales inorgánicas -

Nitrato de amonio 0.0002

Ácido bórico 0.0028

Cloruro de calcio (CaCI ₂ ) (anhidro) 0.2461 0.08 0.08

Fosfato disódico 0.001

Citrato férrico 0.0126 0.032 0.032

Nitrato férrico 0.005

Cloruro de magnesio 0.7412

Sulfato de magnesio (MgS0 ₄ ) (anhidro) 0.4168 0.4 0.1 0.1

Fosfato de potasio monobásico (KH ₂ P0 ₄ ) 0.3 6.3 6.3

Bromuro de potasio 0.0101

Cloruro de potasio (KCI) 0.1091 0.8 Bicarbonato de sodio (NaHC0 ₃ ) 0.2401

Cloruro de sodio (NaCI) 7.1235 10 9 9

Fluoruro de sodio 0.0003

Fosfato de sodio monobásico (NaH ₂ P0 ₄ -H ₂ 0) 0.014

Silicato de sodio 0.0005

Sulfito de sodio 0.2

Cloruro de estroncio 0.0043

Otros componentes

D-glucosa 15.6

Peptona no. 3 8.1281

Caseína pancreática 7.5

Caseína 5

Peptona de soja 5

Extracto de levadura 0.3256 15

Glicerol ³ 10

Sacarosa ³ 10

Maltosa ³ 10

FBS cell culture Gibco ^® (Suero fetal bovino) 100ml

Aminoácidos

Glicina 0.0008

L-alanina 0.0009

L-arginina 0.0126 0.645 1,185

L-asparagina-H ₂ 0 0.0013

L-ácido aspartico 0.0013

L-cisteina 2HCI 1.7031 1.01 0,336

L-ácido glutámico 0.0015 0.645 1,925

L-histidina 0.0042 0.56 0,14

L-isoleucina 0.0052 0.483 0,121

L-leucina 0.0052 0.483 0,121

L-lisina 0.0073 0.541 0,271

L-metionina 0.0015 0.659 0,165

L-fenilalanina 0.0032 0.405 0,101 L-prolina 0.0012

L-serina 0.0011

L-treonina 0.0048 0.657 1,732

L-triptofano 0.001

L-tirosina 0.0052

L-valina 0.0046 0.517 0,129

Vitaminas especificas ^{'■ 1} . , . . ·

Cloruro de colina 0.0001 0.002 0.002

D-pantetonato de calcio 0.0001 0.002 0.002

Ácido fólico 0.0001 0.002 0.002

Niacinamida 0.0001 0.002 0.002

Corhidrato de piridoxal 0.0001 0.002 0.002

Riboflavina <0.0001 0.0002 0.0002

Colhidrato de tiamina 0.0001 0.002 0.002

Inositol 0.0002 0.004 0.004

Es importante destacar que el medio de cultivo de WO2008002152 aun cuando posee pocos componentes, la composición de los mismos es rica en nutrientes indefinidos (ej, extracto de levadura), lo que los hace inespecífico. ( ^a ) Evaluación de cada sustrato por separado en la patente WO2008002152.

Tabla III: Comparación de los parámetros del cultivo por lote de P. salmonis en los medios formulados MD1, MD2 y MD2-CLA con medios del estado del arte.

(Yx/s) Rendimiento de sustrato en biomasa bacteriana, señala la biomasa producida por gramo de sustrato. (Qx/s) Productividad, señala la biomasa producida por hora. (*) SF900II™ es un medio comercial para líneas celulares de Spodoptera frugiperda suministrado por Life Technologies, reportado en WO2008002152 para aislar y evaluar condiciones de pH para el cultivo de P. salmonis. (FC) Fuente de carbono total. (OD) Densidad óptica. (t _max ) Tiempo del cultivo donde se alcanza la OD máxima. La formulación para los medios de cultivo MD2 y MD2-CLA de la invención, entregando índices de cultivo que son significativamente mejores que los reportados en el estado del arte (Yx/s: rendimiento de sustrato en biomasa bacteriana; Qx/s: productividad). Se calculó el rendimiento para cada medio de cultivo de la invención, mediante la medición de la Densidad Óptica (OD) máxima por cada gramo de los compuestos que son usados por la bacteria como potencial fuente de carbono. Se consideran todos los compuestos que pueden ser asimilados por la bacteria como fuente de carbono para este cálculo, debido que estos medios de cultivo fueron diseñados sin tener claridad de cuáles eran los compuestos metabolizados por P. salmonis.

La productividad se calculó como la razón entre la OD del cultivo y el tiempo que transcurrió para llegar a esa OD. A las 60 h, el medio MD2 presentó una productividad de 0.09 OD/h, mientras que WO2008002152 y WO2013084169 reportan 0.01 OD/h. De igual manera MD2 y MD2-CLA presentan un mayor rendimiento, llegando a 0.82 OD/g y 0.95 OD/g respectivamente, de fuente de carbono (FC), lo cual contrasta con el bajo rendimiento alcanzado por WO2008002152 y WO2013084169 que es inferior al 0.1 OD/g FC. En WO2008002152 se utilizó el medio comercial SF900II™ para aislar y evaluar distintas condiciones de cultivo de P. salmonis, en donde se reportan los buenos índices de crecimiento. Si bien no se encontró disponible la formulación de este medio, se puede obtener un índice de productividad que alcanza los 0.11 OD/h, el cual es ligeramente superior al obtenido en MD2 e igual para el caso de MD2-CLA. Sin embargo, al comparar la productividad obtenida a las 60h de cultivo, se puede observar que MD1 , D2 y MD2-CLA superan a todos los medios reportados y evaluados (Tabla III).

Los medios MD1 , MD2 y MD2-CLA mejoran considerablemente los índices de cultivo siendo estos en menor tiempo que los medios reportados en el estado del arte.

Ventajosamente, la Tabla III revela que la cantidad de los compuestos que son fuente de carbono y energía (FC&E) en MD1 , MD2 y MD2-CL están en una proporción considerablemente menor que los medios reportados.

El MD2-CLA presenta una productividad (Qx/s) significativamente mayor a todos los otros medios de cultivo a las 60 h. El medio SF900II sólo muestra una productividad equivalente en el tiempo donde se alcanza biomasa máxima. El D2 presenta una alta productividad a tiempos menores de cultivo y se mantiene hasta el final del cultivo.

La Tabla III demuestra que la mejora en las cantidades específicas de nutrientes y la especificidad general de los medios de cultivo formulados, permiten obtener mayor biomasa en una menor cantidad de tiempo, en relación a los medios de cultivo no específicos indicados en el estado del arte WO2008002152 y WO2013084169. Tanto MD2 como MD2- CLA presentan mejores índices de productividad a las 60h de cultivo que el medio comercial SF900II (Tabla III). Hay que considerar que este medio comercial esta formulado para proliferar líneas celulares, por lo cual posee componentes innecesarios en su formulación para P. salmonis; además, de costos superiores al valor estimado del MD2 y MD2-CLA. El precio del medio de cultivo para un proceso de fermentación es crítico. Por lo tanto, un proceso que utilice MD2 o MD2-CLA en lugar de SF900II presentaría ventajas muy importantes en cuanto a su costo (costo de SF900II es app. 7.4 veces mayor; SF900IITM aproximadamente CL$63.000 por litro; MD2 aproximadamente CL$8.500 por litro).

El medio de cultivo SF900II es marca registrada de composición desconocida para el público por lo tanto la composición de MD2 y MD2-CLA no se derivan de la composición de éste. Adicionalmente, el MD2 y MD2-CLA son medios de cultivo definido mínimo diseñado especialmente para el crecimiento de P. salmonis.

La disponibilidad del medio de cultivo SF900II depende del proveedor, puesto que el proveedor podría decidir no fabricar más el producto, en cambio los medios de cultivo D2 y MD2-CLA no dependen de un proveedor.

El estado del arte reporta el crecimiento de P. salmonis en OD como una medida para indicar los niveles de producción de biomasa alcanzados en cada cultivo. En la presente invención, se reporta adicionalmente el crecimiento bacteriano como concentración de biomasa en peso seco (g biomasa seca/L) o como número de bacterias (N° bacterias/mL).

Con respecto a las cinéticas de crecimiento de P. salmonis documentadas para los medios MD1 y MD2se presentan en las Figuras 1 a 6, donde el tiempo para alcanzar la máxima producción de biomasa se logra alrededor de las 60 h (2,5 días), con un inoculo promedio cercano a los 90±10 mg/L en el tiempo 0 h. Dato considerablemente más eficiente que lo publicado en el estado del arte. La producción de biomasa promedio es de 0,75±0.05 g/L (equivale a 2,7x10 ⁹ N° bacterias/mL; 2,25 OD) en el MD1 (Figura 1 , 2 y 3) y 1 ,5±0,1 g/L (equivale a 7,3x10 ⁹ N° bacterias/mL; 5,5 OD) en el MD2 (Figura 4, 5 y 6), mientras que velocidad especifica de crecimiento (μ) de P. salmonis en el MD1 es de 0,03±0,005 h ^" y en el MD2 es de 0,045±0,005 h ^"1 .

La formulación de un medio de cultivo líquido específico definido para el crecimiento de P. salmonis permite prescindir de una célula hospedadora y por tanto evitar las complicaciones que impone realizar un cultivo en esta modalidad (cultivo célula hospedadora, infección de la célula hospedadora, separación de biomasa bacteriana de las células eucariontes) y además, permite tener una biomasa libre de contaminación (estructuras de la célula hospedadora). Los medios de cultivo MD1 y MD2 tienen definida la proporción y calidad de los sus componentes, lo que permite estandarizar y certificar cada lote de medio que se use para el cultivo de P. salmonis. Lo anterior es una ventaja para la industria, pues el controlar la composición del medio de cultivo en una línea productiva, permite replicar los parámetros de productividad y rendimiento del cultivo en el tiempo. Esto es posible en los medios MD1 y MD2, porque no utilizan sustratos complejos inespecíficos como por ejemplo: peptona, extracto de levadura o suero, cuya proporción de componentes varía entre lotes y proveedores, lo cual hace difícil replicar y por tanto proyectar la productividad y rendimiento de una línea de producción.

Adicionalmente, MD1 y MD2 poseen una calidad estándar de sus componentes, permitiendo a la industria variar de proveedores del medio sin incorporar riesgos a nivel productivo. La novedad de esta formulación es que suministra a la bacteria exclusivamente los componentes básicos y esenciales que permiten la proliferación de P. salmonis, reduciendo o eliminando aquellos compuestos que no son utilizados por la bacteria, permitiendo que la producción de ia bacteria sea más rentable que la formulación de un medio complejo con muchos componentes (Solomons, G. L, (1969). Materials and Methods in Fermentation; AcademicPress: New York, 133-149). La generación de los medios de cultivo MD1 y MD2, se basó en los requerimientos nutricionales específicos de la bacteria, siendo estos analizados específicamente de acuerdo a las condiciones experimentales que cada ensayo iba entregando, por tanto corresponde a un diseño específico, que cubre sus requerimientos nutricionales.

El cultivo de P. salmonis evaluados a escala de biorreactor se describe por primera vez en la presente invención. Los inventores han logrado escalar exitosamente a escala piloto los cultivos de P. salmonis en MD-2, logrando reproducir los índices de concentración de biomasa (OD ₆₀ o), rendimiento (Yx/s) y productividad (Qx/s) informados a menores volúmenes (ver Tablas IV y V).

Como ya se mencionó anteriormente el cultivo se desarrolla en etapas, siendo ellas: la propagación, el cultivo en biorreactor y la recuperación, a propagación involucra el cultivo sucesivo de la bacteria en matraces, con volúmenes crecientes de medio de cultivo (MD-2), y la generación del inoculo, en biorreactor, para el inicio del cultivo a escala piloto (el volumen de inoculo corresponde a un 10% del volumen de producción a nivel piloto). Esta etapa tiene una duración de 10 días. La etapa en biorreactor a escala piloto considera el cultivo de la bacteria en medio definido MD-2 en condiciones controladas de temperatura, pH, concentración de oxígeno disuelto y velocidad de agitación. La duración de esta etapa es 3 días. La recuperación se realiza por centrifugación en un paso, obteniéndose biomasa pura de P. salmonis. El tiempo de duración de esta etapa es despreciable frente al tiempo total del proceso. El proceso así descrito tiene una duración global de 13 días (Figura 7).

Actualmente la biomasa de P. salmonis requerida para la formulación de vacunas se produce mediante la infección de líneas de células eucariotas. A diferencia de lo descrito en el párrafo anterior, el proceso hasta ahora utilizado de cultivo de P. salmonis consta de cinco etapas: 1. Propagación de la línea celular; 2. Propagación de P. salmonis en línea celular; 3. Cultivo en biorreactor de la línea celular; 4. Infección de línea celular cultivada en biorreactor con P. salmonis; y 5. Recuperación de P. salmonis mediante centrifugación. Esta última operación se realiza en dos pasos de centrifugación. Se debe señalar que la biomasa así cosechada podría contener restos de la línea celular eucarionte que repercuten negativamente en el nivel de protección que puede proporcionar la vacuna.

En la Figura 8 se presenta un esquema de este proceso con los tiempos involucrados. El proceso global tiene una duración de 43 a 47 días. Los costos involucrados en este sistema de cultivo son elevados, debido al tiempo que involucra el ciclo de producción y por los costos asociados a servicios, recursos humanos e insumos operacionales. Este último ítem es crítico, pues los insumos (medios de cultivo, fungible operacional) para la propagación de líneas celulares son de elevado costo. El valor comercial por litro del medio de cultivo para la línea celular donde se propaga a P. salmonis, es superior a CL$60.000. Además, la propagación de la línea celular involucra el remplazo del medio de cultivo cada 2 a 3 días. Se debe considerar también que los sistemas donde se cultiva la línea celular son desechables, con reducidos volúmenes de trabajo y con altos costos, por ser materiales especiales que no afecten la viabilidad de las células eucariontes. Estos costos operacionales se magnifican debido al prolongado tiempo del proceso, además de la cantidad de operarios especializados requeridos para la mantención de los cultivos.

Ejemplos:

Los ejemplos descritos a continuación corresponden a una demostración práctica de las ventajas asociadas al medio de cultivo de la presente invención.

Ejemplo 1 : Cultivo de P. salmonis en la modalidad por lote a escala piloto (cultivo biorreactor 10L) en medio de cultivo MD-2.

Dentro de los medios definidos formulados, el MD-2 es el que genera mayores niveles de biomasa en los mismos tiempos de cultivo. Estos cultivos fueron desarrollados a temperatura controlada de 23 °C, con una agitación de 150 RPM, aireación de 1 vvm y pH 6.0. La modalidad de cultivo por lote se escaló hasta un volumen de 10 L, el cual representa para este sistema una escala piloto. Los resultados obtenidos se presentan en la Tabla I. En la Tabla IV se muestra el uso del medio de cultivo MD-2 a distintas escalas, desde matraz a biorreactor de 2, 5 y 10 L. La escala de 10L corresponde a una escala piloto para este tipo de procesos. Tabla IV. Medios de cultivo y sistemas implementados para cultivo de P. salmonis

ndices operacionales. Yx s: Rendimiento de sustrato en biomasa bacteriana. Qx/s: Productividad. FC: Fuente de carbono total agregada. ODeoonm. Densidad óptica a 600 nm.

En la Tabla IV, se aprecia que la modalidad por lote en MD-2 es reproducible a distintos volúmenes, manteniendo los índices de concentración de biomasa, rendimiento y productividad a escala matraz y biorreactor. Por lo demás, este cultivo permite aumentar la biomasa en 19 veces con respecto a la concentración inicial promedio de 0.28 Tabla V (descrita a continuación).

Tabla V. Comparación de las condiciones operacionales de los cultivos de P. salmonis en los medios de la presente invención y los reportados en el estado del arte.

Condiciones operacionales

Agitación Temperatura Inoculo

Sistema de cultivo pH

(rpm) (°C) (OD600nm)

MDl Matraz 100 23 0.28±0.03 6.0 ^a

Matraz y reactor

MD2 150 23 0.28±0.03 6.5 ^b por lote

Reactor por lote

MD2 150 23 0.28±0.03

alimentado

WO2008002152 Matraz 100 20 NR 6.2 ^a

SF900II* Matraz 75 20 NR 6.5 ^a

WO2013084169 Matraz 50 18 0.25

NR: no reportado

( ^a ) cultivo a pH libre, siendo el reportado el pH inicial. ( ^b ) pH inicial en matraz y controlado en reactor. (*) SF900II™ es un medio comercial para líneas celulares de Spodoptera fmgiperda suministrado por Life Technologies, reportado en WO2008002152 para aislar y evaluar condiciones de pH para el cultivo de P. salmonis.

Ejemplo 2: Cultivo de P. salmonis en la modalidad lote alimentado en biorreactores de 2 L en medio de cultivo MD-2 (MD2-CLA).

El cultivo por lote alimentado, fue otra estrategia ensayada para la fermentación de P. salmonis, con la cual se puede obtener mayores niveles de biomasa. Esta se realizó bajo las mismas condiciones operacionales que los cultivos por lote. La diferencia radica que este sistema recibe en forma controlada una alimentación de medio de cultivo basado en MD-2. Los resultados obtenidos señalados en la Tabla IV, demuestran que esta estrategia permite aumentar las concentraciones de biomasa, con mayores rendimientos y productividades que los cultivos desarrollados con anterioridad.

Ejemplo 3: Infectividad de P. salmonis cultivada en MD-2.

La prueba de infectividad de P. salmonis demuestra la conservación de un fenotipo virulento en los cultivos en MD-2. Estos ensayos se realizaron bajo un ambiente controlado, con supervisión diaria donde los parámetros de temperatura del agua y saturación de oxígeno fueron monitoreados diariamente. Se testeó con 180 peces de la especie Salmo salar, de un peso promedio aproximado de 30 grs, en estadio pre-smolt.

Todos los peces desafiados con P. salmonis evidenciaron signos y lesiones descritas para SRS. Así también el tiempo en iniciarse las mortalidades son las esperadas para esta especie, cepa y condiciones utilizadas en este estudio. Se desafió con 4 concentraciones de P. salmonis a los peces donde Directo es la concentración más alta, siendo D1 , D2 y D3 una dilución seriada de este con una diferencia de un logaritmo de concentración medida en N° de bacterias/mL. Con las mortalidades obtenidas de este ensayo (Figura 9), se pudo calcular el DL50. El índice de letalidad calculado para P. salmonis cultivada en MD-2, está en el nivel de la virulencia de las cepas ambientales. Por tanto, los cultivos en MD-2 permiten conservar el fenotipo virulento observado en las cepas ambientales.

Ejemplo 4: índice de protección de las vacunas elaboradas con biomasa obtenida de los cultivos en MD-2.

Se han elaborado vacunas con la biomasa obtenida de los cultivos en MD-2, las cuales han presentado mejoras en los índices de protección con respecto a vacunas tradicionales, elaboradas con biomasa de P. salmonis obtenida de cultivos con líneas celulares eucariontes. La biomasa obtenida de los cultivos en MD-2 fue inactivada mediante un método químico para elaborar las vacunas. En este ensayo se elaboraron vacunas con una alta, media y baja carga de antígeno, donde la alta es 3 veces más concentrada que la media y la media es 3 veces más concentrada que la baja. Posteriormente, los peces de la especie Salmo salar de 70 g, fueron desafiados con la dosis definida en el DL50. Los resultados evidencian que las vacunas indistintamente de su concentración producen el mismo nivel de protección con respecto al control (peces no vacunados; Figura 10).