A presente invenção refere-se ao campo da microbiologia e biotecnologia. Particularmente, a presente invenção refere-se a meio de cultura para bactérias do género Clostridi m, livre de componentes de origem animal, e processo para a produção de sobrenadante contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica .

Antecedentes da invenção

A colagenase (clostridiopeptidase A, EC 3.4.24.3) é uma enzima proteolitica capaz de hidrolisar proteínas do grupo colágeno, nativo e desnaturado (gelatinas) . Nenhuma outra enzima é capaz de clivar o colágeno nativo, devido a sua composição particular de aminoácidos (presença de um grande número de iminoácidos, representados pelo tripeptídeo Gly- Pro-X, onde o resíduo X é, frequentemente, prolina ou hidroxiprolina ) , e a sua macroestrutura singular (estrutura complexa de tripla hélice) .

A colagenase, isolada ou como principal componente de composições contendo outras enzimas proteolíticas , tem sido amplamente utilizada no tratamento de várias doenças e condições patológicas do corpo humano associadas ao depósito excessivo de colágeno e ao acúmulo errático de tecido fibroso rico em colágeno, desde a década de 70. Essas doenças e condições são denominadas doenças mediadas por colágeno, sendo a aplicação local de composições contendo colagenase uma das possibilidades de tratamento alternativo à intervenção cirúrgica. O debridamento de tecidos necrosados (queimaduras, lesões dérmicas, etc.) também é uma das condições na qual o uso de composições contendo colagenase é aprovado pelos órgãos de vigilância sanitária, demonstrando resultados surpreendentes no tratamento de processos de cicatrização.

Algumas aplicações terapêuticas de composições contendo colagenase são: tratamento de queimaduras, exercendo um efeito benéfico concomitante sobre a regeneração tecidual; debridamento enzimático de feridas e tratamento de ferimentos infectados e úlceras (de pele e úlceras de decúbito) ; tratamento de hérnias de disco intervertebral; lise seletiva de fibras de colágeno do corpo vitreo do olho; tratamento de doença de Dupuytren; tratamento de doença de Peyronie; tratamento para capsulite adesiva; tratamento de epicondilite lateral, síndrome do túnel cárpico e fascite plantar; aumento da regeneração de nervos danificados; sendo também muito utilizada por especialidades médicas como cirurgia plástica e em diversos procedimentos dermatológicos e estéticos, por exemplo, no tratamento de celulite e cicatrizes de mamíferos, como acnes, queloides e outras cicatrizes hipertróficas através de injeção intralesional de colagenase purificada.

Outros estudos apontam o uso de composições contendo colagenase em artrite reumatóide, metástase, angiogênese e cirrose .

Colagenases também têm sido descritas como ferramentas importantes para o transplante de alguns órgãos específicos, como por exemplo, para o isolamento de células de Langerhans das ilhotas pancreáticas, células endoteliais microvasculares, hepatócitos e condrócitos (WO 9824889, 1997) . As dissociações de tecido mediadas pelas enzimas colagenolíticas são um passo crítico em vários procedimentos de isolamento celular. A maioria dos usos terapêuticos descritos acima utiliza como fonte de colagenase o sobrenadante, purificado ou não, de cultivos bacterianos, especialmente de cultivos de linhagens de Clostridium hístolyticum. Clostridium histolyticum é uma bactéria cilíndrica, anaeróbia, gram- positiva e formadora de esporos. A atividade colagenolítica das enzimas extracelulares dessa espécie bacteriana é conhecida há mais de 50 anos, quando se isolou pela primeira vez uma enzima extracelular capaz de digerir tendões de Achilles de bovinos.

Atualmente, sabe-se que várias espécies de microrganismos cultivados em condições definidas são capazes de produzir colagenases, entretanto, Clostridium sp, principalmente Clostridium histolyticum, continua sendo a principal fonte de obtenção de enzimas colagenolíticas e gelatinolíticas para uso medicinal devido a sua maior produtividade e atividade enzimática frente a diversas formas de colágeno e seus peptídeos.

Outras fontes de colagenases para uso terapêutico incluem células de mamíferos, crustáceos (caranguejo, camarão) , fungos e outras bactérias {Streptomyces, Pseudomonas e Vibrio) .

A habilidade das colagenases de Clostridium de digerirem vários tipos de colágenos (tipo I, II, III, VII e X) e gelatina é o primeiro fator que as diferenciam das outras fontes de colagenases. Essas enzimas clostridiais além de possuírem potente atividade colagenolítica quando comparadas às colagenases de vertebrados, apresentam um pH ótimo para sua atividade próximo da faixa de pH fisiológico humano.

Após a descrição inicial das enzimas proteolíticas de Clostridium histolyticum, estudos do final da década de 1950 até o meio da década de 1980 observaram a existência de muitas colagenases produzidas por C. histolyticum e a especificidade e estabilidade dessas frações foram aos poucos sendo caracterizadas.

Bond e Van Wart (1984; Biochemistry 23, 3077-3085), isolaram seis enzimas distintas de preparações de colagenase comercial, com pesos moleculares que variam de 68 kDa a 130 kDa e pontos isoelétricos entre pH 5,5 e 6,5, classificando- as em duas classes de acordo com a especificidade de substratos: Classe I - possuem maior atividade sobre colágenos de alto peso molecular (colágeno nativo: intacto); Classe II - exibem uma preferência por fragmentos de colágenos de baixo peso molecular (colágeno desnaturado: gelatinas) . Essas atividades aparentemente são complementares, havendo evidências da sua ação sinérgica sobre o colágeno nativo.

Além das várias isoformas de colagenases das classes I e II, as preparações tradicionais de colagenase, baseadas no sobrenadante de culturas bacterianas de Clostridium histolyticum, contêm mais de 30 enzimas diferentes. O constituinte primário é colagenase (classes I e II) , entretanto, outras proteases importantes encontradas incluem proteases neutras como: gelatinases, clostripainas ( clostridiopeptidase B, EC 3.4.22.8), tripsinas, elastases e aminopeptidases . Enzimas não proteoliticas também são encontradas nas preparações tradicionais de colagenase, incluindo: galactosidase, acetilglucosaminidase, fucosidase, fosfolipase, neuraminidase (ou sialidase) e hialuronidase . Destas enzimas, proteoliticas e não proteoliticas, sialidase, hialuronidase e colagenase estão muito envolvidas no processo de degradação dos componentes da matriz extracelular, sendo desejável a presença dessa "combinação enzimática" para obtenção de composições que possam ser utilizadas como agente de debridamento enzimático de lesões dérmicas e transplante de órgãos (ex. isolamento de ilhotas pancreáticas) .

Sozinha, a colagenase, purificada ou recombinante, é ineficiente para a dissociação de tecidos devido à hidrólise incompleta de todos os polipeptideos do colágeno e à sua atividade limitada quando em altas concentrações de proteínas não-colágeno e de outras macromoléculas encontradas na matriz extracelular . Por este motivo, a composição contendo colagenase mais utilizada para dissociação tecidual e debridamento é uma preparação bruta ou parcialmente purificada (incluindo algumas poucas etapas de purificação) uma vez que há a necessidade da presença de enzimas para atuar no colágeno nativo e nas fibras reticulares, em adição às enzimas que hidrolisam outras proteínas, polissacarídeos e lipídios da matriz extracelular dos tecidos conjuntivo e epitelial. A complexa composição das preparações de colagenase "bruta" introduz dificuldades ao seu processo de produção, relacionadas principalmente a definição de padrões de expressão das enzimas proteolíticas desejáveis na composição do produto final.

De modo contrário, o uso de composições de colagenase para o tratamento de algumas das doenças mediadas por colágeno, exige uma alta pureza das preparações, devido à necessidade de ação específica sobre a digestão apenas de colágeno, sendo a sua forma de administração através de injeções locais. Nesses casos, os processos de purificação do sobrenadante das culturas de C. histolyticum são muito longos, incluindo inúmeras etapas com diferentes estratégias de purificação.

De maneira geral, a pureza das composições de colagenase está diretamente relacionada à aplicação terapêutica desejada. No entanto, independente da aplicação terapêutica, a existência de um processo definido para o cultivo de Clostridium histolyticum é fundamental para direcionar a produção das principais proteases no sobrenadante, purificado ou não, desses cultivos.

A atividade enzimática e a concentração de proteases nos sobrenadantes dos cultivos de C. histolyticum variam com a linhagem bacteriana, meio de cultura, condições de cultivo, idade da cultura, densidade celular, entre outras variáveis. A variabilidade intrínseca desse tipo de processo biotecnológico implica em testes exaustivos para controle de qualidade dos lotes produzidos, aumentando os custos de produção. Além disso, a perda da eficácia das colagenases tradicionais ao longo do tempo, apesar do controle das suas condições de estocagem, tem sido relacionada à composição enzimática do sobrenadante do cultivo bacteriano produzido, exigindo a definição de condições de cultivo capazes de direcionar a expressão de enzimas colagenolíticas e gelatinolíticas , em especial colagenases, por C. histolyticum.

É bem conhecido que a produção de proteases extracelulares em microrganismos é fortemente influenciada por componentes do meio, especialmente pelas fontes de carbono e nitrogénio, e fatores físicos como, por exemplo, pH, temperatura, volume do inoculo, velocidade da agitação orbital e tempo de incubação. Não há um meio de cultura geral para a produção de proteases por diferentes linhagens microbianas. Cada microrganismo possui os seus próprios requerimentos físico-químicos e nutricionais idiossincráticos para o crescimento e secreção enzimática.

Proteínas e peptídeos são as principais fontes de carbono e nitrogénio em cultura de bactérias do género Clostridium. Convencionalmente, infusão cérebro-coração (Brain Heart Infusion - BHI), triptose, proteose peptona, extrato de carne, caseína e gelatina são descritos como fontes de proteínas e peptídeos para o crescimento e produção enzimática por C. histolyticum. A composição dos meios de cultura líquidos descritos para o crescimento de C. histolyticum também inclui, frequentemente, sais inorgânicos, vitaminas, glicose, extrato de levedura, tioglicolato de sódio e sulfato de ferro, em diversas concentrações.

A presença de peptonas de origem animal tem sido definida como fundamental para o crescimento e produção enzimática por C. histolyticum por diversos autores desde a década de 30.

Na década de 50, MacLennan et al. (1953; J. clin. Invest. 32: 1317) avaliaram os efeitos de diversas fontes de carbono e nitrogénio (fitonas, peptonas, colágeno e derivados, glicose) , além da concentração de vitaminas, sais inorgânicos, pH e Fe ⁺⁺ sobre o crescimento e produção de enzimas colagenolíticas e gelatinolíticas por C. histolyticum (diversas linhagens). As concentrações de sal ferroso e peptona de origem animal foram definidas como críticas para o rendimento máximo de produção enzimática. Tal estudo tornou- se referência e o principal meio de cultura investigado por MacLennan et al. foi considerado um "meio de cultura convencional" para obtenção de colagenases de C. histolyticum durante décadas.

Como peptonas de origem animal, são comumente descritos: bacto-peptona, proteose peptona, hidrolisado de caseína, hidrolisado tríptico de caseína, entre outros. Combinações desses componentes com peptonas vegetais são descritas.

Por exemplo, Bergman et al. (1961; Journal of Bacteriology, 82 : 5829) obtém sucesso nos cultivos de C. histolyticum através de um meio de crescimento contendo proteose peptona, hidrolisado de caseína, hidrolisados trípticos de soja e vitaminas. Demonstra que, na ausência de sais inorgânicos, a produtividade de colagenase é igual ou superior à apresentada por MacLennan et al. (1953), entretanto, com redução da produção de azocaseínas, fato interessante por facilitar os procedimentos posteriores de purificação (denominado meio PTV) .

Além da importância das peptonas de origem animal para o crescimento e produção enzimática em culturas de C. histolyticum, também foi investigada a influência de outros componentes do meio de cultura a fim de definir padrões metabólicos para a espécie e, desta forma, aperfeiçoar as suas condições de cultivo.

Mead (1971; J. Gen. Microbiol. 67:47) descreve o padrão de utilização de aminoácidos em diversas espécies do género Clostridium ao longo do seu crescimento, classificando-os em grupos de acordo com as suas necessidades nutricionais. Nesse trabalho, Clostridium histolyticum é considerado como uma linhagem fermentadora de aminoácidos, e sub-classifiçado no chamado Grupo II (C. botulinum; C. histolyticum; C. cochlearium; C. subterminale) . Serina, glutamina, glicina e valina, apesar de serem os principais aminoácidos utilizados por essas espécies, produzem pouco ou nenhum efeito sobre a amplitude do crescimento bacteriano quando adicionados no meio de cultura. A substituição do hidrolisado parcial de caseína por casaminoácidos , de modo contrário, aumenta significativamente o crescimento observado (meio de cultura utilizado: vitaminas, sais inorgânicos, triptofano, cloridrato de cisteína, casaminoácidos - 2 g/L ou hidrolisado de caseína - 3% p/v e extrato de carne) . Apesar desta observação, o autor não avalia a produção de proteases. Mais comum do que o consumo de aminoácidos, a utilização de glicose como fonte energética para o crescimento é bem relatada para diversos microrganismos. Particularmente para C. histolyticum a adição de glicose (e outros açúcares) foi relacionada à redução do crescimento bacteriano (Mead, 1971) . Assim, apesar de inicialmente consideradas espécies sacaroliticas , por serem capazes de utilizarem carboidratos como fontes de energia, diversas linhagens de C. histolyticum apresentam-se como más fermentadoras de carboidratos simples, como glicose, maltose, entre outros. A redução do crescimento de C. histolyticum é ainda mais pronunciada quando os cultivos com glicose são realizados em condições de aerobiose, sugerindo-se a existência de dois fatores inibitórios, açúcares e oxigênio/ar.

Não só a diminuição do crescimento bacteriano, mas também a expressão de proteases já foi relacionada à presença de glicose no meio de cultivo de espécies de Clostridium (C. difficile, por exemplo) , sugerindo a existência de uma relação entre a repressão da expressão da toxina em um ambiente de cultivo com recursos de carbono rapidamente consumíveis .

Como já evidenciado acima, além dos requerimentos nutricionais, o crescimento bacteriano e produção de proteases por espécies do género Clostridium são influenciados pela manutenção de um ambiente anaeróbio. Como alguns anaeróbios, C. histolyticum tolera pequenas quantidades de oxigénio, fato esse observado para outras espécies do género, podendo ser considerado como um microrganismo aerotolerante . Apesar disso, para a definição de processos de crescimento e produção de proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica por C. histolyticum em meio liquido, condições mínimas de anaerobiose devem ser asseguradas .

Os agentes redutores são fundamentais em culturas líquidas de anaeróbios. Entre os agentes mais utilizados estão: digesto de carne, glicose, tioglicolato de sódio, cisteína, sais de ferro ou ferro metálico ou misturas destes.

Hoje, ainda pouco se sabe sobre os componentes do meio de cultivo que influenciam o crescimento e secreção de proteases por C. histolyticum. Dos estudos realizados até o momento, há um consenso apenas sobre a importância dos ingredientes de origem animal, principalmente peptonas, sobre o crescimento de Clostridum histolyticum e a influência desses componentes sobre a produção de proteases, entre elas as colagenases.

Os processos convencionais de cultivo C. histolyticum, apresentam muitas desvantagens como, por exemplo, baixos rendimentos, pouca reprodutibilidade e separação incompleta de impurezas. Além disso, um dos maiores problemas dos processos convencionais de cultivo de C. histolyticum é a predominância do uso de componentes de origem animal na produção de proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica para uso terapêutico em humanos.

A presença de componentes de origem animal ao longo do processo de produção de proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica de C. histolyticum para uso terapêutico em humanos adiciona, indese avelmente, um risco potencial de ocorrência de infecções e reações anafiláticas nos pacientes submetidos a esses tratamentos enzimáticos. Um exemplo muito conhecido de doença causada pela transmissão horizontal interespecífica de patógenos é a encefalite bovina espongiforme (doença de prion; "Doença da Vaca Louca") cuja transmissão do animal hospedeiro original (bovinos) para o homem foi registrada pela primeira vez em 1993, através do contato do ser humano com fluidos fisiológicos e consumo de carne dos animais infectados.

Na última década, os órgãos regulatórios têm incentivado a indústria farmacêutica a usar meios de cultura bacterianos compreendendo ingredientes de origem não animal ao invés de ingredientes de origem animal. Entretanto, atenção especial deve ser dada à esses ingredientes de origem não animal, pois frequentemente eles são submetidos à tratamentos enzimáticos com ingredientes de origem animal para a digestão dos seus componentes protéicos e carboidratos em peptonas e açúcares. Mesmo esses extratos enzimáticos animais sendo uma fração mínima da composição do produto final, a sua presença impede a classificação do produto como livre de componentes de origem animal ("animal free") .

Alguns meios de cultivo de espécies do género Clostridium livres de componentes de origem animal encontram- se descritos nos documentos: 09854296 (1998, Chiron) , WO0105997 (2000, Massachusetts Institute of Technology), WO2005035749 (2004, Allergan) , Busta & Schroder (1971, Effect of soy proteins on the growth of Clostridium perfringens. Appl Microbiol, 22(2), 177-183; Demain et al. (2007, Tetanus toxin production in soy-based médium: nutritional studies and scale-up into small fermentors. Lett Appl Microbiol, 45{6), 635-638); Fang et al. (2009, Production of Clostridum difficile toxin in a médium totally free of both animal and dairy proteins or digests. PNAS, vol. 106: 13225-13229).

Em geral, componentes a base de soja e extrato de levedura são utilizados como substituintes das peptonas de origem animal, sendo capazes de suportar tanto o crescimento, quanto a produção de toxinas nas espécies já investigadas do género Clostridium (C. sporogenes, C. tetanus, C. botulinicum) .

No caso do cultivo de C. histolyticum, especialmente para a produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica, o estado da arte pouco revela sobre a composição de meios de cultura livres de componentes de origem animal capazes de estimular a produção dessas proteases de maneira pelo menos equivalente aos meios tradicionais contendo peptonas de origem animal.

Para C. histolyticum, os meios de cultivo descritos até o momento apresentam desvantagens como, por exemplo: a presença de componentes animais, o alto custo associado a sua composição complexa, a baixa expressão de colagenases ou o longo tempo de cultivo para a obtenção de um sobrenadante com atividade colagenolitica e gelatinolitica adequada para a produção industrial com fins terapêuticos.

Tentativas de obtenção de um meio de cultura livre de componentes de origem animal adequado para o crescimento e produção de colagenases por C. histolyticum são relatadas a seguir .

O documento WO2007089851 (2007; Auxilium) descreve condições de cultivo de C. histolyticum para a obtenção de colagenases. Apesar de descrever a produção de colagenases por C. histolyticum em um meio de cultura livre de componentes de origem animal, destaca como preferido para produzir, com melhor reprodutibilidade, colagenase, um meio de cultura contendo proteose peptona (origem animal) . Apenas o meio de cultura com ingredientes de origem animal foi capaz de produzir as colagenases em proporção adequada para maximizar a sua atividade sinergistica, resultando em um beneficio terapêutico. Além das peptonas (vegetais e/ou animais) , o meio de cultura descrito pode conter aminoácidos (glutamina, triptofano e asparagina) , extrato de levedura, sais inorgânicos, glicose e vitaminas.

O documento US20100086971 (2009; Roche) descreve um meio de cultura para C. histolyticum que inclui peptona derivada de plantas, entretanto, um aditivo derivado de animal gelatina de peixe - é apontado como crucial para maior atividade colagenolitica do sobrenadante dessas culturas. Destaca que a composição liquida contendo peptonas vegetais e gelatina de peixe suporta maior crescimento bacteriano e maior atividade colagenolitica do que o meio de cultura padrão contendo peptona de origem animal.

Assim, até o presente momento, nenhum meio de cultura completamente livre de componentes de origem animal foi capaz de suportar a produção industrial adequada de colagenases por C. histolyticum como demonstrado para os meios de cultura tradicionais, contendo peptonas animais.

Desta forma, é evidente a necessidade do desenvolvimento de meios de cultura livres de componentes de origem animal e processos para a produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica de C. histolyticum.

Assim, a presente invenção tem como objetivo apresentar um meio de cultura para bactérias do género Clostridium, preferencialmente C. histolyticum, livre de componentes de origem animal e processo para produção de sobrenadante contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica adequado para a produção industrial de enzimas colagenoliticas e gelatinoliticas , em especial colagenases, para fins terapêuticos.

Descrição Resumida da Invenção

A presente invenção refere-se a um meio de cultura para bactérias do género Clostridium, livre de componentes de origem animal, caracterizado por compreender água, peptona de origem não animal, ou seus derivados, extrato de levedura e os aminoácidos cisteina e arginina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis . Preferivelmente, as bactérias são de linhagens da espécie Clostridium histolyticum .

O meio de cultura da presente invenção pode compreender adicionalmente um ou mais aditivos selecionados do grupo constituído por agente para ajuste de pH na faixa entre 7 a 8, agente redutor, sais inorgânicos, vitaminas e misturas destes.

A peptona de origem não animal pode ser uma peptona vegetal ou peptona de levedura. Preferivelmente a peptona de origem não animal é uma peptona vegetal selecionada do grupo constituído por soja, algodão, trigo, girassol, arroz, amendoim, fava, ervilha, batata, milho ou misturas destes. Mais preferivelmente, a peptona vegetal é uma peptona de soja.

O meio de cultura da presente invenção é caracterizado pelo fato da concentração da peptona de origem não animal ser de 0,5% a 5% p/v, da concentração de extrato de levedura ser de 0,5% a 5% p/v, da concentração de cisterna, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,01% a 0,1% p/v e da concentração de arginina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,1% a 1% p/v. Preferivelmente, o meio de cultura desta invenção é caracterizado pelo fato da concentração da peptona de origem não animal ser de 1% a 4% p/v, da concentração de extrato de levedura ser de 1% a 4% p/v, da concentração de cisterna, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,03% a 0,07% p/v e da concentração de arginina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,25% a 0,7% p/v. Mais preferivelmente, o meio de cultura desta invenção é caracterizado pelo fato da concentração da peptona de origem não animal ser de 3% p/v, a concentração de extrato de levedura ser de 3% p/v, a concentração de cisteina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,0625% p/v e a concentração de arginina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,375% p/v.

Diferentemente dos meios utilizados convencionalmente para cultivo de C. histolyticum compreendendo pelo menos um ingrediente de origem animal, os meios de cultura da presente invenção são livres de componentes de origem animal, e surpreendentemente estimulam a produção de proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica, particularmente colagenases, de maneira superior aos meios de cultura convencionais contendo peptonas de origem animal.

A presente invenção também se refere a um processo para a produção de um sobrenadante de uma cultura líquida de Clostridium histolyticum contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica caracterizado por compreender as etapas de: a) fornecer um meio de cultura estéril, livre de componentes de origem animal; b) cultivar uma alíquota de cultura estoque de Clostridium histolyticum no meio de cultura da etapa (a) em condições de anaerobiose à cerca de 37 °C até a fase estacionária de crescimento bacteriano para obtenção de um inoculo; c) fornecer um meio de cultura estéril, livre de componentes de origem animal, de acordo com a presente invenção; d) adicionar ao meio de cultura da etapa (c) um volume do inoculo da etapa (b) igual ou inferior a 10% do volume final do meio definido em (c) ; e) cultivar a cultura de C. histolyticum obtida em (d) em condições de anaerobiose à cerca de 37°C até a fase estacionária de crescimento bacteriano; f) separar a matéria celular e outra matéria particulada da fase líquida do cultivo da etapa (e) produzindo um sobrenadante contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica. Tal processo pode incluir uma ou mais etapas adicionais para a purificação de uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica presentes no sobrenadante da etapa (f) .

A presente invenção também se refere a um sobrenadante de cultura liquida de C. histolyticum contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica obtido de acordo com o processo acima mencionado, e composições farmacêuticas compreendendo como ingrediente ativo o sobrenadante de cultura liquida de Clostridium histolyticum e excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

Breve Descrição das figuras

Aspectos da invenção são explicados ou ilustrados pelas seguintes figuras:

Figura 1. Comparação do crescimento bacteriano (densidade óptica 600 nm) de C. histolyticum (ATCC 21000) em cultivos com meios de cultura livre de componentes de origem animal (3% p/v de peptona vegetal, 3% p/v Extrato de levedura, 0,0625% p/v de cloridrato de cisteina) que diferem com relação ao tipo de Peptona vegetal e Extrato de levedura empregado. Meio de cultura padrão (contendo peptona de caseína) utilizado como comparador.

Figura 2. Comparação do crescimento bacteriano (densidade óptica 600 nm) de C. histolyticum (ATCC 21000) em cultivos com meios de cultura livre de componentes de origem animal que diferem quantitativamente com relação ao componente peptona vegetal (HY Pep 1511) e extrato de levedura (YE5114). Os meios de cultura livres de componentes de origem animal contém 0,0625% p/v de cloridrato de cisterna. Meio de cultura padrão (contendo peptona de caseína) utilizado como comparador. Figura 3. Influência sobre o crescimento (DO) e atividade enzimática de diferentes concentrações de extrato de levedura (0-3% p/v) na composição do meio de cultura livre de componentes de origem animal para C. histolyticum (ATCC 21000) contendo 3 ou 4% p/v de peptona de soja e 0,0625% p/v de cloridrato de cisteina.

Figura 4. Influência do pH no crescimento bacteriano (densidade óptica 600 nm) de C. histolyticum (ATCC 21000) em cultivos com meios de cultura livre de componentes de origem animal contendo 3% p/v de peptona de soja (NZ Soy BL4), 3% p/v de Extrato de levedura (YE251) e 0,0625% p/v de cloridrato de cisteina.

Figura 5. Influência da suplementação com sais inorgânicos, vitaminas e aminoácidos sobre o crescimento e atividade colagenolitica e gelatinolitica do sobrenadante obtido de cultura liquida de C. histolyticum (ATCC 21000) em meio de cultura livre de componentes de origem animal contendo: 3% p/v de peptona de soja (NZ SOY BL4), 3% p/v de extrato de levedura (YE 251) e 0,0625% p/v de cloridrato de cisteina. As barras (1-8) no gráfico referem-se a:

1 - Meio Ctrl:

-NZ-soy BL4 (3%) ;

-Ext. levedura YE 251 (3%);

-Cloridrato de cisteina (0,0625%);

2 - Ctrl + Sais*

3 - Ctrl + Vitaminas**

4 - Ctrl + Vitaminas** + Sais*

5 - Ctrl + Aa***

6 - Ctrl + Aa*** + Vitaminas**

7 - Ctrl + Aa*** + Sais*

8 - Ctrl + Aa*** + Vitaminas** + Sais* As vitaminas, e os sais foram testados nas seguintes concentrações :

Figura 6. Influência da suplementação com sais inorgânicos, vitaminas e aminoácidos sobre o crescimento e atividade colagenolitica e gelatinolitica do sobrenadante obtido de cultura liquida de C. histolytícum (ATCC 21000) em meio de cultura livre de componentes de origem animal contendo: 30 g/L de peptona de soja (NZ SOY BL4), 30 g/L de extrato de levedura (YE 251) e os aminoácidos cloridrato de cisteina (0,625 g/L) e cloridrato de arginina (3,75 g/L). Análise da atividade enzimática em gel de zimografia (amostras dos sobrenadantes obtidos para cada meio de cultura analisadas em duplicata). As barras (1 - 4) no gráfico referem-se a:

1 - Meio Ctrl+arginina :

-peptona vegetal NZ-soy BL4 (30 g/L) ;

-Extrato de levedura YE 251 (30 g/L); -Cloridrato de cisteína (0, 625 g/L) ;

-L-arginina (3,75 g/L).

2 - Ctrl + Vitaminas

3 - Ctrl + Fosfatos

4 - Ctrl + Vitaminas + Fosfatos

Figura 7. Comparação da atividade colagenolitica e gelatinolitica do sobrenadante obtido de cultura liquida de C. histolyticum (ATCC 21000) em cultivos com meios de cultura livre de componentes de origem animal (3% p/v de peptona vegetal, 3% p/v Extrato de levedura, 0,0625% p/v de cloridrato de cisteina) que diferem com relação ao tipo de Peptona vegetal e Extrato de levedura empregado. Meio de cultura padrão (contendo peptona de caseína) utilizado como comparador .

Figura 8. Crescimento bacteriano de C. histolyticum (ATCC 21000) e atividade colagenolitica e gelatinolitica do sobrenadante obtido de cultura líquida de C. histolyticum em meio de cultura livre de componentes de origem animal (30 g/L de peptona de soja NZ SOY BL4, 30 g/L de YE251 e 0,625 g/L de cisteína) contendo, adicionalmente, arginina, glicina ou ambos. Na legenda do eixo horizontal temos que:

Ctrl* = NZ-SoyBL4 (30 g/L); Extrato de levedura YE 412 (30 g/L); Cloridrato de cisteína (0,625 g/L); e GA** = Glicina + L-arginina-HCl

Figura 9. Crescimento bacteriano de C. histolyticum (ATCC 21000) e atividade colagenolitica e gelatinolitica do sobrenadante obtido de cultura líquida de C. histolyticum em meio de cultura livre de componentes de origem animal (3% p/v de peptona de soja NZ SOY BL4, 3% p/v de YE251 e 0,0625% p/v de cisteína) contendo adicionalmente grupos de aminoácidos (Grupos de 1 a 6) . Análise da atividade enzimática em gel de zimografia (1 a 6 representam os meios de cultura contendo os grupos de aminoácidos avaliados) . As barras (Grupos de 1 -6 e Controle) no gráfico referem-se a:

'Aminoácidos à lmg/ral cada.

Figura 10. Crescimento bacteriano de C. histolyticum (ATCC 21000) e atividade colagenolitica e gelatinolitica do sobrenadante obtido de cultura liquida de C. histolyticum em meio de cultura livre de componentes de origem animal (3% p/v de peptona de soja NZ SOY BL4, 3% p/v de YE 251 ou YE 412 e 0, 0625% p/v de cisteina) em Biorreator (escala 3 L) . Análise da atividade enzimática ém gel de zimografia ao longo do cultivo .

Figura 11. Crescimento bacteriano de C. histolyticum (ATCC 21000) e atividade colagenolitica e gelatinolitica do sobrenadante obtido de cultura liquida de C. histolyticum em meio de cultura livre de componentes de origem animal (3% p/v de peptona de soja NZ SOY BL4, 3% p/v de YE251 e 0,0625% p/v de cisteina e 0,375% p/v de arginina) em Biorreator (escala 3 L) . Análise da atividade enzimática em gel de zimografia (B) e análise do perfil protéico em gel SDS PAGE (C) ao longo do cultivo (resultados apresentados apenas após 7 horas de cultivo) .

Figura 12. Análise comparativa do crescimento e atividade colagenolitica e gelatinolitica do sobrenadante obtido de cultura liquida de C. histolyticum (ATCC 21000) em meios de cultura livre de componentes de origem animal contendo: 3% p/v de peptona de soja NZ SOY BL4 , 3% p/v de YE251 e 0,0625% p/v de cisteina; ou 3% p/v de peptona de soja NZ SOY BL4, 3% p/v de YE251, 0, 0625% p/v de cisteina e 0, 375% p/v de arginina. Cultivos em Biorreator (escala 3 L) . Análises realizadas ao final do cultivo.

Figura 13. Recuperação de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica do sobrenadante obtido de cultura liquida de C. histolyticum (ATCC 21000) em meio de cultura livre de componentes de origem animal contendo 3% p/v de peptona de soja NZ SOY BL4, 3% p/v de YE251, 0, 0625% p/v de cisteina e 0,375% p/v de arginina. Análise do perfil protéico em gel SDS PAGE ao longo do processo. No gráfico temos que as colunas de 1 a 6 se referem a:

Figura 14. Análise comparativa do crescimento (DO 600 nm) e atividade colagenolitica e gelatinolitica (mU/mL) dos sobrenadantes obtidos de cultura liquida de C. histolyticum ATCC 21000 e T248 em meios de cultura livre de componentes de origem animal contendo: 3% p/v de peptona de soja NZ SOY BL4, 3% ρ/v de YE251, 0, 0625% p/v de cisteina e 0, 375% p/v de arginina. Cultivos em Biorreator (escala 3 L) . Análises realizadas ao final do cultivo (14hr).

Descrição detalhada da invenção

Para garantir uma melhor compreensão do escopo da invenção, sem que isso seja um fator limitante, os termos específicos das áreas de tecnologia relacionadas a presente invenção são definidos a seguir.

"Proteases" (proteinases, peptidases ou enzimas proteolíticas, EC 3.4), de acordo com esta invenção são enzimas que quebram ligações peptídicas entre os aminoácidos das proteínas.

A presente invenção se refere à " colagenases" de Clostridium histolyticum tipo I e tipo II de acordo com a descrição fornecida por Bond . D., van Wart, H. E., 1987, Biochemistry 23:3077-3085 e Bond, M. D., van Wart, H. E., 1984, Biochemistry, 23: 3085.

"Proteínas de colágeno" ou " colágeno" se referem às principais proteínas estruturais presentes na pele e osso da maioria dos animais, importantes componentes da matriz extracelular . As moléculas de colágeno consistem de 3 cadeias polipeptídicas individuais (cadeias alfa) enroladas umas às outras em uma conformação tripla hélice, estabilizada por pontes de hidrogénio.

Na presente invenção, "gelatina" se refere a uma forma protéica irreversível de colágeno parcialmente hidrolisado.

"Atividade colagenolítica e gelatinolítica" é a medida da atividade de proteases na degradação de moléculas de colágeno e/ou gelatinas. De maneira geral, a atividade colagenolítica e gelatinolítica de proteases é verificada através da capacidade e velocidade de degradação de colágeno e gelatinas e representada em unidades/mL, unidades/L, unidades/mg ou unidades/g de enzima. A quantificação da atividade colagenolítica e gelatinolítica pode ser realizada através de ensaios viscosimétricos , colorimétricos (ninidrina; Moore & Stein, JBC, 176, 367, 1948) ou fluorimétricos (substratos colágeno e gelatina marcados com fluoresceína; EnzChek®) . No caso das quantificações através de ensaio colorimétrico com ninidrina, a atividade é medida através da hidrólise enzimática de substrato sintético (Carbobenzoxy-Gly-Pro-Gly- Gly-Pro-Ala) .

Nesta invenção, "crescimento bacteriano" é definido como a divisão de uma célula bacteriana em duas células-filhas idênticas durante um processo chamado de fissão binária. Desta forma, a duplicação da população bacteriana ocorre a cada divisão. Entretanto, se o número de sobreviventes excede a média, a população bacteriana apresenta crescimento exponencial. A medida do crescimento bacteriano exponencial em uma cultura pode ser monitorada através de métodos muito bem conhecidos, como por exemplo, contagem direta de células bacterianas (microscopia, citometria de fluxo) , determinação de valor de biomassa (miligramas, gramas quilos ou toneladas) , contagem de colónias, densidade óptica (medida em espectrofotômetro, comprimento de onda aproximado de 600 nm) , consumo de nutrientes, entre outros. O crescimento bacteriano pode ser caracterizado por quatro diferentes fases: "fase lag" , "fase exponencial ou log", "fase estacionária" e "fase de declínio ou morte".

De maneira geral e em teoria, durante a "Fase lag", as bactérias se adaptam às condições de crescimento. É um período no qual as células estão entrando em um estado de maturação, sendo ainda incapazes de se dividirem. A "fase exponencial ou log" é um período caracterizado pela duplicação celular. Se o crescimento não é limitante, a duplicação celular continua em uma velocidade constante, assim ambos, o número de células e a velocidade de crescimento, duplicam a cada período de tempo. O crescimento exponencial não pode continuar indefinidamente, já que o meio de crescimento possui restrições nutricionais e acúmulo de metabólitos, muitas vezes tóxicos, produzidos pelas células bacterianas em divisão. Durante a "fase estacionária" a velocidade de crescimento diminui em razão das restrições nutricionais e acúmulo de metabólitos tóxicos. Essa fase caracteriza o momento de exaustão de recursos presentes no meio de cultura bacteriana. Na "fase de declínio ou morte", as bactérias esgotam os nutrientes ainda disponíveis no meio de cultura e morrem.

Nesta invenção, "pré-inóculo" é definido como a suspensão de microrganismos obtida a partir do cultivo de uma cultura estoque, a ser utilizado para a continuação do crescimento do microrganismo para a produção de um inoculo.

"Inoculo" ^' é a denominação dada à suspensão de microrganismos em concentração adequada, a ser usada para a continuação do crescimento e/ou fermentação do microrganismo em escala maior (maior volume de meio de cultivo) do que a inicial .

"Condição anaeróbia" ou "anaerobiose" nesta invenção significa a manutenção de condição de cultivo substancialmente livre de oxigénio.

"Meio de cultura fresco" se refere a qualquer meio de cultura para crescimento ou fermentação de microrganismos que não tenha sido ainda utilizado, ou seja, possua integralmente todos os seus componentes.

"Meio de congelamento" é a denominação dada a uma composição capaz de manter a viabilidade de um microrganismo após o seu congelamento, ou liofilização e armazenamento e, consequentemente, a sua capacidade de crescimento e fermentação após o período de armazenamento.

0 armazenamento do microrganismo no meio de congelamento pode ser realizado em temperaturas adequadas para a manutenção do seu congelamento. Além disso, também é possível executar uma etapa de liofilização do microrganismo em meio de congelamento antes do seu armazenamento. Nesta invenção, o meio de congelamento é livre de componentes de origem animal e contém adicionalmente um agente de criopreservação .

"Agente de criopreservação", ou crioprotetor, é uma substância capaz de preservar a viabilidade do microrganismo após o seu congelamento. Dentre os agentes de criopreservação conhecidos para microrganismos destacam-se: sacarose, glicerol, dimetilsulfóxido (DMSO) , entre outros.

"Cultura estoque ou de armazenamento" corresponde a uma aliquota do microrganismo em meio de congelamento armazenado por um período determinado.

"Sobrenandante" é a denominação utilizada nesta invenção para a fase líquida do meio de cultivo (meio de crescimento ou de fermentação) de um microrganismo, que seja livre de material sólido ou particulado. O sobrenadante pode ser obtido por métodos de centrifugação e/ou filtração conhecidos no estado da técnica.

"Peptonas" são compreendidas na presente invenção como sendo misturas de compostos formados através da hidrólise de proteínas (compreende fragmentos de proteínas, cuja composição depende da fonte protéica utilizada para hidrólise) . Usualmente, as peptonas são obtidas por hidrólise enzimática ou ácida de produtos naturais como tecidos animais, leite, tecidos vegetais ou culturas microbianas.

Frequentemente a fonte de proteína para a produção de peptonas de origem animal é um produto secundário da manufatura de carnes e alimentos derivados de leite. Assim, como resultado da sua hidrólise, há inúmeros outros compostos, além de peptídeos e aminoácidos, como por exemplo, gorduras, metais, sais e vitaminas.

"Livre de componentes de origem animal" é a denominação dada à ausência completa de qualquer produto ou composto de origem animal. "Animal" diz respeito a mamíferos, pássaros, répteis, peixes, anfíbios, artrópodes e outras espécies animais. "Animal" exclui microrganismos como bactérias e leveduras. Assim, "livre de componentes de origem animal" pode incluir proteases derivadas de bactérias do género Clostridium, como por exemplo, C. histolyticum. "Livre de componentes de origem animal" não inclui proteínas derivadas de animais, como por exemplo: imunoglobulinas ; digestos de carne, derivados de carne e produtos do leite e seus derivados .

"Componente", "ingrediente", "produto" ou "fonte" "de origem não animal" no contexto da presente invenção são as fontes preferidas de ingredientes para o meio de cultura de Clostridium histolyticum, incluindo vegetais, microrganismos (como por exemplo, levedura) e compostos sintéticos.

"Meio de cultura padrão ou tradicional" refere-se aos meios de cultura para crescimento e/ou fermentação de bactérias do género Clostridium, especialmente C. histolyticum, caracterizados por compreender ingredientes de origem animal, entre eles, proteose peptona, digestos trípticos de carne ou caseína, peptona de caseína, entre outros .

Descrição da invenção

Sabe-se que no caso do crescimento de Clostridium histolyticum, peptonas de origem animal são consideradas ingredientes essenciais do meio de cultura, tendo uma grande influência sobre a produção de proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica . Entretanto, para a produção de proteases para uso terapêutico em humanos, o ideal é que ingredientes de origem animal sejam evitados ao longo de todo processo, eliminando o risco de transmissão horizontal interespecífica de patógenos e a indução de reações imunológicas patológicas contra peptídeos antigênicos de origem animal que possam estar presentes no produto final, mesmo após muitas etapas de purificação.

Desta forma, a presente invenção descreve um meio de cultura livre de componentes de origem animal para o crescimento e produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica por bactérias do género Clostridium . Preferivelmente, um meio de cultura para C. histolyticum.

0 crescimento bacteriano e a produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica através do meio de cultura livre de componentes de origem animal descrito nesta invenção foram comparados às observações dos mesmos parâmetros para cultivos em meio de cultura contendo ingredientes de origem animal como proteose peptona ou hidrolisado de caserna (denominado de meio de cultura padrão ou tradicional).

Particularmente, o meio de cultura descrito na presente invenção estimula a produção de sobrenadante com atividade colagenolitica e gelatinolitica maior do que a obtida através do cultivo de Clostridium histolyticum em meio de cultura padrão (contendo peptonas de origem animal) .

Desta forma, a presente invenção apresenta um meio de cultura para bactérias do género Clostridium, preferivelmente C. histolyticum livre de componentes de origem animal caracterizado por compreender água, peptona de origem não animal, ou seus derivados, extrato de levedura e os aminoácidos cisteina e arginina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis.

O meio de cultura da presente invenção pode compreender adicionalmente um ou mais aditivos selecionados do grupo constituído por agente para ajuste de pH na faixa entre 7 a 8, agente redutor, sais inorgânicos, vitaminas e misturas destes.

Níveis ótimos de crescimento bacteriano e produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica, especificamente colagenase, são obtidos para o meio de cultura descrito nesta invenção com pH variando entre 7,0 a 8,0. Preferivelmente, o pH do meio de cultura é cerca de 7,0. O ajuste do pH deve ser realizado após procedimento de esterilização e antes do inicio do cultivo de C. histolyticum, utilizando-se soluções aguosas de um agente para ajuste de pH conhecido do estado da técnica, por exemplo, sulfato de amónio, NaOH, ácido sulfúrico ou ácido nítrico, não se limitando a estes.

Os aditivos (agente redutor, sais inorgânicos e vitaminas) gue podem ser incluídos no meio de cultura livre de componentes de origem animal são selecionados dentre as substâncias conhecidas do estado da arte.

O meio de cultura de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato do agente redutor ser selecionado do grupo constituído por tioglicolato de sódio, bissulfito de sódio, sais de ferro, glicose e misturas destes.

Adicionalmente, o meio de cultura de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato dos sais inorgânicos serem selecionados do grupo constituído por NaCl, KC1, Na ₂ HP0 ₄ , NaH ₂ P0 ₄ , KH ₂ P0 ₄ , K ₂ HP0, MgS0 ₄ , FeS0 ₄ , MnS0 ₄ , e misturas destes.

Além disso, o meio de cultura de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato das vitaminas serem selecionadas do grupo constituído por biotina, ácido pimélico, nicotinamida, pantotenato de cálcio, ácido fólico, nitrato de tiamina, riboflavina, ácido p-aminobenzóico (PABA) e misturas destes.

As peptonas de origem não animal avaliadas como ingredientes do meio de cultivo de Clostridium histolyticum, encontram-se listadas na Tabela 1.

Tabela 1. Peptonas de origem não animal avaliadas como ingredientes do meio de cultura para Clostridium histolyticum descrito na presente invenção.

Peptonas de origem não animal Fornecedor

Amysoy® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)

HYP A® BioSpringer (França)

Hy-Pep 1510® Sheffield ™ Bioscience ( erry, EUA)

Hy-Pep 1511® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)

Hy-Pep 4601® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)

Hy-Pep 4605® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)

Hy-Pep 5603® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)

Hy-Pep 7504® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)

Hy-soy® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)

NZ-Soy BL4® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)

NZ-Soy BL7® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)

Peptona de soja 312 - AF® Biotecnica Internacional (México)

Peptonas de origem não-animal também podem ser obtidas de outros fornecedores, como por exemplo: Soy peptone® (Gibco) , Bac-soytone® (Difco) , SE50M® (DMV) , Peptona de soja 312® (Biotecnica International, México), SE50MAF-UF® (DMV), Stedygro Soy® e Proyield Soy®.

0 meio de cultura para Clostridium histolyticum livre de componentes de origem animal é caracterizado pelo fato da peptona de origem não animal ser uma peptona vegetal selecionada do grupo constituído por soja, algodão, trigo, girassol, arroz, amendoim, fava, ervilha, batata, milho ou misturas destes. Preferivelmente a peptona vegetal é uma peptona de soja, algodão, trigo ou uma mistura destas. Mais preferivelmente, o meio de cultura para Clostridium histolyticum livre de componentes de origem animal é caracterizado pelo fato da peptona vegetal ser de soja.

A presente invenção revela a observação surpreendente de que peptonas ou outros componentes de origem animal não são necessários em meios de cultura para Clostridium histolyticum, e que o meio de cultura da presente invenção, livre de componentes de origem animal, propicia uma produção de proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica superior àquela obtida em meios de cultura convencionais contendo componentes de origem animal.

Peptonas de origem vegetal de diferentes fornecedores podem ser utilizadas como componente do meio de cultura para Clostridium histolyticum livre de componentes de origem animal de acordo com a presente invenção. Preferivelmente, as peptonas vegetais são hidrolisadas e o seu processo de preparação também é livre de componentes de origem animal.

O meio de cultura de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato da peptona vegetal ser selecionada do grupo constituído por Hy Soy®, Soytone®, Amisoy®, NZ Soy BL4®, NZ Soy BL7®, Hy Pep 1510®, Hy Pep 1511®, Hy Pep 5603®, Hy Pep 7504®, Stedygro Soy®, SE50M®, Proyield Soy®, SE50MAF-UF®, Peptona de soja 312®, e Hy Pep 4601® e misturas destas.

Preferivelmente, o meio de cultura é caracterizado pelo fato da peptona vegetal ser selecionada do grupo constituído por Hy Pep 4601®, NZ soy BL4®, HyPep 1511® e Hy Pep 7504®. Mais preferivelmente, o meio de cultura de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato da peptona vegetal ser NZ soy BL4®.

Além das peptonas de origem não animal ou peptonas vegetais, o meio de cultura desenvolvido para cultivo de Clostridium histolitycum e descrito na presente invenção possui extrato de levedura como um ingrediente fundamental. Os fornecedores comerciais avaliados para esse ingrediente encontram-se listados na Tabela 2.

Tabela 2. Extratos de Levedura avaliados como ingredientes do meio de cultura para Clostridium histolyticum descrito na presente invenção.

Extrato de levedura Fornecedor

Bacto YE® BD Bioscience (EUA)

Hy-Pep YE® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)

Hy-Yeast 412® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)

Hy-Yeast 413® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)

Hy-Yeast 502® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)

Hy-Yeast 501® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)

Hy-Yeast 503® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA)

Prodex 710 SD® BioSpringer (França)

Prodex NS70SD® BioSpringer ( França )

Pronal 5001® BioSpringer (França) Extrato de levedura Fornecedor

YE 11® Sheffield ™ Bioscience (Kerry, EUA) YE151® Biotecnica Internacional (México) YE251® BioSpringer (França)

YE 70161® Fluka (Sigma-Aldrich GmbH)

YE Y4250® Sigma-Aldrich GmbH

Synth® Synth® (Brasil)

YE 207® BioSpringer (França)

YE 5114® Vetec Química Fina (Brasil)

Preferivelmente, o meio de cultura descrito na presente invenção é caracterizado pelo fato do extrato de levedura ser selecionado do grupo constituído por Bacto YE®, Hy-Pep YE®, Hy-Yeast 412®, Hy-Yeast 413®, Hy-Yeast 502®, Hy-Yeast 501®, Hy-Yeast 503® Prodex 710 SD®, Prodex NS70SD®, Pronal 5001®, YE 11®, YE 151®, YE 251®, YE 70161®, YE Y4250®, Synth®, YE 207®, YE 5114® e misturas destes. Mais preferivelmente, o meio de cultura é caracterizado pelo fato do extrato de levedura ser YE 251®.

Com relação aos aminoácidos, arginina é L-arginina e cisteína é L-cisteína ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Preferivelmente, o meio de cultura de acordo com a invenção é caracterizado pelo fato dos sais farmaceuticamente aceitáveis serem cloridrato de cisteína e cloridrato de arginina.

Quantitativamente, o meio de cultura descrito nesta invenção é caracterizado pelo fato da concentração da peptona de origem não animal ser de 0,5% a 5% p/v, da concentração de extrato de levedura ser de 0,5% a 5% p/v, da concentração de cisteína, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,01% a 0,1% p/v e da concentração de arginina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,1% a 1% p/v.

Preferivelmente, o meio de cultura é caracterizado pelo fato da concentração da peptona de origem não animal ser de 1% a 4% p/v, da concentração de extrato de levedura ser de 1% a 4% p/v, da concentração de cisteína, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,03% a 0,07% p/v e da concentração de arginina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,25 a 0,7% p/v. Mais preferivelmente o meio de cultura é caracterizado pelo fato da concentração da peptona de origem não animal ser de 3% p/v, a concentração de extrato de levedura ser de 3% p/v, a concentração de cisteina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0, 0625% p/v e a concentração de arginina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, ser de 0,375% p/v.

De acordo com a presente invenção, o meio de cultura deve ser esterilizado antes do inoculo de C. histolyticum. A esterilização pode ser realizada através de métodos conhecidos por um técnico no assunto, como por exemplo, tratamento por calor úmido em autoclave ou filtração. Desta forma, o meio de cultura descrito nesta invenção é caracterizado por ser estéril.

Preferivelmente, o meio de cultura livre de componentes de origem animal descrito nesta invenção é caracterizado por ser liquido.

O meio de cultura de acordo com a presente invenção também é caracterizado por ser utilizado em um processo para a produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica .

As proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica são secretadas na fase liquida do meio de cultura para C. histolyticum, livre de componentes de origem animal da presente invenção. Colagenases são algumas das proteases secretadas, sendo os principais componentes de natureza protéica do sobrenadante produzido através do cultivo de C. histolyticum. Em um outro aspecto da presente invenção, é descrito um processo para a produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica caracterizado por compreender o cultivo de C. histolyticum em um meio de cultura livre de componentes de origem animal conforme revelado na presente invenção.

0 processo para a produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica é caracterizado por compreender as etapas de:

a) fornecer um meio de cultura estéril, livre de componentes de origem animal;

b) cultivar uma aliquota de cultura estoque de Clostridium histolyticum no meio de cultura da etapa (a) em condições de anaerobiose à cerca de 37°C até a fase estacionária de crescimento bacteriano para a obtenção de um inoculo;

c) fornecer um meio de cultura estéril, livre de componentes de origem animal, de acordo com o descrito na presente invenção;

d) adicionar ao meio de cultura da etapa (c) um volume do inoculo da etapa (b) igual ou inferior a 10% do volume final do meio definido em (c) .

e) cultivar a cultura de C. histolyticum obtida em (d) em condições de anaerobiose à cerca de 37°C até a fase estacionária de crescimento bacteriano;

f) separar a matéria celular e outra matéria particulada da fase liquida do cultivo da etapa (e) produzindo um sobrenadante contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica. A anaerobiose das etapas (b) e (e) do processo acima descrito pode ser estabelecida através de várias técnicas, não se limitando àquelas escolhidas para exemplificar a presente invenção. Métodos para manutenção de condições de anaerobiose para crescimento de microrganismos são bem conhecidos por um técnico no assunto. Por exemplo, a anaerobiose das etapas (b) e (e) pode ser mantida através da adição de 2 ao meio de cultura durante todo o processo de cultivo.

O meio de cultura descrito na etapa (a) do processo para produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum é utilizado para a expansão do número de microrganismos de uma cultura estoque, armazenada em condições adequadas para a manutenção da viabilidade celular. Preferivelmente, a cultura estoque é mantida à -80°C em meio de cultivo livre de componentes de origem animal contendo um ou mais agentes de criopreservação . Para o crescimento de C. histolyticum em meio livre de componentes de origem animal, o ideal é que o cultivo seja realizado a partir de uma cultura estoque caracterizada por conter meio de cultura livre de componentes de origem animal.

A cultura estoque armazenada é produzida a partir do meio de cultura livre de componentes de origem animal compreendendo peptonas vegetais, preferivelmente peptona de soja, ou seus derivados, extrato de levedura, cisteina, pH entre 6,5 e 8,0 e adicionalmente um agente de criopreservação. Agentes de criopreservação para microrganismos, especificamente bactérias, são amplamente conhecidos por um técnico no assunto e podem ser selecionados , sem limitação, de um grupo consistindo de glicerol, sacarose, dimetilsulfóxido e glicose. A quantidade do agente de criopreservação a ser adicionado ao meio de cultura estoque varia de acordo com a linhagem bacteriana e deve ser ajustada previamente a elaboração do banco de microrganismo estoque ("master cell bank" e "work cell bank") .

O objetivo da fase de crescimento (etapa (b) ) é aumentar a quantidade de microrganismos disponíveis e viáveis para a produção das proteases com atividade colagenolitica e gelatinolítica, fato este que ocorre durante a etapa (e) . Adicionalmente, a fase de crescimento permite que os microrganismos dormentes da cultura estoque cresçam ativamente e secretem as proteases com atividade colagenolitica e gelatinolítica na etapa (e) .

O meio de cultura estéril e livre de componentes de origem animal da etapa (a) do processo acima descrito é caracterizado por compreender água, peptona de origem vegetal, extrato de levedura e cisterna. Especificamente, o meio de cultura estéril, livre de componentes de origem animal da etapa (a) é caracterizado por compreender água, de 0,5 a 5% p/v de peptona vegetal, de 0,5 a 5% p/v de extrato de levedura, de 0,01 a 0,1% p/v de cisteína ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis e pH entre 6,5 e 8,0. Preferivelmente, o meio de cultura da etapa (a) é caracterizado por compreender água, 3% p/v de peptona vegetal, 3% p/v de extrato de levedura, 0,0625% p/v de cisteína ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis e pH entre 6,5 e 8,0.

Os resultados apresentados nos Exemplos 1 e 2 mostram que não há necessidade de adição de arginina ao meio de cultura livre de componentes de origem animal para que o crescimento de C. histolyticum seja superior ao apresentado em meio de cultura padrão (contendo peptona de origem animal). Assim, considerando apenas a composição mínima do meio de cultura para atingir os resultados descritos na presente invenção, o meio de cultura preferido para a etapa (a) foi definido apenas com os seus componentes essenciais. Entretanto, resultados semelhantes aos demonstrados para o meio de cultura da etapa (a) são observados em meio de cultura livre de componentes de origem animal compreendendo adicionalmente arginina e outros aditivos (sais inorgânicos, vitaminas e agentes redutores) conforme definido previamente nesta invenção para o meio de cultura para C. histolyticum.

O aminoácido arginina é essencial para os resultados surpreendentes desta invenção com relação à produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica por C. histolyticum (etapa (e) ) . A produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica durante o cultivo de C. histolyticum em meio de cultura livre de componentes de origem animal de acordo com a presente invenção compreendendo os aminoácidos cisteina e arginina é superior à produção observada com o cultivo de C. histolyticum em meio de cultura contendo apenas o aminoácido cisteina e é superior ao observado para os cultivos dessa espécie bacteriana em meio de cultura padrão (contendo peptona de origem animal) .

Desta forma, o processo para produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica é caracterizado pelo fato do meio de cultura estéril, livre de componentes de origem animal da etapa (c) compreender água, peptona vegetal, extrato de levedura, cisteina e arginina, nas faixas de concentração definidas na presente invenção, e pH entre 7,0 e 8,0.

Preferivelmente, o processo para produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica é caracterizado pelo fato do meio de cultura estéril, livre de componentes de origem animal da etapa (c) compreende água, 3% p/v de peptona vegetal, 3% p/v de extrato de levedura, 0, 0625% p/v de cisteina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, 0,375% p/v de arginina, ou seus sais farmaceuticamente aceitáveis, e pH entre 7,0 e 8,0.

O crescimento bacteriano pode ser monitorado pela medida de densidade óptica do meio de cultura durante o processo acima descrito (etapas (b) e (e) ) em espectrofotômetro (leitura à 600 nm) de acordo com métodos bem conhecidos por um técnico no assunto.

0 cultivo de C. histolyticum durante a etapa (b) pode ocorrer em uma ou mais etapas. Preferivelmente, o processo para produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum é caracterizado pelo fato da etapa (b) compreender pelo menos as fases: 1) cultivar a cultura estoque em meio de cultura da etapa (a) na proporção 0,1:1 v/v por cerca de 16 horas para a obtenção de um pré-inóculo; 2) adicionar ao pré-inóculo um volume de meio igual ou superior ao dobro do volume do meio de cultura da fase (1) e manter o cultivo por cerca de 12 horas para a obtenção de um inoculo.

É fundamental que o crescimento durante a etapa (b) não acarrete a lise celular antes da sua inoculação no meio de cultura da etapa (c) , mantendo desta forma a viabilidade do inoculo .

O processo para produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum pode ser caracterizado por compreender apenas as etapas de (c) a (f) , sendo iniciado a partir do cultivo de cultura estoque de C. histolyticum diretamente no meio definido na etapa (c) , sem a necessidade da produção de um inoculo.

Preferivelmente, o processo para produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum é caracterizado pelo fato do cultivo de C. histolyticum durante a etapa (e) envolver a adição de um ou mais agentes conhecidos para ajuste de pH em quantidade suficiente para manutenção do pH do meio de cultura entre 6,5 a 8,0.

Na presente invenção, durante a etapa (f) do processo de obtenção das enzimas colagenoliticas de C. histolyticum, a separação da matéria celular ou outra matéria particulada da fase liquida do meio de cultura, pode ser realizada através de diferentes técnicas de filtração, centrifugação ou purificação cromatográfica, conhecidas no estado da técnica, não se limitando a filtração tangencial, centrifugação, cromatografia de gel filtração, entre outras.

Assim, o processo para produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum é caracterizado pelo fato da etapa (f) ser realizada através de procedimentos de filtração ou centrifugação ou ambos.

Adicionalmente, o processo para produção de um sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum é caracterizado por conter uma ou mais etapas adicionais para a purificação de uma ou mais proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica presentes no sobrenadante obtido na etapa (f) . A purificação pode ser realizada através de diferentes métodos de filtração, purificação cromatográfica ou precipitação salina, não se limitando a precipitação com sulfato de amónio; filtração tangencial; cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade, cromatografia de gel filtração, entre outros, individualmente ou combinados.

De acordo com a presente invenção, o sobrenadante da cultura líquida de C. histolyticum é uma mistura complexa compreendendo não só proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica, especialmente colagenases, mas também outras proteínas, metabólitos bacterianos, componentes do meio de cultura, entre outras substâncias.

Desta forma, um aspecto adicional da presente invenção refere-se ao sobrenadante de uma cultura liquida de Clostridium histolyticum contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica caracterizado por ser produzido pelo processo da presente invenção conforme descrito acima.

Particularmente, o sobrenadante de acordo com a presente invenção é caracterizado por ser constituído de 20 a 90% de colagenases após purificação.

O sobrenadante de acordo com a invenção pode ser diretamente purificado para a obtenção de uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica. Alternativamente, o sobrenadante pode ser armazenado na forma congelada ou liofilizada, sem, no entanto, perder a sua atividade colagenolitica e gelatinolitica.

Em um outro aspecto, a invenção revela o uso do sobrenadante de uma cultura líquida de C. histolyticum obtido a partir do processo descrito na presente invenção caracterizado por ser na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças que se beneficiam da atividade colagenolitica e gelatinolitica das proteases de C. histolyticum. Particularmente, a invenção descreve o uso do sobrenadante de uma cultura líquida de C. histolyticum caracterizado por ser na preparação de um medicamento para o tratamento de doenças mediadas por colágeno ou acúmulo de tecidos fibrosos. Adicionalmente, a invenção descreve o uso do sobrenadante de uma cultura líquida de C. histolyticum caracterizado por ser na preparação de um medicamento para o tratamento de tecidos necrosados e/ou processos de cicatrização. Além disso, o uso do sobrenadante de uma cultura líquida de C. histolyticum é caracterizado por ser na preparação de um medicamento para o debridamento enzimático.

Queimaduras e lesões dérmicas de natureza diversa são exemplos de situações onde o tratamento dos tecidos necrosados faz-se necessário.

A presente invenção também revela uma composição farmacêutica caracterizada por compreender como ingrediente ativo o sobrenadante de uma cultura liquida de C. histolyticum obtido a partir do processo descrito nesta invenção e excipientes farmaceuticamente aceitáveis . A composição farmacêutica pode incluir um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis, tampões, carreadores, estabilizadores, preservativos e espessantes.

A composição farmacêutica, de acordo com a invenção, é caracterizada por ser para a administração em um animal ou humano para fins terapêuticos ou cosmético.

Conforme a presente invenção, as composições farmacêuticas compreendendo como ingrediente ativo o sobrenadante de uma cultura liquida de C. histolyticum podem ser administradas pelas vias oral, sublingual, nasal, intravenosa, intramuscular, intraperitoneal, intra-articular, subcutânea, cutânea, transdérmica, não sendo limitada a estas. Preferivelmente, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção é caracterizada por ser formulada para administração pelas vias subcutânea, cutânea e transdérmica.

Mais preferivelmente, a composição farmacêutica de acordo com a invenção é caracterizada por ser para uso tópico e compreender de 0,2U a 1,8U de colagenase por grama de composição (método colorimétrico com ninidrina) .

Os carreadores ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis são selecionados em função da apresentação final da composição que pode ser na forma de, mas não limitados à cápsulas, comprimidos, soluções para a administração oral, soluções para administração nasal, solução injetável para administração intramuscular, intravenosa, cutânea ou subcutânea ou ainda soluções, pomadas ou cremes para uso tópico. Assim, as composições farmacêuticas da presente invenção compreendem como ingrediente ativo o sobrenadante de uma cultura liquida de C. histolyticum, excipientes ou carreadores farmaceuticamente aceitáveis, na forma de formulações em creme ou pomada, liofilizados ou soluções aquosas. Excipientes, carreadores ou estabilizadores farmaceuticamente aceitáveis não apresentam toxicidade ao organismo receptor nas dosagens e concentrações empregadas e podem incluir os tampões como fosfato, citrato e outros ácidos orgânicos; antioxidantes como ácido ascórbico e metionina; preservantes como cloreto de octadecildimetilbenzil amónio, cloreto de hexametônio, cloreto de benzalcônio, cloreto de benzetônio, fenol, álcool butilico, álcool benzílico, alquil parabenos como metil- e propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol, 3-pentanol e m-cresol; aminoácidos, monossacarideos, dissacarideos e outros carboidratos como glicose, manose, sacarose, manitol ou sorbitol; polissacarídeos (como o polissacarideo hidrofilico ficoll ^® ) , excipientes poliméricos como polivinilpirrolidonas, , dextrinas, polietileno glicóis, agentes de sabor, adoçantes, agentes anti-estáticos , agentes quelantes como EDTA ou EGTA; sais liberadores de ions como sódio, complexos metálicos, surfactantes não-iônicos como polisorbatos "T EEN 20" e "TWEEN 80", lipídeos como fosfolipídeos , ácidos graxos e esteróides como colesterol. Métodos para preparação de composições farmacêuticas são bem conhecidos, ou serão aparentes à luz da presente invenção, pelo especialista da arte em tecnologia farmacêutica .

Tais composições farmacêuticas encontram aplicação no tratamento de doenças que se beneficiam da atividade colagenolitica e gelatinolitica das proteases de C. histolyticum, no tratamento de condições patológicas do corpo humano associadas ao depósito excessivo de colágeno e ao acúmulo errático de tecido fibroso rico em colágeno, no tratamento de tecidos necrosados e em processos de cicatrização e no tratamento por debridamento enzimático.

O sobrenadante do cultivo de C. histolyticum, bem como as proteases com atividade colagenoliticas e gelatinolitica, em particular colagenases, produzidos de acordo com o processo descrito na presente invenção não apresentam toxicidade, resultado este observado através de estudo de citotoxicidade e Toxicidade Dérmica.

Para uma melhor compreensão dos ensinamentos contidos na presente invenção, os exemplos 1 a 10 são apresentados, sem, no entanto, limitar o seu escopo.

Os Exemplos 1-4 demonstram o preparo de meios de cultura, livres de componentes de origem animal, de acordo com o descrito na presente invenção, e o crescimento e produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica por C. histolyticum. Os resultados apresentados comprovam a eficiência do meio de cultura livre de componentes de origem animal no crescimento de C. histolyticum em comparação com o meio de cultura padrão, mesmo sem o aminoácido arginina na sua composição (Figuras 1 e 2) . A importância do extrato de levedura na composição do meio de cultura livre de componentes de origem animal é observada na Figura 3 e a faixa de pH preferida para o cultivo de C. histolyticum encontra-se exemplificada na Figura 4. A suplementação do meio de cultura livre de componentes de origem animal com vitaminas e sais inorgânicos não afeta o crescimento e produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica por C. histolyticum, como demonstrado nas Figuras 5 e 6, definindo essa suplementação como opcional. A maior produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica é observada apenas com a adição de arginina ao meio de cultura livre de componentes de origem animal, definindo o meio de cultura da presente invenção (Figuras 7 e 8). A comprovação da importância da presença dos aminoácidos arginina e cisteina para a produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica no meio de cultura livre de componentes de origem animal da invenção pode ser observada na Figura 9.

Adicionalmente, esses exemplos comprovam a qualidade do sobrenadante obtido através do cultivo em meio de cultura livre de componentes de origem animal, sendo este caracterizado por compreender em sua maioria proteases de alto peso molecular, relacionadas às colagenases de C. histolyticum, cuja atividade enzimática também é demonstrada.

O Exemplo 5 apresenta os resultados do cultivo em Biorreator (3L) utilizando o meio de cultura livre de componentes de origem animal descrito na presente invenção. A Figura 10 apresenta os resultados do cultivo em meio de cultura livre de componentes de origem animal sem arginina, demonstrando a menor produção de proteases quando comparado ao cultivo realizado em meio de cultura livre de componentes de origem animal descrito na invenção contendo arginina (Figura 11) . A Figura 12 apresenta um gráfico comparativo dos parâmetros crescimento e produção enzimática entre os meios de cultura livres de componentes de origem animal avaliados (sem e com arginina) .

O Exemplo 6 relata um processo de recuperação das proteases com atividade colagenoliticas e gelatinolitica presentes no sobrenadante do cultivo de C. histolyticum em meio de cultura livre de componentes de origem animal descrito na presente invenção. Destaca a qualidade do sobrenadante obtido, com ausência de precipitados, facilitando a manipulação dos mesmos. São apresentados os resultados da recuperação das enzimas colagenoliticas por precipitação com sulfato de amónio, seguida de diálise e liofilização (Figura 13).

O Exemplo 7 apresenta uma composição farmacêutica para uso tópico compreendendo o sobrenadante da cultura liquida de C. histolyticum produzido em meio de cultura livre de componentes de origem animal. A estabilidade das composições também é descrita, comprovando a qualidade do produto obtido a partir dos processos fermentativos descritos e definindo mais uma característica vantajosa da presente invenção.

0 Exemplo 8 descreve ensaios de toxicidade dérmica doses repetidas (21dias) em ratos (machos e fêmeas) , demonstrando a ausência de toxicidade das composições farmacêuticas preparadas com as enzimas colagenoliticas obtidas através liofilizado do sobrenadante de cultura líquida de C. histolyticum produzido em meio de cultura livre de componentes de origem animal, de acordo com a invenção, e obtido após procedimento de filtração tangencial. A ausência de toxicidade das composições farmacêuticas destaca, novamente, a qualidade da composição enzimática do sobrenadante das culturas de C. histolitycum em meios livres de componentes de origem animal de acordo com a invenção (Figuras 14 - 17).

O Exemplo 9 apresenta os resultados do cultivo das linhagens de C. histolyticum ATCC21000 e T248 em Biorreator (3L) utilizando o meio de cultura livre de componentes de origem animal descrito na presente invenção. A Figura 14 apresenta os resultados desse cultivo, demonstrando uma produção equivalente de proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica por ambas as linhagens avaliadas.

O Exemplo 10 apresenta os resultados do ensaio de citoxicidade para as proteases com atividade colagenolitica e gelatinolítica obtidas do sobrenadante da cultura liquida de C. histolyticum (ATCC 21000 e T248) em meio de cultura livre de componentes de origem animal.

EXEMPLOS

Os exemplos citados a seguir são meramente ilustrativos, devendo ser empregados somente para uma melhor compreensão dos desenvolvimentos constantes na presente invenção, não devendo, contudo, serem utilizados com o intuito de limitar os objetos descritos.

Linhagens de C. histolyticum podem ser obtidas de diversas fontes, incluindo American Type of Culture Collections (ATCC) . Diversas linhagens de Clostridium histolyticum já foram utilizadas para fins de obtenção da colagenase, assim a presente invenção não se limita apenas à linhagem utilizada para a demonstração da invenção através dos exemplos abaixo.

Em todos os exemplos, a linhagem de Clostridium histolyticum ATCC 21000 foi utilizada (mutante não-móvel de uma linhagem móvel, selvagem, isolada do solo [ATCC 21000™) . Essa linhagem foi escolhida por ser caracterizada como boa produtora de enzimas colagenoliticas e gelatinoliticas . 0 meio de cultura indicado pela ATCC para o seu cultivo inclui peptonas de origem animal, sais inorgânicos e digesto de figado (meio de cultura Reinforced Clostridial Médium - RCM - Oxoid CM149, pH 8,0; cultivo em anaerobiose).

Adicionalmente, os Exemplos 9 e 10 apresentam resultados do cultivo utilizando o meio de cultura livre de componentes de origem animal descrito na presente invenção para a linhagem de Clostridium histolyticum denominada de T248, isolada de amostra de solo superficial de área privada (Espirito Santo do Pinhal/SP, Brasil) . A linhagem T248 foi caracterizada morfológica (bacilo gram positivo, esporulado) , bioquímica (anaeróbio facultativo, que degrada gelatinas) e geneticamente (gene tpi e regiões ribossomais 16S, 23S e intergênica 16S e

23S) , tendo sido completamente sequenciados os genes ColG e ColH, presentes exclusivamente em cepas de C. histolyticum , que codificam Colagenases de classe I e II. A cepa também foi caracterizada filogeneticamente, utilizando as sequências da região 16S-intergênica-23S .

Exemplo 1. Preparo do meio padrão e do meio de cultura liyre de componentes de origem animal para o crescimento de Clostrldinm hlstolyticvan..

O meio de cultura padrão ou tradicional foi preparado usando os seguintes ingredientes para cada litro de meio: Proteose peptona n. 3 ou peptona de caseína (20 g) ; Extrato de levedura (5 g) ; glicose (5 g) ; tioglicolato de sódio (250 mg) em pH 7,0 (ajustado com NaOH 5 M) .

0 meio de crescimento livre de componentes de origem animal foi preparado utilizando os seguintes ingredientes para cada litro de meio: peptona de origem vegetal (10-40 g) ; extrato de levedura (0-30 g) ; cloridrato de cisteína (0,625 g) em pH 7,0 (ajustado com NaOH 5M) .

Após a dissolução de todos os ingredientes descritos acima em água (com exceçâo da glicose, presente apenas no meio padrão) e ajuste do pH para 7,0 (NaOH 5 M) , o meio de cultura foi esterilizado em autoclave à 121 °C por 20 minutos. Uma solução de glicose foi preparada separadamente, esterilizada em autoclave (121 °C por 20 minutos) e adicionada ao meio de cultura padrão apenas no momento de realização dos cultivos.

Foram avaliadas diferentes peptonas de origem vegetal e extratos de levedura, em diferentes quantidades no meio de cultura livre de componentes de origem animal para o crescimento de C. histolyticum descrito acima.

Variação do pH do meio de cultura livre de componentes de origem animal (3% p/v NZ soy BL4, 3% p/v YE251 e 0, 0625% p/v cloridrato de cisteina, pH 7,0) também foi investigada, sendo a faixa avaliada de 6,5 a 8,5.

Exemplo 2. Crescimento de C. histolyticum em meio de cultura liyre de componentes de origem animal e em meio padrão conforme definidos no Exemplo 1.

Inicialmente, a cultura estoque congelada de Clostridium histolyticum (100 pL) foi suspendida em 1 mL do meio padrão ou 1 ml do meio de cultura livre de componentes de origem animal (descrito no Exemplo 1) , separadamente em dois tubos que foram completados com os respectivos meios de cultura para o volume final de 10 mL (cultivo denominado inoculo) . Os tubos contendo o inoculo foram incubados à 37 °C, em anaerobiose, por aproximadamente 16 horas.

Após esse período, o 3 mL do inoculo foram incubados em frascos de 250 mL contendo 150 mL dos respectivos meios de cultura de C. histolyticum. A cultura inoculada foi então mantida à 37 °C por cerca de 12 - 14 horas em anaerobiose (anaerobiose mantida através da adição N2) . Todas as análises apresentadas no Exemplo 2 foram realizadas ao final das 12-14 horas dessa etapa de cultivo.

0 crescimento bacteriano foi determinado pela densidade óptica - DO - através de um espectrofotômetro à 600 nm.

A Figura 1 apresenta os resultados de DO (densidade óptica) de cultivos de C. histolyticum (ATCC 21000) em meio de cultura livre de componentes de origem animal compreendendo peptona vegetal (3% p/v) e extrato de levedura (3% p/v) de diferentes fornecedores. Os fornecedores avaliados demonstram resultados de crescimento bacteriano semelhantes. A Figura 1 também demonstra um aumento significativo da DO observada quando o cultivo é realizado em meio de crescimento livre de componentes de origem animal de acordo com a presente invenção em comparação ao crescimento bacteriano obtido em meio de cultura padrão, com peptonas de origem animal (Vetec + Caseína) . Todos os meios de cultura livre de componentes de origem animal representados na Figura 1 contem 0,625 g/L de cloridrato de cisteina e pH aproximadamente 7,0.

A Figura 2 apresenta o resultado do crescimento de C. histolyticum quando o cultivo é realizado em meio de cultura livre de componentes de origem animal considerando variações nas quantidades de peptona vegetal (Hy-pep 1511; 1-3% p/v) e extrato de Levedura (YE 251; 0-3% p/v) . Todos os meios de cultura livre de componentes de origem animal representados na Figura 2 contem 0,625 g/L de cloridrato de cisteina e pH aproximadamente 7,0. Observa-se alguma variação com relação ao crescimento de C. histolyticum entre esses cultivos em meio de cultura livre de componentes de origem animal, entretanto, os valores de DO (densidade óptica) alcançados são sempre superiores àqueles obtidos através do cultivo de C. histolyticum em meio de cultura padrão (com peptona de origem animal) .

A importância do extrato de levedura na composição do meio de cultura livre de componentes de origem animal de origem animal é demonstrada na Figura 3 (meios de cultura livre de componentes de origem animal contendo 0, 1, 2 ou 3% de Extrato de levedura) . Observa-se que a ausência de extrato de levedura na composição do meio de cultura inibe tanto o crescimento bacteriano quanto a produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica, mesmo considerando um aumento na quantidade de peptona vegetal na sua composição (concentrações avaliadas de peptona de origem vegetal: 3 e 4%). Todos os meios de cultura livre de componentes de origem animal representados na Figura 3 contem 0,625 g/L de cloridrato de cisteina e pH aproximadamente 7,0. A avaliação da atividade colagenolítica e gelatinolitica foi realizada de acordo com o descrito no exemplo 4.

A F-igura 4 representa os resultados de crescimento bacteriano obtidos através do cultivo de C. histolyticum em meio de crescimento com pH variando de 6,5 a 8,5. Dentro da faixa de pH avaliada, apenas o pH mais básico (pH 8,5) influenciou negativamente o crescimento bacteriano.

Exemplo 3. Preparo do meio de cultura para Clostrldlxxm histolyticum liyre de componentes de origem animal e meio de cultura padrão para a produção de sobrenadante contendo proteases com atividade colagenolítica e gelatinolitica.

O meio de cultura padrão foi preparado de acordo com o descrito no Exemplo 1.

O meio de cultura livre de componentes de origem animal da presente invenção foi preparado utilizando os seguintes ingredientes para cada litro de meio: peptona de origem vegetal (30 g) ; extrato de levedura (30 g) ; cloridrato de cisteina (0, 625 g) , cloridrato de arginina (3,75 g) e pH 7 (ajustado com NaOH 5 ) .

Experimentos para demonstração do efeito surpreendente do meio de cultura para C. histolyticum livre de componentes de origem animal definido pela invenção e descrito acima foram realizados com cinco tipos de meios de cultura contendo para cada litro de meio, os componentes:

• Meio 1: peptona de soja (30 g; NZ-Soy BL4®) ; extrato de levedura (30 g; YE 251®); cloridrato de cisteina (0,625 g) em pH 7,0 (ajustado com NaOH 5 M) . • Meio 2: peptona de soja (30 g; NZ-Soy BL4®) ; extrato de levedura (30 g; YE 251®); cloridrato de cisteina (0,625 g) em pH 7,0 (ajustado com NaOH 5 M) e adicionalmente sais e/ou vitaminas e/ou aminoácidos (descritos na legenda da Figura 5) .

• Meio 3: peptona de soja (30 g; NZ-Soy BL4®) ; extrato de levedura (30 g; YE 251®); cloridrato de cisteina (0,625 g) em pH 7,0 (ajustado com NaOH 5 M) e adicionalmente grupos de aminoácidos (Grupos de 1 a 6, descritos na legenda da Figura 9) .

• Meio 4 : peptona de soja (30 g; NZ-Soy BL4®) ; extrato de levedura (30 g; YE 251®); cloridrato de cisteina (0,625 g) em pH 7,0 (ajustado com NaOH 5 M) e adicionalmente glicina e/ou arginina.

• Meio 5: peptona de soja (30 g; NZ-Soy BL4®) ; extrato de levedura (30 g; YE 251®); cloridrato de cisteina (0,625 g) , cloridrato de arginina (3,75 g) em pH 7,0 (ajustado com NaOH 5 M) e adicionalmente sais inorgânicos e vitaminas (descritos na legenda da Figura 6) .

Outras peptonas de origem vegetal foram avaliadas com relação ao cultivo de C. histolyticum para a produção de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica, demonstrando resultados semelhantes à NZ-Soy BL4®. Da mesma forma, os diferentes extratos de levedura avaliados apresentam resultados semelhantes ao YE 251® utilizado nos meios de cultura livre de componentes de origem animal.

As peptonas vegetais e extratos de leveduras adequados para compor o meio de cultura livre de componentes de origem animal não se limitam às utilizadas nos exemplos da presente invenção. Peptonas vegetais e extratos de levedura que demonstrem boa solubilidade em água podem ser utilizados para a preparação de meio de cultura para C. histolyticum de acordo com a presente invenção, desde que sejam livres de componentes de origem animal.

Após a dissolução de todos os componentes do meio de cultura livre de componentes de origem animal em água e ajuste do pH para 7,0 (NaOH 5M) , o meio foi esterilizado em autoclave à 121 °C por 20 minutos.

Exemplo 4. Produção de sobrenadante de uma cultura liquida de Clostrldium histolyticvaa contendo uma ou mais proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica em meio de cultura liyre de componentes de origem animal definidos no Exemplo 3 e meio padrão definido no Exemplo 1.

O cultivo de C. histolyticum em meio de cultura livre de componentes de origem animal foi realizado de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 2. Os meios de cultura avaliados encontrara-se descritos no Exemplo 3 (meios de 1 a 5) .

Ao final de 12-14 horas de cultivo de C. histolyticum nos meios de cultura livre de componentes de origem animal descritos no Exemplo 3, as células bacterianas foram centrifugadas e a quantificação da atividade colagenolitica e gelatinolitica das proteases contidas no sobrenadante foi determinada. Oito mililitros (8 mL) das culturas bacterianas foram submetidos à centrifugação a 5000 rpm por 30 minutos à 4 °C para remoção do material insolúvel (células, restos celulares, precipitados, entre outros) .

O perfil protéico do sobrenadante obtido foi avaliado através eletroforese em gel SDS PAGE 7,5% em condições não redutoras (coloração por nitrato prata) . O perfil de atividade enzimática (não-especifica) foi avaliado em gel SDS-PAGE não redutor contendo 10% de gelatina e corado com Coomassie blue ( zimografia) . Ambas as metodologias de análise são amplamente conhecidas por um técnico no assunto. A quantificação da atividade colagenolitica e gelatinolitica dos sobrenadantes obtidos foi realizada através do reagente EnzChek® Gelatinase/Collagenase Assay Kit (Molecular Probes, Invitrogen) . Os ensaios foram realizados de acordo com instruções do fabricante, em microplacas, utilizando como substrato gelatina e/ou colágeno conjugado com fluoresceina . As leituras foram realizadas em um leitor.de fluorescências. Resumidamente, 100 L do sobrenadante da cultura, após centrifugação, foram misturados ao substrato diluído no tampão de incubação preparado de acordo com as instruções do fabricante. As amostras foram incubadas à 37 °C por 15 minutos e a leitura à 515 nm foi realizada em um leitor de fluorescência de microplacas. Como controle negativo foi realizado todo o procedimento de incubação com meio de cultura estéril no lugar do sobrenadante da cultura. Como controle positivo utilizou-se o reagente Colagenase fornecido pelo kit e preparado de acordo com instruções do fabricante .

O crescimento bacteriano foi determinado pela densidade óptica - DO - através de um espectrofotômetro à 600 nm.

Inicialmente, a suplementação do meio de cultura livre de componentes de origem animal (meio 2; compreendendo peptona vegetal, extrato de levedura e cisteína) com vitaminas, sais inorgânicos e aminoácidos foi avaliada, demonstrando a pouca influência desses aditivos sobre o crescimento e produção de um sobrenadante de uma cultura líquida de Clostridium histolyticum contendo proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica (Figura 5) . Como controle desse experimento foi utilizado o meio 1.

A adição de vitaminas, sais inorgânicos e aminoácidos ao meio de cultura livre de componentes de origem animal descrito pela invenção (meio 5; compreendendo peptona vegetal, extrato de levedura, cisterna e arginina) também resulta em pouca variação na biomassa (DO) e na atividade colagenolítica e gelatinolítica do sobrenadante desses cultivos. A Figura 6 demonstra esses resultados, confirmando a caracterização dessa suplementação com vitaminas e sais como opcional ao meio de cultura da presente invenção. Como controle desse experimento foi utilizado o meio 1.

Variações qualitativas (diferentes fornecedores) dos componentes peptona vegetal e extrato de levedura também foram avaliados (Meio 1 contendo peptona vegetal, extrato de levedura e cisterna) com relação a produção de um sobrenadante de uma cultura de C. histolyticum contendo proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica. A Figura 7 mostra que os resultados de atividade colagenolítica e gelatinolítica obtidos para esses cultivos são da mesma ordem dos resultados obtidos para o cultivo de C. histolyticum em meio padrão (com peptona animal) . Dessa forma, observa-se a necessidade de um ingrediente adicional ao meio de cultura para o aumento da atividade colagenolítica e gelatinolítica observada no sobrenadante da cultura líquida de C. histolyticum, o que foi solucionado pelo meio de cultura da presente invenção.

Surpreendentemente, observa-se através da Figura 8 que o cultivo de C. histolyticum no meio de cultura livre de componentes de origem animal descrito na presente invenção e que contém os aminoácidos cisteína e arginina (meio 4), resulta em um sobrenadante com atividade colagenolítica e gelatinolítica significativamente maior do que a apresentada para o cultivo em meio de cultura livre de componentes de origem animal contendo apenas o aminoácido cisteína (Meio 1, utilizado como controle desse experimento) . Tal efeito é devido a arginina uma vez que a adição de outro aminoácido, por exemplo glicina, reduz a atividade colagenolitica e gelatinolitica observada.

A Figura 9 apresenta os resultados de atividade colagenolitica e gelatinolitica e DO (600 nm) observados em cultivo de C. histolyticum com o meio 3 (meio livre de componentes de origem animal com cisteina e grupos de aminoácidos) . Como controle foi realizado o cultivo em meio 1 (meio livre de componentes de origem animal e apenas o aminoácido cisteina) . Observa-se que nenhum outro aminoácido, ou combinação de aminoácidos, adicionado ao meio de cultura foi capaz de aumentar a atividade colagenolitica e gelatinolitica observada no sobrenadante de cultura liquida de C. histolyticum como propiciado surpreendentemente pelo aminoácido arginina (Figura 8).

Adicionalmente, observa-se que apenas 14 horas de fermentação são suficientes para a recuperação do sobrenadante contendo enzimas colagenoliticas e gelatinolitica em níveis adequados para uma produção industrial, um período inferior ao comumente empregado, sendo este um parâmetro com grande influência nos processos produtivos em escala industrial.

Exemplo 5. Produção de sobrenadante de uma cultura líquida de Clostridium histolyticvan contendo proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica em meio de cultura liyre de componentes de origem animal - cultivo em Biorreatores .

Inicialmente, a cultura estoque congelada de Clostridium histolyticum (100 μΐ,) foi suspendida em 1 mL do meio cultura livre de componentes de origem animal (meio 1, definido abaixo) , e posteriormente adicionado meio de cultura para o volume final de 10 mL (cultivo denominado pré-inóculo) . Os tubos contendo o pré-inóculo foram incubados à 37 °C, em anaerobiose, por aproximadamente 16 horas. Após esse período, o 3 mL do pré-inóculo foram incubados em frascos de 250 mL contendo 150 mL dos respectivos meios de cultura de C. histolyticum. A cultura foi então mantida à 37 °C por cerca de 12 - 14 horas em anaerobiose (anaerobiose mantida através da adição N _2; cultivo denominado inoculo) .

Para os cultivos realizados em Biorreator (New Brunswick) , 60 mL do inoculo foram adicionados a 3 litros de meio de cultura de C. histolyticum. As culturas foram então incubadas à 37 °C em condições de anaerobiose (adição N ₂ ) . O pH do meio de cultura foi monitorado ao longo do processo (fermentação), sendo ajustado para a faixa de 6,5-8,0 com hidróxido de amónio (5 M) ou ácido sulfúrico (2 M) . O tempo de cultura foi de cerca de 14 horas, momento no qual a fase da cultura já se caracterizava como fase estacionária por pelo menos 2 horas.

Foram avaliados dois meios de cultura, cuja composição para cada litro de meio, segue abaixo:

• Meio 1: peptona de soja (30 g; NZ-Soy BL4®) ; extrato de levedura (30 g YE 251®) ; cloridrato de cisteína (0, 625 g) e pH 7 (ajustado com hidróxido de amónio 5 M após esterilização) .

• Meio 6: peptona de soja (30 g; NZ-Soy BL4®) ; extrato de levedura (30 g YE 251®) ; cloridrato de cisteína (0,625 g) , cloridrato de arginina (3,75 g) e pH 7 (ajustado com hidróxido de amónio 5 M após esterilização) .

Abaixo são descritas detalhadamente as etapas do processo de produção de um sobrenadante de uma cultura de C. histolyticum contendo proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica de acordo com a presente invenção.

1 - Preparo do banco celular: foi realizado através do cultivo de C. histolyticum (ATCC 21000) em placas de Agar (meio livre de componentes de origem animal compreendendo peptona de soja, extrato de levedura e ágar) . Colónias que apresentam grande crescimento foram isoladas e inoculadas em meio para banco de células contendo os mesmos ingredientes do meio sólido, com exceção do ágar. A cultura de C. histolyticum cultivada nesse meio foi então combinada com glicerol (10%, estéril), fracionada em criotubos e congelada à -80 °C para uso posterior. Esse meio de congelamento pode ser utilizado para estocar a cultura por pelo menos 1 ano sem a perda de viabilidade celular.

2 - Fase de crescimento (preparo do pré-inóculo e inoculo) : uma aliquota do banco celular foi descongelada à temperatura ambiente e rapidamente, ΙΟΟμΙ dessa aliquota foram transferidos para lml do meio de cultura livre de componentes de origem animal (Meio 1) , ao qual foram adicionados mais 9 mL do mesmo meio para o crescimento da bactéria à 37°C em anaerobiose por cerca de 16 horas (pré- inóculo) . Posteriormente, o pré-inóculo foi utilizado para preparar o inoculo de acordo com a descrição apresentada anteriormente.

3 - Fase de Fermentação (produção de sobrenadante de cultura liquida de C. histolyticum contendo proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica) : 60 mL do inoculo foram transferidos para um fermentador contendo 3 L de meio de cultura livre de componentes de origem animal (pH 7, Meio 1) e mantido por cerca de 14 horas à 37 °C em condições anaeróbias (através da adição de N ₂ ) . Ao longo do cultivo, o controle de pH da fermentação foi realizado através da adição de hidróxido de amónio (5 M) toda vez que o pH apresentou-se inferior à 6,5, ou ácido sulfúrico (2 M) toda vez que o pH apresentou-se superior à 8. O crescimento bacteriano máximo e a melhor produção de proteases com atividade colagenolítica e gelatinolitica ocorreram após 14 horas de fermentação bacteriana (Figura 10) .

O mesmo processo foi realizado utilizando-se o Meio 6 como meio de cultura livre de componentes de origem animal da etapa 3.

O crescimento bacteriano foi monitorado através de medidas de densidade óptica (600 nm) realizadas a cada 2 horas de cultivo em espectrofotômetro .

O perfil protéico e perfil enzimático do sobrenadante obtido dos cultivos de C. histolyticum descritos acima foram avaliados através de eletroforese em gel SDS PAGE 7,5% em condições não redutoras (Figura 11; coloração por nitrato prata) e gel SDS-PAGE não redutor contendo 10% de gelatina e corado com Coomassie blue (Figuras 10 e 11; zimografia) .

4 - Obtenção do sobrenadante de cultura liquida de C. histolyticum e recuperação das proteases com atividade colagenolítica e gelatinolitica: A obtenção do sobrenadante de cultura líquida e recuperação das enzimas colagenolíticas e gelatinolitica foram realizadas como descrito no exemplo 4 (centrifugação para obtenção do sobrenadante) e através de precipitação salina, diálise e liofilização, de acordo com a descrição detalhada apresentada no Exemplo 6 ou filtração tangencial (5KDa de tamanho de poro) seguida de liofilização . A atividade colagenolítica e gelatinolitica do sobrenadante foi monitorada através de ensaios fluorimétricos de atividade enzimática descritos detalhadamente no Exemplo 4 (resultados apresentados na Figura 10 e 11) .

A Figura 10 apresenta os resultados (DO, atividade enzimática e zimografia) de dois processos fermentativos realizados com o meio de cultura 1 (meio 1) . A Figura 11 apresenta os resultados (DO, atividade enzimática, gel SDS-Page/nitrato de prata e zimografia) de um processo fermentativo realizado com o meio de cultura 6 (meio 6) . Observa-se através da análise da Figura 11, uma curva de crescimento bacteriano semelhante ao obtido nas fermentações em biorreatores com meio 1 (contendo apenas o aminoácido cisteina, Figura 10), entretanto e surpreendentemente observa-se uma atividade colagenolitica e gelatinolitica significativamente superior, demonstrando a influência da adição de arginina ao meio de cultura livre de componentes de origem animal para o aumento da produção de enzimas colagenoliticas e gelatinolitica nos cultivos de C. histolyticum (atividade em U/mL) .

A Figura 12 apresenta a comparação da atividade colagenolitica e gelatinolitica (mU/mL) e densidade óptica (DO 600 nm) entre os cultivos com meio 1 (contendo apenas o aminoácido cisteina) e cultivos com o meio 6 (contendo os aminoácidos cisteina e arginina) , demonstrando claramente um aumento médio de cerca de 30% da atividade colagenolitica e gelatinolitica do sobrenadante do cultivo de C. histolyticum em meio contendo cisteina e arginina.

Adicionalmente, imagens da eletroforese em gel de zimografia e SDS PAGE (coloração com nitrato de prata) dos sobrenadantes obtidos do cultivo de C. histolyticum são apresentadas, demonstrando a qualidade dos sobrenadantes, com a presença predominante de proteínas de alto peso molecular, identificadas aqui como sendo correspondentes às colagenases (Figuras 10 e 11) .

Exemplo 6. Recuperação das proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica obtidas do sobrenadante da cultura liquida de C. histolyticum em meio de cultura liyre de componentes de origem animal . O sobrenadante contendo as proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica foi obtido através do cultivo de C. histolyticum de acordo com o descrito no Exemplo 5, utilizando como meio da etapa 3 o meio 6 (contendo os aminoácidos cisteina e arginina) .

Para a recuperação das proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica obtidas do sobrenadante da cultura liquida de C. histolyticum, inicialmente, adicionou- se 243,73 g de (NH ₄ ) ₂ S0 ₄ em 500 mL de sobrenadante, agitou-se a mistura e reservou-a em geladeira por 2 h (etapa de precipitação salina) . Em seguida, centrifugou a mistura a 8500 rpm por 30 min e à 4°C. O material obtido após precipitação salina e centrifugação, foi resuspendido em 12,0 mL de tampão fosfato de sódio 2 mM pH 7,2, sendo então submetido à diálise com tampão fosfato de Sódio 2 mM pH 7,2. Foram realizadas 3 trocas de tampão antes do congelamento e liofilização das amostras. A liofilização foi realizada por pelo menos 18 h. O material liofilizado foi coletado para análise e caracterização.

A caracterização do sobrenadante após diálise e liofilização foi realizada através de eletroforese das amostras em gel SDS-PAGE 7,5% em condições não redutoras, com posterior coloração por nitrato de prata. A Figura 13 representa os resultados obtidos através do procedimento descrito acima, demonstrando a excelente qualidade do sobrenadante obtido através do cultivo de C. histolyticum em meio de cultura de acordo com a presente invenção e a estabilidade das proteases após processamento e liofilização. Através da análise em gel SDS PAGE é possível observar a presença predominante de proteínas de alto peso molecular (colagenases) , cuja prevalência é aumentada após a sua liofilização. O processo aqui descrito para a liofilização do sobrenadante de C. histolyticum contendo proteases com atividade colagenolítica e gelatinolitica apresenta um bom rendimento, sendo recuperado aproximadamente 90% da atividade enzimática do sobrenadante inicial.

Exemplo 7. Composição farmacêutica para uso tópico contendo colagenases de C. histolyticvan - Ensaios de Estabilidade

A composição farmacêutica utilizada para exemplificar a presente invenção foi uma pomada dermatológica compreendendo os ingredientes apresentados abaixo:

A atividade colagenase especifica foi determinada pela hidrólise enzimática de substrato sintético (Carbobenzoxy- Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala) , sendo quantificada através de ensaio colorimétrico com ninidrina. Uma unidade de enzima é definida como sendo responsável pela liberação de 1 mol de Gly-Pro-Ala do hexapeptideo Z-Gly-Pro-Gly-Gly-Pro-Ala em 1 minuto à 37 °C.

A composição farmacêutica foi preparada através da dispersão do liofilizado (quantidade equivalente à atividade colagenase especifica igual a 0,2 U, 0,6 U e 1,8 U/g de formulação), obtido de acordo com o exemplo 5 (liofilizado do sobrenadante obtido em cultivo com o meio 6 e após procedimento de filtração tangencial) , nos demais excipientes e homogeneização. A dose de 0,6U/g de composição é considerada a dose terapêutica adequada para uso humano. O estudo de Estabilidade foi realizado com a formulação

2 descrita acima, armazenada em bisnagas de alumínio em apresentação de 30g. Os testes realizados, especificação e os resultados observados encontram-se descritos nas tabelas 3 e 4. Todos os ensaios de estabilidade foram realizados em câmaras climáticas especificas para ensaios de estabilidade.

Tabela 3. Estabilidade de longa duração: 30°C ± 2°C, 75% ± 5% de UR (Umidade Relativa) .

Observa-se a manutenção das características do produto inicial em ambas a condições avaliadas, comprovando a qualidade do produto obtido através do meio de cultura (meio 6, contendo cisteína e arginina) e processo para a produção de um sobrenadante de uma cultura líquida de Clostridium histolyticum descritos na presente invenção. Exemplo 8. Composição farmacêutica para uso tópico contendo colagenases de C. istolyticvaar- Toxicidade

As composições farmacêuticas utilizadas para exemplificar a presente invenção é a mesma utilizada para a realização dos ensaios de estabilidade descritos acima (Exemplo 7) .

Foi realizado um ensaio de toxicidade dérmica doses repetidas (21 dias) em pele escarificada de ratos com as composições preparadas de acordo com o Exemplo 7 (ingrediente ativo: liofilizado com atividade Colagenase especifica de 0,2U/g, 0,6U/g e l,8U/g). Como controle do ensaio, uma composição placebo, preparada de acordo com o Exemplo 7, sem, no entanto, adicionar o ingrediente ativo, foi utilizada.

0 ensaio, baseado no Guideline 410 da OECD consistiu em provocar cirurgicamente, a ratos previamente anestesiados, uma ferida utilizando punch" estéril de 4mm no centro da linha média dorsal no primeiro dia da administração (pêlos da região dorsal removidos por meio de aparelho depilador) . A aplicação tópica da composição (0,425g; composições contendo 0,2U, 0,6U e 1,8U de colagenase por grama) em uma área equivalente a 30-40cm2 foi realizada com auxilio de espátula, dentro e ao redor da ferida, uma vez ao dia, durante 21 dias, a três grupos de Rattus norvegicus (variedade albina, linhagem istar) por sexo (10 ratos por grupo, 5 machos e 5 fêmeas, nuliparas e não prenhes) .

O local da aplicação foi preservado por meio de curativo com gaze e uma fita adesiva não irritante por aproximadamente 24 horas após a administração.

Em paralelo, um grupo controle (10 ratos, 5 machos e 5 fêmeas) recebeu apenas o placebo (Placebo Colagenase) . Adicionalmente, foram constituídos dois grupos satélites, um avaliado com a maior dose da composição teste (10 ratos, 5 machos e 5 fêmeas) e outro com a composição controle (10 ratos, 5 machos e 5 fêmeas) , tratados por 21 dias e acompanhados por mais 14 dias após o final do periodo da exposição, a fim de se verificar a reversibilidade, a persistência ou os efeitos tardios da exposição à substância- teste .

Diariamente e logo após cada aplicação foram observados os seguintes parâmetros:

1. Alterações na pele e pêlos.

2. Alterações nos olhos e membranas da mucosa.

3. Alterações respiratórias e circulatórias.

4. Alterações do Sistema Nervoso Central e Autónomo.

5. Alterações na atividade somato-motora e comportamento padrão .

6. Outras alterações como tremores, convulsão, salivação, diarreia, letargia, sonolência e coma.

Foram registrados semanalmente o peso corporal (Tabela 5) e os consumos de água e ração. Ao final do estudo, amostras de sangue foram coletadas para análises hematológicas (hematócrito, concentração de hemoglobina, contagem de eritrócitos, cálculo dos índices hematimétricos, leucócitos diferenciais e totais, tempo de protrombina, tempo de tromboplastina parcial ativada e contagem de plaquetas - Tabela 6) e bioquímicas (sódio, potássio, cálcio, fósforo, triglicérides, albumina, creatinina, ureia, proteínas totais, alanina aminotransferase e aspartato aminotransferase e colesterol, glicemia - Tabela 7) . Em seguida, os animais foram submetidos à eutanásia e necropsia (Tabela 8) . Amostras de tecidos foram encaminhadas para análise histopatológica.

A administração em doses repetidas (21 dias) para a composição farmacêutica descrita, em todas as doses avaliadas, não induziu mortes, nem alterações nas avaliações clínicas, no peso corporal e nos consumos de ração e água, nos exames hematológicos, bioquímicos e/ou anatomopatológicos passíveis de relação com a exposição ao ingrediente ativo da composição. Assim, os resultados obtidos demonstraram que a administração da composição farmacêutica contendo o liofilizado (quantidade equivalente à atividade colagenase específica igual a 0,2 U, 0,6 U e 1,8 U/g de formulação), obtido de acordo com o exemplo 5 (liofilizado do sobrenadante obtido após procedimento de filtração tangencial) durante um período de 21 dias por via dérmica a Rattus novergicus nas formulações de 0,2U/g, 0,6U/g e l,8U/g foi bem tolerada e não promoveu alterações passíveis de relação com toxicidade. Observa-se, surpreendentemente, que mesmo em dose três vezes superior à dose terapêutica considerada para humanos, a composição descrita na presente invenção não apresenta sinais de toxicidade em ratos.

Tabela 5. Peso corporal (ratos machos e fêmeas). Grupos experimentais para avaliar a toxicidade dérmica em doses repetidas (21 dias) de composição tópica contendo sobrenadante purificado e liofilizado derivado da cultura de C. histolyticum (ATCC 21000) em meio de cultura livre de componentes de origem animal contendo peptona de soja (30 g/L), Extrato de levedura (30 g/L), cloridrato de cisteína (0,625 g/L) e cloridrato de arginina (3,75 g/L). Composição controle: apenas com excipientes.

Grupos- machos

0,2U/g 0,6U/g l,8U/g

Semanas MÉDIA D.P. n MÉDIA D.P. n MÉDIA D.P. n

0 296,40 22,56 5 302,12 26, 92 5 306,56 13, 94 5

1 279,14 17, 93 5 282,68 28, 46 5 292,72 19, 68 5

2 283,04 17, 54 5 277,10 15, 17 5 301,68 15, 09 5

3 280,94 19,34 5 273,42 18, 43 5 291,20 20, 19 5

4

5

Grupos - machos Controle Controle-Satélite l,8U/g-Satélite

Semana MÉDIA D.P. n MÉDIA D.P. n MÉDIA D.P. n

0 298,68 14, 04 5 284,00 39, 46 5 311,18 18, 05 5

1 279,42 15, 00 5 285,16 15, 10 5 292,58 15, 10 5

2 287,22 19, 90 5 293,50 17, 76 5 295,92 14, 75 5

3 278,96 16, 01 5 298,08 16, 36 5 300,94 15, 77 5

4 328,12 9, 95 5 335,12 21, 56 5

5 324,26 9,24 5 338,34 17, 92 5

Grupos -fêmeas

0,2U/g 0,6U/g l,8U/g

Semanas MÉDIA D.P. n MEDIA D.P. n MÉDIA D.P. n

0 252,20 21,28 5 221,00 7,89 5 238,86 14, 88 5

1 238,02 21,38 5 215,14 15, 93 5 226,60 10,31 5

2 247,14 21, 54 5 218,36 10, 92 5 235,10 12, 05 5

3 244,42 15, 77 5 212,52 12, 20 5 240,98 12,59 5

4

5

Grupos -fêmeas

Controle Cont ole-Satélite l,8U/g-Satélite

Semana MÉDIA D.P. n MÉDIA D.P. n MÉDIA D.P. n

0 230,56 19,88 5 252,72 32, 44 5 234,16 8, 57 5

1 223,60 9, 98 5 228,32 11, 05 5 226,70 9,75 5

2 235,72 15, 04 5 238,44 7, 61 5 227,64 8, 16 5

3 225,42 13, 91 5 247,70 15, 98 5 242,98 11, 99 5

4 258,32 12, 35 5 256,58 9, 85 5

5 247,16 6, 91 5 247,12 7,71 5

Tabela 6. Análise hematológica (ratos machos e fêmeas). Grupos experimentais para avaliar a toxicidade dérmica em doses repetidas (21 dias) de composição tópica contendo sobrenadante purificado e liofilizado derivado da cultura de C. histolyticum (ATCC 21000) em meio de cultura livre de componentes de origem animal contendo peptona de soja (30 g/L), Extrato de levedura (30 g/L), cloridrato de cisteina (0,625 g/L) e cloridrato de arginina (3,75 g/L). Composição controle: apenas com excipientes.

Tabela 7. Análise bioquímica (machos e fêmeas). Grupos experimentais para avaliar a toxicidade dérmica em doses repetidas (21 dias) de composição tópica contendo sobrenadante purificado e liofilizado derivado da cultura de C. histolyticum (ATCC 21000) em meio de cultura livre de componentes de origem animal contendo peptona de soja (30 g/L) , Extrato de levedura (30 g/L) , cloridrato de cisteina (0,625 g/L) e cloridrato de arginina (3,75 g/L). Composição controle: apenas com excipientes. * p<0,05 vs . grupo controle

{ANOVA seguida do post hoc de Bonferroni) .

Tabela 8. Análise de pesos de órgãos corporais (machos e fêmeas) . Grupos experimentais para avaliar a toxicidade dérmica em doses repetidas (21 dias) de composição tópica contendo sobrenadante purificado e liofilizado derivado da cultura de C. histolyticum (ATCC 21000) em meio de cultura livre de componentes de origem animal contendo peptona de soja (30 g/L), Extrato de levedura (30 g/L), cloridrato de cisteina (0,625 g/L) e cloridrato de arginina (3,75 g/L). Composição controle: apenas com excipientes.

Clostridlvaa hxstolyticvau (linhagens ATCC 21000 e T248) contendo proteases com atividade colagenolitica e gelatinol tica em meio de cultura liyre de componentes de origem animal — cultivo em Biorreatores .

Os cultivos em biorreator para a obtenção dos sobrenadantes avaliados e os métodos de análise utilizados foram realizados conforme descrito previamente no Exemplo 5, utilizando como meio da etapa 3 o meio 6 (contendo os aminoácidos cisterna e arginina) .

A Figura 14 apresenta a comparação da atividade colagenolitica e gelatinolitica (mU/mL) e densidade óptica (DO 600 nm) entre os cultivos das linhagens de Clostridium histolyticum ATCC 21000 e T248. Observa-se que não há diferença significativa (Análise estatística: Mann Whitney; p<0,05) sobre a atividade colagenolitica e gelatinolitica entre os sobrenadantes do cultivo de C. histolyticum de ambas as linhagens avaliadas.

Exemplo 10. Ensaio de citoxicidade de proteases com atividade colagenolitica e gelatinolitica obtidas do sobrenadante da cultura liquida de C. hxstolytxcvaa (ATCC 21000 e T248) em meio de cultura liyre de componentes de origem animal .

As proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica foram obtidas de acordo com o descrito no Exemplo 6 (amostras liofilizadas ) .

As células utilizadas nos ensaios de citotoxicidade foram do tipo fibroblástico, da linhagem estabelecida em cultura V79 clone M-8, oriunda de pulmão de Hamster Chinês (Cricetulus griseus) . Os fibroblastos foram mantidos em cultura continua em garrafas de 25cm2 (TPP, Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland) até atingirem a densidade de confluência. 0 cultivo foi realizado em meio DMEM suplementado com 10% de soro fetal bovino (Nutricell) , 100UI/mL de penicilina, e 10C^g/mL de sulfato de estreptomicina (Nutricell), em estufa a 37°C sob atmosfera úmida e contendo 5% de C02 (Melo et al., 2000, 2001).

Os ensaios de citotoxicidade foram realizados em placas de 96 cavidades (IWAKI, Asahi Techno Glass, Co., Funabasi, Japan) , com 3 x IO ⁴ células/mL em cada cavidade (lOO L/cavidade) seguido de incubação a 37°C por 48 horas. A viabilidade celular inicial foi verificada pelo teste de exclusão do Azul de Tripan. O meio foi retirado após as 48 horas e as culturas foram expostas durante 24 horas ao meio DMEM suplementado contendo diferentes concentrações (até a concentração máxima de 1 mg/mL) das amostras liofilizadas abaixo descritas:

Amostra Procedência Linhagem

1 Adquirida de terceiros -

2 Adquirida de terceiros -

Obtida de acordo com a

presente invenção

3 (Exemplo 6) . ATCC 21000

Obtida de acordo com a

presente invenção

4 (Exemplo 6) . ATCC 21000 Obtida de acordo com a

presente invenção

5 (Exemplo 6) . T248

Após 24 horas de tratamento, as culturas foram processadas de acordo com os protocolos específicos dos testes para determinação do conteúdo de ácidos nucléicos

(DNA) , incorporação do vermelho neutro (VN) e redução do MTT (MTT) .

As proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica obtidas do cultivo de C. histolyticum de acordo com a presente invenção não apresentam citotoxicidade, resultado este observado através dos resultados apresentados na Tabela 9.

Tabela 9. Resultado dos ensaios de Citotoxicidade de proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica obtidas do sobrenadante de Clostridium histolyticum, ATCC2100 e T248, produzido de acordo com a presente invenção, e proteases com atividade colagenolítica e gelatinolítica presentes em matéria-prima adquirida de terceiros.

IC50 (mg/mL) IC50 (U/mL)

Atividade

Amostra

(U/g) Ácidos Ácidos

MTT VN MTT VN

Nucléicos Nucléicos

1 2.214,00 0, 35 0, 35 0, 35 0, 69 0, 69 0, 648

2 2.090,00 0, 33 0, 33 0,31 0, 69 0, 69 0, 648

3 2.429, 00 * * 0, 90 2, 43 2,43 2, 186

4 3.073, 00 * * * 3,07 3,07 3,073

5 3.646, 00 0,20 0, 20 0,20 0,73 0,73 0, 729