TITULO MEDIO DE CULTIVO DE CELULAS PROGENITORAS HUMANAS Y USO PARA LA PROLIFERACIbN DE DICHAS CELULAS PARA SU POSTERIOR TRANSPLANTE AUTOLOGO SECTOR DE LA TECNICA La invention se refiere al ambito de la biomedicina regenerativa, mas específicamente a un medio de cultivo de cellas progenitoras que evita los problemas asociados a la utilización de sueros heter6logos y componentes de origen animal no humano en el cultivo de cellas para el autotransplante.

ESTADO DE LA TECNICA Las cellas germinales son en la actualidad objeto de mucha atención en el ambit de la medicina regenerativa debido a su utilidad para la regeneraci6n de tejidos danados por causas externas o deficiencias genetics.

En estudios recientes se ha mostrado la utilidad del transplante de cellas progenitoras autólogas para mejorar la function del miocardio danado por isquemia (Regenerating functional myocardium: improved performance after skeletal myoblast transplantation. Taylor DA, Atkins BZ, Hungspreugs P, Jones TR, Reedy MC, Hutcheson KA, Glower DD, Kraus WE. Nat Med. 1998 8: <BR> <BR> 929-33. ) (Cellular cardiomyoplasty : myocardial regeneration with satellite cell<BR> implantation. Chiu RC, Zibaitis A, Kao RL. Ann Thorac Surg. 1995 60: 12-8. ) Mas especfficamente, se han realizado ya ensayos clfnicos de fase I utilizando cellas progenitoras de músculo esquelético autólogo en los que se muestra la utilidad de dichas cellas para mejorar la function del miocardio infartado (Autologous skeletal myoblast transplantation for severe postinfarction left ventricular dysfunction. Menasche P, Hagege AA, Vilquin JT, Desnos M, Abergel E, Pouzet B, Bel A, Sarateanu S, Scorsin M, Schwartz K, Bruneval P, Benbunan M, Marolleau JP, Duboc D. J Am Coll Cardiol. 2003 41: 1078-83).

La estrategia utilizada esta basada en la utilización de cellas germinales de origen autólogo, lo que evita los problemas relacionados con los aspectos eticos derivados de la utilización de cellas embrionarias, el rechazo,

por parte del sistema inmune del huesped de las celulas heterologas injertadas y la posible introduccion de patógenos externos, tales como virus, priones etc.

El injerto de cellas progenitoras para regenerar la pérdida de function de un tejido, como es el caso del miocardio infartado, requiere el aporte de un numero elevado de cellas, por ejemplo entre 100 y 300 millones de cellas. Es muy difícil obtener dicho numero de cellas directamente de los tejidos del paciente, por lo cual es necesario disponer de procedimientos adecuados para extraer y purificar las cellas germinales a partir de pequenas cantidades de tejido autólogo y a continuación cultivar dichas cellas germinales hasta obtener el numero adecuado para el transplante.

Existen en la actualidad multiples procedimientos para la extracci6n y cultivo de cellas precursoras de músculo esquelético (US 5.324. 656 Media for normal human muscle satellite cells), (US 5.833. 978 Method of in vitro preconditioning healthy donor's myoblasts before transplantation thereof in compatible patients suffering of recessive myopathies like muscular dystrophy, for improving transplantation success) (WO 03/012076 Culture medium to improve the purity of myoblast cultures and method using same). Los medios de cultivo estran compuestos de un medio basal definido y un componente indefinido consistente en suero bovino fetal y en algunos casos un suplemento consistente en factores de crecimiento.

La utilización de sueros heterólogos y en particular no humanos, puede tener importantes consecuencias negativas debidas al rechazo inmunoiogico y a la introducción de patógenos resultante de la imposibilidad de eliminar con absoluta certeza la presencia de virus y priones. Es decir, para el transplante de cellas progenitoras con fines regenerativos es necesario: a) disponer de un numero de cellas eficaz para el transplante, b) evitar el rechazo por parte del sistema inmune del huésped de los componentes transplantados, y c) evitar la introducción de agentes patógenos exógenos al huésped.

En el caso particular de la regeneración del miocardio infartado, se ha logrado una mejora parcial de la function cardiac mediante la implantación en el perfmetro de la zona del miocardio infartado de cellas progenitoras de musculo esqueletico autologo (Autologous skeletal myoblast transplantation for

severe postinfarction left ventricular dysfunction. Menasche P, Hagege AA, Vilquin JT, Desnos M, Abergel E, Pouzet B, Bel A, Sarateanu S, Scorsin M, Schwartz K, Bruneval P, Benbunan M, Marolleau JP, Duboc D. J Am Coll Cardiol. 2003 41: 1078-83).

A partir de una porcin de musculo esquelético del paciente se separan y purifican las cellas progenitoras que a continuacion se cultivan para alcazar el numero de cellas efectivo para el transplante. Las cellas progenitoras cultivadas se implantan en el miocardio del paciente, por ejemplo, utilizando una aguja hipodérmica o un cathéter.

Aunque la utilizacion de cellas progenitoras autólogas permite generar un numero suficiente de cellas eficaz para el transplante evitando a la vez los problemas de rechazo inmunológico e infecciones por patógenos derivados del donante, la utilización de medios de cultivo que incluyen componentes de origen animal sigue siendo un problema que preocupa debido a la posibilidad de introducción de patógenos de origen animal presentes en el suero. Debido a la potencial existencia de patógenos todavfa desconocidos en los materiales de origen biologico, la exclusion de tales agentes solo se puede garantizar utilizando materiales sintéticos o recombinantes y excluyendo todo material de origen animal. Incluso materiales tales como la alumina de suero bovino, garantizada por no contener patógenos especfficos, podrfa ser un vehfculo para la introduccion de patógenos cuya presencia habria sido imposible de detectar por no ser todavfa conocidos.

Por consiguiente, un medio para el cultivo de cellas destinadas a la regeneración de tejidos debe, ademas de proporcionar los nutrientes y factores de crecimiento adecuados, estar exento de materiales de origen animal. Una estrategia para alcazar tal objetivo consiste en utilizar exclusivamente materiales sintéticos y materiales autólogos, derivados del propio huésped.

DESCRIPCION DE LA INVENCION Breve descripcion de la invencion La presente invention se refiere a un medio de cultivo de cellas progenitoras humanas y al uso para la proliferación de dichas cellas para su posterior transplante autólogo. Dicho medio de cultivo consiste en un medio

definido suplementado con factores de crecimiento, mas un componente indefinido consistente en suero del propio paciente, que permite un crecimiento rapid de dichas cellas, frecuentemente superior al obtenido utilizando procedimientos basados en el uso de suero bovino fetal. Con este medio de cultivo se eliminan posibles fuentes de patógenos externos derivados de la utilización en el medio de cultivo de componentes de origen animal que suplementan los medios de cultivo sintéticos y los problemas de rechazo inmunológico.

La presente invention zambien se refiere al uso de dicho medio de cultivo capaz de promover la proliferación de cellas progenitoras de músculo esquelético para su posterior transplante autólogo en pacientes humanos y en particular para implante en pacientes afectos de patoiogfa cardiovascular.

Descripción detallada de la invenci6n La presente invención se enfrenta con el problema de proporcionar nuevos medios de cultivo capaces de promover la proliferaci6n de cellas progenitoras para su posterior transplante autologo en pacientes humanos.

La presente invention se basa en que los inventores han observado que un medio para el cultivo de cellas progenitoras de músculo esquelético consistente en un medio definido suplementado con factores de crecimiento, mas un componente indefinido consistente en suero del propio paciente, permite un crecimiento rapido de dichas cellas, no inferior y frecuentemente superior al obtenido utilizando los procedimientos anteriores basados en el uso de suero bovino fetal.

Asi, un objeto de la presente invention es un medio de cultivo completo semidefinido adecuado para el crecimiento de cellas progenitoras de músculo esquelético humanas, en adelante medio de cultivo de la presente invencion, para su posterior transplante a seres humanos, preferentemente para el transplante autólogo, constituido por: a) suero autólogo del propio paciente receptor del injerto entre el 1 y el 20% (v/v) ; b) un suplemento consistente entre 1 y 20 ng/ml de Epidermal Growth Factor (EGF), 1 y 20 ng/ml de basic Fibroblast Growth Factor (bFGF), entre 0,05 y 2 ug/ml dexametasona, y entre 1 y 20 pg/ml insulina ; y

c) un medio de cultivo definido para cellas animales entre 80 y 99 %.

Los margines aquf descritos son biológicamente razonables. Hay referencias, para los casos en que se utilizaron estos factores de crecimiento individual mente, estos oscilan alrededor de 10 ng/mi, por ejemplo bFGF se utiliza entre 3 y 10 ng/ml (US 5.324 656), EGF 10 ng/ml y Dexamentasona a 3 ug/ml (Autologous skeletal myoblast transplanted to isquemia damaged myocardium in humans Francis D. Pagani et al. J. American College of Cardiology, 2003,41 : 879-888).

Tal como se refiere en la presente patente el termino"medio de cultivo definido"se refiere a un medio artificial que aporta los mínimos requerimientos de aminoacidos esenciales, minerals, vitaminas, hormonas, etc, y que pertenece, a titulo ilustrativo y sin limitar el alcance de la presente invencion, al siguiente grupo: Ham's F12, MCDB 120, MCDB 131.

Un objeto particular de la presente invention lo constituye un medio de cultivo de la presente invención constituido por: a) suero autólogo del paciente receptor del injerto al 10%, b) un suplemento consistente en 10 ng/ml de EGF recombinante, 10 ng/ml de bFGF recombinante, 0. 4 ug/ml de dexametasona y 10 ug/ml de insulina recombinante, y c) un medio de cultivo definido Ham's F12 al 90%.

Con el medio de cultivo de la presente invention se eliminan posibles fuentes de patógenos externos derivados de la utilización en el medio de cultivo de componentes de origen animal que suplementan los medios de cultivo sintéticos y los problemas de rechazo inmunológico. Edemas, el crecimiento de las cellas progenitoras de músculo esquelético autólogo es comparable o superior al crecimiento de dichas cellas en los medios sintéticos suplementados con suero bovino fetal.

Un objeto adicional de la presente invention lo constituye el uso de un medio de cultivo definido para celulas animales al que se le ha anadido un suplemento de factores de crecimiento, para producir un medio de cultivo capaz de promover la proliferaci6n de cellas progenitoras de músculo esquelético para su posterior transplante autólogo en pacientes humanos.

Finalmente, otro objeto de la invención lo constituye el uso del medio de la presente invention para la proliferacion de cellas progenitoras de musculo esquelético para su posterior implante en pacientes afectos de patologfa cardiovascular.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Figura 1.-La figura muestra una gráfica de Side scatter contra Fluorescencia de un cultivo de mioblastos humanos tenido con una IgG control isotópico, panel izquierdo o con un anticuerpo IgG antidesmina, panel derecho.

Aproximadamente el 52% de la población celular muestra reactividad con el anticuerpo antidesmina.

EJEMPLOS DE READZAOON El siguiente ejemplo sirve para ilustrar la invención y no debe ser considerado en sentido limitativo del alcance de la misma.

1-Aislamiento y cultivo de cellas progenitoras de musculo esqueletico El siguiente procedimiento se realize en una camard de cultivo de flujo laminar vertical, en una sala para cultivos celulares.

A partir de una muestra de músculo esquelético del paciente se obtuvo material biológico para los siguientes experimentos. Se obtuvieron muestras de aproximadamente 5 g de un músculo esqueletico adecuado, en condiciones de esterilidad, a partir de donantes anestesiados y a través de una incision de aproximadamente 5 cm. Las muestras se depositaron en un tubo de plastic steril, convenientemente identificado, conteniendo medio de cultivo celular Ham's F12 y penicilina/estreptomicina a una concentración de 100 unidades/ml y 100 pg/ml, respectivamente. El traslado de la muestra a la sala de cultivo se realize empleando un tiempo maximo de una hora.

Posteriormente, se lav6 dicha muestra tres veces con 20 mi de medio de cultivo Ham's F12 conteniendo penicilina/estreptomicina a una concentración de 100 unidades/ml y 100 ug/ml, respectivamente y se disgregó finamente utilizando pinzas y bisturf quirurgico steriles. EI material disgregado se suspendit en 5 ml de medio de cultivo Ham's F12 sin suero conteniendo 2 mg/ml de colagenasa (Sigma C-2674) previamente esterilizada por filtration a

través de un filtro de 0, 2 um (Millipore) y se incubé durante 1 hora a 37°C con agitacion. A continuación se realiz6 un segundo tratamiento añadiendo tripsina recombinante (rProtease, nitrogen) a 37°C con agitation durante 20 minutos.

Una vez transcurrida la incubación se centrifugé a 2000 x g durante 30 minutos a 4°C, se descarto el sobrenadante y se suspendieron las cellas en 3 ml de suero del paciente para detener la acci6n de las proteasas. Se diiuyo la suspension añadiendo 7 mi de medio de cultivo Ham's F12 y se filtr6 a través de un filtro con un tamano de poro de 100 pm (Millipore), para eliminar los detritus y restos del tratamiento con proteasas. La fraction filtrada se deposits en un frasco de cultivo de 75 cm2 y se cultivé en medio Ham's F-12, suplementado con suero bovino fetal al 20% y 5 ng/ml de bFG F recombinante, en un incubador a 37°C, 5% C02.

Los cultivos de cellas progenitoras se mantuvieron en Ham's F12 hasta alcanzar el 70% de confluencia. Al alcazar este punto los cultivos se tripsinizaron y se expandieron trasladandolos a un frasco de cultivo de 175 cm2 en el que se mantuvieron en las mismas condiciones, hasta alcazar de nuevo el 70 % de confluencia y asi sucesivamente hasta alcazar el numero de cellas deseado.

EI numero total de cellas y el porcentaje de cellas progenitoras de músculo esquelético asf obtenidas se valoraron mediante citometrfa de flujo de los cultivos. Para ello, se descarto el medio de cultivo de las cellas progenitoras, generadas tal como se describe6 previamente, y se incubaron las cellas adheridas al plastico del frasco con 3 ml de tripsina recombinante durante 5 minutos a temperatura ambiente. La accon de las proteasas se detuvo añadiendo un volumen igual de medio de cultivo. Se contaron las cellas utilizando un hemocitómetro y la suspension de cellas se centrifugé a 400 x g durante 5 minutos a temperatura ambiente. A continuación se resuspendio el precipitado de cellas a una concentración de 106 celulas/ml en Ham's F12, se transfiri6 1 ml de la suspension a un tubo conic de 1,5 ml (Eppendorf) y se centrifuge en una microcentrffuga a 10.000 rpm durante 0,5 minutos a temperatura ambiente. EI precipitado de cellas se suspendit en 1 ml de PBS, 1% BSA, 0,1% azida sódica (PBA) y se repitió la centrifugación en las mismas condiciones. EI precipitado de cellas se suspendit en 100 pi de

70% etanol : agua durante 30 minutos a 4 °C con agitation ocasional. A continuación se centrifugaron las cellas en una microcentrffuga como en el caso anterior, se descarto el sobrenadante y se lavaron las coulas 2 veces con 1 mi de PBA. EI precipitado de cellas se resuspendio en 100 pi de PBA conteniendo 2 pI de un anticuerpo monoclonal antidesmina (Dako M 0760) y se incubaron durante 30 minutos a 4°C. Una cantidad igual de cellas control se incubé con la misma cantidad de la correspondiente IgG isotfpica (Sigma M 9269) en las mismas condiciones [Factors affecting functional outcome alter autologous skeletal myoblast transplantation. B. Pouzet et al., Ann. Thorac.

Surg. 2001,71 : 844-851].

Una vez concluidas las incubaciones se lavaron las celulas 2 veces con 1 ml de PBA, como en el caso anterior y el precipitado de cellas resultante se suspendit en 100 NI PBA conteniendo 2 pi de un anticuerpo anti IgG murino conjugado a FITC (Dako F 0479) y se incubaron durante 30 minutos a 4°C. Las cellas marcadas se lavaron 2 veces con PBA, como en el caso anterior.

La proportion de cellas progenitoras en la población de cellas cultivadas se determine utilizando un citómetro de flujo analizador Coulter X-L.

En la Figura 1 se muestran los resultados de tal analisis. Se observa que aproximadamente la mitad de la poblacion son mioblastos.

2.-Definicion del medio de cultivo de cellas progenitoras Se compare la capacidad proliferativa de las cellas progenitoras humanas en diferentes medios de cultivo con y sin componentes heterólogos de origen humano o animal.

Se utilizaron muestras de tejido muscular para producir suspensiones de cellas tal como se describio en el Ejemplo 1. Una vez disgregada se dividio la muestra en 3 alfcuotas con el mismo numero de cellas y se cultivé cada una de estas alicuotas tal como se describe en el Ejemplo 1, excepto que una alfcuota se cultivo en el medio (a), otra en el medio (b) y la tercera en el medio (c). Estos medios se describen a continuación.

(a) Medio de cultivo Ham's F12 suplementado con suero bovino fetal (SBF) al 20% (control referencia de crecimiento).

(b) Medio de cultivo Ham's F12 suplementado con suero del paciente al 10%.

(c) Medio de cultivo Ham's F12 suplementado con suero del paciente al 10%, 10 ng/ml de EGF recombinante (Sigma), 5 ng/ml de bFGF recombinante (PrepoTech EC Ltd), 0. 4 Ng/ml de dexametasona (Sigma) y 10 pg/ml de insulina recombinante (Sigma).

EI suero se prepare a partir de sangre, Se permite la coagulacion espontanea de la sangre a 37°C y a continuación se centrifuga a 3000 rpm y se separa el sobrenadante, consistente en el suero.

Se efectuaron determinaciones semanales del numero de cellas y analysis citométricos para determinar la proporcion de cellas progenitoras en el cultivo. El experimento se repitió por cuadriplicado utilizando muestras de diferentes individuos.

Las Tablas I y II muestran los resultados experimentales. En comparación con el medio de cultivo control (a) y el suplementado con suero del paciente (b), se puede observar que sólo con el medio suplementado con suero del paciente mas factores de crecimiento (c) se ha obtenido de todos los pacientes un numero de cellas superior a 200. 000. 000 a los 21 dfas. Se observa zambien, que este medio de cultivo optimizado favorece el crecimiento de cellas progenitoras frente a otros tipos celulares presentes en el cultivo (fibroblastos principalmente).

Tabla I.-N umero total de cellas de cada paciente en cada uno de los medios de cultivo en los tiempos de crecimiento indicados. Paciente 1 7 dias 14 dias 21 dias Suero bovino fetal 2.323. 332 7. 053. 328 23. 429.328 Suero paciente 1. 029. 999 3. 283. 332 17. 679.984 Suero paciente + 2. 869. 999 55. 666. 650 502. 333.200 Factores Crecimiento Paciente 2 7 dfas 14 dfas 21 dias Suero bovino fetal N. d 3. 423. 331 13. 523.994 Suero paciente N. d 2. 366. 665 7. 517.328 Suero paciente + 3. 036. 666 35, 919. 984 379. 733.280 Factores Crecimiento Paciente 3 7 dias 14 dias 21 dias Suero bovino fetal 1.658. 332 3. 972. 000 5. 119.992 Suero paciente 1. 516. 665 4. 114. 992 13. 153.482 Suero paciente + 5. 669-998 37. 633. 320 396. 799.920 Factores Crecimiento Paciente 4 7 días 14 días 21 días Suero bovino fetal 2. 078. 888 4. 641. 991 9. 715.200 Suero paciente 1. 609. 998 3. 941. 589 9. 533.316 Suero paciente + 4. 106. 666 38. 367. 964 239. 931.930 Factores Crecimiento

Tabla II.-Porcentaje de células progenitoras de cada paciente en cada uno de los medios de cultivo en los tiempos de crecimiento indicados. Paciente 1 7 dias 14 dias 21 dfas Suero bovino fetal 89 66 51 Suero paciente 69 25 20 Suero paciente + 92 91 88 Factores Crecimiento Paciente 2 7 dfas 14 dfas 21 dias Suero bovino fetal N. d 73 73 Suero paciente N. d 26 31 Suero paciente + 95 84 83 Factores Crecimiento Paciente 3 7 dfas 14 dfas 21 dfas Suero bovino fetal 42 52 53 Suero paciente 21 27 25 Suero paciente + 49 45 63 Factores Crecimiento Paciente 4 7 dfas 14 dfas 21 dfas Suero bovino fetal 64 45 49 Suero paciente 11 8 11 Suero paciente + 28 22 16 Factores Crecimiento