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Title:
CULTURE MEDIUM FOR PREPARING NEURAL STEM CELLS AND USE THEREOF
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2013/127293
Kind Code:
A1
Abstract:
Provided are a culture medium for preparing neural stem cells and use thereof, the culture medium for preparing neural stem cells comprising: a basic culture medium suitable for the growth of stem cells, and a cell signal pathway inhibitor selected from at least one of GSK inhibitor, MEK inhibitor, TGF-β inhibitor, ROCK inhibitor and BMP inhibitor.

Inventors:
PAN GUANGJIN (CN)
PEI DUANQING (CN)
WANG LIHUI (CN)
WANG LINLI (CN)
XUE YANTING (CN)
Application Number:
PCT/CN2013/071468
Publication Date:
September 06, 2013
Filing Date:
February 06, 2013
Export Citation:
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Assignee:
GUANGZHOU INST BIOMED & HEALTH (CN)
International Classes:
A61K35/30; C12N5/0797; A61P25/00; A61P25/28; C12M3/00; C12N5/079; C12N5/0793; C12N5/10; C12Q1/02
Domestic Patent References:
WO2011056971A22011-05-12
WO2009006422A12009-01-08
Foreign References:
CN102604894A2012-07-25
CN102191221A2011-09-21
Other References:
FENG NIANHUA ET AL.: "Differentiation of human induced pluripotent stem cells into neural cells", CHINESE JOURNAL OF PATHOPHYSIOLOGY, vol. 26, no. 8, 2010, pages 1662 - 1664, XP008174472
JI XUDONG ET AL.: "Investigation of differentiation derived from human umbilical cord blood into neuron-like cells", HENAN MEDICAL RESEARCH, vol. 14, no. 3, September 2005 (2005-09-01), pages 215 - 219, XP008174474, ISSN: 1004-437x
WENLIN LI ET AL.: "Generation of rat and human induced pluripotent stem cells by combining Genetic reprogramming and chemical inhibitor", CELL STEM CELL, vol. 4, 9 January 2009 (2009-01-09), pages 16 - 19, XP009139066
FENG NIANHUA ET AL.: "Differentiation of induced pluripotent stem cells into neural stem cells", BASIC & CLINICAL MEDICINE, vol. 30, no. 12, December 2010 (2010-12-01), pages 1263 - 1267, XP008174473
Attorney, Agent or Firm:
TSINGYIHUA INTELLECTUAL PROPERTY LLC (CN)
北京清亦华知识产权代理事务所(普通合伙) (CN)
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Claims:
权利要求书

1、 一种用于制备神经干细胞的培养基, 其特征在于, 包含:

基础培养基, 所述基础培养基适于干细胞生成; 以及

细胞信号通路抑制剂, 所述细胞信号通路抑制剂为选自 GSK抑制剂、 MEK抑制剂、

TGF- β抑制剂、 ROCK抑制剂和 BMP抑制剂的至少一种。

2、 根据权利要求 1所述的培养基, 其特征在于, 所述基础培养基为 mTeSRl。

3、 根据权利要求 1所述的培养基, 其特征在于, 所述细胞信号通路抑制剂为 GSK抑 制剂 CHIR99021、MEK抑制剂 PD0325901、TGF- β抑制剂 A83-01、: OCK抑制剂 thiazovivin 和 BMP抑制剂 DMH1的组合。

4、 根据权利要求 3所述的培养基, 其特征在于, 按照重量百分比, 所述培养基含有: 浓度为 0.3μΜ-30μΜ的 GSK抑制剂 CHIR99021 ;

浓度为 ΙΟηΜ-ΙΟμΜ的 ΜΕΚ抑制剂 PD0325901 ;

浓度为 50ηηι-5μΜ 的 TGF- β抑制剂 A83-01 ;

浓度为 50ηηι-5μΜ的 ROCK抑制剂 thiazovivin; 以及

浓度为 20ηηι-2μΜ的 BMP抑制剂 DMH1。

5、 根据权利要求 3所述的培养基, 其特征在于, 按照重量百分比, 所述培养基含有: 浓度为 3μΜ的 GSK抑制剂 CHIR99021 ;

浓度为 ΙμΜ的 ΜΕΚ抑制剂 PD0325901;

浓度为 0.5μΜ 的 TGF- β抑制剂 A83-01 ;

浓度为 0.5μΜ的 ROCK抑制剂 thiazovivin; 以及

浓度为 0.2μΜ的 BMP抑制剂 DMH1。

6、 一种用于制备神经干细胞的试剂盒, 其特征在于, 所述试剂盒中含有细胞信号通路 抑制剂,所述细胞信号通路抑制剂为选自 GSK抑制剂、 MEK抑制剂、 TGF- β抑制剂、 ROCK 抑制剂和 BMP抑制剂的至少一种。

7、 根据权利要求 6所述的制备神经干细胞的试剂盒, 其特征在于, 所述细胞信号通路 抑制剂为 GSK抑制剂 CHIR99021、 MEK抑制剂 PD0325901、 TGF- β抑制剂 A83-01、 ROCK 抑制剂 thiazovivin和 BMP抑制剂 DMH1的组合。

8、 根据权利要求 7所述的制备神经干细胞的试剂盒, 其特征在于, 所述 GSK抑制剂 CHI 9902K MEK抑制剂 PD0325901、 TGF- β抑制剂 A83-01、 ROCK抑制剂 thiazovivin 和 BMP抑制剂 DMH1分别设置在不同的容器中。

9、 根据权利要求 6所述的制备神经干细胞的试剂盒, 其特征在于, 进一歩包括基础培 养基, 所述基础培养基为 mTeSRl。

10、 根据权利要求 9所述的制备神经干细胞的试剂盒, 其特征在于, 所述细胞信号通 路抑制剂溶解于所述基础培养基中。

11、根据权利要求 10所述的制备神经干细胞的试剂盒,其特征在于, 按照重量百分比, 所述细胞信号通路抑制剂为:浓度为 3μΜ的 GSK抑制剂 CHIR99021、浓度为 ΙμΜ的 ΜΕΚ 抑制剂 PD0325901、 浓度为 0.5μΜ的 TGF- β抑制剂 A83-01、 浓度为 0.5μΜ的 ROCK抑制 剂 thiazovivin以及浓度为 0.2μΜ的 BMP抑制剂 DMH1的组合。

12、一种用于制备神经干细胞的试剂盒, 其特征在于, 包含权利要求 1-5任一项所述的 培养基。

13、 权利要求 6-12任一项所述的试剂盒在制备神经干细胞中的用途。

14、 权利要求 1-5任一项所述的培养基在制备神经干细胞中的用途。

15、 一种制备神经干细胞的方法, 其特征在于, 包括以下步骤- 利用权利要求 1-5任一项所述的培养基, 培养体细胞, 所述体细胞携带编码选自 Oct4、 Sox2、 lf4以及 miR302的至少一种多功能干细胞因子的核酸序列, 以便诱导所述体细胞转 分化为神经干细胞。

16、 根据权利要求 15所述的方法, 其特征在于, 所述体细胞为人尿液脱落细胞。

17、 根据权利要求 16所述的方法, 其特征在于, 所述体细胞是通过下列步骤获得的: 对人尿液进行离心, 以便获得沉淀物;

利用尿液培养基对所述沉淀物进行培养, 以便获得原代人尿液脱落细胞; 以及 利用携带编码选自 Oct4、 Sox2、 Klf4以及 miR302的至少一种多功能干细胞因子的核 酸序列的载体, 对所述原代人尿液脱落细胞进行转化, 以便获得所述体细胞。

18、 根据权利要求 17所述的方法, 其特征在于, 所述载体携带编码 Oct4、 Sox2、 Klf4 以及 miR302的核酸序列。

19、根据权利要求 1S所述的方法, 其特征在于, 所述载体为分别携带编码 Oct4、 Sox2、

Klf4以及 miR302的核酸序列的不同质粒。

20、 根据权利要求 17所述的方法, 其特征在于, 利用电转导对所述原代人尿液脱落细 胞进行转化。

21、 根据权利要求 15所述的方法, 其特征在于, 进一步包括:

利用基础培养基, 对所述神经干细胞进行贴壁培养; 以及

将经过贴壁培养的神经干细胞在神经干细胞培养基中进行培养, 所述神经干细胞培养 基为含有 1%N2 supplement、 1%非必需氨基酸、 0.1%肝素、 20ng/ml碱性成纤维细胞生长因 子和 20ng/m〖表皮生长因子的 DMEM/F12培养基。

22、 一种神经干细胞或其衍生物, 其特征在于, 所述神经干细胞是根据权利要求 15-21 任一项所述的方法获得的。

23、 权利要求 22所述的神经干细胞或其衍生物在制备药物中的用途, 所述药物用于治 疗神经细胞损伤所引起的疾病。

24、 一种治疗神经细胞损伤所引起的疾病的方法, 其特征在于, 包括:

将权利要求 22所述的神经干细胞或其衍生物引入患者体内。

25、 一种制备神经细胞的方法, 其特征在于, 将权利要求 22所述的神经干细胞在适于 分化的条件下进行培养。 26、 根据权利要求 25所述的方法, 其特征在于, 利用含有 1%N2 supplemen 1% 非必需氨基酸、 0.1%肝素, 并添加有浓度均为 10 ng/mL的神经营养因子 BDNF、 GDNF、 CNTF和 IGF的 DMEM/F12培养基, 对所述神经干细胞进行培养, 以便获得不同类型的神 经元和神经胶质细胞。

27、 一种用于制备神经干细胞的系统, 其特征在于, 包括:

分离装置, 所述分离装置用于从人尿液中分离人尿液脱落细胞;

转化装置, 所述转化装置与所述分离装置相连, 并且设置有携带编码选自 Oct4、 Sox2、 Klf4以及 miR302的至少一种多功能干细胞因子的核酸序列的载体,以便对所述人尿液脱落 细胞进行转化; 以及

转分化装置, 所述转分化装置与所述转化装置相连, 并且设置有权利要求 1-5任一项所 述的培养基, 用于对所述经过转化的人尿液脱落细胞进行转分化, 以便诱导所述经过转化 的人尿液脱落细胞转分化为神经干细胞。

28、 一种筛选诱导神经干细胞分化的化合物的方法, 其特征在于, 包括以下步骤: 将权利要求 22所述的神经干细胞与候选化合物接触; 以及

检测接触所述候选化合物前后神经干细胞的多能性,

其中, 基于接触所述候选化合物后, 所述神经干细胞的多能性是否降低, 判断所述候 选化合物是否具有诱导神经干细胞分化的活性。

29、 一种治疗神经退行性疾病和神经损伤疾病的方法, 其特征在于, 包括以下步骤: 分离患者的体细胞;

根据权利要求 15-21任一项所述的方法, 基于所述体细胞, 制备神经干细胞; 以及 将所述神经干细胞引入所述患者体内。

30、 一种鉴定制剂对神经系统是否具有影响的方法, 其特征在于, 包括以下步骤: 将所述制剂与权利要求 22所述的神经干细胞接触; 以及

对接触前后的神经干细胞进行检测,

其中,

基于所述神经干细胞的行为变化, 判断所述制剂对神经系统是否具有影响。

Description:
用于制备神经干细胞的培养基及其用途

优先权信息

本申请请求 2012 年 2 月 29 日向中国国家知识产权局提交的、 专利申请号为 201210051095.0的专利申请的优先权和权益, 并且通过参照将其全文并入此处。 技术领域

本发明涉及生物医药领域。具体地, 本发明涉及用于制备神经干细胞的培养基及其 用途。 背景技术

干细胞 (stem cells)是人体及其各种组织细胞的初始来源, 其最显著的生物学特征是 既有自我更新和不断增殖的能力, 又有多向分化的潜能。干细胞根据不同的来源 分为成 体干细胞 (somatic stem cells)和胚胎干细胞 (embryonic stem cells, ES细胞)。 成体干细胞 包括神经干细胞、 骨髓间充质干细胞、 造血干细胞等。 目前除对造血干细胞和间充质干 细胞的研究较多外, 对神经干细胞的研究也比较深入。

1992年, Reynolds和 Weiss等首次成功地从成年小鼠的纹状体分离出 神经干细 胞, 这种细胞具有自我更新和分裂增殖能力, 可以分化为神经系统大部分类型的细胞, 对损伤和疾病具有反应能力。 1998年, 日本学者 Okano和美国康内尔大学的 Goldman 合作, 证实了成人脑组织中神经干细胞的存在。 目前, 人们通过不断的实践证明了神经 系统内多潜能干细胞的存在并分离成功,为神 经系统损伤修复和退行性病变的细胞替代 治疗带来了新希望。 因为神经元不可再生修复的特性一直是医学科 学难以超越的障碍, 兼之中枢神经系统组织结构的脆弱易损性和它 决定智能活动的重要性,中枢神经系统疾 病及其后遗症始终是影响人类生命健康和生存 质量的顽疾之一,神经干细胞的研究成为 干细胞研究领域中最积极和最活跃的部分, 临床方面拥有光明的应用前景。

然而, 目前对于神经干细胞的相关研究仍有待改进。 发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问 题之一。 为此, 本发明的一个目的在 于提出一种能够有效制备神经干细胞的手段。

为此, 根据本发明的一个方面, 本发明提出了一种用于制备神经干细胞的培养 基。 根据本发明的实施例, 该用于制备神经干细胞的培养基包括: 基础培养基, 所述基础培 养基适于干细胞生长; 以及细胞信号通路抑制剂,所述细胞信号通路 抑制剂为选自 GSK 抑制剂、 MEK抑制剂、 TGF- β抑制剂、 ROCK抑制剂和 BMP抑制剂至少一种。 发明 人发现, 通过使用该培养基对体细胞进行培养, 尤其是对表达转录调控因子的体细胞进 行培养, 能够有效地使得体细胞转分化为神经干细胞( 在本文中有时也称为 "诱导性神 经干细胞" ) , 并且时间大大缩短。

根据本发明的又一方面, 本发明提出了一种用于制备神经干细胞的试剂 盒。根据本 发明的实施例, 该试剂盒含有细胞信号通路抑制剂, 所述细胞信号通路抑制剂为选自 GSK抑制剂、 MEK抑制剂、 TGF- β抑制剂、 ROCK抑制剂和 BMP抑制剂的至少一种。 发明人发现, 通过使用该试剂盒对体细胞进行培养, 尤其是表达转录调控因子的体细胞 进行培养, 能够有效地使得体细胞转分化为神经干细胞, 并且时间大大缩短。

根据本发明的又一方面, 本发明提出了一种用于制备神经干细胞的试剂 盒, 该试剂 盒包含前述的培养基。 发明人发现, 通过使用该试剂盒对体细胞进行培养, 尤其是表达 转录调控因子的体细胞进行培养, 能够有效地使得体细胞转分化为神经干细胞, 并且时 间大大缩短。

根据本发明的再一方面,本发明提出了前面所 述的试剂盒在制备神经干细胞中的用 途。 利用根据本发明实施例的试剂盒, 能够有效地对体细胞进行培养, 尤其是表达转录 调控因子的体细胞进行培养, 能够有效地使得体细胞转分化为神经干细胞, 并且时间大 大缩短。

根据本发明的另一方面,本发明提出了前面所 述的培养基在制备神经干细胞中的用 途。 由此, 能够有效地通过对体细胞尤其是表达转录调控 因子的体细胞进行体外培养, 能够有效地使得体细胞转分化为神经干细胞, 并且时间大大缩短。

根据本发明的又一方面, 本发明提出了一种制备神经干细胞的方法。根 据本发明的 实施例, 该方法包括以下步骤: 利用前面所述的培养基, 培养体细胞, 所述体细胞携带 编码选自 Oct4、 Sox2、 Klf4以及 miR302的至少一种多功能干细胞因子的核酸序列 , 以 便诱导所述体细胞转分化为神经干细胞。发明 人发现, 通过利用根据本发明实施例的培 养基,对携带编码特定转录因子即多功能干细 胞因子的核酸序列的体细胞进行培养, 能 够有效地使得体细胞转分化为神经干细胞, 并且时间可以大大缩短。

根据本发明的再一方面, 本发明还提出了一种神经干细胞或其衍生物。 根据本发明 的实施例, 该神经干细胞是根据前面所述的方法获得的。 此外, 根据本发明实施例的神 经干细胞或其衍生物能够在适当的条件下有效 地分化成神经细胞。

根据本发明的又一方面,本发明提出了前面所 述的神经干细胞或其衍生物在制备药 物中的用途, 所述药物用于治疗神经细胞损伤所引起的疾病 。 由于根据本发明实施例的 神经干细胞或其衍生物能够在适当的条件下有 效地分化成神经细胞, 因而,可以进一步 将该神经干细胞或其衍生物制成药物, 从而可以治疗神经细胞损伤所引起的疾病。

根据本发明的再一方面, 本发明提出了一种治疗神经细胞损伤所引起的 疾病的方 法。 根据本发明的实施例, 该方法包括: 将前面所述的神经干细胞或其衍生物引入患者 体内。通过将前面所述的神经干细胞或其衍生 物引入患者体内, 神经干细胞或其衍生物 能够在患者体内有效地分化为神经细胞,从而 可以进一歩弥补由于神经细胞损伤所引起 的身体损伤。

根据本发明的另一方面, 本发明提出了一种制备神经细胞的方法。根据 本发明的实 施例, 该方法包括将前面所述的神经干细胞在适于分 化的条件下进行培养。通过本发明 的方法, 能够有效地使得神经干细胞分化成为神经细胞 , 从而有效地制备了神经细胞。

根据本发明的再一方面, 本发明提出了一种用于制备神经干细胞的系统 。根据本发 明的实施例, 该系统包括: 分离装置, 所述分离装置用于从人尿液中分离人尿液脱落 细 胞; 转化装置, 所述转化装置与所述分离装置相连, 并且设置有携带编码选自 Oct4、 Sox2、 Klf4以及 imR302的至少一种多功能干细胞因子的核酸序列 的载体, 以便对所述 人尿液脱落细胞进行转化; 以及转分化装置, 所述转分化装置与所述转化装置相连, 并 且设置有前面所述的培养基, 用于对所述经过转化的人尿液脱落细胞进行转 分化, 以便 诱导所述经过转化的人尿液脱落细胞转分化为 祌经干细胞。利用该系统, 能够有效地实 施前述制备神经干细胞的方法, 从而可以有效地制备神经干细胞。

根据本发明的另一方面,本发明提出了一种筛 选诱导神经干细胞分化的化合物的方 法。 根据本发明的实施例, 该方法包括以下步骤: 将前面所述的神经干细胞与候选化合 物接触; 以及检测接触所述候选化合物前后神经干细胞 的多能性; 其中, 基于接触所述 候选化合物后, 所述神经干细胞的多能性是否降低, 判断所述候选化合物是否具有诱导 神经干细胞分化的活性。利用该方法能够有效 地筛选获得能够诱导神经干细胞分化的化 合物。

根据本发明的再一方面,本发明提出了一种治 疗神经退行性疾病和神经损伤疾病的 方法。 根据本发明的实施例, 该方法包括以下步骤: 分离患者的体细胞; 根据前面所述 的制备神经干细胞的方法, 基于所述体细胞, 制备神经干细胞; 将所述神经干细胞引入 所述患者体内。利用本发明的治疗神经退行性 疾病和神经损伤疾病的方法, 能够有效地 将制备获得的神经干细胞引入患者体内,进而 神经干细胞在患者体内能够有效地分化为 神经细胞, 进一步, 能够弥补由于神经退行和神经细胞损伤所引起 的身体损伤, 从而能 够治疗神经退行性疾病和神经损伤疾病。

根据本发明的又一方面,本发明提出了一种鉴 定制剂对神经系统是否具有影响的方 法。 根据本发明的实施例, 该方法包括以下步骤: 将所述制剂与根据本发明实施例的神 经干细胞接触; 以及对接触前后的神经干细胞进行检测, 其中, 基于所述神经干细胞的 行为变化,判断所述制剂对神经系统是否具有 影响。利用该方法能够有效地鉴定制剂对 神经系统是否具有影响。 本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部 分给出,部分将从下面的描述中变得 明显, 或通过本发明的实践了解到。 附图说明

本发明的上述和 /或附加的方面和优点从结合下面附图对实施 的描述中将变得明 显和容易理解, 其中:

图 1 : 显示了根据本发明一个实施例的制备神经干细 胞的方法的流程示意图; 图 2: 显示了根据本发明一个实施例的用于制备神经 干细胞的系统的结构示意图; 图 3 : 显示了根据本发明一个实施例的治疗神经退行 性疾病和神经损伤疾病的方法 的流程示意图;

图 4: 显示了根据本发明一个实施例的诱导诱导性神 经干细胞过程中各阶段的细胞 的形态图;

图 5 : 显示了根据本发明一个实施例的免疫荧光及 Real-Time PCR方法鉴定诱导性 神经干细胞的神经干细胞标志基因表达水平的 结果; 以及

图 6 : 显示了根据本发明一个实施例的免疫荧光检测 诱导性神经干细胞体外分化物 中不同类型神经元及祌经胶质细胞的标志物表 达的结果。 发明详细描述

下面详细描述本发明的实施例, 所述实施例的示例在附图中示出, 其中自始至终相 同或类似的标号表示相同或类似的元件或具有 相同或类似功能的元件。下面通过参考附 图描述的实施例是示例性的, 仅用于解释本发明, 而不能理解为对本发明的限制。 根据本发明的一个方面, 本发明提出了一种用于制备神经干细胞的培养 基。 根据本发 明的实施例, 该用于制备神经干细胞的培养基可以包括: 基础培养基, 该基础培养基适于 干细胞生长; 以及细胞信号通路抑制剂, 该细胞信号通路抑制剂为选自 GSK抑制剂、 MEK 抑制剂、 TGF- β抑制剂、 ROCK抑制剂和 BMP抑制剂的至少一种。 发明人发现, 通过使用 该培养基对体细胞进行培养, 尤其是对表达转录调控因子的体细胞进行培养 , 能够有效地 使得体细胞转分化为神经干细胞, 并且培养时间大大缩短。

根据本发明的实施例, 基础培养基的类型并不受特别限制。 根据本发明的一个实施例, 基础培养基为 mTeSRl (可以从 Stem Cell公司购得)。 根据本发明的实施例, 各细胞信号通 路的抑制剂的具体类型也不受特别限制。 根据本发明的一个实施例, 细胞信号通路抑制剂 可以为 GSK抑制剂 CHIR99021、 MEK抑制剂 PD0325901、 TGF- β抑制剂 A83-01、 ROCK 抑制剂 thiazovivin和 BMP抑制剂 DMH1的组合。 这些抑制剂均为市售可得的, 并且由此, 可以进一歩提高将体细胞转分化为神经干细胞 的效率。 对于各抑制剂在用于制备神经干细 胞的培养基中的浓度, 并不受特别限制。 根据本发明的一个实施例, 按照重量百分比, 该 培养基可以含有: 浓度为 0.3μΜ-30μΜ的 GSK抑制剂 CHIR99021 ; 浓度为 ΙΟηΜ-ΙΟμΜ的 ΜΕΚ抑制剂 PD0325901 ; 浓度为 50ιιιη-5μΜ的 TGF- β抑制剂 A83-01 ; 浓度为 50ηηι-5μΜ 的 ROCK抑制剂 thiazovivin; 以及浓度为 20ηηι-2μΜ的 BMP抑制剂 DMH1。 优选地, 根据 本发明的一个实施例, 按照重量百分比, 所述培养基可以含有: 浓度为 3μΜ的 GSK抑制剂 CHI 99021 ; 浓度为 ΙμΜ的 ΜΕΚ抑制剂 PD0325901 ; 浓度为 0.5μΜ的 TGF- β抑制剂 A83-01 ;浓度为 0.5μΜ的 ROCK抑制剂 thiazoYivin;以及浓度为 0.2μΜ的 BMP抑制剂 DMH1。 由此, 可以进一歩提高将降体细胞转分化为神经干细 胞的效率。

根据本发明的又一方面, 本发明提出了一种用于制备神经干细胞的试剂 盒。 根据本发 明的实施例, 该试剂盒含有细胞信号通路抑制剂, 该细胞信号通路抑制剂为选自 GSK抑制 齐!]、 MEK抑制剂、 TGF- β抑制剂、 ROCK抑制剂和 BMP抑制剂的至少一种。 发明人发现, 通过使用该试剂盒对体细胞进行培养, 尤其是对表达转录调控因子的体细胞进行培养 , 能 够有效地使得体细胞转分化为神经干细胞, 并且时间大大缩短。 根据本发明的实施例, 各 细胞信号通路的抑制剂的具体类型不受特别限 制。 根据本发明的一个实施例, 所述细胞信 号通路抑制剂可以为 GSK抑制剂 CHIR99021、 MEK抑制剂 PD0325901、 TGF- β抑制剂 A83-01、 ROCK抑制剂 thiazovivin和 BMP抑制剂 DMH1的组合。 这些抑制剂均为市售可 得的, 并且由此, 可以进一步提高将体细胞转分化为神经干细胞 的效率。 对于各抑制剂在 用于制备祌经干细胞的培养基中的浓度, 并不受特别限制。根据本发明的一个实施例, GSK 抑制剂 CHI 9902 MEK 抑制剂 PD032590 TGF- β抑制剂 Α83-0 ROCK 抑制剂 thiazovivin和 BMP抑制剂 DMH1分别设置在不同的容器中。 由此, 可以方便地使用该试剂 盒对体细胞进行转分化处理。 根据本发明的一个实施例, 该试剂盒可以进一步包括基础培 养基, 其中该基础培养基为 mTeSRl (可以从 Stem Cell公司购得)。

根据本发明的实施例, 细胞信号通路抑制剂的存在形式并不受特别限 制。 根据本发明 的一个实施例, 在该试剂盒中, 细胞信号通路抑制剂可以溶解于基础培养基中 。 由此, 可 以方便地使用试剂盒对体细胞进行转分化处理 。 根据本发明的一个实施例, 在该试剂盒中, 按照重量百分比, 溶解于基础培养基中的细胞信号通路抑制剂可 以为: 浓度为 3μΜ的 GSK 抑制剂 CHIR99021、 浓度为 ΙμΜ的 ΜΕΚ抑制剂 PD0325901、 浓度为 0.5μΜ 的 TGF- β抑 制剂 Α83-01、 浓度为 0.5 μΜ的 ROCK抑制剂 thiazovivin以及浓度为 0.2μΜ的 BMP抑制 剂 DMH1的组合。 由此, 可以进一步提高使用试剂盒对体细胞进行转分 化处理的效率。

根据本发明的又一方面, 本发明提出了一种用于制备神经干细胞的试剂 盒, 该试剂盒 包含前述的用于制备神经干细胞的培养基。 发明人发现, 通过使用该试剂盒对体细胞进行 培养, 尤其是对表达转录调控因子的体细胞进行培养 , 能够有效地使得体细胞转分化为神 经干细胞, 并且时间大大缩短。 关于用于制备神经干细胞的培养基, 前面己经进行了详细 描述, 在此不再赘述。

根据本发明的再一方面, 本发明提出了前面所述的试剂盒在制备神经干 细胞中的用途。 利用根据本发明实施例的试剂盒, 能够有效地对体细胞进行培养, 尤其是对表达转录调控 因子的体细胞进行培养, 能够有效地使得体细胞转分化为神经干细胞, 并且时间大大缩短。 关于试剂盒, 前面己经进行了详细描述, 在此不再赘述。

根据本发明的另一方面, 本发明提出了前面所述的培养基在制备神经干 细胞中的用途。 由此, 能够有效地通过对体细胞尤其是表达转录调控 因子的体细胞进行体外培养, 能够有 效地使得体细胞转分化为神经干细胞, 并且时间大大缩短。 关于用于制备神经干细胞的培 养基, 前面已经进行了详细描述, 在此不再赘述。

根据本发明的又一方面, 本发明提出了一种制备神经干细胞的方法。 根据本发明的实 施例, 该方法可以包括以下步骤: 利用前面所述的用于制备神经干细胞的培养基 , 培养体 细胞, 该体细胞携带编码选自 Oct4、 Sox2、 lf4以及 miR302的至少一种多功能干细胞因 子的核酸序列, 以便诱导体细胞转分化为神经干细胞。 发明人发现, 通过利用根据本发明 实施例的培养基, 对携带编码特定转录因子即多功能干细胞因子 的核酸序列的体细胞进行 培养, 能够有效地使得体细胞转分化为神经干细胞, 并且时间可以大大缩短。 根据本发明 的实施例, 体细胞的类型并不受特别限制。 根据本发明的一个实施例, 体细胞可以为人尿 液脱落细胞。 由此, 可以方便地获得起始细胞, 从而提高制备神经干细胞的效率, 降低制 备神经干细胞的成本, 避免采用侵入式手术方法获取起始细胞带来的 人力物力成本。

进一步, 根据本发明的实施例, 携带编码选自 Oct4、 Sox2、 Klf4以及 miR302的至少 一种多功能干细胞因子的核酸序列的体细胞, 也可以通过对不携带所述多功能干细胞因子 的体细胞进行生物学处理而得到。具体地,根 据本发明的实施例,携带编码选自 Oct4、 Sox2、 Klf4 以及 miR302 的至少一种多功能干细胞因子的核酸序列的体 细胞可以通过下列步骤获 得:

首先, 对人尿液进行离心, 以便获得沉淀物。

接着, 利用尿液培养基对所述沉淀物进行培养, 以便获得原代人尿液脱落细胞。

然后, 利用携带编码选自 Oct4、 Sox2、 Klf4 以及 miR302的至少一种多功能干细胞因 子的核酸序列的载体, 对原代人尿液脱落细胞进行转化, 以便获得体细胞。 根据本发明的 一个实施例, 载体携带编码 Oct4、 Sox2、 Klf4以及 miR302的核酸序列。 根据本发明的一 个实施例, 载体为分别携带编码 Oct4、 Sox2、 Klf4以及 miR302的核酸序列的不同质粒。 根据本发明的一个实施例, 利用电转导对原代人尿液脱落细胞进行转化。

在获得神经干细胞后, 还可以进一步对神经干细胞进行扩增培养。 根据本发明的实施 例, 对神经干细胞进行扩增培养的方法并不受特别 限制, 根据本发明的一个实施例, 本发 明的制备神经干细胞的方法可以进一步包括下 列步骤以实现对神经干细胞的扩增:

首先, 利用基础培养基, 对神经干细胞进行贴壁培养。 其中, 该基础培养基可以为 mTeSRl„

然后, 将经过贴壁培养的神经干细胞在神经干细胞培 养基中进行培养, 该神经干细胞 培养基为含有 1%N2 supplement 1%非必需氨基酸、 0.1%肝素、 20ng/ml碱性成纤维细胞生 长因子和 20ng/ml表皮生长因子的 DMEM/F12培养基。

根据本发明的再一方面, 本发明还提出了一种神经干细胞或其衍生物。 根据本发明的 实施例, 该神经干细胞是根据前面所述的方法获得的。 此外, 根据本发明实施例的神经干 细胞或其衍生物能够在适当的条件下有效地分 化成神经细胞。

根据本发明的又一方面, 本发明提出了前面所述的神经干细胞或其衍生 物在制备药物 中的用途, 该药物用于治疗神经细胞损伤所引起的疾病。 由于根据本发明实施例的神经干 细胞或其衍生物能够在适当的条件下有效地分 化成神经细胞, 因而, 可以进一歩将该神经 干细胞或其衍生物制成药物, 从而可以治疗神经细胞损伤所引起的疾病。

根据本发明的再一方面, 本发明提出了一种治疗神经细胞损伤所引起的 疾病的方法。 根据本发明的实施例, 该方法可以包括: 将前面所述的神经干细胞或其衍生物引入患者 体 内。 通过将前面所述的神经干细胞或其衍生物引入 患者体内, 神经干细胞或其衍生物能够 在患者体内有效地分化为神经细胞, 从而可以进一歩弥补由于神经细胞损伤所引起 的身体 损伤。

根据本发明的另一方面, 本发明提出了一种制备神经细胞的方法。 根据本发明的实施 例, 该方法包括将前面所述的神经干细胞在适于分 化的条件下进行培养。 通过本发明的方 法, 能够有效地使得神经干细胞分化成为神经细胞 , 从而有效地制备了神经细胞。 根据本 发明的实施例, 对神经干细胞进行分化培养的方法并不受特别 限制。 根据本发明的一个实 施例, 可以利用含有 1%N2 supplement, 1%非必需氨基酸、 0.1%肝素, 并添加有浓度均为 10 ng/mL的神经营养因子 BDNF、 GDNF, CNTF和 IGF的 DMEM/F12培养基, 对神经干 细胞进行培养, 以便获得不同类型的神经元和祌经胶质细胞。

根据本发明的再一方面, 本发明提出了一种用于制备神经干细胞的系统 。 根据本发明 的实施例, 参照图 2, 该系统 1000可以包括: 分离装置 100、 转化装置 200以及转分化装 置 300。 其中, 分离装置 100用于从人尿液中分离人尿液脱落细胞。转化 装置 200与分离装 置 100相连, 并且设置有携带编码选自 Oct4、 Sox2、 Klf4以及 miR302的至少一种多功能 干细胞因子的核酸序列的载体, 用于从分离装置 100接收人尿液脱落细胞并对其进行转化。 转分化装置 300与转化装置 200相连, 并且设置有前面所述的用于制备神经干细胞的 培养 基, 用于从转化装置 200接收经过转化的人尿液脱落细胞并对其进行 转分化, 以便诱导经 过转化的人尿液脱落细胞转分化为神经干细胞 。 利用该系统, 能够有效地实施前述制备神 经干细胞的方法, 从而可以有效地制备神经干细胞。

根据本发明的另一方面, 本发明提出了一种筛选诱导神经干细胞分化的 化合物的方法。 根据本发明的实施例, 该方法可以包括以下步骤: 将前面所述的神经干细胞与候选化合物 接触; 以及检测接触候选化合物前后神经干细胞的多 能性; 其中, 基于接触候选化合物后, 神经干细胞的多能性是否降低, 判断候选化合物是否具有诱导神经干细胞分化 的活性。 利 用该方法能够有效地筛选获得能够诱导神经干 细胞分化的化合物。

根据本发明的再一方面, 本发明提出了一种治疗神经退行性疾病和神经 损伤疾病的方 法。 根据本发明的实施例, 参照图 3, 该方法可以包括以下步骤:

首先, 分离患者的体细胞。

其次, 根据前面所述的制备神经干细胞的方法, 基于获得的体细胞, 制备神经干细胞。 然后, 将获得的神经干细胞引入患者体内。

利用本发明的治疗神经退行性疾病和神经损伤 疾病的方法, 能够有效地将制备获得的 神经干细胞引入患者体内, 进而神经干细胞在患者体内能够有效地分化为 神经细胞, 进一 步, 能够弥补由于神经退行和神经细胞损伤所引起 的身体损伤, 从而能够治疗神经退行性 疾病和神经损伤疾病。

根据本发明的又一方面, 本发明提出了一种鉴定制剂对神经系统是否具 有影响的方法。 根据本发明的实施例, 该方法可以包括以下歩骤: 将制剂与根据本发明实施例的神经干细 胞接触; 以及对接触前后的神经干细胞进行检测, 其中, 基于神经干细胞的行为变化, 判 断制剂对神经系统是否具有影响。 利用该方法能够有效地鉴定制剂对神经系统是 否具有影 响。

需要说明的是, 本发明的用于制备神经干细胞的培养基及其用 途, 是本申请的发明人 通过艰苦的创造性劳动和优化的工作而完成的 。 并且, 在本发明的各方面中所描述的特征 是可以相互引用的, 为方便起见, 不再赘述。 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。 本领域技术人员将会理解, 下面的实施 例仅用于说明本发明, 而不应视为限定本发明的范围。 实施例中未注明具体技术或条件的, 按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者 按照产品说明书进行。 所用试剂或仪器未注 明生产厂商者, 均为可以通过市购获得的常规产品。

实施例 1 : 制备神经干细胞

1、 分离人尿液脱落细胞 (Urine cells, UC)

按照以下步骤, 分离尿液脱落细胞:

( 1 ) 收集中段尿液 150-200ml, 置于无菌容器, 并加入双抗 (青霉素 /链霉素);

(2) 然后将上述尿液转入 50ml离心管, 400g离心 lOmin;

(3 ) 吸掉上清, 以便剩余约 5ml尿液;

(4) 向上述剩余尿液中加入含有双抗的 PBS约 10-30ml, 轻轻混匀, 然后 400g离心 lOmin;

(5 ) 吸掉上清至剩余液体少于 0.5ml :

(6) 然后向上述剩余尿液中加入 lml尿液细胞培养基重悬沉淀, 并收集细胞;

(7) 将上述收集到的细胞平铺接种于已用 0.1%的明胶(Gelatin)预包被处理的 60mm 培养皿(或六孔板)中, 补加 lml尿液细胞培养基, 其中, 尿液细胞培养基是通过将含 10% 胎牛血清 (FBS, PAA公司)、 双抗的高葡萄糖 DMEM (Dulbcco's Modifed Eagle Medium) 培养基(HyClone公司)和 SingleQuot Kit CC-4127 REGM培养基 (Lonza公司) 1 : 1混合而获 得的;

(8 ) 将接种有细胞的培养皿置于 37°C, 5%C02的培养箱内培养 3天;

(9) 观察培养皿内是否有细胞贴壁, 然后轻轻补加 lml 培养基, 继续置于 37°C, 5%C02 培养箱内进行培养;

( 10) 在接种细胞的第 5-7天, 吸去培养皿内的培养基, 并用 PBS洗涤一遍, 然后向 培养皿中添加新鲜尿液培养基 (不加抗生素), 可见细胞贴壁生长;

( 11 ) 视细胞生长情况添加或更换培养基, 可用 0.25%胰酶消化传代扩增;

( 12) 当尿液细胞扩增至第 2 代开始, 收获原代人尿液脱落细胞, 并用冻存液 (90%FBS+10%DMSO) 将其用液氮冻存, 备用。

2、 诱导诱导性神经干细胞 (induced neural stem cell, iNSC )

iNSC的诱导试验包括细胞准备、 质粒电转、 细胞接种诱导、 细胞克隆挑取、 iNSC扩增 等环节, 具体步骤如下: ( 1 ) 将冻存的原代人尿液脱落细胞进行复苏, 并接种于 10cm盘 (或者六孔板) 中;

(2 ) 待原代人尿液脱落细胞在 10cm盘中的汇合度至 90%左右时,用 0.25%胰酶对其 进行消化, 然后收集细胞并计数;

(3 ) 将适量细胞 (每个电转体系的细胞数量在 50-150万范围) 转移至 1.5ml的 EP 管中, 200g离心 5min;

(4 ) 吸掉 EP管中的上清, 并收集细胞沉淀于电转杯中;

(5 ) 配制质粒转化体系:向上述电转杯中依次加入 82 μΐ Basic Nucleofector® Solution for Mammalian Epithelial Cells禾 Π 18μ1 supplement l(Lonza公司)轻轻混匀, 然后加入 5μg质 粒, 充分混匀, 以便获得质粒转化体系, 其中质粒包括 pCEP4-02SET2K(3 g)和 pCEP4-mi -302 (2 g);

(6 ) 将电转杯置于 Amaxa电转仪 (Lonza公司)上, 选择 T-013 (或 T-020) 程序进行 电转;

(7 ) 将电转后的细胞转移至包被有基质胶(Matrigd) 六孔板(或者 10cm盘)上, 每孔接种约 10-30万细胞, 可根据细胞状态进行调整, 然后添加尿液细胞培养基, 将细胞培 养过夜;

( 8 ) 次日 (或转染后第二日), 将上述六孔板中的尿液细胞培养基更换为含有 3μΜ CHI 9902K ΙμΜ PD032590K 0.5μΜ A83-01 ( Tocris Bioscience )、 0.5μΜ thiazovivin禾!] 0.2μΜ DMH1 (Tocris Bioscience) 的 mTeSRl ±咅养基 ( Stem Cell公司) 本发明的用于制备神 经干细胞的培养基进行培养, 观察细胞, 并每隔一天更换一次培养基;

(9 ) 在电转后约 12-15天, 经过诱导的细胞将长出大小合适、 边缘清晰、 细胞排列 紧密的克隆, 利用机械法挑取细胞克隆, 并将其分成小块, 接种于包被有 Matrigel的基质胶 (Matrigd) 的六孔板 (或十二孔板) 上, 用普通 mTeSRl培养基进行培养;

( 10 ) 当经过培养的细胞克隆贴壁后, 更换新鲜培养基, 并继续培养 3-5天, 隔天换 液, 可见大量排列成神经花环 (Rosette) 样结构的或者具有极性排列的神经干细胞样细 胞 团;

( 1 1 ) 机械法挑取神经干细胞样细胞团, 并用 lml枪头轻轻吹打, 将细胞团吹成小块 或单细胞, 并将获得的单细胞转移至装有神经干细胞培养 基的 T25培养瓶中继续培养, 其 中,神经干细胞培养基为含有 1%N2 supplement(Gibco)、 1%非必需氨基酸(NEAA, Gibco)、 0.1%肝素(Heparin, Sigma)、 20ng/ml碱性成纤维细胞生长因子〔bFGF, Invitrogen)和 20ng/ml 表皮生长因子 (EGF, R&D Systems) 的 DMEM/F12培养基;

( 12 ) 悬浮生长于培养瓶中一周后, 细胞可形成边界清晰的神经球 (这时的神经球被 定义为 P1代神经球), 此后, 每 2-3天更换一次培养基, 更换的量为原培养基的一半;

( 13 ) 当细胞生长到 7-14天(视神经球大小) 时, 即从细胞置于培养瓶中用神经干细 胞培养基培养开始的第 7-14天, 将其进行传代, 将直径超过 300μπι的神经球转移至 15ml 的离心管中, 待神经球自然沉降或离心 (50g, l-2min) 后, 吸除上清, 并向离心管中添加 lml Accutase, 使其于 37 °C下进行消化 3-5min; ( 14 ) 向上述离心管中添加神经干细胞培养基(其中 ,神经干细胞培养基为含有 1%N2 supplement(Gibco), 1%非必需氨基酸(ΝΕΑΑ, Gibco)、 0.1%肝素(Heparin, Sigma) 20ng/ml 碱性成纤维细胞生长因子(bFGF, Invitrogen)和 20ng/ml表皮生长因子(EGF, R&D Systems) 的 DMEM/F12培养基) 至反应体系的体积为 10ml, 然后 200g离心 5mm;

( 15 ) 吸掉上清, 然后向离心管中添加少量神经干细胞培养基 (约 500μΙ), 混匀, 并 用 lml枪头轻轻吹打将细胞团打散成小块, 再向离心管中添加 lml神经干细胞培养基, 混 匀后接种于新的培养瓶中, 继续培养以形成第二代神经球。

其中, 利用倒置显微镜 (Olympus, BX51 ) 对从原代人尿液脱落细胞诱导制备神经干 细胞过程中各阶段的细胞进行形态观察并照相 , 结果见图 4。 图 4显示了本实施例的诱导诱 导性神经干细胞过程中各阶段的细胞的形态图 。 如图 4所示, A为原代人尿液脱落细胞; B为细胞经过电转后诱导形成的细胞克隆; C为挑取的克隆贴壁后的形态; D为 iNSC神经 球,放大倍数为 100。 实施例 2: 诱导性神经干细胞(iNSC)表型的鉴定

1、 免疫荧光染色检测 iNSC中 NSC标志物的表达

( 1 ) 将已包被基质胶 (Matrigel) 的玻片置于 24孔板中, 取 5-10个实施例 1制备的 体积较小的 iNSC神经球 (即 iNSC神经干细胞) 贴在玻片上, 然后向玻片上添加 ΙΟΟμΙ神 经干细胞培养基,培养过夜,次日再向每个孔 中添加 500μ1神经干细胞培养基,培养 1-2天;

(2 ) 利用 4%的多聚甲醛, 将上述经过培养的细胞于室温下固定 20 min ;

(3 ) 用 PBS将经过固定的细胞充分漂洗 3 次, 每次 5min;

(4 ) 向经过漂洗的细胞中添加一抗(Pax6、Nestin、So xl、Sox2)、 1% BSA、 10% normal goat serum 、 0.3% Triton X-100和 PBS , 然后于 4°C下培养过夜;

(5 ) 用 PBS将培养过夜的细胞洗涤 3 次, 每次 5min ;

( 6 ) 向经过洗涤的细胞中添加相应的标记有 Alexa 568 或 488的二抗 (Invitrigen), 然后于室温下进行避光孵育 1 h;

( 7 ) 用 PBS将经过避光孵育的细胞洗涤 3 次, 每次 5min;

(8 ) 向上歩获得的经过洗涤的细胞中添加 DAPI ( Sigma),然后于室温下进行避光孵 育 3 min;

( 9 ) 用 PBS将上步获得的经过避光孵育的细胞洗涤 3 次, 每次 5ηώι ;

( 10 ) 然后进行封片, 并对样品进行观察照相, 结果见图 5。

2、 Real-Time PCR鉴定诱导性神经干细胞 GNSC ) 中神经干细胞标志基因的表达 首先, 使用 Trizd (Takara公司)试剂, 按照制造商说明, 提取实施例 1制备的诱导性 神经干细胞的总 R A。 然后, 用 M-MLV ( Takara公司) 试剂盒对提取的总 NA进行逆转 录, 获得 cDNA, 并使用 SYBR® Premix Ex Taq™ 试剂盒 (Takara公司)和 ABI 7300荧光 定量 PCR仪 (ABI公司) 对 cDNA进行 Real-Time PCR, 以便鉴定神经干细胞标志基因的 表达, 结果见图 5。 其中, Real-Time PCR引物的序列见下表

注: F : 正向; R反向。

图 5显示了利用免疫荧光及 Real-Time PC 方法鉴定、检测实施例 1制备的 iNSC中神 经干细胞标志基因的表达水平的结果。 如图 5所示, 其中, A和 B为免疫荧光染色结果, A 表明 iNSC中有 Pax6和 Nestin表达, B表明 iNSC中有 Soxl ( B )表达; C为 Real-Time PCR 检测结果, 结果分别显示了 iNSC中 Sox2、 Pax6, Soxl及 Nestin的基因表达水平, 其中 UC 为尿液细胞, iPS为由原代人尿液脱落细胞诱导形成的多能性 干细胞。 3、 体外鉴定 iNSC的分化能力

将已包被基质胶(Matrigel)的玻片置于 24孔板中,将实施例 1制备的 iNSC神经球(诱 导性神经干细胞)贴在玻片上, 然后向玻片上添加 ΙΟΟμΙ神经干细胞培养基, 培养过夜, 次 日再向每个孔中添加 1ml神经分化培养基,培养 1-2天,其中,神经分化培养基为含有 1%N2 supplement(Gibco), 1%非必需氨基酸 (NEAA, Gibco)、 0.1%肝素 (heparin, Sigma) 和每 种均为 10 ng/mL的神经营养因子 BDNF、GDNF、CNTF和 IGF(Peprotech公司)的 DMEM/F12 培养基。 然后, 每隔一天更换神经分化培养基, 换液量为原培养基的一半, 培养 2 周后, 获得诱导性神经干细胞的体外分化物。 然后, 通过免疫荧光检测获得的诱导性神经干细胞 的体外分化物中 Tuj、 Map2、 Dcx、 TH、 GABA、 Glutamine及 GFAP蛋白的表达, 结果见 图 6。 其中 TH、 GABA、 Glutamine及 GFAP蛋白分别为不同类型的神经元和神经胶质 胞 的标志物, 由此, 能够通过检测诱导性神经干细胞的体外分化物 中 Tuj、 Map2、 Dcx、 TH、 GABA、 Glutamine及 GFAP蛋白的表达, 来鉴定诱导性神经干细胞经体外分化获得的不 同 类型的神经元和神经胶质细胞, 从而能够确认 iNSC的体外分化能力。

图 6 显示了根据本发明一个实施例的免疫荧光检测 诱导性神经干细胞体外分化的不同 类型神经元及神经胶质细胞的标志物表达的结 果。如图 6所示, A表明 自发分化形成 了大量的神经元和胶质细胞; B表明诱导性神经干细胞体外分化物中有 Map2和 GABA表 达; C表明诱导性神经干细胞体外分化物中有 Map2和 Glutamine表达; D表明诱导性神经 干细胞体外分化物中有 TH表达; E表明诱导性神经干细胞体外分化物中有 Tuj和星形胶质 细胞标记物 GFAP表达; F表明诱导性神经干细胞体外分化物中有 Dcx和 Tuj表达。 工业实用性

本发明的用于制备神经干细胞的培养基, 能够有效地应用于神经干细胞的制备, 利用 该培养基对体细胞进行培养, 尤其是对表达转录调控因子的体细胞进行培养 , 能够有效地 使得体细胞转分化为神经干细胞, 并且时间大大缩短。 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描 述, 本领域技术人员将会理解。 根据已 经公开的所有教导, 可以对那些细节进行各种修改和替换, 这些改变均在本发明的保护范 围之内。 本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等 同物给出。

在本说明书的描述中, 参考术语"一个实施例"、 "一些实施例"、 "示意性实施例"、 "示 例"、 "具体示例"、 或 "一些示例"等的描述意指结合该实施例或示例 述的具体特征、 结 构、 材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例 或示例中。 在本说明书中, 对上述术语 的示意性表述不一定指的是相同的实施例或示 例。 而且, 描述的具体特征、 结构、 材料或 者特点可以在任何的一个或多个实施例或示例 中以合适的方式结合。