Die vorliegende Erfindung liegt auf dem Gebiet der mikroskopischen Untersuchung von Fluoreszenzproben. Insbesondere betrifft sie eine Küvette und eine Mikrotiterplatte zur Aufnahme und Positionierung einer oder mehrerer Fluoreszenzproben sowie eine Lichtscheiben-Fluoreszenz-Mikroskopie(LSFM)-Anordnung, ein System und ein Verfahren zur Untersuchung einer Fluoreszenzprobe.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Fluoreszenzmikroskopie wird in unterschiedlichen Bereichen zur Untersuchung von biologischen Proben eingesetzt. Ein Beispiel ist die fluoreszenzmikroskopische Untersuchung von Zell-Spheroiden, insbesondere von multizellulären Tumor-Spheroiden, bei denen es sich um kugelförmige Zellaggregate oder Zellanhäufungen handelt, die mehrere tausend Zellen umfassen können. Solche Proben können einen Durchmesser zwischen einigen 10 μιη und einigen 100 μιη aufweisen.

Für die Fluoreszenz-Untersuchung werden die Proben mit einem oder mehreren Fluoreszenzfarbstoffen präpariert, die mit einer bestimmten Wellenlänge angeregt werden können. Alternativ können auch Proben verwendet werden, die selbstproduzierte Fluoreszenzfarbstoffe aufweisen und daher nicht mit solchen präpariert werden müssen. In Antwort auf die Anregung emittieren die präparierten Probenbestandteile ein charakteristisches Fluoreszenzlicht-Spektrum, wobei sich die Wellenlänge der maximalen Fluoreszenzemission typischerweise von der Anregungswellenlänge unterscheidet. Ein Beispiel für einen geeigneten Fluoreszenzfarbstoff ist der Farbstoff DRAQ5, der mit einer Wellenlänge von 633 nm angeregt werden kann und der in Antwort auf diese Anregung eine maximale Fluoreszenzemission im Bereich von 700 nm aufweist. Um eine Probe dreidimensional zu untersuchen, können nacheinander verschiedene Probenebenen angeregt werden, die parallel zueinander liegen und sich in unterschiedlichen Tiefen der Probe befinden. Eine solche selektive Anregung eines in einer Ebene liegenden oder scheibenförmigen Probenbereichs kann dadurch erreicht werden, dass das Anregungslicht in Form einer Lichtebene oder Lichtscheibe in die Probe projiziert bzw. fokussiert wird. Eine Möglichkeit eine solche Lichtebene zu erzeugen, besteht darin, den Anregungsstrahl durch eine bestimmte Optik entsprechend zu formen. Eine andere Möglichkeit besteht darin, den Anregungslichtstrahl entlang einer Ebene zu scannen. Die verwendete Scannrate ist dabei üblicherweise mehrere Größenordnungen höher als die Detektions- oder Abtastrate, mit der ein Detektionsmittel, z.B eine CCD-Kamera, das von der angeregten Probenebene emittierte Fluoreszenzlicht detektiert. Dadurch erscheint die detektierte Probenebene als eine gleichmäßig beleuchtete Ebene, auch wenn der gescannte Anregungsstrahl an sich eine im Wesentlichen eindimensionale Ausdehnung hat.

Bei der zuvor beschriebenen Lichtscheiben-Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) wird üblicherweise solches Fluoreszenzlicht detektiert, das von der Probe senkrecht zur Lichtebene ausgesandt wird, weil dadurch die zu detektierenden Probenbereiche, die in einer Ebene angeordnet sind, gleichermaßen intensiv detektiert werden. Ein weiterer Vorteil ist, dass das zu detektierende Fluoreszenzlicht mit vergleichsweise wenig Anregungslicht vermischt ist.

Um Proben mit Hilfe von Lichtscheiben-Fluoreszenz-Mikroskopie zu untersuchen, werden im Stand der Technik verschiedene Anordnungen verwendet. Zum Beispiel wird für die obengenannte Untersuchung die Probe auf oder unter einem Deckglas positioniert und schräg von oben beleuchtet. Mit einem geeigneten Detektionsobjektiv wird das von der Probe schräg nach oben und senkrecht zur Beleuchtungsrichtung emittierte Fluoreszenzlicht empfangen und an ein Detektionsmittel zur Detektion weitergeleitet. Ein Nachteil einer solchen Untersuchung besteht darin, dass jede einzelne Probe zunächst „gefunden" werden muss, bevor sie genau untersucht werden kann. Deshalb ist ein solches Untersuchungsverfahren, insbesondere bei einer Vielzahl von Proben, sehr zeitaufwändig und ungeeignet, wenn die Untersuchung mit einem hohen Durchsatz erfolgen soll.

Nachteilig ist weiterhin, dass bei einer solchen Untersuchung die Abbildungsqualität oft nicht optimal ist. Beispielsweise kann sie beeinträchtigt werden, wenn die Probe auf dem Deckglas von einem Probenmedium umgeben ist, dessen Oberfläche, an der das Anregungslicht und das empfangene Fluoreszenzlicht gebrochen werden, unregelmäßig gewölbt ist, wodurch Abbildungsfehler entstehen können.

Auch wenn sich die Probe unter einem Deckglas befindet und die Beleuchtung und das Empfangen des Fluoreszenzlichtes senkrecht zueinander erfolgen, können aufgrund der Brechungsindexänderungen und der zugehörigen Lichtbrechung an der schräg zur Beleuchtungsrichtung und zur Richtung des empfangenen Fluoreszenzlichtes verlaufenden Oberseite und Unterseite des Deckglases Abbildungsfehler auftreten.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Vorrichtungen und ein Verfahren zur mikroskopischen Untersuchung einer Fluoreszenzprobe zur Verfügung zu stellen, welche die obengenannten Nachteile überwinden und eine vorteilhafte Probenuntersuchung gestatten.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Diese Aufgabe wird durch die unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen und Ausführungsformen sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben. Die vorliegende Erfindung betrifft eine Küvette zur Aufnahme einer Probe und zur Positionierung der Probe für eine Untersuchung mittels inverser Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere inverser Lichtscheiben-Fluoreszenz-Mikroskopie. Die Küvette umfasst eine Öffnung, die an einem oberen Ende der Küvette angeordnet ist sowie eine erste und eine zweite transparente Bodenwand, die derart zueinander angeordnet sind, dass ihre Flächennormalen mit einem Winkel zwischen 70° und 1 10°, vorzugsweise zwischen 80° und 100°, besonders vorzugsweise zwischen 85° und 90° und insbesondere von zumindest annähernd 90° zueinander geneigt sind.

Die erfindungsgemäße Küvette ist geeignet, eine mit einem Fluoreszenzfarbstoff markierte Probe der eingangs genannten Art allein oder zusammen mit einem Probenmedium, beispielsweise zusammen mit einer wässrigen Lösung, in der sich eine oder mehrere Proben befinden, durch ihre Öffnung aufzunehmen. Sowohl bei der Aufnahme der Probe als auch bei der Untersuchung und Positionierung der Probe ist die Küvette so ausgerichtet, dass ihre Öffnung vertikal nach oben weist. Daher gelangt die Probe aufgrund der Schwerkraft an einen Probenort, der sich am Boden der Küvette befindet und der direkt an die zueinander geneigten Bodenwände angrenzt. Dies kann beispielsweise durch ein Absinken im Probenmedium erfolgen oder dadurch, dass die Probe am Boden der Küvette abgelegt wird oder auf diesen fällt, wobei die Probe durch die geneigten Bodenwände und die Schwerkraft zum Probenort geführt oder an den Probenort geleitet wird. Der Probenort entspricht demjenigen Volumen, in das die Probe in der ausgerichteten Küvette ohne aktives Zutun von außen mithilfe der geneigten Bodenwände gelangt oder geführt wird. Die Küvette bietet damit den Vorteil, eine Probe für eine Untersuchung ohne aktives Zutun und beschädigungsfrei an einen Probenort in der Küvette führen zu können und die Probenposition auf den Probenort beschränken zu können. Weil der Probenort bekannt und räumlich eng eingegrenzt ist, ist die Probe schnell auffindbar, wodurch der Zeitaufwand für eine optische Untersuchung der Probe reduziert werden kann. Weil die erste und zweite Bodenwand transparent sind, kann die Probe am Probenort durch die erste oder die zweite Bodenwand entlang einer Beleuchtungsrichtung mit Anregungslicht beleuchtet oder angeregt werden, und kann Fluoreszenzlicht, das vom Probenort senkrecht zur Beleuchtungsrichtung ausgesandt wird, die Küvette durch die zweite bzw. die erste Bodenwand entlang einer Detektionsrichtung verlassen. Im Idealfall beträgt der Winkel zwischen der ersten und zweiten Bodenwand 90°. Dies gestattet es, die Beleuchtungsrichtung und die Detektionsrichtung so zu wählen, dass die Beleuchtungsrichtung mit der Richtung der Flächennormalen der ersten oder zweiten Bodenwand übereinstimmt und die Detektionsrichtung mit der Richtung der Flächennormalen der zweiten bzw. ersten Bodenwand übereinstimmt. Weil bei der Untersuchung sowohl das Anregungslicht als auch das zu detektierende Fluoreszenzlicht senkrecht durch die jeweilige Bodenwand treten können, ist es möglich, Abbildungsfehler oder optische Verzerrungen, wie beispielsweise eine sphärische Aberration, Astigmatismus oder Koma, die sich bei einer Abweichung des Einfalls- oder Ausfallswinkels von 90° ergeben und die umso größer sind, je größer die Abweichung ist, zu vermeiden oder zu reduzieren. Mit der Küvette ist daher eine Untersuchung möglich, bei der zwischen der Probe und den Objektiven sämtliche Grenzflächen, an denen sich für das Anregungslicht und/oder für das zu detektierende Fluoreszenzlicht ein Brechungsindexübergang ergibt, senkrecht zum Lichtweg stehen. Dadurch kann die Lichtscheibe verzerrungsfrei oder nahezu verzerrungsfrei in die Probe fokussiert werden und die angeregte Probenebene verzerrungsfrei oder nahezu verzerrungsfrei abgebildet werden. Man beachte, dass die erfindungsgemäße Küvette nicht auf den obengenannten Idealfall beschränkt ist, sondern dass die Neigung der Bodenwände auch innerhalb des genannten Bereiches liegen kann, mit dem ebenfalls eine vorteilhafte Untersuchung mit geringer Verzerrung möglich ist.

Ein weiterer Vorteil der Küvette besteht darin, dass sie sich für die Untersuchung mit einer inversen Mikroskop-Anordnung eignet. Bei einer inversen Mikroskop-Anordnung sind die Objektive zur Untersuchung der Probe unterhalb der Probe angeordnet. Aufgrund der transparenten Bodenwände können sowohl das beleuchtende Beleuchtungsobjektiv als auch das Fluoreszenzlicht empfangende Detektionsobjektiv unterhalb der Küvette angeordnet werden. Weil oberhalb der Küvette keine Objektive benötigt werden, kann die Küvette von oben frei zugänglich sein, was viele Vorteile bei der Handhabung mit der Probe und der Untersuchung bietet. Beispielsweise kann die Küvette ohne großen Zeitaufwand ausgetauscht werden, ohne dass dabei die Objektiveinstellung verändert werden muss, die Probe kann während der Untersuchung grob von oben inspiziert werden oder es kann Probenmedium hinzugegeben oder entnommen werden.

Bei der Küvette sind die Bodenwände für das Anregungslicht und das zu detektierende Fluoreszenzlicht transparent. Vorzugsweise sind die Bodenwände derart transparent, dass die Transmission in zwei Wellenlängenbereichen, die jeweils eine Breite von mindestens 20 nm aufweisen und die sich jeweils zwischen 300 nm und 1200 nm, insbesondere zwischen 400 nm und 800 nm befinden, mindestens 50 %, vorzugsweise mindestens 70 % und besonders vorzugsweise mindestens 90 % beträgt. Die Wellenlänge von Anregungs- und Fluoreszenzlicht bei rein fluoreszenzmikroskopischen Anwendungen liegt üblicherweise im Bereich zwischen 400 nm und 800 nm. Eine Transmission für den größeren Bereich zwischen 300 nm und 1200 nm gestattet die zusätzliche Verwendung der Küvette für weitere Anwendungen unter Verwendung weiterer Wellenlängen, beispielsweise für ein Schneiden mittels UV-Licht (sog. „UV cutter") oder eine Ausnutzung des Effektes der optischen Pinzette. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Küvette zumindest teilweise aus einem Polymer, insbesondere aus Polyfluorethylen, Polytetrafluorethylen, Tetrafluorethylen, einem Cyclo-Olefm-Polymer, Perfluorpropylen, einem Polyamid oder einem Polyimid gebildet. Aus diesen Materialen kann die Küvette auf vergleichsweise einfache Art und Weise und kostengünstig mit Hilfe eines thermischen Formungsprozesses hergestellt werden.

In einer anderen Ausführungsform besteht die erfindungsgemäße Küvette zumindest teilweise aus Glas.

Der Brechungsindex der Bodenwände weist vorzugsweise einen Wert zwischen 1,2 und 1,7 auf. Um Brechungsindex-Unterschiede im Strahlengang in Beleuchtungsrichtung und in Detektionsrichtung zu reduzieren und die Qualität der optischen Abbildung zu verbessern, kann die erfindungsgemäße Küvette auch zusammen mit geeigneten Immersionsmedien verwendet werden, die beispielsweise in die Küvette eingebracht werden und/oder die außen an die Küvette angrenzend vorgesehen sind.

In einer vorteilhaften Ausführungsform liegt die Wandstärke der Bodenwände zwischen 12,5 μηι und 160 μιη. Dadurch kann die Qualität der optischen Untersuchung weiter verbessert werden, insbesondere wenn das Licht nicht senkrecht auf die Bodenwände einfällt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Küvette weisen die Flächennormalen der ersten und zweiten Bodenwand zu einer Längsachse der Küvette einen Winkel zwischen 40° und 50°, vorzugsweise von zumindest annähernd 45° auf. Dadurch kann bei einer vertikalen Ausrichtung der Längsachse und bei nach oben weisender Öffnung die Probe unter einem Winkel von zumindest annähernd 45° schräg von unten beleuchtet werden, und das Fluorenzenzlicht ebenfalls unter einem Winkel von zumindest annähernd 45° schräg von unten empfangen werden, wobei die Beleuchtungs- und die Detektionsrichtung um zumindest annähernd 90° zueinander geneigt sind. Dies erlaubt die Verwendung einer symmetrischen Untersuchungsanordnung .

In einer anderen Ausführungsform ist der Winkel zwischen der Flächennormalen und der zweiten Bodenwand und einer Längsachse der Küvette kleiner als 40°, insbesondere liegt er zwischen 35° und 10°. In dieser Ausführungsform wird die Probe vorzugsweise durch die erste Bodenwand beleuchtet und wird das durch die zweite Bodenwand ausgesandte Fluoreszenzlicht detektiert. Bei einer vertikalen Ausrichtung der Längsachse ist die zweite Bodenwand somit flacher und die erste Bodenwand steiler ausgerichtet. Dementsprechend ist das Detektionsobjektiv bei seiner bevorzugten Ausrichtung in Richtung der Flächennormalen der zweiten Bodenwand vergleichsweise steil und weniger zur vertikalen Richtung geneigt ausgerichtet. Man beachte, dass die Angabe, dass ein Objektiv „in Richtung der Flächennormalen ausgerichtet ist" bedeuten soll, dass die optische Achse des Objektivs und die Flächennormale zumindest annähernd parallel sind. Bei der Verwendung mehrerer Küvetten, die nebeneinander angeordnet sind, hat dies den Vorteil, dass das Detektionsobjektiv näher an die zweite Bodenwand herangebracht werden kann, ohne dabei an die benachbarten Küvetten anzustoßen. Dadurch kann bei mehreren nebeneinander angeordneten Küvetten ein Detektionsobjektiv mit einem kleineren Arbeitsabstand und einer höheren Vergrößerung verwendet werden.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform weist die Küvette weiterhin eine dritte und eine vierte transparente Bodenwand auf, die derart zueinander angeordnet sind, dass ihre Flächennormalen mit einem Winkel zwischen 70° und 110°, vorzugsweise zwischen 80° und 100°, besonders vorzugsweise zwischen 85° und 95° und insbesondere von zumindest annähernd 90° zueinander geneigt sind. Dadurch kann die Probe aus vier unterschiedlichen Richtungen, die den jeweiligen Richtungen der Flächennormalen entsprechen, auf die zuvor beschriebene vorteilhafte Art untersucht werden. Weiterhin kann der Probenort, an den die Probe durch die Bodenwände geführt wird und auf den die Position der Probe beschränkt ist, weiter verkleinert werden. Dadurch kann die zu untersuchende Probe mit noch weniger Zeitaufwand mit Hilfe von Objektiven aufgefunden werden.

Die Bodenwände können derart angeordnet sein, dass jedes Flächennormalen-Paar der vier genannten Flächennormalen einen Winkel zwischen 70° und 110°, vorzugsweise zwischen 80° und 100°, besonders vorzugsweise zwischen 85° und 95° und insbesondere von zumindest annähernd 90° einschließt. Die vier transparenten Bodenwände können eine umgedrehte Pyramide bilden und die Probe kann aus vier unterschiedlichen Richtungen mit unterschiedlichen Ansichten, die insbesondere um zumindest annähernd 90° zueinander gedreht sind, mit hoher Qualität und schnell untersucht werden.

In einer Ausführungsform ist der Querschnitt der Küvette rechteckig, insbesondere quadratisch. In anderen Ausführungsformen hat die Küvette einen elliptischen, insbesondere einen kreisförmigen Querschnitt. Bei einem kreisförmigen Querschnitt kann die Küvette beispielsweise um eine Längsachse drehbar in einer kreisförmigen Aufnahmeöffnung angeordnet werden. Das innere Volumen oder Fassungsvermögen der Küvette kann zwischen 0,01 ml und 0,5 ml, besonders vorzugsweise zwischen 0,05 ml und 0,2 ml, insbesondere zwischen 0,09 ml und 0,13 ml betragen.

Der maximale Innendurchmesser der Küvette kann zwischen 3 mm und 9 mm, vorzugsweise zwischen 4 mm und 8 mm aufweisen. Die Höhe der erfindungsgemäßen Küvette kann zwischen 3 mm und 30 mm, vorzugsweise zwischen 3 mm und 20 mm und besonders vorzugsweise zwischen 3 mm und 10 mm betragen.

Um mehrere Küvetten zu einer Küvetten-Reihe und/oder zu einem Küvetten-Array zu verbinden, können an einer Küvette Verbindungsmittel vorgesehen sein. Die Verbindung kann beispielsweise durch eine Steckverbindung (sog.„Pin and Socket"- Verbindung) oder durch eine magnetische Verbindung gebildet werden.

In einer vorteilhaften Ausführungsform können einzelne Küvetten und/oder eine Gruppe von verbundenen Küvetten von der Küvetten-Reihe und/oder dem Küvetten-Array getrennt werden. Dies ist zum Beispiel vorteilhaft, wenn einige bereits untersuchte Proben entfernt werden sollen, z.B. für weitere Untersuchungen, und andere Proben noch zu untersuchen sind, oder wenn bestimmte Proben ausgetauscht werden sollen. Außerdem können mehrere oder eine Vielzahl von Proben mit einer hohen Durchsatzgeschwindigkeit und mit einer hohen Qualität untersucht werden.

Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin eine Mikrotiterplatte zur Aufnahme und Positionierung von Proben für eine Untersuchung mittels inverser Fluoreszenzmikroskopie, insbesondere inverser Lichtscheiben-Fluoreszenz-Mikroskopie, die mehrere Küvetten nach einer der zuvor genannten Ausführungsformen umfasst und die einstückig ausgebildet ist. Wenn eine Mikrotiterplatte eine Vielzahl von Küvetten in einem definierten und bekannten Abstand enthält, kann eine Vorrichtung zur Untersuchung der Probe schnell auf einen bestimmten Probenort eingestellt werden. Dabei können die zu untersuchenden Proben schnell gefunden werden und zwar ohne, dass nach der Probe selbst gesucht zu werden braucht, sondern allein aus Kenntnis der Geometrie der Mikrotiterplatte und unter Ausnutzung der Tatsache, dass die Küvetten der Mikrotiterplatte geeignet sind, die Probe am vorbestimmten Probenort innerhalb der Küvette zu „sammeln". Dadurch können eine Vielzahl von Proben mit einer hohen Durchsatzgeschwindigkeit und mit einer hohen Qualität untersucht werden. Vorzugsweise ist die Mikrotiterplatte einstückig aus einem Polymer, insbesondere aus einer Polymerfolie durch thermische Formung gebildet, wobei das Polymer eines der zuvor genannten Polymere sein kann. Eine solche Mikrotiterplatte kann kostengünstig und mit der benötigten optischen Qualität der Bodenwände gefertigt werden.

In einer anderen Ausführungsform ist die Mikrotiterplatte nicht einstückig gebildet, sondern umfasst einen Rahmen zur Aufnahme mehrerer Küvetten gemäß einer oder mehrerer der zuvor genannten Ausführungsformen, wobei die Küvetten zusätzlich Halterungsmittel umfassen, über welche sie in dem Rahmen aufgenommen werden können. In dieser Ausführungsform können die Küvetten beispielsweise einzeln und/oder in Gruppen aus dem Rahmen entnehmbar sein und/oder um ihre jeweilige Längsachse in dem Rahmen drehbar aufgenommen sein. Dadurch wird einerseits die Untersuchbarkeit verbessert, weil beispielsweise durch manuelles Drehen einer Küvette die Probenansicht geändert werden kann, und andererseits wird die Handhabung bei der Untersuchung verbessert, weil beispielsweise zum Entfernen oder Tauschen einzelner Küvetten nicht die gesamte Mikrotiterplatte entfernt oder getauscht werden muss. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die Mikrotiterplatte ein Array mit mehreren Küvetten nach einer der zuvor genannten Ausführungsformen und einen Rahmen zur Aufnahme des Arrays. Das Küvetten- Array ist dabei einstückig gebildet, vorzugsweise aus einer dünnen Polymerfolie mittels thermischer Formung. Mithilfe des Rahmens kann das Küvetten-Array stabilisiert und/oder in einer Untersuchungsvorrichtung aufgenommen und positioniert werden. Der Rahmen kann beispielsweise eine Platte mit mehreren Durchgangslöchern umfassen, durch die die Küvetten des Küvetten-Arrays geführt werden können und in denen sie aufgenommen werden können.

In den Mikrotiterplatten gemäß der zuvor genannten Ausführungsformen können die mehreren Küvetten in einem Array angeordnet sein, insbesondere in einem (6 x 8)-, (8 x 12)-, (16 x 24)- oder einem (32 x 48)-Array.

Die vorliegende Erfindung umfasst weiterhin eine Lichtscheiben-Fluoreszenz- Mikroskopie(LSFM)-Anordnung zur Untersuchung einer Probe, insbesondere zur Untersuchung einer Vielzahl von Proben mit einem hohen Durchsatz. Die LSFM- Anordnung umfasst eine Beleuchtungsquelle zur Erzeugung von Anregungslicht, ein Beleuchtungsobjektiv, ein Detektionsobjektiv sowie Positioniermittel. Das Beleuchtungsobjektiv dient zum Empfangen des Anregungslichts und zum Fokussieren des Anregungslichts in Form einer Lichtebene auf einen Probenort, wobei das Beleuchtungsobjektiv schräg nach oben gerichtet ist. Das Detektionsobjektiv dient zum Empfangen von Fluoreszenzlicht, welches von einer am Probenort positionierten Probe ausgesandt wird, wobei das Detektionsobjektiv schräg nach oben gerichtet ist und in einem Winkel zwischen 70° und 110°, vorzugsweise zwischen 80° und 100°, besonders vorzugsweise zwischen 85° und 95°, insbesondere von zumindest annähernd 90° zum Beleuchtungsobjektiv angeordnet ist. Mit Hilfe des Positioniermittels kann eine Mikrotiterplatte nach einer der zuvor genannten Ausführungsformen in Bezug auf das Beleuchtungsobjektiv und das Detektionsobjektiv positioniert werden. Dazu kann die Mikrotiterplatte und/oder das Beleuchtungs- und das Detektionsobjektiv verschoben werden. Die genannte Anordnung der Objektive zueinander entspricht der Ausrichtung der Beleuchtungsrichtung und der Detektionsrichtung zueinander. Auch hier bezeichnet der „Winkel" zwischen den Objektiven den Winkel zwischen den entsprechenden optischen Achsen.

In einer vorteilhaften Ausführungsform der LSFM- Anordnung sind das Beleuchtungsobjektiv und das Detektionsobjektiv derart in einem Aufnahmemittel aufgenommen, dass die Objektive gemeinsam um eine vertikale Achse drehbar und/oder gemeinsam gegenüber der vertikalen Achse kippbar sind. Eine solche Positioniermöglichkeit kann besonders vorteilhaft mit der Küvette gemäß der Ausführungsform mit vier Bodenwänden eingesetzt werden, da über eine Drehung um die vertikale Achse die Objektive leicht für Probenuntersuchungen aus unterschiedlichen Perspektiven eingestellt werden können.

Die LSFM- Anordnung kann weiterhin ein Detektionsmittel zum Detektieren von Fluoreszenzlicht, ein erstes Reflektionsmittel zum Ablenken des Anregungslichts zu dem Beleuchtungsobjektiv und ein zweites Reflektionsmittel zum Ablenken des vom Detektionsobjektiv empfangenen Fluoreszenzlichts zu dem Detektionsmittel umfassen. Dabei ist das erste Reflektionsmittel derart ausrichtbar, dass bei einem Kippen und/oder Drehen des Beleuchtungsobjektivs das Anregungslicht derart durch das erste Reflektionsmittel zu dem Beleuchtungsobjektiv abgelenkt werden kann, dass es weiterhin zumindest näherungsweise in Richtung der optischen Achse in das Beleuchtungsobjektiv eintritt. Das zweite Reflektionsmittel ist derart ausrichtbar, dass bei einem Kippen und/oder Drehen des Detektionsobjektivs das Fluoreszenzlicht vom gekippten und/oder gedrehten Detektionsobjektiv durch das zweite Reflektionsmittel weiterhin zumindest näherungsweise zu dem Detektionsmittel abgelenkt werden kann. Mit anderen Worten kann mit Hilfe des ersten und zweiten Reflektionsmittels sichergestellt werden, dass die Probe bei einem Drehen und/oder Kippen weiterhin korrekt beleuchtet werden kann und das emittierte Fluoreszenzlicht weiterhin korrekt detektiert werden kann.

In einer Weiterbildung der LSFM- Anordnung ist das Beleuchtungsobjektiv auch zum Empfangen von Fluoreszenzlicht vom Probenort geeignet und das Detektionsobjektiv ist auch zum Empfangen und Fokussieren des Anregungslichts geeignet. Auch diese Ausführungsform umfasst ein Detektionsmittel zum Detektieren von Fluoreszenzlicht und weiterhin ein drittes Reflektionsmittel zum Ablenken des Anregungslichts zu dem Beleuchtungsobjektiv oder zu dem Detektionsobjektiv, und ein viertes Reflektionsmittel zum Ablenken des vom Detektionsobjektiv oder vom Beleuchtungsobjektiv empfangenen Fluoreszenzlichts zu dem Detektionsmittel. Das dritte und das vierte Reflektionsmittel sind jeweils in eine erste und in eine zweite Stellung verstellbar, wobei in der ersten Stellung das dritte Reflektionsmittel zum Ablenken des Anregungslichts zu dem Beleuchtungsobjektiv und das vierte Reflektionsmittel zum Ablenken des vom Detektionsobjektiv empfangenen Fluoreszenzlichts zu dem Detektionsmittel eingestellt sind. In der zweiten Stellung sind das dritte und vierte Reflektionsmittel genau umgekehrt eingestellt, nämlich das dritte Reflektionsmittel zum Ablenken des Anregungslichts zu dem Detektionsobjektiv und das vierte Reflektionsmittel zum Ablenken des vom Beleuchtungsobjektiv empfangenen Fluoreszenzlichts zu dem Detektionsmittel. Mit Hilfe des dritten und vierten Reflektionsmittels kann damit der Zeitaufwand für die Untersuchung weiter verringert werden, weil die Beleuchtungsrichtung und die Detektionsrichtung schnell vertauscht werden können, ohne dass dafür die Ausrichtung der Objektive zur Küvette geändert werden muss. In den zuvor genannten Ausführungsformen kann das erste Reflektionsmittel auch mit dem dritten Reflektionsmittel identisch sein und das zweite Reflektionsmittel kann mit dem vierten Reflektionsmittel identisch sein, sodass die jeweiligen zuvor beschriebenen Operationen über zwei verschiedene und nicht notwendigerweise über vier verschiedene Reflektionsmittel vorgenommen werden können. Dabei kann das erste und das zweite Reflektionsmittel für mindestens eine, vorzugsweise jedoch für jede Kipp- und/oder Drehposition der Objektive die genannte erste und die genannte zweite Stellung aufweisen, sodass vorzugsweise in jeder Kipp- und/oder Drehposition die Beleuchtungsrichtung und die Detektionsrichtung mit Hilfe der Reflektionsmittel vertauscht werden können.

Weiterhin umfasst die vorliegende Erfindung ein System zur Untersuchung einer Probe, das eine Mikrotiterplatte nach einer der zuvor genannten Ausführungsformen und eine LSFM- Anordnung nach einer der zuvor genannten Ausführungsformen umfasst. Zusätzlich zu einer erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte oder alternativ dazu kann das System auch eine Mikrotiterplatte mit Küvetten umfassen, die jeweils einen horizontalen transparenten Boden aufweisen. Bei einer solchen Mikrotiterplatte wird die Probe nicht durch zwei separate und unter einem Winkel zueinander angeordnete Bodenwände untersucht, sondern durch nur einen transparenten Boden einer Küvette, der bei einer gebrauchsmäßigen Ausrichtung der Küvette horizontal verläuft. Da vorzugsweise solches Fluoreszenzlicht von der Probe detektiert wird, das von der Probe senkrecht zur angeregten Lichtebene emittiert wird, sind die Detektionsrichtung und die Anregungsrichtung bei einer Verwendung einer Mikrotiterplatte mit Küvetten, die einen horizontalen transparenten Boden aufweisen, nicht senkrecht zum transparenten horizontalen Boden.

Vorzugsweise umfasst das System eine erfindungsgemäße Mikrotiterplatte, ist das Beleuchtungsobjektiv senkrecht auf eine Bodenwand sowie auf den Probenort gerichtet und ist das Detektionsobjektiv senkrecht auf eine andere Bodenwand und ebenfalls auf den Probenort gerichtet. In einer Ausführungsform befinden sich die durch das Beleuchtungsobjektiv definierte Beleuchtungsrichtung, die durch das Detektionsobjektiv definierte Detektionsrichtung und die Längsachse mindestens einer Küvette in einer gemeinsamen vertikalen Ebene. Bei einer solchen Anordnung können die Objektive, das Detektionsmittel und das Beleuchtungsmittel beispielsweise entlang einer Schiene montiert und angeordnet werden.

Schließlich umfasst die vorliegende Erfindung auch ein Verfahren zur Untersuchung einer Probe, vorzugsweise einer Vielzahl von Proben mit einem hohen Durchsatz, mit einem System nach einer zuvor genannten Ausführungsformen. Das Verfahren umfasst ein Fokussieren von Anregungslicht in Form einer Lichtebene an einem Probenort innerhalb einer der mehreren Küvetten, wobei das Fokussieren zumindest annähernd senkrecht durch eine Bodenwand erfolgt. Weiterhin umfasst das Verfahren ein Detektieren von Fluoreszenzlicht, das von einer Probe am Probenort zumindest annähernd senkrecht zur Lichtebene und zumindest annähernd senkrecht durch eine andere Probenwand ausgesandt wird.

In einem Verfahren gemäß einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird eine Mikrotiterplatte mit Küvetten verwendet, die einen horizontalen transparenten Boden aufweisen. Dieses Verfahren umfasst ein Fokussieren von Anregungslicht in Form einer Lichtebene an einem Probenort innerhalb einer Küvette durch einen der genannten horizontalen transparenten Böden in einem Winkel zwischen 40° und 50°, vorzugsweise von zumindest annähernd 45° zur Flächennormalen des horizontalen transparenten Bodens und ein Detektieren von Fluoreszenzlicht, das von einer Probe am Probenort zumindest annähernd senkrecht zur Lichtebene und in einem Winkel zwischen 40° und 50°, vorzugsweise von zumindest annähernd 45° zur Flächennormalen des horizontalen transparenten Bodens ausgesandt wird.

In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren weiterhin ein Abtasten einer Probe am Probenort, wobei die Probe zumindest annähernd senkrecht zur Lichtebene verschoben wird. Dies hat den Vorteil, dass die fokussierte Lichtebene während des Abtastens der Probe zur Probe zentriert bleibt, oder genauer gesagt, zur einer gedachten Achse zentriert bleibt, die durch die Mitte der Probe und in Abtastrichtung verläuft. Dadurch wird bei jeder Abtastposition jeweils nur eine schmale Probenebene zur Fluoreszenz angeregt, wodurch die Abbildung nicht durch Fluoreszenzlicht von benachbarten Bereichen der angeregten Probenebene beeinträchtigt wird und die Untersuchungsqualität beim Abtasten insgesamt verbessert werden kann.

KURZBESCHREIBUNG DER FIGUREN

Weitere Vorteile und Merkmale der vorliegenden Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung, in der bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung beispielhaft anhand von Zeichnungen näher erläutert werden, in denen

Figuren 1 a) und b) zwei verschiedene Ansichten einer erfindungsgemäßen Küvette gemäß einer Ausführungsform mit zwei Bodenwänden zeigen,

Figuren 2 a) und b) zwei verschiedene Ansichten einer erfindungsgemäßen Küvette gemäß einer anderen Ausführungsform zeigen, die vier Bodenwände umfasst, eine Schnittansicht und Unteransicht einer erfindungsgemäßen Küvette gemäß einer Ausführungsform zeigt, die ähnlich zu der Ausführungsform aus Figur 1 ist,

Figur 4 eine Schnittansicht und Unteransicht einer erfindungsgemäße Küvette gemäß einer Ausführungsform zeigt, die ähnlich zu der Ausführungsform aus Figur 2 ist,

Figuren 5 a) und b) zwei verschiedene Ansichten einer erfindungsgemäßen Küvette gemäß einer Ausführungsform zeigen, die einen quadratischen Querschnitt aufweist und die ein Verbindungsmittel und/oder ein Halterungsmittel umfasst,

Figur 6 einen Teil eines erfindungsgemäßen Systems gemäß einer

Ausführungsform mit einer Mikrotiterplatte zeigt, wobei die Mikrotiterplatte eine Vielzahl der Küvetten gemäß der Ausführungsform aus Figur 1 umfasst, Figuren 7 a) bis d) unterschiedliche perspektivische Ansichten des Systems aus Figur 6 aus zeigen,

Figuren 8 a) bis d) schematische Darstellungen eines Teils eines erfindungsgemäßen

Systems gemäß einer anderen Ausführungsform zeigen, wobei das System Küvetten gemäß einer anderen Ausführungsform umfasst,

Figur 9 eine schematische Darstellung einer erfindungsgemäßen Lichtscheiben- Fluoreszenz-Mikroskopie (LFSM)-Anordnung gemäß einer Ausführungsform zeigt, und

Figur 10 eine erfindungsgemäße LFSM-Anordnung gemäß einer anderen

Ausführungsform zeigt.

In den angefügten Zeichnungen werden für gleiche Elemente gleiche Bezugszeichen verwendet.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN

Figur 1 zeigt eine erfindungsgemäße Küvette 110 gemäß einer bevorzugten Ausführungsform, wobei Figur 1 a) eine Perspektivansicht und Figur 1 b) eine Seitenansicht der Küvette 110 zeigt. Die Küvette 110 umfasst eine Öffnung 12 an einem oberen Ende sowie einen oberen Abschnitt 14 und einen unteren Abschnitt 16. Der obere Abschnitt 14 umfasst eine Seitenwand 18. Der untere Abschnitt 16 umfasst eine erste transparente Bodenwand 20 und eine zweite transparente Bodenwand 22. Bei der Küvette 110 aus Figur 1 sind die erste und die zweite Bodenwand 20 und 22 derart angeordnet, dass ihre Flächennormalen mit einem Winkel von 90° zueinander geneigt sind. Die Flächennormalen der ersten und zweiten Bodenwand 20 und 22 sind in Figur 1 b) jeweils durch eine gestrichelte Linie dargestellt.

Figur 2 zeigt ähnliche Ansichten wie Figur 1, jedoch von einer Küvette 210 gemäß einer anderen Ausführungsform. Im Unterschied zur Küvette 110 aus Figur 1 weist die Küvette 210 aus Figur 2 weiterhin eine dritte Bodenwand 24 und eine vierte Bodenwand 26 auf. Bei der Küvette 210 gemäß dieser Ausführungsform ist jedes Paar von Flächennormalen der vier Flächennormalen der vier Bodenwände 20 bis 26 mit einem Winkel von 90° zueinander geneigt. Die Flächennormalen der dritten und vierten Bodenwand sind in Figur 2 b) jeweils durch eine gestrichelte Linie dargestellt. Die Figuren 3 und 4 zeigen jeweils eine erfindungsgemäße Küvette 310 und 410 gemäß verschiedener Ausführungsformen, wobei die Küvette 310 der Figur 3 der Küvette 1 10 aus Figur 1 ähnelt und die Küvette 410 aus Figur 4 der Küvette 210 aus Figur 2 ähnelt. In den Figuren 3 und 4 ist oben jeweils ein Längsschnitt der Küvette 310 bzw. 410 entlang einer Längsachse 28 gezeigt. Unten in den Figuren 3 und 4 ist jeweils eine Unteransicht der Küvette 310 bzw. 410 gezeigt, die sich ergibt, wenn die Küvette 310 bzw. 410 von unten entlang ihrer Längsachse 28 betrachtet wird.

Auch wenn dies in den Längsschnitten der Figuren 3 und 4 nur für die erste und zweite Bodenwand 20 und 22 zu erkennen ist, handelt es sich bei sämtlichen Bodenwänden 20 bis 26 um planparallele Wände, d.h. die gegenüberliegenden Außenflächen einer Bodenwand liegen in parallelen Ebenen, sodass die Bodenwand eine gleichmäßige Dicke aufweist, die dem Abstand der parallelen Ebenen entspricht.

Die Figuren 5 a) und 5 b) zeigen jeweils eine Perspektivansicht und eine perspektivische Seitenansicht einer erfindungsgemäßen Küvette 510 gemäß einer weiteren Ausführungsform, die - wie auch die Küvetten 110 und 310 - zwei Bodenwände aufweist, nämlich eine erste Bodenwand 20 und eine zweite Bodenwand 22, deren Flächennormalen in einem Winkel von 90° zueinander geneigt sind. Im Unterschied zu den zuvor genannten Ausführungsformen 1 10 und 310 hat der obere Abschnitt 14 der Küvette 510 aus Figur 5 einen quadratischen Querschnitt und umfasst die Küvette 510 zusätzlich einen Küvettenrahmen 30.

Der Küvettenrahmen 30 kann als ein Verbindungsmittel dienen, über das mehrere Küvetten 510 zu einer Küvetten-Reihe und/oder zu einem Küvetten- Array verbunden werden können. Eine solche Küvetten-Reihe oder ein solches Küvetten- Array, die mehrere einzelne Küvetten 510 umfassen, die über ihre Küvettenrahmen 30 miteinander verbunden sind, bilden eine Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte. Die einzelnen Küvetten 510 sind in der Mikrotiterplatte dabei vorzugsweise derart zueinander angeordnet, dass ihre Längsachsen 28 parallel zueinander verlaufen. Die Verbindung mit Hilfe der Küvettenrahmen 30 kann dabei über eine Steckverbindung (nicht gezeigt) vorgenommen werden. In dieser Ausführungsform umfasst der Küvettenrahmen 30 weiterhin einen oder mehrere Pins (nicht dargestellt) und ein oder mehrere Löcher (nicht dargestellt), sodass für eine Verbindung die Pins eines Küvettenrahmens 30 in die Löcher eines benachbarten Küvettenrahmens 30 gesteckt werden können. In einer anderen Ausführungsform besteht die Verbindung aus einer Magnetverbindung (nicht gezeigt).

In anderen Ausführungsformen übernimmt der Küvettenrahmen 30 alternativ oder zusätzlich die Funktion eines Halterungsmittels. In einer Ausführungsform umfasst eine erfindungsgemäße Mikrotiterplatte einen Rahmen zur Aufnahme mehrerer Küvetten 510. In dieser Ausführungsform können aufgenommenen Küvetten 510 über ihren Küvettenrahmen 30 in dem genannten Rahmen gehalten werden.

Eine nicht dargestellte erfindungsgemäße Ausführungsform einer Küvette umfasst einen oberen Abschnitt 14 mit einem kreisförmigen Querschnitt, beispielsweise wie in den Figuren 1 und 2 dargestellt, und einen Küvettenrahmen 30, der auf den kreisförmigen oberen Abschnitt 14 angepasst ist. Eine solche Küvette ist in einer Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte vorgesehen, in welcher die einzelnen Küvetten frei drehbar um ihre Längsachse 28 in den Rahmen aufgenommen werden können.

In einer anderen Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte sind die einzelnen Küvetten nicht aus einem Rahmen entnehmbar oder in diesen einsetzbar, sondern ist die Mikrotiterplatte einstückig gebildet, beispielsweise aus einem Polymer und/oder aus Glas.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Mikrotiterplatte einschließlich ihrer Küvetten durch ein thermisches Formungsverfahren aus einer dünnen Polymerfolie gebildet. Beispiele für geeignete Ausgangsmaterialien zur einstückigen Herstellung einer Mikrotiterplatte sind in der folgenden Tabelle angegeben: Dicke erhältlicher

Bezeichnung des Polymermaterials Brechungsindex

Polymerfolien

Cyclo-Olefm-Polymer 1,509; 1,525; 100 μιη

1,531; 1,535

Tetrafluorethylen-Perfluorpropylen (FEP), 1,350 12,5 μιη; 25 μιη; 50 μηι; PFA, 125 μιη

Polyamid 1,54 Als Granulat erhältlich, aus dem eine Folie hergestellt werden kann

Polyimid 1,66 Von 7,9 μιη bis 152 μιη

Eine erfindungsgemäße Mikrotiterplatte 32 gemäß einer Ausführungsform, die mehrere Küvetten 110 der Figur 1 umfasst, ist in der Figur 6 und den Figuren 7 a) bis 7 d) dargestellt.

Die Figuren 6 und 7 zeigen einen Teil eines erfindungsgemäßen Systems 34, das eine Lichtscheiben-Fluoreszenz-Mikroskopie(LSFM)-Anordnung umfasst, die weiter unten anhand der Figuren 9 und 10 noch ausführlich beschrieben wird, und das eine erfindungsgemäße Mikrotiterplatte 32 umfasst. Wie in den Figuren 6 und 7 dargestellt, umfasst die LSFM- Anordnung ein Beleuchtungsobjektiv 36 und ein Detektionsobjektiv 38. Das Beleuchtungsobjektiv 36 und das Detektionsobjektiv 38 definieren eine Beleuchtungsrichtung 40 und eine Detektionsrichtung 42, die in den Figuren 6 und 7 a) durch gestrichelte Linien dargestellt sind. Bei dem erfindungsgemäßen System 34 aus den Figuren 6 und 7 ist die Mikrotiterplatte 32 horizontal oder waagerecht angeordnet, sodass die Längsachsen 28 der einzelnen Küvetten 110 vertikal ausgerichtet sind und die Öffnungen 12 der Küvetten 110 nach oben weisen. Das Beleuchtungsobjektiv 36 und das Detektionsobjektiv 38 sind derart ausgerichtet, dass die Beleuchtungsrichtung 40 und die Detektionsrichtung 42 jeweils um 45° gegenüber den Längsachsen 28 geneigt sind.

Mit dem System 34 können in den Küvetten 110 befindliche Proben derart untersucht werden, dass die Probe durch eine Anregungslichtebene beleuchtet wird, die mit Hilfe des Beleuchtungsobjektives 36 entlang der Beleuchtungsrichtung senkrecht durch die erste oder zweite Bodenwand 20 oder 22 an einen Probenort in der Küvette 110 fokussiert wird. Außerdem kann solches Fluoreszenzlicht detektiert werden, das die Probe senkrecht zur Lichtebene und senkrecht durch die zweite bzw. erste Bodenwand 22 bzw. 20 aussendet. Eine solche Probenbeleuchtung bzw. Probenanregung und Fluoreszenzemission ist schematisch in Figur 5 b) dargestellt, in der eine Fluoreszenzprobe 44, die sich an einem Probenort befindet, mit Anregungslicht entlang der Beleuchtungsrichtung 40 beleuchtet wird und Fluoreszenzlicht in Detektionsrichtung 42 senkrecht zur Beleuchtungsrichtung 40 und senkrecht zur zweiten Bodenwand 22 durch die zweite Bodenwand 22 aussendet. Für eine Untersuchung einer Vielzahl von Fluoreszenzproben 44 mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Systems 34 können die Proben 44 mitsamt eines Probenmediums durch die Öffnungen 12 in die einzelnen Küvetten 110 der Mikrotiterplatte 32 eingebracht werden. Da die Mikrotiterplatte 32 für die Untersuchung horizontal ausgerichtet ist, d.h. die Küvetten 110 mit ihrer Längsachse 28 vertikal ausgerichtet sind, gelangen die Proben 44 aufgrund der Schwerkraft an einen Probenort am Boden der Küvetten und innerhalb der Küvetten, der direkt an die erste Bodenwand 20 und die zweite Bodenwand 22 angrenzt. Dementsprechend grenzt der Probenort bei den Küvetten 210 und 410 gemäß der Ausführungsformen aus Figur 2 und Figur 4 direkt an alle vier Bodenwände 20 bis 26 an.

Wie in der Figur 3 dargestellt, verläuft der Probenort 46 bei den Küvetten 110 und 310 der Figuren 1 und 3 entlang einer Linie am Boden der Küvetten 110 und 310. Die Größe des Probenortes 46 entspricht dabei etwa einem zylinderförmigen Volumen, wobei der Zylinder etwa einen der Probe entsprechenden Durchmesser hat und eine Länge hat, die der Länge der Grenzlinie zwischen der ersten und zweiten Bodenwand 20 und 22 entspricht.

Wie in der Figur 4 dargestellt ist, befindet sich der Probenort 46 bei den Küvetten 210 und 410 mit jeweils vier Bodenwänden 20 bis 26 in der Mitte des Küvettenbodens oberhalb der Spitze der durch die vier Bodenwände 20 bis 26 gebildeten, umgedrehten Pyramide. Die Größe des Probenortes 46 entspricht dabei etwa dem Volumen der Probe.

Es ist zu beachten, dass in anderen nicht dargestellten Ausführungsformen der Küvettenboden nicht die Form eines umgedrehten Trapezdaches oder einer umgedrehten Pyramide hat - wie es beispielsweise in den Figuren 3 und 4 dargestellt ist - sondern die Form eines umgedrehten Trapezdachstupfes oder eines umgedrehten Pyramidenstupfes hat. Auch wenn bei solchen Ausführungsformen der Probenort im Vergleich zu anderen Ausführungsformen etwas größer sein kann, handelt es sich dennoch um ein kleines Volumen, in dem die Probe immer noch sehr gut und schnell auffindbar ist. Auch bei diesen Ausführungsformen kann die Probe durch die geneigten Bodenwände auf vorteilhafte Art untersucht werden.

Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Küvetten können somit eine Vielzahl von kleinen Fluoreszenzproben, die beispielsweise einen Durchmesser von etwa einigen 10 μιη bis etwa einigen 100 μιη aufweisen können, ohne eine aufwändige Positionierung oder Handhabung an einen bekannten, schnell auffindbaren und die Probe eng eingrenzenden Probenort 26 gebracht werden. Dadurch kann in dem System 34 die Mikrotiterplatte 32 mit Hilfe eines Positioniermittels ohne Weiteres derart zu dem Beleuchtungsobjektiv 36 und dem Detektionsobjektiv 38 ausgerichtet werden, dass die Objektive 36 und 38 auf einen bestimmten Probenort einer bestimmten Küvette gerichtet sind. Da die Probenorte 46 jeweils nur einen kleinen Bereich umfassen, kann die zu untersuchende Fluoreszenzprobe schnell gefunden werden. Das erfindungsgemäße System 34 ermöglicht damit eine schnelle und effiziente Untersuchung einer Vielzahl von Proben und ist besonders gut für eine Untersuchung mit einem hohen Probendurchsatz geeignet.

Die inverse Untersuchungsanordnung des Systems 34, bei dem die Beleuchtung und die Detektion von unten erfolgen, hat den Vorteil, dass sowohl das Beleuchtungsobjektiv 36 als auch das Detektionsobjektiv 38 unterhalb der Mikrotiterplatte 32 angeordnet sind, sodass die einzelnen Küvetten 110 von oben frei zugänglich sind und ausreichend Platz zur Verfügung steht, um einzelne Küvetten zu entfernen oder auszutauschen oder um beispielsweise Proben und/oder Probenmedien zu entnehmen, hinzuzufügen oder auszutauschen. Aufgrund der Anordnung ihrer Bodenwände gestattet es die erfindungsgemäße Küvette, senkrecht zu einer angeregten Probenebene emittiertes Fluoreszenzlicht zu detektieren, wobei gleichzeitig sowohl das Anregungslicht als auch das detektierte Fluoreszenzlicht senkrecht durch die entsprechenden Bodenwände hindurchtritt. Dadurch kann einerseits die anregende Lichtebene ohne optische Verzerrung oder zumindest mit geringer optischer Verzerrung in die Probe fokussiert werden. Andererseits können die angeregten Probenstrukturen der beleuchteten Probenebene gleichmäßig und ohne optische Verzerrung oder zumindest mit geringer optischer Verzerrung abgebildet und detektiert werden. Dadurch kann eine hohe Abbildungsqualität und eine hohe Qualität der Probenuntersuchung zur Verfügung gestellt werden.

Eine Untersuchung mit Hilfe einer Mikrotiterplatte 132 gemäß einer anderen Ausfuhrungsform ist in den Figuren 8 a) bis 8 d) dargestellt. Bei der Mikrotiterplatte 132 sind die erste und zweite Bodenwand 20 und 22 der Küvetten derart angeordnet, dass der Winkel α zwischen der Flächennormalen der zweiten Bodenwand 22 und der Längsachse 28 der Küvetten kleiner ist als der Winkel ß zwischen der Flächennormalen der ersten Bodenwand 20 und der Längsachse 28. Damit verläuft bei einer Untersuchung, bei der die Mikrotiterplatte 132 horizontal ausgerichtet ist, die zweite Bodenwand 22 flacher als die erste Bodenwand 20. Wenn das Fluoreszenzlicht senkrecht durch die zweite Bodenwand 22 empfangen wird, dann ist das Detektionsobjektiv 38, entsprechend der Richtung der Flächennormalen der zweiten Bodenwand 22, steiler zur Ebene der Mikrotiterplatte ausgerichtet. Daher kann das Detektionsobjektiv 38 näher an die Mikrotiterplatte 132 herangebracht werden, ohne an die diese anzustoßen. Dadurch können bei einer Untersuchung Detektionsobjektive 38 mit einem geringeren Arbeitsabstand verwendet werden. Der Arbeitsabstand bezeichnet den Abstand zwischen der Objektivöffnung und dem zu detektierenden Bereich der Probe. In den Figuren 8 a) bis 8 d) wird jeweils dasselbe Beleuchtungsobjektiv 36 mit unterschiedlichen Detektionsobjektiven 38 verwendet. Das Beleuchtungsobjektiv 36 hat einen Arbeitsabstand von 22,5 mm. Der Arbeitsabstand des Detektionsobjektivs 38 beträgt 3,4 mm in Figur 8 a), 10,6 mm in Figur 8 b), 12 mm in Figur 8 c) und 21,0 mm in Figur 8 d).

Anhand der zuvor genannten Ausführungen wird deutlich, dass mit Hilfe der Mikrotiterplatte 132 ein System bereitgestellt werden kann, das die bereits zuvor genannten Vorteile aufweist und das den zusätzlichen Vorteil bietet, dass ein Detektionsobjektiv mit einem geringen Arbeitsabstand und einer damit einhergehenden hohen Vergrößerung verwendet werden kann. Beispielsweise weist das Detektionsobjektiv 38 aus Figur 8 a) mit einem Arbeitsabstand von 3,4 mm eine 100-fache Vergrößerung auf.

Figur 9 zeigt eine erfindungsgemäße LSFM-Anordnung 48 gemäß einer Ausführungsform, die als Teil des zuvor beschriebenen Systems 32 verwendet werden kann. Die LSFM- Anordnung umfasst einen Laser 50, ein Beleuchtungsobjektiv 36, ein Detektionsobjektiv 38, einen XYZ- Verschiebetisch 52 und eine CCD-Kamera 54. Bei einer Probenuntersuchung mit Hilfe der LSFM- Anordnung 48 durchläuft das vom Laser 50 erzeugte Anregungslicht zunächst einen optoelektronischen Shutter 56, mit dem die Beleuchtung bedarfsweise abgeschaltet werden kann. Das aus dem Shutter 56 austretende Anregungslicht wird über zwei Spiegel 58 zu einem Strahlaufweiter 60 abgelenkt, durch den der Anregungslichtstrahl aufgeweitet wird. Anschließend durchläuft der aufgeweitete Anregungslichtstrahl eine Zylinderlinse, sodass der Anregungslichtstrahl die Form einer Lichtscheibe annimmt. Der Anregungsstrahl wird über einen Spiegel 64 zu dem Beleuchtungsobjektiv 36 abgelenkt, durch welches der lichtscheibenförmige Anregungsstrahl fokussiert wird. Mit Hilfe des XYZ- Verschiebetisches 52 kann eine erfindungsgemäßen Mikrotiterplatte so verschoben werden, dass ein bestimmter Probenort mit der zu untersuchenden Probe (nicht gezeigt) an den Ort der fokussierten Lichtebene positioniert wird und die Probenposition zur Lichtebene eingestellt wird. Das von der Probe senkrecht zur Lichtebene ausgesendete Fluoreszenzlicht wird mit Hilfe des Detektionsobjektives 38 empfangen und über einen Spiegel 66, durch einen Filter 68 und durch eine Linse 70 an die CCD-Kamera 54 zur Detektion weitergeleitet. In der LSFM- Anordnung 48 sind die Objektive 36 und 38 mit Hilfe eines jeweiligen Halters 72 derart ausgerichtet, dass die Beleuchtung der Probe mit Anregungslicht und das Empfangen des emittierten Fluoreszenzlichtes jeweils schräg von unten in Bezug auf die horizontal ausgerichtete und mit Hilfe des XYZ- Verschiebetisches 52 positionierte Mikrotiterplatte erfolgt. Die Beleuchtungsrichtung und die Detektionsrichtung sind jeweils um 45° zu den Längsachsen 28 der Küvetten geneigt und spannen eine vertikale Ebene auf, die parallel zur Zeichnungsebene liegt.

Für eine dreidimensionale Untersuchung einer Probe wird die beleuchtende oder anregende Lichtscheibe in Bezug auf die Probe verschoben, sodass mit Hilfe eines solchen Abtastens der Probe nacheinander unterschiedliche Probenebenen detektiert werden können. Für ein solches Abtasten wird die Mikrotiterplatte vorzugsweise in Detektionsrichtung 42 verschoben, sodass die untersuchte Probe senkrecht durch die fokussierte Lichtebene geschoben wird. Anders als bei einer Verschiebung der Probe in X-Richtung schräg zur Lichtebene, bleibt das Anregungslicht bei einem Verschieben senkrecht zur Lichtebene während einer vollständigen Probenabtastung gleichbleibend in der Probe fokussiert, sodass eine scharfe dreidimensionale Abbildung und damit eine Untersuchung mit einer hohen Qualität zur Verfügung gestellt werden kann. Eine LSFM- Anordnung 148 gemäß einer anderen Ausführungsform ist in Figur 10 dargestellt. Die LSFM- Anordnung 148 umfasst ein Stellmittel 74, mit dem das Beleuchtungsobjektiv 36 und das Detektionsobjektiv 38 gemeinsam um einen Winkel φ um eine vertikale Achse gedreht werden können und/oder um einen Winkel Θ gegenüber der vertikalen Achse verkippt werden können. Die vertikale Achse entspricht bei einer Probenuntersuchung der Längsachse 28 der Küvette, in der sich die Probe befindet. Die LSFM- Anordnung 148 umfasst einen ersten Strahlteiler-Spiegel 76, einen ersten verstellbaren Spiegel 78, einen zweiten verstellbaren Spiegel 80, zwei zweite Strahlteiler-Spiegel 82, zwei Spiegel 84 und zwei Spiegel 86.

Der erste Strahlteiler-Spiegel 76 und der erste verstellbare Spiegel 78 sind für das Anregungslicht des Lasers 50 durchlässig und für das von der Probe ausgesandte Fluoreszenzlicht reflektierend. Im Gegensatz dazu sind die zweiten Strahlteiler- Spiegel 82 für das Anregungslicht reflektierend und für das Fluoreszenzlicht durchlässig. Der erste verstellbare Spiegel 78 und der zweite verstellbare Spiegel 80 sind kontinuierlich zwischen einer jeweiligen ersten Position und einer jeweiligen zweiten Position verstellbar, insbesondere kippbar, wobei sich die ersten Positionen und die zweiten Positionen in Abhängigkeit des Drehwinkels φ und des Kippwinkels Θ verändern. Der erste und der zweite verstellbare Spiegel 78 und 80 sind weiterhin um die vertikale Achse drehbar. In einer Ausführungsform können sie auch entlang und/oder quer zur vertikalen Achse verschiebbar sein.

Das durch den ersten Strahlteiler-Spiegel 76 hindurchtretende Anregungslicht tritt durch den ersten verstellbaren Spiegel 78 hindurch und wird anschließend nacheinander über den zweiten verstellbaren Spiegel 80, einen der Spiegel 82 und einen der Spiegel 84 derart abgelenkt, dass es in das Beleuchtungsobjektiv 36 entlang seiner optischen Achse eintritt. Wie weiter unten beschrieben ist, kann das Anregungslicht auch in das Detektionsobjektiv 38 entlang seiner optischen Achse eintreten, wobei sich der zweite verstellbare Spiegel 80 in einer anderen Position befindet und das Ablenken jeweils über den anderen der Spiegel 82 und 84 erfolgt.

Das aus dem Detektionsobjektiv 38 entlang seiner optischen Achse austretende Fluoreszenzlicht wird von einem der Spiegel 84 abgelenkt, so dass es durch einen der Spiegel 82 hindurchtritt und auf einen der Spiegel 86 auftrifft. Über den Spiegel 86, den ersten verstellbaren Spiegel 78 und den ersten Strahlteiler- Spiegel 76 wird das Fluoreszenzlicht nacheinander und zu der CCD-Kamera 54 abgelenkt, so dass es von ihr detektiert werden kann. Wie weiter unten beschrieben ist, kann das Fluoreszenzlicht auch aus dem Beleuchtungsobjektiv 36 entlang seiner optischen Achse austreten, wobei das Ablenken jeweils über den anderen der Spiegel 84 und 86 und durch den anderen der Spiegel 82 erfolgt und wobei sich der erste verstellbare Spiegel 78 in einer anderen Position befindet.

In einer Ausführungsform der LSFM-Anordnung 148 sind das Beleuchtungsobjektiv 36, das Detektionsobjektiv 38 sowie die Spiegel 82, 84 und 86 zueinander unbeweglich und können gemeinsam als Einheit gedreht und/oder gekippt werden, wobei der Laser 50 und die CCD- Kamera 54 nicht mitgedreht und nicht mitgekippt werden. Wenn beim Drehen und/oder Kippen die Position und die Ausrichtung des zweiten verstellbaren Spiegels 80 unverändert bliebe, dann würde das Anregungslicht den zweiten verstellbaren Spiegel 80 von der ursprünglichen Position und in die ursprüngliche Richtung verlassen - d.h. weiterhin auf demselben Weg verlassen - und nicht entlang der gedrehten bzw. gekippten optischen Achse des Beleuchtungsobjektivs 36 durch das Beleuchtungsobjektiv 36 hindurchtreten. Der zweite verstellbare Spiegels 80 ist jedoch derart verstellbar, dass das vom ursprünglichen Weg kommenden Anregungslicht den zweiten verstellbaren Spiegel 80 auf einem veränderten Weg verlassen kann, auf dem es entlang der optischen Achse des gedrehten bzw. gekippten Beleuchtungsobjektivs 36 durch das Beleuchtungsobjektiv 36 hindurchtritt.

Wenn das Detektionsobjektiv 38 gedreht und/oder gekippt wird, dann kommt das empfangene und aus dem Detektionsobjektiv 38 ausgetretene Licht aus einer anderen Richtung bzw. aus einer anderen Richtung und an einer anderen Position beim ersten verstellbaren Spiegel 78 an. Wenn beim Drehen und/oder Kippen die Position und die Ausrichtung des ersten verstellbaren Spiegels 78 unverändert bliebe, dann würde das Licht den ersten verstellbaren Spiegel 78 nicht auf dem ursprünglichen Weg verlassen und daher nicht oder schlechter von der CCD-Kamera 54 detektiert. Der erste verstellbare Spiegel 78 ist jedoch derart verstellbar, dass auch das vom gedrehten und/oder gekippten Detektionsobjektiv 38 auf einem anderen Weg kommende Licht den ersten verstellbaren Spiegel 78 auf dem ursprünglichen Weg verlassen kann, so dass es aus der ursprünglichen Richtung auf die ursprüngliche Position der CCD-Kamera 54 auftreffen und zumindest annähernd unverändert von ihr detektiert werden kann. Das Verstellen des ersten und zweiten verstellbaren Spiegels 78 und 80 kann ein Kippen zwischen der ersten und der zweiten Position, ein Drehen um die vertikale Achse und ein Verschieben entlang der vertikalen Achse und/oder quer zu der vertikalen Achse umfassen.

In einer anderen Ausführungsform der LSFM-Anordnung 148 sind die Objektive 36 und 38 und die Spiegel 82, 84 und 86 nicht gänzlich zueinander unbeweglich, sondern die Spiegel 82 und 86 sind kippbar. In dieser Ausführungsform kann die oben beschriebene Anpassung der Lichtwege beim Kippen der Objektive 36 und 38 durch ein kombiniertes Kippen des ersten verstellbaren Spiegels 78 und eines der Spiegel 86 sowie durch ein kombiniertes Kippen des zweiten verstellbaren Spiegels 80 und eines der Spiegel 82 vorgenommen werden. Die Anpassung der Lichtwege an das Drehen der Objektive 36 und 38 kann wie bei der zuvor beschriebenen Ausführungsform allein durch ein Drehen des ersten und des zweiten verstellbaren Spiegels 78 und 80 vorgenommen werden. Ein Verschieben eines Spiegels ist bei dieser Ausführungsform für eine Anpassung nicht erforderlich.

In der LSFM-Anordnung 148 kann das Beleuchtungsobjektiv 36 auch zum Empfangen von Fluoreszenzlicht eingesetzt werden und das Detektionsobjektiv 38 kann auch zum Fokussieren von Anregungslicht eingesetzt werden. Mit Hilfe des ersten und zweiten verstellbaren Spiegels 78 und 80 können die Beleuchtungsrichtung und die Detektionsrichtung auf einfache Art und Weise vertauscht werden, indem die verstellbaren Spiegel 78 und 80 von der ersten Position in die zweite Position oder von der zweiten Position in die erste Position gestellt werden. Wenn sich die Spiegel 78 und 80 in der ersten Position befinden, erfolgt die Beleuchtung über das Beleuchtungsobjektiv und das Empfangen des Fluoreszenzlichtes über das Detektionsobjektiv 38. Wenn sich die Spiegel 78 und 80 in der zweiten Position befinden, erfolgt die Beleuchtung der Probe über das Detektionsobjektiv 38 und das Empfangen des Fluoreszenzlichtes über das Beleuchtungsobjektiv 36. Die oben beschriebene LSFM-Anordnung 148 kann besonders vorteilhaft für die Untersuchung einer Probe eingesetzt werden, die sich in einer Küvette 410 mit vier Bodenwänden befindet. Bei dieser Untersuchung kann die Probe aus vier unterschiedlichen Richtungen mit einer hohen Qualität untersucht werden. Für eine derartige Untersuchung müssen das Beleuchtungsobjektiv und das Detektionsobjektiv jedoch nicht jeweils in vier, sondern nur jeweils in zwei entsprechende Drehwinkelpositionen gebracht werden. Für die Untersuchung einer Probe aus vier um 90° zueinander gedrehten Richtungen müssen die Objektive nicht um 360° um die vertikale Achse gedreht werden, sondern nur um 90°. Dadurch kann die Zeit, die für ein Drehen der Objektive benötigt wird, erheblich reduziert werden, nämlich um nahezu 75%. Insbesondere bei der Untersuchung einer Vielzahl von Proben aus jeweils vier um 90° zueinander gedrehten Perspektiven kann damit viel Zeit gespart werden.

Die LSFM- Anordnungen 48 und 148 gemäß der Ausführungsformen aus Figur 9 und Figur 10 können auch miteinander kombiniert werden, sodass in einem erfindungsgemäßen System, das eine LSFM- Anordnung umfasst und eine Mikrotiterplatte umfasst, sowohl die Mikro titerplatte als auch die Objektive positionierbar sein können.

Weiterhin können die zuvor beschriebenen Ausführungsformen der Küvette und der Mikrotiterplatte auch in einer FSFM- Anordnung verwendet werden, in der sich zwischen den Objektiven und den Bodenwänden und/oder in der Küvette eine Immersionsflüssigkeit befindet, beispielsweise Wasser oder eine wässrige Lösung, wodurch die Brechungsindexunterschiede für das Anregungslicht und für das Fluoreszenzlicht an den Grenzflächen der Bodenwände und der Probe reduziert werden können. Dadurch kann die Abbildungsqualität weiter verbessert werden.

Es wird darauf hingewiesen, dass die zuvor beschriebenen Ausführungsformen als rein beispielhaft und die Erfindung nicht einschränkend anzusehen sind. Die beschriebenen Merkmale können in beliebiger Kombination von Bedeutung sein.

BEZUGSZEICHENLISTE

110, 210, 310, 410, 510 Küvette

12 Öffnung

14 oberer Abschnitt

16 unterer Abschnitt

18 Seitenwand

20 erste Bodenwand

22 zweite Bodenwand

24 dritte Bodenwand

26 vierte Bodenwand

28 Längsachse

30 Küvettenrahmen

32, 132 Mikrotiterplatte

34 System

36 Beleuchtungsobj ektiv

38 Detektionsobj ektiv

40 Beleuchtungsrichtung

42 Detektionsrichtung

44 Fluoreszenzprobe

46 Probenort

48, 148 LSFM-Anordnung

50 Laser

52 XYZ-Verschiebetisch

54 CCD-Kamera

56 optoelektronischer Shutter

58, 64, 66, 84, 86 Spiegel

60 Strahlaufweiter

62 Zylinderlinse

68 Filter

70 Linse

72 Halter

74 Stellmittel

76 erster Strahlteiler-Spiegel

78 erster verstellbarer Spiegel

80 zweiter verstellbarer Spiegel

82 zweiter Strahlteiler-Spiegel