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Title:
CYCLIC CARBONATE MONOMER CONTAINING DOUBLE IODINE, BIODEGRADABLE POLYMER PREPARED THEREBY AND USE
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2016/127940
Kind Code:
A1
Abstract:
Disclosed are a cyclic carbonate monomer containing double iodine, a biodegradable polymer prepared thereby and a use. The polymer can be obtained by ring-opening polymerization of the cyclic carbonate monomer containing double iodine, without affecting the ring-opening polymerization and without a protection and deprotection process. The polymer which is obtained by ring-opening polymerization of the cyclic carbonate monomer of the present invention can be assembled into a nano-vesicle and a micelle as a drug carrier, a biological tissue scaffold or a CT contrast media.

Inventors:
ZHONG, Zhiyuan (199 Ren Ai road Suzhou Industrial Park, Suzhou, Jiangsu 3, 215123, CN)
ZOU, Yan (199 Ren Ai road Suzhou Industrial Park, Suzhou, Jiangsu 3, 215123, CN)
WEI, Yaohua (199 Ren Ai road Suzhou Industrial Park, Suzhou, Jiangsu 3, 215123, CN)
MENG, Fenghua (199 Ren Ai road Suzhou Industrial Park, Suzhou, Jiangsu 3, 215123, CN)
Application Number:
CN2016/073743
Publication Date:
August 18, 2016
Filing Date:
February 12, 2016
Export Citation:
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Assignee:
SOOCHOW UNIVERSITY (199 Ren Ai road Suzhou Industrial Park, Suzhou, Jiangsu 3, 215123, CN)
International Classes:
C07D319/06; A61K47/34; A61K49/04; B82Y30/00; B82Y40/00; C08G64/30
Foreign References:
CN104672199A2015-06-03
CN104610538A2015-05-13
CN102090392A2011-06-15
Other References:
WANG, YING ET AL.: "Reductively and Hydrolytically Dual Degradable Nanoparticles by ''Click'' Crosslinking of a Multifunctional Diblock Copolymer", POLYM. CHEM., vol. 4, no. 5, 31 December 2013 (2013-12-31), pages 1657 - 1663
ZHANG, QIUJIN ET AL.: "Synthesis and Characterization of Biodegradable Amphiphilic PEG-Grafted Poly (DTC-co-CL", CHINESE CHEMICAL LETTERS, 31 December 2010 (2010-12-31), pages 1255 - 1258
SHI, QUAN ET AL.: "Synthesis and Characterization ot Azido- and Amino-bearing Aliphatic Polyesters", CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES, vol. 29, no. 7, 31 July 2008 (2008-07-31), pages 1492 - 1494
SHI, QUAN ET AL.: "Synthesis and Characterization of Azido- and Amino-bearing Aliphatic Polyesters", CHEMICAL JOURNAL OF CHINESE UNIVERSITIES, vol. 29, no. 7, 31 July 2008 (2008-07-31), pages 1492 - 1494
GOU, PENGFEI ET AL.: "Drug-Grafted Seven-Arm Amphiphilic Star Poly(Caprolactone-co-tonerbonate)-B-Poly (Ethylene Glycol)s Based on a Cyclodextrin Core: Synthesis and Self-Assembly Behavior in Water", POLYM.CHEM., vol. 1, no. 8, 31 December 2010 (2010-12-31), pages 1205 - 1214
GOU, PENGFEI ET AL.: "Drug-Grafted Seven-Arm Amphiphilic Star Poly(Caprolactone-co-tonerbonate)-B-Poly (Ethylene Glycol)s Based on a Cyclodextrin Core: Synthesis and Self-Assembly Behavior in Water", POLYM. CHEM., vol. 1, no. 8, 31 December 2010 (2010-12-31), pages 1205 - 1214
CHOPIN, S. ET AL.: "60]Fullerene Diol Issued from Pentaerythritol Derivatives", TETRAHEDRON LETTERS, vol. 46, 31 December 2005 (2005-12-31), pages 373 - 376
Attorney, Agent or Firm:
SUZHOU CREATOR PATENT AND TRADEMARK AGENCY, LTD (TAO Haifeng / 5th Floor, No. 93 Ganjiang West Road Gusu Distric, Suzhou Jiangsu 2, 215002, CN)
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Claims:
权利要求书

[权利要求 1] 一种含双碘环碳酸酯单体, 其特征在于: 所述含双碘环碳酸酯单体的 化学结构式如下:

[权利要求 2] 权利要求 1所述含双碘环碳酸酯单体的制备方法, 其特征在于, 包括 以下步骤: 将二溴新戊二醇与金属碘化物在低沸点溶剂中反应得到化 合物 A; 然后在氮气气氛中, 在环醚类溶剂中, 将化合物 A与氯甲酸 乙酯、 三乙胺反应得到含双碘环碳酸酯单体。

[权利要求 3] 一种侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物, 其含有含双碘环碳酸 酯单元, 其特征在于: 所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物 由含双碘环碳酸酯单体通过以下方式聚合得到:

( 1) 含双碘环碳酸酯单体均聚;

(2) 含双碘环碳酸酯单体与其它碳酸酯单体共聚;

(3) 含双碘环碳酸酯单体与环酯单体共聚;

所述含双碘环碳酸酯单体为 所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物的分子量为 3〜500 kDa

[权利要求 4] 根据权利要求 3所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物, 其特 征在于: 所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物分子链上含碘 量为 5<¾〜65<¾。

[权利要求 5] 根据权利要求 3所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物, 其特 征在于: 所述环酯单体为己内酯、 丙交酯或者乙交酯; 所述其它碳酸 酯单体为含双硫环碳酸酯、 2,4,6-三甲氧基苯甲缩醛季戊四醇碳酸酯 或者三亚甲基环碳酸酯。

[权利要求 6] 根据权利要求 3所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物, 其特 征在于: 含双碘环碳酸酯单体聚合吋, 以聚乙二醇、 乙二醇、 异丙醇 或丙炔醇为引发剂, 双 (双三甲基硅基) 胺锌为催化剂。

[权利要求 7] 根据权利要求 3所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物, 其特 征在于: 含双碘环碳酸酯单体聚合吋, 聚合温度为 40°C, 聚合吋间为 24〜72小吋。

[权利要求 8] 权利要求 3所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物在制备药物 载体中的应用; 所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物的分子 量为 3〜50 kDa; 所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物分子 链上含碘量为 5<¾〜65<¾。

[权利要求 9] 权利要求 3所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物在制备生物 组织工程支架中的应用; 所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合 物的分子量为 5〜500 kDa; 所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚 合物分子链上含碘量为 35%〜65<¾。

[权利要求 10] 权利要求 3所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物在制备 CT造 影剂中的应用; 所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物的分子 量为 100〜500 kDa; 所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物分 子链上含碘量为 35<¾〜65<¾。

Description:
说明书

发明名称:含双碘环碳酸酯单体、 由其制备的生物可降解聚合物及 应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种生物可降解聚合物材料及其应 用, 具体涉及一种侧链含双碘的 生物可降解聚合物及其应用, 属于医药材料领域。

背景技术

[0002] 生物可降解聚合物具有非常独特的性能, 例如它们通常具有良好的生物相容性 , 能在体内降解, 降解产物可被人体吸收或通过人体正常生理途 径排出体外, 而被广泛应用于生物医学的各个领域, 如手术缝合线、 骨固定器械、 生物组织 工程支架材料、 和药物控制释放载体等。 其中, 合成的生物可降解聚合物由于 其免疫原性较低、 其性能含如降解性能和机械性能等均可方便得 到控制等而尤 其受到关注。 合成的生物可降解聚合物主要有脂肪族聚酯、 聚碳酸酯、 聚氨基 酸、 聚磷酸酯、 聚酸酐、 聚原酸酯等。 其中, 聚碳酸酯如聚三亚甲基环碳酸酯

(PTMC) 和脂肪族聚酯如聚乙交酯 (PGA) 、 聚丙交酯 (PLA) 、 丙交酯 -乙交 酯共聚物 (PLGA) 、 聚己内酯 (PCL) 等是最常用的生物可降解聚合物, 已获 得美国食品药物管理部门 (FDA) 的许可。

[0003] 但是, 现有的生物可降解聚合物如 PTMC、 PGA、 PLA、 PLGA和 PCL等结构比 较单一, 缺乏可用于修饰的官能团, 往往难以满足医学需求, 例如, 基于这些 传统生物可降解聚合物的药物载体或是表面修 饰涂层存在稳定性差的致命弱点

[0004] 近年来, 文献报道了许多不同类型的功能性生物可降解 聚合物。 人们尤其对含 有羟基 (OH) 、 羧基 (COOH) 、 氨基 (NH 2 ) 、 巯基 (SH) 等功能基团的生 物可降解聚合物感兴趣, 因为带有这些功能性基团的聚合物可以直接键 接一些 药物, 实现药物的可控持续释放; 或者一些具有生物活性的分子通过功能基团 连接到聚合物上, 就可以改善整个材料的生物相容性和生物活性 。 功能性生物 可降解聚合物通常是通过幵环聚合功能性的环 状单体, 或通过解保护或通过进 一步修饰而得到。 聚碳酸酯的生物降解产物主要是二氧化碳和中 性的二元醇, 不产生酸性降解产物, 其中功能性环状碳酸酯单体可以和很多环酯类 单体, 如 乙交酯 (GA) 、 丙交酯 (LA) 、 己内酯 (ε-CL) 等, 以及其它环状碳酸酯单体 共聚, 得到不同性能的生物可降解聚合物。

技术问题

[0005] 现有技术中, 由于在幵环聚合过程中, 环碳酸酯单体结构中存在易于反应的基 团, 因此在由单体制备功能性环状生物可降解聚合 物吋, 都需要通过保护和脱 保护步骤, 这导致制备过程繁琐。

问题的解决方案

技术解决方案

[0006] 本发明的目的是, 提供一种含双碘环碳酸酯单体及其制备方法。

[0007] 为达到上述目的, 本发明具体的技术方案为: 一种含双碘环碳酸酯单体, 其化 学结构式如下:

[0009] 本发明还公幵了上述含双碘环碳酸酯单体的制 备方法, 包括以下步骤: 将二溴 新戊二醇与金属碘化物在低沸点溶剂中反应得 到化合物 A; 然后在氮气气氛中, 在环醚类溶剂中, 将化合物 A与氯甲酸乙酯、 三乙胺反应得到含双碘环碳酸酯化 合物。

[0010] 上述技术方案中, 二溴新戊二醇与金属碘化物的摩尔比为 1:(2〜4); 化合物 A与 氯甲酸乙酯、 三乙胺的摩尔比为1:(2〜3) :(2〜3); 碘化物为碘化钾或碘化钠; 所 述低沸点溶剂一般指沸点不高于 80。C的有机溶剂, 比如丙酮、 甲醇、 二氯乙烷、 丁酮等, 本发明优选为丙酮; 环醚类溶剂优选为四氢呋喃。

[0011] 优选的技术方案中, 制备含双碘环碳酸酯化合物吋, 先将化合物 A与氯甲酸乙 酯溶于环醚类溶剂, 再滴加三乙胺。

[0012] 优选的技术方案中, 上述制备方法还包括提纯处理, 具体为: [0013] i、 化合物 A的提纯: 反应结束后, 抽滤反应物; 再旋蒸滤液得到白色固体化合 物 A; ii、 含双碘环碳酸酯化合物的提纯: 反应结束后, 过滤, 滤液经旋转浓缩 , 再用乙醚进行重结晶, 得到白色晶体, 即含双碘环碳酸酯化合物。 上述抽滤 、 旋蒸、 旋转浓缩以及重结晶都属于现有技术, 本领域技术人员可以根据需要 自行选择。 本发明优选在含双碘环碳酸酯化合物提纯吋, 用乙醚重结晶 3-5次。

[0014] 本发明还公幵了一种侧链含双碘功能基团的生 物可降解聚合物, 其含有含双碘 环碳酸酯单元, 由含双碘环碳酸酯单体通过以下方式聚合得到 :

[0015] (1) 含双碘环碳酸酯单体均聚;

[0016] (2) 含双碘环碳酸酯单体与其它碳酸酯单体共聚;

[0017] (3) 含双碘环碳酸酯单体与环酯单体共聚;

[0018] 所述含双碘环碳酸酯单体为

[0019] 所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物 的分子量为 3〜500kDa。

[0020] 以质量计, 上述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物 分子链上含碘量为 5

<¾〜65<¾。

[0021] 上述技术方案中, 含双碘环碳酸酯单体聚合吋, 以聚乙二醇、 乙二醇、 异丙醇 或丙炔醇为引发剂, 双 (双三甲基硅基) 胺锌为催化剂。

[0022] 上述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物 由含双碘环碳酸酯单体幵环均聚 聚合得到或者以聚乙二醇等为引发剂, 含双碘环碳酸酯单体和其他单体进行幵 环共聚反应得到。 所述其他单体包括其他碳酸酯单体, 比如含双硫环碳酸酯、 2, 4,6-三甲氧基苯甲缩醛季戊四醇碳酸酯或者三 甲基环碳酸酯 (TMC); 还包括环 酯单体, 比如乙交酯、 己内酯 (ε-CL)或丙交酯 (LA)。 由于碘基团不影响幵环聚合 , 在聚合过程中无需保护和脱保护过程。 含双碘环碳酸酯单体聚合吋, 聚合温 度为 40°C, 聚合吋间为 24〜72小吋。

[0023] 本发明中, 以聚乙二醇为引发剂, 二氯甲烷作溶剂, 双 (双三甲基硅基) 胺锌 为催化剂, 引发上述含双碘环碳酸酯单体进行幵环聚合反 应, 形成两嵌段共聚 物 PEG- b-PIC; 反应式为:

[0024] 还可以二氯甲烷作溶剂, 双 (双三甲基硅基) 胺锌为催化剂, 以聚乙二醇、 乙 二醇、 异丙醇或丙炔醇为引发剂, 二氯甲烷作溶剂, 双 (双三甲基硅基) 胺锌 为催化剂, 引发上述含双碘环碳酸酯单体与其余其它碳酸 酯单体进行幵环共聚 合反应, 形成共聚物; 还可以二氯甲烷作溶剂, 双 (双三甲基硅基) 胺锌为催 化剂, 以聚乙二醇、 乙二醇、 异丙醇或丙炔醇为引发剂, 引发上述含双碘环碳 酸酯单体与环酯单体的幵环共聚合反应, 形成共聚物。

[0025] 根据本发明的方法得到的侧链含双碘功能基团 的生物可降解聚合物的化学结构 式可以如下所示:

[0026] 其中, Rl选自以下基团中的一种: 一 CH 3 、 一 CH 2 -CH 3 、 — CH(CH 3 ) 2 — CH「 CH;、 一 CH「 CH 2 — CH「 CH;、 — CH 2 — CH=CH 2 、 — CH 2 — CH=CH 2 、 —CH「C 0 CH、

, 式中1^ = 20〜250, R4选自以下基团中的一种:

[0028] —CH 3

[0029] R2选自以下基团中的一种:

R3为基团:

; 式中 a = 2、 3、 4; b = 20〜250。

[0031] 由本发明的环碳酸酯单体与侧链含双硫五元环 功能基团碳酸酯单体幵环聚合得 到的含有碘的聚合物, 具有良好的生物可降解性, 可以在催化量的还原剂如二 硫代苏糖醇或谷胱甘肽催化下形成稳定的化学 交联, 但在细胞内还原环境下会 快速解交联; 可以用于制备药物载体。 并且含有碘的功能生物可降解聚合物由 于其具有特殊的显影效果, 可用于 CT显影剂或者生物组织工程支架。 上述侧链 含双碘功能基团的生物可降解聚合物可以作为 造影剂, 在生物体诊断过程中发 挥作用。

[0032] 所以本发明请求保护上述侧链含双碘功能基团 的生物可降解聚合物在制备药物 载体中的应用; 所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物 的分子量为 3〜50 kDa; 所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物 分子链上含碘量为 5%〜65<¾

[0033] 本发明请求保护上述侧链含双碘功能基团的生 物可降解聚合物在制备生物组织 工程支架中的应用; 所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物 的分子量为 5 〜500kDa; 所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物 分子链上含碘量为 35 <¾〜65<¾。

[0034] 本发明请求保护上述侧链含双碘功能基团的生 物可降解聚合物在制备 CT造影 剂中的应用; 所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物 的分子量为 100〜50 OkDa; 所述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚合物 分子链上含碘量为 35%〜6 5<¾。

发明的有益效果

有益效果

[0035] 由于上述方案的实施, 本发明与现有技术相比, 具有以下优点:

[0036] 1.本发明首次利用含双碘功能基团的环状碳酸 单体通过活性可控幵环均聚合 或与其他碳酸酯单体、 环酯单体的共聚合得到分子量可控、 分子量分布较窄的 生物可降解聚合物, 由于碘基团不影响环碳酸酯单体的幵环聚合, 因此聚合过 程无需现有技术中的保护和脱保护过程, 简化了操作步骤, 克服了现有技术中 环碳酸酯聚合需要保护与脱保护的技术偏见。

[0037] 2.本发明公幵的环碳酸酯单体制备简单, 由其可以方便的幵环聚合得到生物相 容性好的包含碳酸酯链段的聚合物; 该聚合物可进一步进行自组装用于控制药 物释放体系、 组织工程和 CT造影剂, 在生物材料方面, 具有良好的应用价值。 对附图的简要说明

附图说明

[0038] 图 1为实施例一中含双碘环碳酸酯单体的核磁谱 ;

[0039] 图 2为实施例三中侧链含双碘基团的生物可降解 合物的核磁图;

[0040] 图 3为实施例五中侧链含双碘基团的生物可降解 合物的核磁图;

[0041] 图 4为实施例十三中侧链含双碘基团的生物可降 共聚物纳米粒子粒径分布图

[0042] 图 5为实施例十三中侧链含双碘基团的碳生物可 解聚物纳米粒子细胞毒性结 果图;

[0043] 图 6为实施例十四中生物可降解聚合物纳米粒子 透射电子显微镜 (TEM) 图

[0044] 图 7为实施例十五中侧链含双碘基团的生物可降 聚合物的细胞毒性结果图; [0045] 图 8为实施例十九中侧链含双碘基团的生物可降 聚合物形成的靶向纳米粒子 的 CT造影;

[0046] 图 9为实施例二十中侧链含双碘基团的生物可降 聚合物纳米粒子通过尾静脉 注射在小鼠体内循环的 CT图;

[0047] 图 10为实施例二十中侧链含双碘基团的生物可降 聚合物纳米粒子通过尾静脉 注射在小鼠体内循环的 CT值图;

[0048] 图 11为实施例二十中侧链含双碘基团的生物可降 聚合物纳米粒子通过尾静脉 注射在小鼠体膀胱内的 CT图;

[0049] 图 12为实施例二十中侧链含双碘基团的生物可降 聚合物纳米粒子通过尾静脉 注射在小鼠体内的 CT造影图;

[0050] 图 13为实施例二十一中侧链含双碘基团的生物可 解聚合物 PEG- b-PIC的 CT图 [0051] 图 14为实施例二十二中侧链含双碘基团的生物可 解聚合物 PEG- b-PIC纳米粒 子体外的 X射线衰减系数和体外的 CT效果图;

[0052] 图 15为实施例二十三中侧链含双碘基团的生物可 解聚合物 PEG- b-PIC纳米粒 子的体外渗透压结果;

[0053] 图 16为实施例二十四中侧链含双碘基团的生物可 解聚合物 PEG- b-PIC纳米粒 子的体内急毒性实验中的血常规测试;

[0054] 图 17为实施例二十四中侧链含双碘基团的生物可 解聚合物 PEG- b-PIC纳米粒 子的体内急毒性实验室中的血液生化测试;

[0055] 图 18为实施例二十五中侧链含双碘基团的生物可 解聚合物 PEG- b-PIC纳米粒 子作为血池造影的 CT图像;

[0056] 图 19为实施例二十六中侧链含双碘基团的带有新 血管靶向分子 cRGD的 cRGD

-PEG- b-PIC纳米粒子对于 U87MG脑胶质瘤的 CT成像;

[0057] 图 20为实施例二十六中侧链含双碘基团的带有新 管靶向分子 cRGD的 cRGd-P

EG- b-PIC纳米粒子对于 MCF-7人乳腺癌的 CT成像;

[0058] 图 21为实施例二十七中侧链含双碘基团的带有新 血管靶向分子 cRGD的 cRGD

-PEG- b-PIC纳米粒子对于 A549原位肺癌的 CT成像;

[0059] 图 22为实施例二十八中侧链含双碘基团的 PEG- b-PIC纳米粒子对于 SMMC-7721 原位肝癌的 CT成像。

本发明的实施方式

[0060] 下面结合实施例和附图对本发明作进一步描述 :

[0061] 实施例一含双碘环碳酸酯单体 (IC) 的合成:

[0062] 1、 二溴新戊二醇 (20g, 76.4 mmol) 溶在 300mL丙酮中完全溶解, 加入碘化 钾 (25.3 g, 152.4 mmol) , 避光冷凝回流反应 24小吋。 反应物抽滤除去生成的 溴化钾, 然后旋转蒸发得白色固体为化合物 A, 产率: 97.5%;

[0063] 2、 在氮气保护下, 化合物 A (5 g, 14.0mmol) 溶于干燥过的 THF ( 150mL) 中, 搅拌至完全溶解。 接着冷却到 0°C, 加入氯甲酸乙酯 (2.81 mL, 29.5 mmol ) , 然后逐滴加入 Et 3 N (4.1 mL, 29.5 mmol) 。 待滴加完毕后, 该体系在冰水 浴条件下继续反应 4h。 反应结束后, 过滤掉产生的 Et 3 N.HCl, 滤液经旋转浓缩 , 最后用乙醚进行重结晶, 得到白色晶体, 即含双碘环碳酸酯单体 (IC) , 产 率: 32<¾。 附图 1为上述产物 IC的 Ή NMR核磁图谱(400MHz, CDC1 3 ): δ 3.62 (s, 4H), 4.43 (s, 4H)。 IC的元素分析为: C: 18.43 %, H: 2.05 %, O: 12.62 % (理论: C: 18.85 %, H: 2.09 %, O: 12.56 % , I: 66.49%) , 质谱: MS:

381.2 (理论分子量: 382) 。

[0064] 实施例二含双碘环碳酸酯单体 (IC) 的合成:

[0065] 二溴新戊二醇 (20g, 76.4 mmol) 溶在 300mL四氢呋喃中完全溶解, 加入碘化 钠 (25.3 g, 152.4 mmol) , 避光冷凝回流反应 24小吋。 反应物抽滤除去生成的 溴化钠, 然后旋转蒸发得白色固体为化合物 A, 产率: 95.5% ; 在氮气保护下, 化合物 A (5 g, 14.0mmol) 溶于干燥过的 1.4-环氧六环 (150mL) 中, 搅拌至完 全溶解。 接着冷却到 0°C, 加入氯甲酸乙酯 (2.81 mL, 29.5 mmol) , 然后逐滴 加入 Et 3 N (4.1 mL, 29.5 mmol) 。 待滴加完毕后, 该体系在冰水浴条件下继续 反应 4 h。 反应结束后, 过滤掉产生的 Et 3 N.HCl, 滤液经旋转浓缩, 最后用乙醚 进行重结晶, 得到白色晶体, 即含双碘碳酸酯单体 (IC) , 产率: 23%。

[0066] 实施例三两嵌段聚合物 PEG5k- b-PIC22.7k的合成

[0067] 在手套箱里, 0.6 g ( 1.57 mmol) IC单体和 0.1 g (0.02 mmol) 聚乙二醇溶在 3 mL二氯甲烷中, 加入密封反应器里, 然后加入双 (双三甲基硅基) 胺锌的二氯 甲烷溶液 (O. l mol/L) , 密封反应器, 放入 40°C油浴中反应 3天后, 用 2滴冰乙酸 终止反应, 在冰乙醚中进行沉淀, 最终经过过滤、 真空干燥得到产物 PEG5k- b -PIC22.7k。 附图 2为上述侧链含双碘功能基团的生物可降解聚 物的核磁图谱。 Ή NMR (400MHz, CDC1 3 ): δ 3.30 (-OC H 3 -), 3.63 (-CCH 2 -) , 3.74 (-C H 2 C H 2 -), 4.38 (-CH 2 CH 2 -)。 GPC测的分子量: 32.4 kDa, 分子量分布: 1.42。

[0068] 实施例四两嵌段聚合物 PEG5k- b-PIC50k的合成

[0069] 将实施例三中 IC单体的用量改为 lg (2.61mmol) , 最终经过反应得到产物 PEG

5k- b-PIC50k, 称为侧链含双碘的聚合物, 属于生物可降解聚合物。

[0070] 实施例五侧链含双碘的生物可降解聚合物 PEG5k-P(CDC5.6k- co-IC27.2k)的合 成

[0071] 在氮气环境下, 0.026 g (0.14 mmol) 双硫五元环碳酸酯单体 (CDC) 和 0.13 g

(0.34 mmol) 的侧链含双碘碳酸酯单体 (IC) 溶在 l mL二氯甲烷中, 加入密封 反应器里, 然后加入分子量 5000的聚乙二醇 0.022 g (0.0043 mmol) 和 0.1 mol/L 的催化剂双 (双三甲基硅基) 胺锌的二氯甲烷溶液 (0.1 mol/L) , 密封反应器, 放入 40。C油浴中反应 2天后, 用冰乙酸终止反应, 在冰乙醚中沉淀, 最终经过过 滤、 真空干燥得到两嵌段侧链含双碘基团的生物可 降解聚合物 PEG5k-P(CDC5.6k - co-IC27.2k)。 附图 3为上述聚合物的核磁图谱, Ή NMR (400MHz, CDC1 3 ): 3.08 (s, -CCH 2 ), 3.64 (s, -CCH 2 ), 3.30 (m, -OCH 3 ) , 3.65 (t, -O H 2 CH 2 0-) , 4.25 m, -CCH 2 ) , 4.38 (m, -CCH 2 ); 核磁计算得到 m=l 13.6, x=29.2, y=71.2,

[0072] 实施例六侧链含双碘的生物可降解聚合物 PEG5k-P(IC4.8k- CO -CL14.2k)的合成 [0073] 在氮气环境下, 0.5 g ( 1.3 mmol) IC单体和 1.5 g ( 13.2 mmol) 的己内酯 (ε-CL

) 溶在 10mL二氯甲烷中, 加入密封反应器里, 然后加入分子量 5000的聚乙二醇

0.5 g (0.1 mmol) 和 1

mL的催化剂双 (双三甲基硅基) 胺锌的二氯甲烷溶液 (0.1 mol/L) , 接着把反 应器密封好, 转移出手套箱, 放入 40°C油浴中反应 1天后, 用冰乙酸终止反应, 在冰乙醚中沉淀, 最终经过过滤、 真空干燥得到产物 PEG5k-P(IC4.8k- CO -CL14.2k), 核磁计算得到 m=l 13.6, x=122.8, y=13.1, n=135.9; GPC测的分子量 : 31.3 kDa, 分子量分布: 1.42。

[0074] 实施例七 Alk-PIC3.8k的合成

[0075] g (1.3 mmol) IC单体溶在 1 mL二氯甲烷中, 加入密封反应 器里, 然后加入精制的丙炔醇 l mmol/L和 I mL的催化剂双 (双三甲基硅基) 胺 锌的二氯甲烷溶液 (O.l mol/L) , 密封反应器, 放入 40°C油浴中反应 1天后, 用 冰乙酸终止反应, 在冰乙醚中沉淀, 最终过滤、 真空干燥得到产物侧链含双碘 基团的碳酸酯均聚物 Alk-PIC4.8k, 核磁计算得到 x=12.6, GPC测的分子量: 0.62 kDa, 分子量分布: 1.28。

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[0076] 实施例八侧链含双碘的生物可降解聚合物 iPr-P(IC0.7k - CO -CL90k)的合成

[0077] 在氮气环境下, 0.1 g (0.26 mmol) IC单体和 10g (87.7

mmol) 的己内酯单体 (CL) 溶在 10mL二氯甲烷中, 加入密封反应器里, 然后 加入异丙醇 6 mg (0.1 mmol) 和 ImL的催化剂双 (双三甲基硅基) 胺锌的二氯甲 烷溶液 (O.l mol/L) , 接着把反应器密封好, 转移出手套箱, 放入 40°C油浴中反 应 2天后, 用冰乙酸终止反应, 在冰乙醚中沉淀, 最终经过过滤、 真空干燥得到 产物 iPr-P(IC0.7k - co-CL90k), 核磁计算得到 x=1.8, y=78.9, n=80.7; GPC测的分

[0078] 实施例九侧链含双碘聚合物 P(IC- co-CL)(6.21k)-PEG(0.5k)-P(IC- co-CL)(6.21k) 的合成 [0079] 在氮气环境下, 1.5 g (13.2 mmol) ε-CL和 0.0625 g (0.164 mmol) IC单体溶在 8 mL二氯甲烷中, 加入密封反应器里, 后加入 0.05 g的 PEG500 (0.01 mmol) 和 1 mL的催化剂双 (双三甲基硅基) 胺锌的二氯甲烷溶液 (O.l mol/L) , 40°C油浴 中反应一天后, 用冰乙酸终止反应, 在冰乙醚中沉淀, 最终经过过滤、 真空干 燥得到聚合物 P(IC- co-CL)(6.21k)-PEG(0.5k)-P(IC- co-CL)(6.21k)。 Ή NMR (400MHz, CDCl 3 ): 1.40 (m, -COCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -), 1.65 (m, -COCH 2 CH 2 CH 2CH 2 CH 2 -), 2.30 (t, -COCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 -), 3.63 (s, -CCH 2 ), 4.03 (t, -COCH 2 CH 2 CH 2 CH 2 CH 2 0-), 4.05 (s, -CH 2 OCOCHCH 2 -), 4.07 (s, -OCH 2 CCH 2 0-), 4.38 (m, -CCH 2 ); 核磁计算得到 m=11.4, x=6.3 , y=43.9,

n=51.2; GPC测的分子量: 14.6 kDa, 分子量分布: 1.38。

[0080] 实施例十两嵌段侧链含双碘聚合物 NHS-PEG6.5k-PIC50k的合成

[0081] 在氮气环境下, lg (2.61mmol) IC溶在 3 mL二氯甲烷中, 加入密封反应器里 , 然后加入 0.065 g (O.Olmmol) NHS-PEG6500和 0.5 mL的催化剂双 (双三甲基 硅基) 胺锌的二氯甲烷溶液 (O.l mol/L) , 接着把反应器密封好, 转移出手套箱 , 40。C油浴反应 2天后, 冰乙酸终止反应, 冰乙醚中沉淀, 最终经过过滤、 真空 干燥得到 NHS-PEG6.5k-PIC50k。

[0082] 实施例十一两嵌段侧链含双碘聚合物 Mal-PEG6k-PIC50k的合成

[0083] 在氮气环境下, l g (2.61 mmol) IC溶在 3 mL二氯甲烷中, 加入密封反应器里 , 然后加入 0.06 g (0.01 mmol) Mal-PEG6000和 0.1 mol/L的催化剂双 (双三甲基 硅基) 胺锌的二氯甲烷溶液 (0.1 mL) 40°C油浴反应 2天, 后处理同实施例二, 得到 Mal-PEG6k-PIC50k。

[0084] 实施例十二靶向两嵌段聚合物 cNGQ-PEG6.5k-PIC50k的合成 [0085] 环状多肽 cNGQGEQc (cNGQ) 偶联的聚合物 cNGQ-PEG6.5k-PIC50k的合成分 为两步, 第一步如实施例四制备 NHS-PEG6.5k-PIC50k; 第二步为 cNGQ的氨基 与其通过酰胺化反应键合。 先将上述聚合物 NHS-PEG6.5k-P溶在 DMF中, 加入 两倍摩尔量的 cNGQ, 30°C反应两天后, 透析除去游离 cNGQ, 冷冻干燥得到 cN GQ-PEG6.5k-P, 通过核磁和 BCA蛋白试剂盒计算 cNGQ接枝率为 92<¾。

[0086] 采用上述类似的制备方法可以制备多种侧链含 双碘的生物可降解双亲性聚合物 , 原料比例以及表征见表 1。

[0087] 表 1各个聚合物制备条件、 产物的核磁及 GPC表征结果

[0088] 实施例十三 MTT测试 PEG5k-P(CDC5.6k- co-IC27.2k)囊泡的细胞毒性

[0089] 聚合物 PEG5k-P(CDC5.6k- co-IC27.2k)纳米囊泡通过透析方法制备。 具体过程 是: 将 5 mg聚合物 PEG5k-P(CDC5.6k- co-IC27.2k)溶在 1 mL Ν,Ν二甲基甲酰胺中 , 在 25°C搅拌条件下, 向其中滴加 4.0mL磷酸盐缓冲溶液 (10mM, pH 7.4) 。 得 到的溶液搅拌 l h后, 装入预先准备好的透析袋中 (SPECTRA/POR, MWCO: 3500) , 用磷酸盐缓冲溶液 (10mM, pH 7.4) 透析 24 h得到交联的纳米囊泡。 由 图 4可知, 动态激光光散射 (DLS) 测试结果显示该纳米囊泡的水合直径 115nm , 粒径分布 0.11。

[0090] 采用 MTT法对 PEG5k-P(CDC5.6k- co-IC27.2k)纳米囊泡的细胞毒性进行测试。

使用到的细胞为 B16 (鼠黑色素瘤细胞) 和 L929 (人成纤维细胞) 。 在 37°C, 5 <¾二氧化碳条件下, 在含有 10%血清的 Dulbecco's modified Eagle培养基 (DMEM ) 中培养, 细胞密度为 lxlO 4

个 /孔。 24小吋后, 培养基用 90μί含有 10%血清的 DMEM和 ΙΟμί不同浓度的 PEG5 k-P(CDC5.6k- co-IC27.2k)纳米囊泡 (浓度分别为 0.3、 0.6、 0.9、 1.2和 1.5 mg/mL

) 替换, 细胞继续培养 24小吋; 接着培养基用 ΙΟΟμί新鲜的 DMEM替换, 并加入 1(VL MTT溶液 (5 mg/mL) 。 继续培养 4小吋, 加入 10( L DMSO溶解生成的结 晶子。 样品的光学密度用 BioTek微盘测量仪在 570nm处测定。 细胞单独在 10%血 清的 DMEM培养基中培养的结果作为标准, 记为 100%存活。 附图 5为 B16细胞 ( A) 和 L929细胞 (B) 存活率图; 从图中可以看出, 发现 B16细胞和 L929细胞存 活率在纳米囊泡浓度达到 1.2 mg/mL吋仍然大于 83%, 说明聚合物生物相容性很 好。

[0091] 实施例十四侧链含双碘的生物可降解聚合物 PEG- b-PIC纳米囊泡的制备

[0092] 聚合物 PEG- b

-PIC纳米囊泡通过透析方法制备。 具体过程是: 将 5mg聚合物 PEG- b-PIC (PIC分 子量分别为 12.3 kg/mol和 22.7 kg/mol)溶在 ImL Ν,Ν二甲基甲酰胺中, 在 25°C搅拌 条件下, 向其中滴加 4.0mL磷酸盐缓冲溶液 (10mM, pH

7.4) 。 得到的溶液搅拌 lh后, 装入预先准备好的透析袋中 (SPECTRA/POR, MWCO: 3500) , 用磷酸盐缓冲溶液 (10mM, pH 7.4) 透析 24除去有机溶剂。 附 图 6A, B分别为上述环生物可降解聚合物 PEG5k- b-PIC12.3k、 PEG5k- b

-PIC22.7k自组装形成纳米粒子的透射电子显微镜 (TEM) 图, 可以看出该纳米 粒子为中空囊泡结构。

[0093] 实施例十五侧链含双碘聚合物 PEG- b-PIC制备的胶束和囊泡的细胞毒性测试 [0094] 采用 MTT法对 PEG5k- b-PIC12.3k纳米囊泡、 PEG5k- b-PIC7.6k纳米胶束的细胞 毒性进行测试, 使用的细胞为 MCF-7 (人乳腺癌细胞) , HepG2 (人肝癌细胞) 和 L929 (人成纤维细胞) 。 在 37°C, 5%二氧化碳条件下, 在含有 10%血清的 Dul becco's modified Eagle培养基 (DMEM) 中培养, 细胞密度为 1x10 4 个 /孔。 24小 吋后, 培养基用 90μί含有 10%血清的 DMEM和 ΙΟμί不同浓度的 PEG -b-PIC纳米 粒子溶液 (浓度分别为 0.3、 0.6、 0.9、 1.2和 1.5mg/mL) 替换, 细胞继续培养 24 小吋; 接着培养基用 ΙΟΟμί新鲜的 DMEM替换, 并加入 ΙΟμί ΜΤΤ溶液 (5mg/mL ) 。 继续培养 4小吋, 加入 ΙΟΟμί

DMSO溶解生成的结晶子。 样品的光学密度用 BioTek微盘测量仪在 570nm处测定 。 细胞单独在 10%血清的 DMEM培养基中培养的结果作为标准, 记为 100%存活 。 附图 7为 MCF-7细胞 (A) , HepG2细胞 (B) 和 L929细胞 (C) 存活率图; 从 图中可以看出, 发现细胞存活率大于 82%, 说明聚合物 PEG- b-PIC材料生物相容 性很好。

[0095] 实施例十六 PEG5k- b-PIC7.6k纳米粒子胶束对疏水抗癌药物阿霉素的 装载

[0096] 采用溶剂交换法制备侧链含双碘的生物可降解 聚合物 PEG- b-PIC7.6k载药纳米 胶束。 4 mL磷酸缓冲溶液 (10mM, pH 7.4) 逐滴加入 SJlmL PEG5k- b-PIC7.6k 的 DMF溶液 (5 mg/mL) 和 ΙΟΟμί阿霉素 (DOX, 10% , 5mg/mL) 的二甲亚砜 溶液的混合液中, 超声 1小吋后装入透析袋 (Spectra/Pore ®, MWCO 3500) 中, 在 PB (lOmM, pH 7.4) 中透析 12小吋。 将 ΙΟΟμί纳米粒子溶液冷冻干燥, 然后 溶解于 3.0mL的 DMF溶液中, 利用荧光分光光谱仪测试, 结合阿霉素的标准曲 线计算包封率。 从荧光测得结果可算出, 该纳米胶束载疏水药物阿霉素理论载 药量为 10%吋, 载药效率为 82%, 载药量为 8.07%, 由以上结果可知, 侧链含双 碘基团的生物可降解聚合物 PEG5k- b-PIC7.6k纳米粒子对抗癌药物阿霉素有很高 的包裹效率。 用同样的方法可以装载其他的疏水药物到聚合 物胶束中。

[0097] 由本发明的得到的含有碘的生物可降解生物可 降解聚合物对细胞毒性小, 对抗 癌药物有很高的包裹效率, 可以作为相容性好的药物载体。

[0098] 实施例十七合成二嵌段聚合物 PEG5k-P(CDC5.6k- co-IC46.2k)

[0099] 在氮气环境下, 0.026 g (0.14 mmol) CDC和 0.22 g (0.68 mmol) IC溶在 1 mL 二氯甲烷中, 加入密封反应器里, 然后加入分子量 5000的甲氧基聚乙二醇 0.022 g (0.0043 mmol) 和 0.1 mol/L的催化剂双 (双三甲基硅基) 胺锌的二氯甲烷溶 液 (0.1 mol/L) , 反应器密封好后转移出手套箱, 放入 40°C油浴中反应 2天后, 用冰乙酸终止反应, 在冰乙醚中沉淀, 最终经过过滤、 真空干燥得到两嵌段生 物可降解聚合物 PEG5k-P(CDC5.6k- co-IC46.2k)。 GPC测的分子量: 72.2 kDa, 分 子量分布: 1.42。

[0100] 实施例十八制备两嵌段聚合物 PEG5k-P(CDC5.6k- co-IC46.2k)交联纳米囊泡 [0101] 取 100(VL的 PEG5k-P(CDC5.6k- co-IC46.2k)聚合物的 DMF溶液 (5 mg/mL) , 向其中逐滴加入 4 mL磷酸盐缓冲溶液 (PB, pH 7.4, 10mM) , 后放置 2小吋, 然 后在 PB中透析 (MWCO 3500) 24小吋, 除去有机溶剂同吋囊泡膜内含有的双硫 五元环可以通过巯基-双硫交换反应而自行交 , 得到交联聚合物囊泡, 标记为 CLPs。 DLS测试结果显示该交联纳米囊泡 CLPs的水合直径 123

nm, 粒径分布 0.13。

[0102] 实施例十九靶向聚合物的制备及其与 PEG5k-P(CDC5.6k- co-IC46.2k)制备的靶 向纳米囊泡 ( c RGD20/CLPs) 用于 CT造影

[0103] 在氮气环境下, 0.026 g (0.14 mmol) CDC和 0.22 g (0.68 mmol) 的 IC溶在 1 mL二氯甲烷中, 加入密封反应器里, 然后加入分子量 6000的末端用 Ν,Ν羟基琥 珀酰亚胺 (NHS) 活化的聚乙二醇 0.026 g (0.0043 mmol) 和 0.1 mol/L的催化剂 双 (双三甲基硅基) 胺锌的二氯甲烷溶液 (0.1 mol/L) , 接着把反应器密封好, 转移出手套箱, 放入 40。C油浴中反应 2天后, 用冰乙酸终止反应, 在冰乙醚中沉 淀, 最终经过过滤、 真空干燥得到两嵌段聚合物 NHS-PEG6k-P(CDC5.6k- co -IC46.2k)。 该聚合物和短肽 cRGD的氨基发生的酰胺化反应在 30°C进行, 该聚合 物 0.2 g (0.00035 mmol) 和 cRGD 5.61 mg (0.0007 mmol) 在氮气保护下反应 48 小吋后, 水中透析两天, 得到最终靶向聚合物 cRGD-PEG6k-P(CDC5.6k- co -IC46.2k)。

[0104] 取 80( L的 PEG5k-P(CDC5.6k- co-IC46.2k)聚合物的 DMF溶液 (5

mg/mL) 和 20( L cRGD-PEG6k-P(CDC5.6k- co-IC46.2k)聚合物的 DMF溶液 (5 mg/mL) 混合均匀后, 向其中逐滴加入 4 mL磷酸盐缓冲溶液 (PB, pH 7.4, 10mM) , 后放置 2小吋, 然后在 PB中透析 (MWCO 3500) 24小吋除去有机溶 剂, 同吋囊泡膜内含有的双硫五元环可以通过巯基 -双硫交换反应而自行交联, 得到含有 20%cRGD的交联靶向囊泡, 标记为 cRGD20/CLPs。 附图 8为上述纳米囊 泡的 CT图, 可以看出, 随着囊泡浓度的增大, CT值随之增大; 并且囊泡浓度与 CT值之间有很好的线性关系。 所以, 基于该含碘聚合的聚合物囊泡可以做为显 影物质。

[0105] 实施例二十靶向纳米囊泡 cRGD20/CLPs在体外和小鼠体内的 CT造影

[0106] 配置三组溶液, 显示其在小鼠体内的 CT造影效果: 第一组为靶向交联纳米囊 泡 cRGD20/CLPs (实施例十九) 、 第二组为没有靶向的纳米囊泡 CLPs (实施例 十八) 、 第三组为对照组碘海醇 (Iohexol)溶液; 三组注射的碘的含量一致。 通过 尾静脉注射溶液到小鼠体内, 观察不同吋间点得 CT造影图, 从图 9中可以观察到 , cRGD20/CLPs在小鼠体内经过 4个小吋的循环, CT图显示有明显的显影效果, 说明 cRGD20/CLPs可以有效在肿瘤部位积累, CLPs在肿瘤部位聚集稍弱, 而对 照组碘海醇却没有显影现象。 通过图 10中 CT值的变化可以看出, 经过 4小吋的循 环, cRGD20/CLPs的 CT变化值最高, CLPs其次, 对照组最低, 经过 7小吋的循 环, cRGD20/CLPs的 CT是其他两组的 2倍和 10倍。 从图 11中可看出, 循环 40分钟 后, 碘海醇对照组在膀胱里有很强的造影信号, 而 cRGD20/CLPs组则很弱, 可 知 cRGD20/CLPs在小鼠体内循环相对于小分子碘海醇 影剂更不容易被体内清 除, 并且有很长的循环吋间。 图 12为直接在小鼠肿瘤部位注射 cRGD20/CLPs, 经过 1小吋的循环, 相对于未注射前有很强的造影信号。

[0107] 实施例二十一侧链含双碘的生物可降解 PEG- b-PIC纳米粒子的 CT造影

[0108] 生物可降解聚合物 PEG- b-PIC纳米粒 (PEG5k- b-PIC7.6k胶束、 PEG5k- b

-PIC 12.3k囊泡和 PEG5k- b-PIC22.7k囊泡) 的 CT图如附图 13所示。 可以看出, 随 着聚合物中 PIC分子量的增大, 显影强度随之增大; 同吋, 和水相比, PEG5k- b -PIC22.7k纳米囊泡具有最明显的显影效果; 所以, 该侧链含双碘基团的生物可 降解聚合物纳米囊泡和纳米胶束可以作为显影 物质。

[0109] 实施例二十二 PEG5k- b-PIC50k纳米囊泡的体外 X射线衰减系数的测试

[0110] 不同含碘量的 PEG-b-PIC纳米囊泡浓缩后得到含碘量分别为 50, 20, 10, 5, 2. 5 mg/mL的纳米囊泡溶液。 附图 14中分别为 PEG-b-PIC和碘海醇的体夕卜 X射线衰 减系数的 CT图。 如图所示, 在相同碘量下, PEG-b-PIC纳米囊泡与碘海醇有相同 的体外衰减系数, 且 HU值和浓度呈线性关系。 因此, 由 PEG-b-PIC所形成的纳 米囊泡具有很好的 X射线衰减系数, 可以用来作为 CT成像的显影剂。

[0111] 实施例二十三 PEG5k- b-PIC50k纳米囊泡的体外渗透压测试

[0112] 不同含碘量的 PEG-b-PIC纳米囊泡浓缩得到含碘量分别为 80, 50, 40, 30, 20 mg/mL的纳米囊泡溶液。 附图 15中分别为 PEG-b-PK:、 碘海醇、 碘克沙醇通过露 点渗透压仪 (WESCOR Vapro 5600)测得的在 PBS (7.4, 10mM) 缓冲溶液中的 渗透压。 可知, PEG-b-PIC纳米囊泡的渗透压不随浓度的增加而增 加, 都和血液 的渗透压相当。 比起传统的小分子造影剂, 本发明的 PEG-b-PIC纳米囊泡不会产 生渗透压带来的副作用的问题。

[0113] 实施例二十四 PEG5k- b-PIC50k纳米囊泡的体内急毒性实验

[0114] 50mgI/mL聚合物纳米囊泡通过尾静脉注射 (200μϋ 到小鼠体内 24小吋后, 采 集血液后将小鼠牺牲。 测定的血常规和血生化的数据如附图 16, 17。 数据显示 , 该造影剂在给药剂量为 500mgI/mL的吋候在体内并没有显示出急毒性, 而且对 肝脏和肾脏的功能并没有产生影响。

[0115] 实施例二十五 PEG5k-b-PIC50k纳米囊泡作为血池造影剂的体内成

[0116] 50mgI/mL聚合物纳米囊泡通过尾静脉注射 (200μϋ 至 ljC57/BL6小鼠体内, 收 集不同吋间间隔的 CT图像, 分别选取 0小吋, 、 15分钟, 、 60分钟, 、 80分钟、 , 和 100分钟来观测 PEG -b-PIC纳米作为血池造影的效果。 如附图 18所示, 在 0小 吋从冠状面可以看出, 主动脉和下腔静脉有明显的增强, 从失状面观察, 60分 钟吋, 可以从 CT图像上看到明显且清晰的血管图像。 经过计算, CT值增强有 22 0, 并且持续到 100分钟吋, CT值增强大于 200。 由此结果说明, 该纳米囊泡可以 用于血池的长吋间和高效造影。

[0117] 实施例二十六 cRGD靶向的 cRGD-PEG5k- b-PIC50k纳米囊泡作为肿瘤新生血 管靶向的纳米造影剂

[0118] 50mgI/mL混有 cRGD-PEG- b-PIC纳米囊泡通过尾静脉注射 (200μί) 到荷瘤裸 鼠体内, U87MG脑胶质瘤和 MCF-7人乳腺癌两种恶性肿瘤的皮下模型被选用 为新生血管靶向的模型的 CT成像。 不同吋间点的 CT图像被收集用来证明肿瘤新 生血管的靶向能力。 由附图 19可知, U87MG荷瘤小鼠在心脏部位的 CT值增强在 两小吋达到 150HU, 并且在 10小吋候仍然有 100HU的增强。 在肝脏部位的 CT值 增强在两小吋达到 75HU, 并且随着吋间的增加逐步的增加, 在 10小吋的吋候达 到 100HU的增强。 在脾脏部位的增强 10小吋达到 270HU。 在肿瘤部位, 6小吋 CT 值增强达到 50HU。 说明该纳米囊泡可以很好靶向到 U87MG脑胶质瘤部位的新生 血管。 由附图 20可知, MCF-7荷瘤小鼠在心脏部位的 CT值增强 8小吋候仍有 150H U, 而肿瘤部位的 CT值增强达到 65HU。 说明该纳米囊泡可以很好的靶向到 MCF- 7人乳腺癌的新生血管。

[0119] 实施例二十七 带有 cRGDNGQ靶向的 cNGQRGD-PEG5k- b-PIC50k纳米粒子囊 泡作为原位肺癌新生血管靶向诊断的纳米靶向 造影剂

[0120] 50mgI/mL混有 cNGQRGD-PEG-b-PIC纳米囊泡通过尾静脉注射 (200μϋ 到荷 瘤 Α549非小细胞肺癌的原位肿瘤模型的裸鼠体内 收集不同吋间点的 CT图像被 收集用来证明原位肿瘤的靶向能力。 由附图 21可知, Α549荷瘤小鼠在 2小吋 CT 的增强达到 400HU并且到 7小吋候扔有大于 400HU的增强。 可以说明, 用 cNGQ 修饰的纳米囊泡可以用来作为靶向 A549原位肺癌的造影剂。

[0121] 实施例二十八 PEG5k- b-PIC50k纳米囊泡作为原位肝癌的纳米造影剂

[0122] 50mgI/mL的 PEG- b-PIC纳米囊泡用过尾静脉注射 (200μϋ 到荷 SMMC-7721原 位肝癌瘤的裸鼠体内。 不同吋间点的 CT图像被收集用来证明该纳米囊泡的作为 原位肝癌造影剂。 8小吋肝脏部位深色部位是肿瘤部位。 相比于正常的肝细胞, 癌症细胞会吞噬较少的没有经过修饰的纳米囊 泡, 所以在 CT成像中肿瘤部位相 比周围的正常细胞较暗。 由此可以说明, PEG- b

-PIC纳米囊泡可以用来作为 SMMC-7721原位肝癌的纳米造影剂, 用于肝癌的诊 断。

[0123] 实施例二十九

靶向交联纳米囊泡 cRGD20/CLPs装载亲水药盐酸多柔比星 (D0X HC1) 及体外 释放

[0124] 采用溶剂置换法制备聚合物囊泡, D0X HC1的装载采用 pH梯度法, 利用囊泡 内外 pH的不同来包裹亲水药物 DOX.HCl。 取 80( L的 PEG5k-P(CDC5.6k- co -IC46.2k)聚合物的 DMF溶液 (5 mg/mL) 和 200μΙ^ cRGD-PEG6k-P(CDC5.6k- co -IC46.2k)聚合物的 DMF溶液 (5 mg/mL) 混合均匀后, 滴加到 4000μί柠檬酸钠 / 柠檬酸缓冲溶液 (10mM, pH 4.0) 中, 在 37°C (200rmp) 摇床中放置 5小吋形成 囊泡, 然后加入 0.05 mL的 PB (4 M, pH

8.1 ) 建立 pH梯度, 随后立即加入 DOX.HC1的 PB溶液, 摇床中放置 5- 10小吋允许 药物进入囊泡中。 最后装入透析袋 (MWCO 7000) 中对 PB ( lOmM , pH 7.4) 透析 24小吋, 出去有机溶剂和自由药同吋囊泡自动交联, 换五次水, 得到载 DO X-HC1的 cRGD20-CLPs。 载不同比例的药 (ΙΟ^^Ο^) 的囊泡的粒径在 105- 124 nm, 粒径分布在 0.10-0.15。 荧光光谱仪测定 DOX.HC1的包裹效率为 63<¾-77<¾。 同此法可以高效装载亲水抗癌药盐酸表阿霉素 、 盐酸伊利替康和盐酸米托蒽醌 , 效率在 50-80%。

[0125] DOX.HC1的体外释放实验是在 37°C恒温摇床中震荡 (200rpm) 进行, 每组各有 三个平行样。 第一组, 载 DOX.HC1的自交联囊泡在加入 lOmM GSH模拟细胞内 还原环境 PB ( 10mM, pH 7.4)中; 第二组, 载 DOX.HC1的自交联囊泡在 PB

( lOmM, pH 7.4); 载药自交联囊泡的浓度为 30mg/L, 取 0.6 mL

放入透析袋 (MWCO: 12,000) 中, 每个试管中加入相应的透析溶剂 25 mL, 在 预定的吋间间隔, 取出 5.0mL透析袋外部介质用作测试, 同吋向试管中补加 5.0m L相应介质。 使用荧光仪测定溶液中药物浓度。 D0X,HC1累积释放量与吋间的关 系图可以看出, 加入模拟肿瘤细胞内 GSH后, 其释放明显要快于没加 GSH的样 本, 说明载药自交联囊泡在 lOmM的 GSH的存在下, 能有效释放药物。

[0126] 实施例三十载药的交联囊泡 CLPs和靶向交联囊泡 cRGD20/CLPs的血液循环 [0127] 如实施例二十九制备的载 D0X,HC1的 cRGD20/CLPs、 无靶向装 D0X,HC1的交联 囊泡 CLP、 以及不交联的囊泡 PEG5k-PIC46.2k和自由的 DOX.HCl通过尾静脉注射 入 Balb/C裸鼠中 (DOX药量为 10mg/kg) , 在 0、 0.25、 0.5、 1、 2、 4、 8、 12和 2 4小吋定点取血约 10μί, 通过差量法准确计算血液重量, 再加如 ΙΟΟμί浓度为 1 % 的曲拉通和 50(VL DMF萃取 (其中含有 20mM的 DTT, 1 M的 HC1) ; 然后离心 (20000转 /分钟, 20分钟) 后, 取上层清液, 通过荧光测得每个吋间点 DOX.HC1 的量。 由计算可知, 靶向载药交联囊泡、 载药交联囊泡和载药不交联囊泡在小 鼠体内的消除半衰期分别为 6.84、 6.46和 3.73小吋, 而 D0X,HC1的仅为 0.13小吋

, 所以靶向载药自交联囊泡在小鼠体内稳定, 有较长循环吋间。 其他载药靶向 自交联囊泡、 载药自交联囊泡的血液循环实验的操作和计算 方法相同。

[0128] 实施例三十一 交联囊泡 CLPs和靶向交联囊泡 cRGD20/CLPs在荷 B16黑色素瘤 小鼠的活体成像

[0129] 活体成像实验选用体重为 18~20克左右, 4~6周齢的 Balb/C裸鼠, 在皮下注射 5x 10 6 个 B16黑色素瘤细胞, 大约 3~4周后, 肿瘤大小为 100~200mm 3 吋幵始实验。 以如实施例二十九制备的载 DOX.HC1的 cRGD20/CLPs、 无靶向载 DOX.HC1的自 交联囊泡 CLP和自由的 D0X,HC1为例。 将荧光物质 cy-7标记的 cRGD20/CLPs和无 靶向的 CLPs通过尾静脉注射小鼠体内, 然后在不同吋间点 1、 2、 4、 6、 8、 12 、 24、 48小吋用小动物活体成像仪来追踪囊泡的去向 实验结果可知, CRGD20- CLPs在肿瘤部位很快积累, 且在 48小吋后荧光仍然很强。 说明 cRGD20-CLPs能 主动靶向及富集到肿瘤部位。 其他靶向交联囊泡、 交联囊泡的活体成像实验的 操作和计算方法相同。

[0130] 实施例三十二 载药交联囊泡 CLPs和靶向交联囊泡 cRGD20/CLPs在荷 SKOV3卵 巢癌小鼠的体内生物分布

[0131] 体内生物分布实验中肿瘤的接种以及尾静脉给 药同实施例三十一。 如实施例二 十九制备的载 D0X,HC1的 cRGD20/CLPs、 无靶向载 D0X,HC1的交联囊泡 CLP和 自由 DOX.HCl通过尾静脉注射小鼠体内 (DOX.HCl: 10mg/kg) , 12小吋后处死 老鼠, 将肿瘤及心, 肝, 脾, 肺和肾组织取出, 清洗称重后加入 50( L 1%的曲 拉通通过匀浆机磨碎, 再加入 90( L DMF萃取 (其中含有 20mM的 DTT, 1 M的 HC1) 。 离心 (20000转 /分钟, 20分钟) 后, 取上层清液, 通过荧光测得每 个吋间点 DOX.HC1的量。 结果得出, cRGD20/CLPs、 CLPs和 DOX.HCr注射 12小 吋在肿瘤积累的 DOX.HC1量分别为 6.68、 2.81和 0.61 ID<¾/g (每克肿瘤或组织中 的 DOX HC1占总 DOX HC1注射量) , cRGD20/CLPs是 CLPs和 DOX HC1的 2.4和 11 倍, 说明载药 cRGD20/CLPs通过主动靶向在肿瘤部位积累较多。

[0132] 实施例三十三 载药靶向交联囊泡 cRGD20/CLPs和空靶向交联囊泡对 Balb/C小 鼠的最大耐受剂量 (MTD)

[0133] 实验选用体重为 18~20克左右, 4~6周齢的 Balb/C裸鼠。 单剂量注射载药 cRGD2 0/CLPs (阿霉素的浓度为 60和 80mg/kg) 、 空的 cRGD20/CLPs (聚合物 300和 400 mg/kg) 和自由阿霉素 (5和 10mg/kg) , 每组小鼠五只, 最后的 10天, 每天观察 小鼠的精神状态及测量体重。 MTD的标准为小鼠非意外性死亡及小鼠体重低于 1 5<¾。 结果可知, 载药靶向交联囊泡的 MTD大于 80mg/kg, 空 cRGD20-CLPs的 MT D大于 400mg/kg, 而 DOX的 MTD小于 10mg/kg, 由此可知, 载药靶向交联囊泡对 小鼠有很高的耐受能力, 大大的提高了治疗窗。

[0134] 实施例三十四 载药靶向交联囊泡 cRGD20-CLPs和交联囊泡 CLPs在荷 B16瘤的 小鼠中的抑瘤效果、 体重变化

[0135] 实验选用体重为 18~20克左右, 4~6周齢的 Balb/C裸鼠, 在皮下注射 5x10 6 个 B16 细胞, 大约两周后, 肿瘤大小为 30~50mm 3 吋幵始实验。 如实施例二十九制备的 载 D0X,HC1的 cRGD20/CLPs、 无靶向载 D0X,HC1的交联囊泡 CLP、 自由 DOX,HC 1以及 PBS分别在 0、 4、 8和 12天通过尾静脉注射小鼠体内 (DOX药量为 10mg/kg ) 。 在 0~18天, 每两天称量小鼠的体重, 游标卡尺测量肿瘤体积, 肿瘤体积计 算方法为: V= (LxWxH) 12, (其中 L为肿瘤的长度, W为肿瘤的宽度, H为肿 瘤的厚度) 。 持续观察小鼠的生存到 45天。 cRGD20-CLPs治疗组 19天吋, 肿瘤 得到明显抑制, 而 CLPs组肿瘤有一定的增长。 DOX.HC1虽然也能抑制肿瘤的增 长, 但其小鼠体重在 7天吋降低了 20%, 说明对小鼠的毒副作用很大。 相比之下 c RGD20/CLPS和 CLPs组的小鼠体重几乎没有改变, 说明载药交联囊泡对小鼠没有 毒副作用。 因此, 本发明的靶向交联囊泡载药后可有效抑制肿瘤 的增长, 对小 鼠没有毒副作用。

[0136] 实施例三十五载药靶向交联囊泡 cRGD20/CLPs在荷 B16瘤小鼠中的 CT成像 [0137] 如实施例二十六, 将含 50mgl/m的如实施例三十四中的样品通过尾静脉 射 (2 ΟΟμϋ 到荷 B16瘤小鼠中。 不同吋间点的 CT图像被收集用来证明肿瘤靶向能力 。 结果可知, 在 B16荷瘤小鼠的肿瘤部位, 6小吋 CT值增强达到 140HU; 在心脏 的 CT值增强在两小吋达到 200HU, 并且在 12小吋仍然有 120HU的增强。 在肝脏 的 CT值增强在两小吋达到 85HU, 并且随着吋间的增加逐步增加, 在 10小吋达到 100HU的增强。 在脾脏部位的增强 10小吋达到 270HU。 说明该纳米囊泡既可以用 于治疗, 也可以很好靶向肿瘤成像。 该载药靶向纳米囊泡还可以用于原位肺癌 的诊断和治疗。

以上这些结果均说明本发明的含碘聚合物形成 的靶向纳米囊泡可以在体内造影 , 用于制备显影剂, 在肿瘤及其他疾病的诊断方面有广泛的应用前 景。