In Erkrankungen wie Osteoarthritis und Rheuma findet eine Zerstörung des Gelenkes statt, besonders bedingt durch den proteolytischen Abbau von Kollagen durch Kollagenasen.

Kollagenasen gehören zur Superfamilie der Metalloproteinasen (MP) oder Matrix- Metallproteinasen (MMP). Die MMPs bilden eine Gruppe von Zn-abhängigen Enzymen, die am biologischen Abbau der extrazellulären Matrix beteiligt sind (D. Yip et al in Investigational New Drugs 17 (1999), 387-399 und Michaelides et al in Current Pharmaceutical Design 5 (1999) 787- 819). Diese MMPs sind insbesondere fähig, fibrilläres und nicht-fibrilläres Kollagen, sowie Proteoglycane abzubauen, die beide wichtige Matrixbestandteile darstellen. MMPs sind beteiligt an Prozessen der Wundheilung, der Tumorinvasion, Metastasenwanderung sowie an Angiogenese, multipler Sklerose, Herzversagen und Atherosklerose (Michaelides S. 788 ; siehe oben). insbesondere spielen sie eine wichtige Rolle beim Abbau der Gelenkmatrix in der Arthrose und der Arthritis, sei es nun die Osteoarthrose, Osteoarthritis oder die rheumatoide Arthritis.

Eine ausgewählte Subgruppe innerhalb der MMPs wird z. B. durch die Kollagenasen gebildet.

Nur Kollagenasen haben die Fähigkeit, natives Kollagen, das ja eine wichtige Stützfunktion in der Matrix ausübt, abzubauen. Diese Subgruppe besteht aus der interstitiellen Kollagenase MMP-1, der Neutrophilen-Kollagenase MMP-8, sowie der erst später identifizierten MMP-13.

MMP-13 konnte im Körper von gesunden, ausgewachsenen Individuen praktisch nicht entdeckt werden, es wird nur im Verlauf von Krankheiten, z. B. in Krebszellen oder Ulcera exprimiert. MMP-13 ist auch in der Gelenkmatrix von arthrotischen Menschen und Säugetieren, insbesondere bei klinisch fortgeschrittener Arthrose nachgewiesen worden, während es im Gelenkgewebe von gesunden Erwachsenen nicht vorkommt. Die Hemmung von MMP-13 durch entsprechende Inhibitoren ist deshalb besonders geeignet, um die genannten Krankheiten zu bekämpfen.

Eine Vielzahl von verschiedenen Inhibitoren der MMP's, bzw. der Kollagenasen sind bekannt (EP 0 606 046 ; W094/28889 ; WO 96/27583). Es ist auch bekannt, dass cyclische und

heterocyclische N-substituierten Alpha-Iminohydroxam-und Carbonsäuren Inhibitoren von Metalloproteinasen sind (EP 0 861 236).

Nach den ersten klinischen Studien an Menschen hat sich nun gezeigt, dass MMPs Nebenwirkungen hervorrufen. Die hauptsächlich genannten Nebenwirkungen sind muskuloskeletale Schmerzen oder Anthralgien. Der Stand der Technik besagt eindeutig, dass erwartet wird, dass selektive Inhibitoren diese genannten Nebenwirkungen reduzieren können (Yip, Seite 387, siehe oben).

Nachteil der bekannten Inhibitoren der MMPs ist daher häufig die mangelnde Spezifität der Hemmung für nur eine Klasse der MMPs. Daher hemmen die meisten MMP-Inhibitoren mehrere MMPs gleichzeitig, weil die katalytische Domäne der MMPs eine ähnliche Struktur aufweist. Demzufolge wirken die Inhibitoren in unerwünschter Weise auf viele Enzyme, auch solche mit vitaler Funktion ein (Massova I, et al., The FASEB Journal (1998) 12,1075-1095).

In der Anmeldung WO 97/18194 (EP 0 861 236) werden bereits cyclische und heterocyclische N- substituierte Alpha-Iminohydroxam und Alpha-Iminocarbonsäuren beschrieben, die eine starke inhibitorische Wirkung auf MMP-3 und MMP-8 aufweisen. Die in WO 97/18194 offenbarten Verbindungen, die in den Beispielen beschrieben werden, zeigen auch eine starke hemmende Wirkung auf MMP-13, wie durch erneute eigene Messungen festgestellt worden ist.

In dem Bestreben, wirksame Verbindungen zur Behandlung von Bindegewebs-erkrankungen zu finden, wurde nun gefunden, dass die erfindungsgemäß eingesetzten Verbindungen starke Inhibitoren der Matrix-Metalloproteinase 13 sind, während die erfindungsgemäß eingesetzten Verbindungen im wesentlichen unwirksam sind bei den MMPs 3 und 8. Diese erfindungsgemäß eingesetzten Verbindungen sind somit viel gezielter zur selektiven Behandlung der genannten Krankheiten geeignet, als die in WO 97/18194 offenbarten und in den Beispielen beschriebenen Verbindungen, die neben MMP-13 auch noch andere MMPs inhibieren. Daher ist zu erwarten, dass diese selektiven Inhibitoren bei der Behandlung der genannten Erkrankungen ein wesentlich verbessertes Nebenwirkungsspektrum aufweisen werden.

Die Erfindung betrifft daher die Verwendung von Verbindungen der Formel I

und/oder alle stereoisomeren Formen der Verbindung der Formel I und/oder Gemische diese Formen in jedem Verhältnis, und/oder ein physiologisch verträgliches Salz der Verbindung der Formel I zur Herstellung eines Arzneimittels zur Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen, an deren Verlauf eine verstärkte Aktivität von Matrix-Metalloproteinase 13 beteiligt ist, wobei A für Kohlenstoffatom oder Stickstoffatom steht, worin A unsubstituiert oder durch-(C1-C4)-Alkyl substituiert ist, n für die ganze Zahlen 1 oder 2 steht, R1 für 1.- (Cl-Cl 0)-Alkyl, worin Alkyl gerade oder verzweigt ist, 2. -(C2-C10)-Alkenyl, worin Alkenyl gerade oder verzweigt ist, 3.-(C2-C10)-Alkinyl, worin Alkinyl gerade oder verzweigt ist, 4. -(C1-C4)-Alkyl-Phenyl, 5.- (C1-C4)-Alkyl- (C3-C7)-Cycloalkyl, 6.-(C3-C7)-Cycloalkyl oder 7. -CH2CF3 steht und R2 für Wasserstoffatom oder- (C1-C4)-Alkyl steht.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Verbindungen der Formel I, wobei A für Kohlenstoffatom oder Stickstoffatom steht, worin A unsubstituiert oder durch Methyl substituiert ist, n für die ganze Zahlen 1 oder 2 steht R1 für 1.- (C2-C6)-Alkyl, worin Alkyl gerade oder verzweigt ist,

2.-CH2-Phenyl, oder 3.-CH2-Cyclopropyl, steht, und R2 für Wasserstoffatom oder Methyl steht.

Die Erfindung betrifft ferner die Verwendung von Verbindungen der Formel II, wobei

R1 für 1.-(C2-C6)-Alkyl, worin Alkyl gerade oder verzweigt ist, 2. -CH2-Phenyl, oder 3.-CH2-Cyclopropyl, steht, und R2 für Wasserstoffatom oder Methyl steht.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft die Verwendung von Verbindungen der Formel III, wobei

2.L -CH2-Phenyl, oder 3.-CH2-Cyclopropyl, steht, und R2 für Wasserstoffatom oder Methyl steht.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft neue Verbindungen der Formel I,

und/oder alle stereoisomeren Formen der Verbindung der Formel I und/oder Gemische diese Formen in jedem Verhältnis, und/oder ein physiologisch verträgliches Salz der Verbindung der Formel I, wobei A für Kohlenstoffatom oder Stickstoffatom steht, worin A unsubstituiert oder durch- (C1-C4)-Alkyl substituiert ist, n für die ganze Zahlen 1 oder 2 steht R1 für 1. -(C1-C10)-Alkyl, worin Alkyl gerade oder verzweigt ist, 2. -(C2-C10)-Alkenyl, worin Alkenyl gerade oder verzweigt ist, 3.- o)-Alkinyl, worin Alkinyl gerade oder verzweigt ist, 4. -(C1-C4)-Alkyl-Phenyl, 5. -(C1-C4)-Alkyl-(C3-C7)-Cycloalkyl, 6.-(C3-C7)-Cycloalkyl oder 7.-CH2CF3 steht und R2 für Wasserstoffatom oder- (C1-C4)-Alkyl steht.

Die Erfindung betrifft ferner Verbindungen der Formel I, wobei A für Kohlenstoffatom oder Stickstoffatom steht, worin A unsubstituiert oder durch Methyl substituiert ist, n für die ganze Zahlen 1 oder 2 steht R1 für 1.- (C2-C6)-Alkyl, worin Alkyl gerade oder verzweigt ist, 2.-CH2-Phenyl, oder 3.-CH2-Cyclopropyl, steht, und R2 für Wasserstoffatom oder Methyl steht.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verbindungen der Formel II, wobei

R1 für 1.- (C2-C6)-Alkyl, worin Alkyl gerade oder verzweigt ist, 2.-CH2-Phenyl, oder 3.-CH2-Cyclopropyl, steht, und R2 für Wasserstoffatom oder Methyl steht.

Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft Verbindungen der Formel III, wobei

R1 für 1.- (C2-C6)-Alkyl, worin Alkyl gerade oder verzweigt ist, 2.-CH2-Phenyl, oder 3.-CH2-Cyclopropyl, steht, und R2 für Wasserstoffatom oder Methyl steht.

Unter dem Begriff"(C1-C10)-Alkyl" werden Kohlenwasserstoffreste verstanden, deren Kohlenstoffkette geradkettig oder verzweigt ist und 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthält,

beispielsweise Methyl, Ethyl, Propyl, Iso-Propyl, Butyl, Iso-Butyl, tertiär-Butyl, Pentyl, Iso- Pentyl, Neopentyl, Hexyl, 2, 3-Dimethylbutyl, Neohexyl, Heptyl, Octanyl, Nonanyl, Decanyl.

Unter dem Begriff"(C2-C10)-Alkenyl"werden Kohlenwasserstoffreste verstanden, deren Kohlenstoffketten geradkettig oder verzweigt ist und 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthält und je nach Kettenlänge 1,2 oder 3 Doppelbindungen enthalten. (C3-C7)-Cycloalkyl-Reste sind beispielsweise Verbindungen, die sich von 3-bis 7-gliedrige Monocyclen wie Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl oder Cycloheptyl herleiten.

Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur Herstellung der Verbindung der Formel I und/oder einer stereoisomeren Form der Verbindung der Formel I und/oder eines physiologisch verträglichen Salzes der Verbindung der Formel I, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man a) eine Verbindung der Formel IV,

worin A, R2 und n wie in Formel I definiert sind und Re ein Wasserstoffatom oder eine Ester-Schutzgruppe darstellt, mit einer Verbindung der Formel V, v worin Rz Chloratom, imidazolyl oder OH bedeutet, in Gegenwart einer Base zu einer Verbindung der Formel VI umsetzt,

worin A, R2 und n wie in Formel I definiert sind und Re wie oben definiert ist, und b) eine nach a) hergestellte Verbindung der Formel VI mit Wasserstoff und einem Metallkatalysator zu einem Amin der Formel VII reduziert und anschließend die Verbindung der Formel Vil mit einer Verbindung der Formel VIII

worin R1 wie in Formel I definiert ist, in Gegenwart einer basischen Verbindung wie Triethylamin, Trimethylamin oder Pyridin zu einer Verbindung der Formel IX

umsetzt, wobei R1, R2, A und n wie in Formel I definiert sind und Re wie oben definiert ist, c) eine nach Verfahren a) hergestellte Verbindung der Formel I, die aufgrund ihrer chemischen Struktur in enantiomeren Formen auftritt, durch Salzbildung mit enantiomerenreinen Säuren oder Basen, Chromatographie an chiralen Stationärphasen oder Derivatisierung mittels chiraler enantiomerenreinen Verbindungen wie

Aminosäuren, Trennung der somit erhaltenen Diastereomeren, und Abspaltung der chiralen Hilfsgruppen in die reinen Enantiomeren auftrennt, oder d) die nach den Verfahren b) oder c) hergestellte Verbindung der Formel I entweder in freier Form isoliert oder im Falle des Vorliegens von sauren oder basischen Gruppen in physiologisch verträgliche Salze umwandelt.

Als Ester-Schutzgruppe Re können die in Protective Groups in Organic Synthesis, T. H. Greene, P. G. M. Wuts, Wiley-Interscience, 1991, als Schutzgruppen für Ester verwendete Gruppen eingesetzt werden. Bevorzugte Ester-Schutzgruppen sind beispielsweise Methyl, Ethyl, Isopropyl, tert. Butyl oder Benzyl.

Die eingesetzten Ausgangsprodukte und Reagenzien können entweder nach bekannten Verfahren hergestellt werden oder sind käuflich erhältlich. Das Spinacinringsystem kann beispielsweise gemäß S. Klutchko et al. 0. Heterocyclic. Chem., 28,97, (1991)) hergestellt werden.

Die Umsetzungen erfolgen beispielsweise wie in WO 97/18194 dargestellt. Die Umsetzung gemäß Verfahrensschritt a) erfolgt in Gegenwart einer Base wie KOH, NaOH, LiOH, N, 0-Bis- (trimethylsilyl) acetamid (BSA), N-Methylmorpholin (NMM), N-Ethylmorpholin (NEM), Triethylamin (TEA), Diisopropylethylamin (DIPEA), Pyridin, Collidin, Imidazol oder Natriumcarbonat in Lösungsmitteln wie Tetrahydrofuran (THF), Dimethylformamid (DMF), Dimethylacetamid, Dioxan, Acetonitril, Toluol, Chloroform oder Methylenchlorid, oder auch in Gegenwart von Wasser.

Die Umsetzung gemäß Verfahrensschritt b) erfolgt beispielsweise mit den Metalikatalysatoren Pd/C, SnCi2 oder Zn unter Standardbedingungen.

Im Verfahrensschritt c) wird die Verbindung der Formel I sofern sie in diastereoisomerer oder enantiomerer Form auftritt und bei der gewählten Synthese als deren Gemische anfällt, in die reinen Stereoisomeren getrennt, entweder durch Chromatographie an einem gegebenenfalls chiralen Trägermaterial, oder, sofern die razemische Verbindung der Formel I zur Salzbildung befähigt ist, durch fraktionierte Kristallisation der mit einer optisch aktiven Base oder Säure

als Hilfsstoff gebildeten diastereomeren Salze. Als chirale Stationärphasen für die dünnschicht- oder säulenchromatographische Trennung von Enantiomeren eignen sich zum Beispiel modifizierte Kieselgelträger (sogenannte Pirkle-Phasen) sowie hochmolekulare Kohlenhydrate wie Triacetylcellulose. Für analytische Zwecke sind nach entsprechender, dem Fachmann bekannter Derivatisierung, auch gaschromatographische Methoden an chiralen Stationärphasen anwendbar. Zur Enantiomerentrennung der racemischen Carbonsäuren werden mit einer optisch aktiven, in der Regel kommerziell erhältlichen Base wie (-)-Nicotin, (+) -und (-)-Phenyl-ethylamin, Chininbasen, L-Lysin oder L-und D-Arginin die unterschiedlich löslichen diastereomeren Salze gebildet, die schwerer lösliche Komponente als Feststoff isoliert, das leichter lösliche Diastereomer aus der Mutterlauge abgeschieden, und aus den so gewonnenen diastereomeren Salzen die reinen Enantiomeren gewonnen. Auf prinzipiell gleiche Weise kann man die racemischen Verbindungen der Formel I, die eine basische Gruppe wie eine Aminogruppe enthalten, mit optisch aktiven Säuren, wie (+)-Campher-10- sulfonsäure, D-und L-Weinsäure, D-und L-Milchsäure sowie (+) und (-)-Mandelsäure in die reinen Enantiomeren überführen. Auch kann man chirale Verbindungen, die Alkohol-oder Amin-funktionen enthalten, mit entsprechend aktivierten oder gegebenenfalls N-geschützten enantiomerenreinen Aminosäuren in die entsprechenden Ester oder Amide, oder umgekehrt chirale Carbonsäuren mit carboxygeschützten enantiomerenreinen Aminosäuren in die Amide oder mit enantiomerenreinen Hydroxycarbonsäuren wie Milchsäure, in die entsprechenden chiralen Ester überführen. Sodann kann die Chiralität des in enantiomerenreiner Form eingebrachten Aminosäure-oder Alkoholrestes zur Trennung der. Isomeren genutzt werden, indem man eine Trennung der nunmehr vorliegenden Diastereomeren durch Kristallisation oder Chromatographie an geeigneten Stationärphasen vornimmt und danach den mitgeführte chiralen Molekülteil mittels geeigneter Methoden wieder abspaltet.

Saure oder basische Produkte der Verbindung der Formel I können in Form ihrer Salze oder in freier Form vorliegen. Bevorzugt sind pharmakologisch verträgliche Salze, z. B. Alkali-oder Erdalkalimetallsalze bzw. Hydrochloride, Hydrobromide, Sulfate, Hemisulfate, alle möglichen Phosphate sowie Salze der Aminosäuren, natürlicher Basen oder Carbonsäuren.

Die Herstellung physiologisch verträglicher Salze aus zur Salzbildung befähigten Verbindungen der Formel 1, einschließlich deren stereoisomeren Formen, gemäß Verfahrensschritt d) erfolgt in an sich bekannter Weise. Die Verbindungen der Formel I bilden mit basischen Reagenzien

wie Hydroxiden, Carbonaten, Hydrogencarbonaten, Alkoholaten sowie Ammoniak oder organischen Basen, beispielsweise Trimethyl-oder Triethylamin, Ethanolamin oder Triethanolamin oder auch basischen Aminosäuren, etwa Lysin, Ornithin oder Arginin, stabile Alkali-, Erdalkali-oder gegebenenfalls substituierte Ammoniumsalze. Sofern die Verbindungen der Formel I basische Gruppen aufweisen, lassen sich mit starken Säuren auch stabile Säureadditionssalze herstellen. Hierfür kommen sowohl anorganische als auch organische Säuren wie Chlorwasserstoff-, Bromwasserstoff-, Schwefel-, Phosphor-, Methansulfon-, Benzolsulfon-, p-Toluolsulfon-, 4-Brombenzol-sulfon-, Cyclohexylamidosulfon-, Trifluormethylsulfon-, Essig-, Oxal-, Wein-, Bernstein-oder Trifluoressigsäure in Frage.

Die Erfindung betrifft auch Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen wirksamen Gehalt an mindestens einer Verbindung der Formel I und/oder eines physiologisch verträglichen Salzes der Verbindung der Formel I und/oder eine gegebenenfalls stereoisomere Form der Verbindung der Formel I, zusammen mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Trägerstoff, Zusatzstoff und/oder anderen Wirk-und Hilfsstoffen.

Aufgrund der pharmakologischen Eigenschaften eignen sich die erfindungsgemäßen Verbindungen zur selektiven Prophylaxe und Therapie all solcher Erkrankungen, an deren Verlauf eine verstärkte Aktivität der Metalloproteinase 13 beteiligt ist. Dazu gehören degenerative Gelenkerkrankungen wie Osteoarthrosen, Spondylosen, Knorpelschwund nach Gelenktrauma oder längerer Gelenksruhigstellung nach Meniskus-oder Patellaverletzungen oder Bänderrissen. Ferner gehören dazu auch Erkrankungen des Bindegewebes wie Kollagenosen, Periodontalerkrankungen, Wundheilungsstörungen und chronische Erkrankungen des Bewegungsapparates wie entzündliche, immunologisch oder stoffwechselbedingte akute und chronische Arthritiden, Arthropathien, Myalgien und Störungen des Knochenstoffwechsels. Ferner eignen sich die Verbindungen der Formel I zur Behandlung der Ulceration, Atherosklerose und Stenosen. Weiterhin eignen sich die Verbindungen der Formel I zur Behandlung von Entzündungen, Krebserkrankungen, Tumormetastasenbildung, Kachexie, Anorexie und septischem Schock. Die genannten Erkrankungen können mit den erfindungsgemäß eingesetzten Verbindungen wesentlich spezifischer und mit einem kleineren Nebenwirkungsspektrum eingesetzt werden, weil im wesentlichen nur MMP-13 gehemmt wird.

Die Applikation der erfindungsgemäßen Arzneimittel kann durch orale, inhalative, rektale oder transdermale Applikation oder durch subkutane, intraartikuläre, intraperitoneale oder intravenöse Injektion erfolgen. Bevorzugt ist die orale Applikation.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels, das dadurch gekennzeichnet, dass man mindestens eine Verbindung der Formel I mit einem pharmazeutisch geeigneten und physiologisch verträglichen Träger und gegebenenfalls weiteren geeigneten Wirk-, Zusatz-oder Hilfsstoffen in eine geeignete Darreichungsform bringt.

Geeignete feste oder galenische Zubereitungsformen sind beispielsweise Granulate, Pulver, Dragees, Tabletten, (Mikro) Kapseln, Suppositorien, Sirupe, Säfte, Suspensionen, Emulsionen, Tropfen oder injizierbare Lösungen sowie Präparate mit protrahierter Wirkstoff-Freigabe, bei deren Herstellung übliche Hilfsmittel wie Trägerstoffe, Spreng-, Binde-, Überzugs-, Quellungs-, Gleit-oder Schmiermittel, Geschmacksstoffe, Süßungsmittel und Lösungsvermittler Verwendung finden. Als häufig verwendete Hilfsstoffe seien Magnesiumcarbonat, Titandioxid, Laktose, Mannit und andere Zucker, Talkum, Milcheiweiß, Gelatine, Stärke, Cellulose und ihre Derivate, tierische und pflanzliche Öle wie Lebertran, Sonnenblumen-, Erdnuß-oder Sesamöl, Polyethylen-glykol und Lösungsmittel wie etwa steriles Wasser und ein-oder mehrwertige Alkohole wie Glycerin, genannt.

Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Präparate in Dosierungseinheiten hergestellt und verabreicht, wobei jede Einheit als aktiven Bestandteil eine bestimmte Dosis der erfindungsgemäßen Verbindung der Formel I enthält. Bei festen Dosierungseinheiten wie Tabletten, Kapseln, Dragees oder Suppositorien, kann diese Dosis bis zu etwa 1000 mg, bevorzugt jedoch etwa 50 bis 300 mg und bei Injektionslösungen in Ampullenform bis zu etwa 300 mg, vorzugsweise aber etwa 10 bis 100 mg, betragen.

Für die Behandlung eines erwachsenen, etwa 70 kg schweren Patienten sind je nach Wirksamkeit der Verbindung gemäß Formel I, Tagesdosen von etwa 20 mg bis 1000 mg Wirkstoff, bevorzugt etwa 100 mg bis 500 mg indiziert. Unter Umständen können jedoch auch höhere oder niedrigere Tagesdosen angebracht sein. Die Verabreichung der Tagesdosis kann sowohl durch Einmalgabe in Form einer einzelnen Dosierungseinheit oder aber mehrerer

kleinerer Dosierungseinheiten als auch durch Mehrfachgabe unterteilter Dosen in bestimmten Intervallen erfolgen.

Endprodukte werden in der Regel durch massenspektroskopische Methoden (FAB-, ESI-MS) bestimmt, angegeben sind jeweils der Hauptpeak. Temperaturangaben in Grad Celsius, RT bedeutet Raumtemperatur (22 °C bis 26 °C). Verwendete Abkürzungen sind entweder erläutert oder entsprechen den üblichen Konventionen.

Nachfolgend ist die Erfindung an Hand von Beispielen näher erläutert.

Herstellungsbeispiele Die Herstellung der Verbindungen 1,3, 4 und 5 in Tabelle 1 erfolgte analog zu den in Beispiel 2 dargestellten Verfahrensweisen.

Beispiel 2 Stufe 1 : Herstellung von 2- (4'-Nitro-biphenyl-4-sulfonyl)-1, 2,3, 4-tetrahydro-isochinolin-3- (R)- carbonsäure 44,2 g (250 mmol) 1, 2, 3, 4-Tetrahydroisochinolinyl-3- (R)-carbonsäure wurden in 500 mi 1N wässriger Natronlauge gelöst und unter Rühren mit 150 g (300 mmol) 4, 4'-Nitrobiphenyl- sulfonylchlorid, gelöst in 500 ml Tetrahydrofuran, versetzt. Dabei wurde die Reaktionstemperatur auf unter 25 °C gehalten und der pH-Wert der Lösung wurde durch Zugabe von 1N NaOH auf pH 10 eingestellt. Das Reaktionsgemisch wurde 12 Stunden (h) bei Zimmertemperatur gerührt.

Zur Aufarbeitung wurde die Reaktionslösung über Celtes Klärschicht filtriert und anschließend wurde das Filtrat am Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck auf die Hälfte des ursprünglichen Volumens eingeengt. Die erhaltene Lösung wurde mittels Zugabe von 20% iger wässriger Citronensäurelösung auf pH 2 bis 3 angesäuert, wobei das Reaktionsprodukt als farbloser Feststoff ausfiel. Der erhaltene Feststoff wurde abfiltriert und im Vakuumtrockenschrank bei 40 °C getrocknet.

Man erhielt 77,9 g (71 % der Theorie, farbloser Feststoff)

Massenspektrum : ES) : [M + H+] : m/z= 439,4 Stufe 2 : Herstellung von 2 (4'-Nitro-biphenyl-4-sulfonyl)-1,2, 3, 4-tetrahydro-isochinolin-3- (R)- carbonsäuremethylester Zu einer Lösung von 65 ml Thionylchlorid (885 mmol) in 800 ml Methanol wurden bei einer Temperatur von-15 °C bis-10 °C 77, 5 g (177 mmol) der in Stufe 1 hergestellten Carbonsäure portionsweise zugegeben. Anschließend wurde 1 Stunde bei 25 oc sowie 1 Stunde bei 50 °C gerührt.

Zur Aufarbeitung wurde die Reaktionslösung unter reduziertem Druck eingeengt und mit 300 mi Dichlormethan und 300 ml gesättigter wässriger NaHCO3-Lösung verrührt. Die organische Phase wurde anschließend mit Wasser neutral gewaschen, über Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel unter reduziertem Druck entfernt. Das auf diese Weise erhaltene Rohprodukt (80 g, braunes Öl) wurde mittels Chromatographie an Kieselgel (40µ - 63µ) mit n- Heptan : Ethylacetat=2 : 1 als mobiler Phase gereinigt.

Man erhielt 27 g (34 % der Theorie (d. Th.), farbloses Öl) Massenspektrum : ESI : [M + H+] : m/z= 453,4 Stufe 3 : Herstellung von 2 (4'-Amino-biphenyl-4-sulfonyl)-1, 2,3, 4-tetrahydro-isochinolin-3- (R)- carbonsäuremethylester 53 g (117 mmol) der gemäß Stufe 2 hergestellten Nitroverbindung wurden in 1,5 1 einer 1 : 1 Mischung aus Tetrahydrofuran (THF) und Methanol gelöst, mit 1 g Pd (10 % auf Aktivkohle) versetzt und in einer Hydrierapparatur mit H2 bis zum Ende der H2-Aufnahme hydriert (Wasserstoffverbrauch 7. 21).

Zur Aufarbeitung wurde der Katalysator über Celtes Klärschicht filtriert und das Filtrat am Rotationsverdampfer unter reduziertem Druck eingeengt. Der ölige Rückstand wurde in Dichlormethan aufgenommen, über Na2SO4 getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter

reduziertem Druck entfernt. Das auf diese Weise erhaltene Rohprodukt wurde aus Diethylether umkristallisiert.

Man erhielt 45,7 g (93 % d. Th., farbloser Feststoff) Massenspektrum : ESI : [M + H+] : m/z= 423, 4 Stufe 4 : Herstellung von 2 (4'-Isopropoxycarbonylamino-biphenyl-4-sulfonyl)-1, 2,3, 4- tetrahydro-isochinolin-3- (R)-carbonsäuremethylester 16,9 g (40 mmol) der Verbindung aus Stufe 3 wurden in 200 mi absoluten Dichlormethan gelöst und unter Rühren bei-70 °C bis-60 OC nacheinander mit 4,9 ml Pyridin (60 mmol) sowie 44 ml (44 mmol) Chlorameisensäureisopropylester versetzt. Anschließend wurde 3 h bei dieser Temperatur gerührt. Zur Aufarbeitung wurde das Reaktionsgemisch bei 0 oc mittels Zugabe von 10 ml Wasser hydrolysiert. Nach Abtrennung der organischen Phase wurde diese neutral gewaschen, mit Na2S04 getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter verminderten Druck am Rotationsverdampfer entfernt. Der so erhaltene Rückstand kristallisierte nach Zugabe von 100 ml n-Pentan in Form lachsfarbener Kristalle aus.

Man erhielt 20, 1g (98 %, lachsfarbene Kristalle) Massenspektrum : ESI : [M + H+] : m/z= 509,5 Stufe 5 : Herstellung von 2 (4'-Isopropoxycarbonylamino-biphenyl-4-sulfonyl)-1, 2,3, 4- tetrahydro-isochinolin-3- (R)-carbonsäure 20 g des gemäß Stufe 4 hergestellten Carbonsäureesters (39,4 mmol) wurden in 200 ml THF gelöst und bei 25 oc mit 48 ml 1 M wässriger LiOH-Lösung versetzt. Die Reaktionslösung wurde 3 h bei 25 °C gerührt.

Anschließend wurde das Reaktionsgemisch unter verminderten Druck eingeengt, der Rückstand in 750 ml Wasser aufgenommen, über Celtes Klärschicht unter Zusatz von Aktivkohle filtriert und die Mutterlauge mittels wässriger Zitronensäure angesäuert. Das ausgefallene Reaktionsprodukt wurde filtriert und mittels Chromatographie an Kieselgel (40 u

- 63 p) unter Verwendung von Dichlormethan : Methanol im Verhältnis 9 : 1 als mobiler Phase gereinigt.

Man erhielt 14,1 g (72 % d. Th, farbloser Feststoff) Massenspektrum : ESI : [M + H+] : m/z= 495. 2 Beispiel 6 Stufe 1 : 5- (4'-Nitro-biphenyl-4-sulfonyl)-1-methyl-4, 5,6, 7-tetrahydro-1 H-imidazo [4,5- c] pyridine-6-carbonsäure 2 g 1-Methylspinacin (9,19 mmol) wurden in 15 mi Wasser gelöst und bei 0 °C mit 3 Äquivalenten einer 3 N NaOH-Lösung (9,19 ml) versetzt. Nach 10 Minuten (min) tropft man eine Lösung des 4'-Nitro-biphenyl-4-sulfonylchlorids (2,74g, 9,19 mmol) in Acetonitril langsam zu, nach dem Erreichen der Raumtemperatur wird der Ansatz noch für 12 h gerührt. Das Rohprodukt wurde chromatographisch gereinigt.

Man erhielt 1,9 g (47 % d. Th, farbloser Feststoff) Massenspektrum : ESI : [M + H+] : m/z= 443 Stufe Z : 5- (4'-Amino-biphenyl-4-sulfonyl)-1-methyl-4, 5,6, 7-tetrahydro-1 H-imidazo [4,5- c] pyridine-6-carbonsäure 1 g (2,3 mmol) 5- (4'-Nitro-biphenyl-4-sulfonyl)-1-methyl-4, 5,6, 7-tetrahydro-1H-imidazo [4,5- c] pyridin-6-carbonsäure wurde in 15 ml Dimethylformamid (DMF) gelöst, mit 0,1 g Hydrierkatalysator (10% Pd auf Aktivkohle) versetzt und innerhalb von 2 h quantitativ hydriert.

Nach der Entfernung des Lösungsmittels wurde das Rohprodukt chromatographisch gereinigt.

Man erhielt 0,74 g (78 % d. Th, farbloser Feststoff) Massenspektrum : ESI : [M + H+] : m/z= 413 Stufe 3 : 5- (4'-Alkoxycarbonylamino-biphenyl-4-sulfonyl)-1-methyl-4, 5,6, 7-tetrahydro-1H- imidazo [4, 5-c] pyridine-6-carbonsäuren

Man löste 500 mg (1. 2 mmol) 5- (4'-Amino-biphenyl-4-sulfonyl)-1-methyl-4, 5,6, 7-tetrahydro-1 H- imidazo- [4, 5- c] pyridine-6-carbonsäure in 3 ml DMF, kühlte im Eisbad auf 0 °C ab und fügte 2,4 mmol Pyridin hinzu. Nach 15 min Rühren bei 0 °C erfolgte die Zugabe von 1,8 mmol Chlorameisensäureisopropylester. Die Reaktionslösung wurde anschließend noch für 2 h bei Raumtemperatur gerührt. Die Aufreinigung des Rohprodukts erfolgte mit Hilfe chromatographischer Methoden.

Man erhielt 0,38 g (64 % d. Th, farbloser Feststoff) Massenspektrum : ESI : [M + H+] : m/z= 499 Die Herstellung der Verbindungen 7 bis 10 in Tabelle 1 erfolgte analog zu den in Beispiel 6 dargestellten Verfahrensweisen.

Tabelle 1 Beispiel, Struktur MS (ESI+) 1 CD Chiral 481 -"li-_ o _ N O J asz zon zu l, N ouzo °' .. I°o choral CN O , S 7 '- 0 _ r o N O- 3 0 537 ... 0 o S O \ NO 4 509 N 9 1/N ; s'o o' w o N O 5 C) 507 6 499 6 499 L Õ N J1 O' zozo 499 '6499 N zu .,.. % O O O 7 547 cl H N--2 \ 513 0 0 0-9 N-- ( 0 8 527 '' 0- NN_S : O O 9 513 C02H g-513 N C02H zozo N 0 O 10 511 N N 0 in Zu /\ N

Pharmakologische Beispiele Darstellung und Bestimmung der enzymatischen Aktivität der katalytischen Domäne des humanen Stromelysins (MMP 3) und der Neutrophilen-Kollagenase (MMP8).

Die beiden Enzyme-Stromelysin (MMP-3) und Neutrophilen-Kollagenase (MMP-8) -wurden dargestellt nach Ye et al. (Biochemistry ; 31 (1992) Seiten 11231-11235). Zur Messung der

Enzymaktivität oder der Enzyminhibitorwirkung werden bei physiologischem pH 70 NI Pufferlösung, und 10 ul Enzymlösung mit 10 ul einer 10% igen (v/v) wässrigen Dimethylsulfoxid- Lösung, die gegebenenfalls den Enzyminhibitor enthält, für 15 Minuten inkubiert. Nach Zugabe von 10 ul einer 10% igen (v/v) wässrigen Dimethylsulfoxid-Lösung, die 1 mol/1 des Substrates enthält, wird die Enzymreaktion fluoreszenzspektroskopisch verfolgt (328 nm (ex)/ 393 nm (em)).

Die Enzymaktivität wird dargestellt als Extinktionszunahme/Minute. Die in Tabelle 2 aufgeführten Iso-werte werden als diejenige Inhibitorkonzentrationen ermittelt, die jeweils zu einer 50% igen Inhibierung des Enzyms führen.

Die Pufferlösung enthält 0,05 % Brij (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) sowie 0,1 mol/1 Tris/HCI, 0,1 mot/1 NaCI, 0,01 mol/l CaCI2 und 0,1 mol/1 Piperazin-N, N'-bis [2-ethan-sulfonsäure] (pH=7, 5).

Die Enzymlösung enthält 5 ug/ml einer der nach Ye et al. dargestellten Enzymdomänen. Die Substratlösung enthält 1 mmol/l des fluorogenen Substrates (7-Methoxycoumarin-4-yl) acetyl- Pro-Leu-Gly-Leu-3- (2', 4'-dinitrophenyl)-L-2, 3-diaminopropionyl-Ala-Arg-NH2 (Bachem, Heidelberg, Deutschland).

Bestimmung der enzymatischen Aktivität der katalytischen Domäne der humanen Kollagenase - 3 (MMP-13).

Dieses Protein wird als inaktives Pro-Enzym von der Fa. INVITEK, Berlin, erhalten (Katalog Nr.

30 100 803). Aktivierung des Proenzyms : 2 Volumenanteile Proenzym werden mit 1 Volumenanteil APMA-Lösung bei 37 °C für 1,5 Stunden inkubiert. Die APMA-Lösung wird aus einer 10 mmol/L p-Aminophenyl-Mercuric Acetate Lösung in 0,1 mmol/L NaOH durch Verdünnen mit 3 Volumenteile Tris/HCI Puffer pH7,5 (siehe unten) hergestellt. Der pH-Wert wird durch Zugabe von 1mmol/L HCI zwischen 7,0 und 7,5 eingestellt. Nach der Aktivierung des Enzyms wird dieses mit dem Tris/HCI Puffer auf eine Konzentration von 1, 67 pg/mL verdünnt.

Zur Messung der Enzymaktivität werden 10 uL Enzymlösung mit 10 uL einer 3% igen (v/v) gepufferten Dimethylsulfoxid-Lösung (Reaktion 1) für 15 Minuten inkubiert. Zur Messung der

Enzyminhibitoraktivität werden 10, uL Enzymlösung mit 10 pL einer 3% igen (v/v) gepufferten Dimethylsulfoxid-Lösung, die den Enzyminhibitor enthält, inkubiert (Reaktion 2).

Sowohl bei Reaktion 1 als auch bei Reaktion 2 wird nach Zugabe von 10 uL einer 3% igen (v/v) wässrigen Dimethylsulfoxid-Lösung, die 0,75 mmol/L des Substrates enthält, die Enzymreaktion fluoreszenzspektroskopisch verfolgt (328 nm (Extinktion) /393 nm (Emission)).

Die Enzymaktivität wird dargestellt als Extinktionszunahme/Minute.

Die Inhibitorwirkung wird als prozentuale Hemmung nach folgender Formel berechnet : % Hemmung = 100- [ (Extinktionszunahme/Minute in Reaktion 2)/ (Extinktionszunahme/Minute in Reaktion 1) x 100].

Der IC50, d. h. die für eine 50% ige Hemmung der Enzymaktivität erforderliche Inhibitorkonzentration wird grafisch durch Auftragen der prozentualen Hemmungen bei verschiedenen Inhibitorkonzentrationen ermittelt.

Die Pufferlösung enthält 0,05% Brij (Sigma, Deisenhofen, Deutschland) sowie 0,1 mol/L Tris/HCI, 0,1 mol/L NaCl, 0,01 mol/L CaCl2 (pH=7, 5).

Die Enzymlösung enthält 1, 67 ug/mL der Enzymdomäne.

Die Substratlösung enthält 0,75 mmol/L des fluorogenen Substrates (7-Methoxycoumarin-4- yl) acetyl-Pro-Leu-Gly-Leu-3- (2', 4'-dinitrophenyl)-L-2, 3-diaminopropionyl-Ala-Arg-NH2 (Bachem, Heidelberg, Deutschland).

Die nachfolgende Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse.

Tabelle 2 Beispiel MMP 3 MMP 8 MMP 13 Nr. fC5o (nM) Cso (nM)) C5o (nM) 1 3000 2300 40 2 3000 6000 30 3>10000200070 2000. 3000 20 5 3000 4000 20 6 10000 4000 80 7 >10000 1000 60 >10000 5000 70 9 10000 200 60 10 >10000 700 20

Vergleichsbeispiele Die folgenden in Tabelle 3 genannten Verbindungen wurden wie in WO 97/18194 beschrieben hergestellt.

Tabelle 3 : Beispiel Struktur MMP 131) MMP 32) MMP 82) Nr. (nM) (nM) (nM) 34 0 50 500 10 " O n_e w i 35 O 30 100 5 X \ 0 /\ 39 0 2, 9 100 1 ", ILOH \ I NSO N 0 1) Die Bestimmung erfolgte wie oben beschrieben 2) und 3) Die Daten wurden der WO 97/18194 entnommen Die Tabelle 3 zeigt, dass strukturell ähnliche Verbindungen aus dem Stand der Technik keine Selektivität bei der Inhibition nur gegen MMP 13 aufweisen.