Campo de la técnica

La presente invención se refiere a decapéptidos cíclicos que tienen pro- piedades inhibidoras del crecimiento celular, en particular inhiben el crecimiento de diversas líneas celulares tumorales.

Estado de la técnica anterior

Los péptidos están cobrando cada vez más importancia como fármacos. Es bien conocido que péptidos aislados de la naturaleza o análogos de los mismos presentan una considerable actividad inhibidora del crecimiento celular.

Por ejemplo en el artículo de Ali et al., Solid-Phase Total Synthesis of Cyclic Decapeptide Phakellistatin 12, J. Nat. Prod., 2008, 71(6), 1059-1062, se describe que el decapéptido cíclico Phakellistatin 12 de origen natural, ciclo(IFTLPPYIPP), es un compuesto que inhibe el crecimiento de células cancerosas.

En el artículo de Montgomery et al., Didemnin B: a new immunosuppres- sive cyclic peptide with potent activity in vitro and in vivo, Transplantation, 1985, 40(1), 49-56, se describe el heptapéptido cíclico Didemnin B de origen marino que presenta efectos antiproliferativos frente a líneas celulares cancerosas.

En el artículo de Meier et al., Somatostatin analog (octreotide) in clinical use: current and potential indications, Schweiz Med. Wochenshr., 1992, 122(25), 957- 968, se describe un octapéptido cíclico que también tiene un efecto antiproliferativo.

En el artículo de Pettit et al., Isolation and Structure of Stylostatin 1 from the Papua New Guinea Marine Sponge Stylotella aurantium, J. Org. Chem., 1992, 57(26), 7217-7220, se describe un cicloheptapéptido aislado de una esponja que tiene la estructura ciclo(LAIPFNS) y que presenta propiedades inhibidoras del crecimiento de células de leucemia.

En el artículo de Forns et al., Constrained derivatives of Stylostatin 1. 1. Synthesis and Biological Evaluation as Potential Anticancer Agents, J. Med. Chem., 2003, 46(26), 5825-5833, se describe el heptapéptido cíclico Stylostatin 1 y unos análogos sintéticos, que presentan un efecto inhibidor del crecimiento de líneas celulares cancerosas. En el artículo de Gbankoto et al., Cytotoxic Effect of Laxaphycins A and B on Human Lymphoblastic Cells (CCRF-CEM) Using Digitised Videomicrofluorome- try, In vivo, 2005, 19(3), 577-582, se describe que el tridecapéptido cíclico Laxaphycin B posee un efecto citotóxico significativo e inhibe la división celular y el crecimiento de células cancerosas humanas.

En la solicitud de patente europea EP-A-0894092, se describe un hepta- péptido cíclico, Trunkamide A, aislado de Lissoclinum sp., que presenta propiedades antitumorales frente a líneas celulares de tumores humanos.

En la solicitud de patente PCT WO-A-2005/034982, se describen penta- péptidos cíclicos derivados del péptido natural Sansalvamide A que presentan mejores propiedades antitumorales que el compuesto natural.

Sin embargo los productos naturales y sus derivados presentan ciertas desventajas, tales como una solubilidad insuficiente en disolventes acuosos, o deben obtenerse mediante procedimientos sintéticos complejos. Además, en algunas ocasiones también presentan una vida media corta y la incapacidad de ser administrados por vía oral debido a la proteólisis en el tracto gastrointestinal.

Subsiste pues la necesidad de disponer de compuestos que presenten una actividad inhibidora del crecimiento de células cancerosas, que sean fáciles de sintetizar, que presenten una cierta resistencia a la degradación por proteasas y que sean solubles en disolventes acuosos.

Los autores de la presente invención han desarrollado péptidos que resultan de fácil preparación, que presentan actividad inhibidora del crecimiento de células cancerosas y son solubles en disolventes acuosos.

Objeto de la invención

El objeto de la presente invención es el uso de péptidos cíclicos definidos por una fórmula específica para preparar un medicamento para inhibir el crecimiento celular.

Forma parte también del objeto de la invención dichos péptidos cíclicos para uso como inhibidores del crecimiento celular.

También forma parte del objeto de la invención el uso de dichos péptidos para preparar un medicamento para el tratamiento o profilaxis de tumores. Forma parte también del objeto de la invención dichos péptidos cíclicos para uso en el tratamiento o profilaxis de tumores.

Figuras

En la Figura 1 se presentan los resultados del ensayo de inmunoblot y densitometría del efecto de los péptidos sobre la ruta de supervivencia (señalización celular) de las MAPK (Mitogen Activated Phosphorilated Kinases), en concreto de la fosfo-ERKl/2. Las bandas de proteínas se han normalizado respecto al control. Los péptidos BPC88, BPC98 y BPC194 no muestran actividad bloqueadora de ERK1/2. Por el contrario, BPC96 y BPC198 bloquean la fosforilación (activación) de ERK 12h posttratamiento de las células de carcinoma de cérvix con los compuestos. Las bandas de actina corresponden a un control de carga.

En la Figura 2 se presentan los resultados de inmunoblot y densitometría del efecto de los péptidos de la invención sobre PARP (poli(ADP-ribosa)polimerasa) y p53. Los péptidos BPC96, BPC98, BPC194, BPC198 muestran claramente actividad apoptótica en células de carcinoma de cérvix puesto que, respecto a las células control, la rotura de PARP y posterior aparición del fragmento escindido (banda de 89 kD) es evidente en todos los péptidos anteriormente citados. Es importante subrayar que la actividad apoptótica ya se detecta 12h post-tratamiento de las células tumorales con los nuevos compuestos. Las células HeLa expresan constitutivamente p53wt (http://p53.free.fr/p53_info/p53_info.html). Los resultados del western blot de p53 muestran que los péptidos BPC88 y BPC96, debido a su actividad citotóxica, han producido un aumento de la proteína p53, producto del gen supresor de tumores p53. Descripción detallada de la invención

En el artículo de Monroc et al., Impr vement of cyclic decapeptides against plant pathogenic bacteria using a combinatorial chemistry approach, Peptides, 2006, 27(1 1), 2575-2584, se describen decapéptidos cíclicos que son activos frente a bacterias patógenas para las plantas como son Erwinia amylovora, Pseudomonas syrin- gae y Xanthomonas vesicatoria.

Los autores de la presente invención han descubierto un grupo de dichos péptidos que presenta actividad inhibidora del crecimiento celular, en particular inhiben el crecimiento de células cancerosas, y que son apropiados para la preparación de un medicamento para el tratamiento o profilaxis de tumores.

Péptidos

El objeto de la presente invención es el uso de péptidos cíclicos que responden a la fórmula general (I):

en donde: Χ', Χ ² , X ³ y X ⁴ son indistintamente K o L

para preparar un medicamento para inhibir el crecimiento celular.

En una realización preferida, los péptidos de la invención se emplean para preparar un medicamento para inhibir el crecimiento de células cancerosas. En una realización preferida, los péptidos de la invención se emplean para preparar un medicamento para el tratamiento o profilaxis de tumores.

En el contexto de esta descripción se entiende por "medicamento para in- hibir el crecimiento de células cancerosas" aquel medicamento que inhibe la proliferación de las células de un tumor.

El término "tumor" se refiere a un tejido que comprende células que crecen de forma incontrolada, esto es, hiperproliferativamente. Los tumores incluyen leucemias, linfomas, mielomas, plasmacitomas, y similares; así como tumores sólidos. Ejemplos de tumores sólidos incluyen por ejemplo melanoma, fibrosarcoma, mixosar- coma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogénico, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing's, carcinoma de colon, carcinoma de las glándulas sebáceas, carcinoma de células escamosas, adenocarcinoma, tumor testicular, carcinoma epitelial y retino- blastoma, así como aquellos propios del cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, cáncer de piel, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de cuello de útero, cáncer de pulmón y cáncer de vejiga.

También forma parte del objeto de la invención dichos péptidos cíclicos para uso como inhibidores del crecimiento celular.

En una realización preferida, los péptidos cíclicos son para uso como in- hibidores del crecimiento de células cancerosas.

En una realización preferida, los péptidos cíclicos son para uso en el tratamiento o profilaxis de tumores. El término "ciclo" que se encuentra al principio de la secuencia de aminoácidos en la fórmula general (I) significa que el péptido es cíclico, de modo que el grupo α-carboxílico del aminoácido Q está unido mediante un enlace peptídico con el grupo α-amino del primer aminoácido X _\ .

En la fórmula (I) los aminoácidos se representan mediante una única letra de acuerdo con la Comisión para la Nomenclatura Bioquímica de la IUPAC-IUB, según se describe en el libro Biochemical Nomenclature and Related Documents, 2nd edition, Portland Press, 1992, Londres [ISBN 1-85578-005-4] y que es bien conocida por el experto en la materia.

Según dicha nomenclatura, la letra K representa el aminoácido L-lisina, que también se puede abreviar mediante el código de tres letras como Lys, la letra L el aminoácido L-leucina (Leu), la letra F el aminoácido L-fenilalanina (Phe), la letra Q el aminoácido L-glutamina (Gln).

En los péptidos de la invención todos los aminoácidos tienen la configuración L.

Los péptidos que pertenecen a este grupo inhiben el crecimiento celular y, por tanto, resultan apropiados para ser empleados para preparar medicamentos cito- tóxicos, en particular para preparar medicamentos que inhiben el crecimiento de células cancerosas, y en particular para preparar medicamentos para el tratamiento o profilaxis de tumores.

Los péptidos de la invención se presentan en la Tabla I:

TABLA I

SEQ ID NO: Referencia Péptido

1 BPC088 Ciclo(KKLLKFKKLQ)

2 BPC202 Ciclo( KKKKFKKLQ)

3 BPC190 Ciclo(LKK KFK LQ)

4 BPC198 Ciclo(KLKKKFKKLQ)

5 BPC098 Ciclo(LLKKKFKKLQ)

6 BPC194 Ciclo( KLKKFKKLQ) 7 BPC096 Ciclo(LKL KFKKLQ)

8 BPC094 Ciclo(KLLK FKKLQ)

9 BPC188 Ciclo(LLLK FKKLQ)

10 BPC186 Ciclo(KKKLKF KLQ)

1 1 BPC092 Ciclo(LK L FKKLQ)

12 BPC090 Ciclo(KLKLKFKKLQ)

13 BPC196 Ciclo(LLKLKFKKLQ)

14 BPC192 Ciclo(LKLL FKKLQ)

15 BPC184 Ciclo(KLLLKF KLQ)

16 BPC200 Ciclo(LLLLKFKKLQ)

Resultan preferidos los péptidos cíclicos que tienen la estructura definida por las secuencias SEQ ID NO: 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8, y 15; más preferidos los péptidos definidos por las secuencias SEQ ID NO: 1, 4, 5, 6, y 7.

Una característica de los péptidos de la invención es su estructura cíclica. Según se describe en WO-A-98/03192, los péptidos cíclicos son más resistentes a los procesos proteolíticos en comparación con sus homólogos lineales. De este modo la vida media de los péptidos cíclicos en el cuerpo humano es más larga que la de los lineales. Este hecho no se traduce en una persistencia negativa en el medio ambiente, ya que dichos péptidos acaban degradándose finalmente por las rutas biológicas habituales.

Los péptidos descritos en la invención tienen 10 aminoácidos, y son apropiados para ser preparados empleando los procedimientos habituales de síntesis de péptidos en fase sólida como los descritos por R. B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 1963, 85, 2149-2154. Entre dichos procedimientos se pueden mencionar:

el procedimiento que usa la resina 4-metilbencidrilamina (MBHA) funcionaliza- da con grupos amino, como soporte sólido para llevar a cabo las reacciones sucesivas de acoplamiento entre los diferentes aminoácidos que integran el péptido y la etapa de ciclación, y - el procedimiento Multipin , en el que se emplean las SynPhase Lantems comercializadas por la empresa Mimotopes (Australia). En la página web http://www.mimotopes.com/, se puede encontrar información sobre dicha técnica.

Ambos procedimientos son bien conocidos por el experto en la materia y se encuentran descritos por ejemplo en S.A.Kates, F.Albericio Eds., Solid-Phase Synt- hesis. A practica! guide, Marcel Dekker, New York, 2000 (ISBN: 0-8247-0359-6), o en K. Burguess Eds., Solid-Phase Organic Synthesis, Wiley, John & Sons, New York, 1999 (ISBN: 0471318256).

Cuando se emplea la resina MBHA como soporte sólido, habitualmente se incorpora a la resina un espaciador bifuncional sensible al medio ácido, que permite el desanclaje del péptido sintetizado en condiciones suaves.

Por ejemplo un espaciador bifuncional apropiado es el Fmoc-Rink- Linker (número CAS: 145469-56-3) comercializado por la empresa Iris Biotech (Alemania).

Dicho espaciador, una vez se ha unido con su grupo carboxílico a un grupo amino de la resina MBHA, y se ha eliminado el grupo protector Fmoc, presenta un grupo amino libre que permite el anclaje de un aminoácido que tenga un grupo carboxílico libre.

En el mercado se puede adquirir la resina Fmoc-Rink-MBHA en la empresa Iris Biotech, que ya tiene incorporado el espaciador mencionado.

Si el aminoácido tiene un grupo carboxílico libre en la cadena lateral, como por ejemplo el ácido glutámico o el ácido aspártico, entonces se puede unir al soporte sólido a través de dicha cadena lateral, manteniendo disponibles el otro grupo carboxílico y el grupo amino para la formación de nuevos enlaces peptídicos.

Preferiblemente se emplea la resina MBHA funcionalizada con grupos amino, como soporte sólido para llevar a cabo las reacciones sucesivas de acoplamiento entre los diferentes aminoácidos que integran el péptido y la etapa de ciclación.

En dicho procedimiento se utiliza la química del grupo Fmoc (9- fluorenilmetoxicarbonilo) como protector del grupo α-amino de los aminoácidos que se emplean para preparar los péptidos de la invención. Un procedimiento para la preparación de los péptidos de la invención puede ser por ejemplo el que se describe a continuación.

En la primera etapa se procede al anclaje del ácido glutámico a la resina, a través del grupo carboxílico libre de su cadena lateral. Los otros dos grupos reactivos del ácido glutámico se mantienen protegidos para evitar reacciones secundarias: por ejemplo, el grupo α-carboxílico en forma de éster alílico, y el grupo α-amino protegido por el grupo Fmoc.

A continuación se elimina el grupo protector Fmoc del grupo a-amino del ácido glutámico, y se incorpora el siguiente aminoácido del péptido que tiene el grupo α-amino protegido por el grupo Fmoc. El enlace se establece entre el grupo carboxílico del nuevo aminoácido y el grupo amino del ácido glutámico.

Este proceso de eliminación del grupo protector Fmoc y la incorporación del nuevo aminoácido se repite hasta que se completa un péptido con una estructura lineal.

En el caso del aminoácido lisina, el grupo amino de la cadena lateral está protegido por el grupo Boc (t-butiloxicarbonilo), que es estable a las condiciones de eliminación del grupo Fmoc.

Una vez finalizados los acoplamientos se elimina el éster alílico que protege el grupo α-carboxílico del ácido glutámico, y se elimina el grupo Fmoc que protege el grupo α-amino del último aminoácido incorporado.

Seguidamente se procede a la ciclación entre el grupo α-carboxílico del ácido glutámico y el grupo α-amino del último aminoácido incorporado. De esta forma se obtiene un péptido cíclico unido a la resina.

La escisión del péptido del soporte sólido se realiza en condiciones áci- das e implica la ruptura del enlace entre el grupo amino y el grupo bencidrilo del linker, conduciendo a la formación del residuo de glutamina (Q), que se encuentra presente en los péptidos de la invención, como se puede observar en la fórmula general (I). Al mismo tiempo que se libera el péptido del soporte sólido se eliminan los grupos Boc de los residuos de lisina.

Tras un proceso convencional de aislamiento, los péptidos de la invención se obtienen con un buen rendimiento, habitualmente comprendido entre el 70% y el 80%, en forma de sólidos pulverulentos, y se caracterizan mediante análisis por HPLC, y espectrometría de masas (ESI-MS, MALDI-TOF o FAB-MS).

Sorprendentemente se ha comprobado que los péptidos de la invención inhiben el crecimiento de células, en particular el crecimiento de células cancerosas y, por tanto, pueden ser empleados para preparar un medicamento para el tratamiento o profilaxis de tumores.

Ensayos biológicos

La actividad inhibidora del crecimiento celular de los péptidos de la in- vención frente a una línea celular tumoral de origen mamario que se describe a continuación se ha evaluado mediante la determinación del porcentaje (%) de inhibición del crecimiento celular a una concentración de 40 μΜ.

También se ha determinado la concentración de péptido necesaria para inhibir el 50% del crecimiento celular de diversas líneas tumorales descritas a continua- ción. Habitualmente dicha concentración se denomina IC ₅₀ y se expresa en μΜ.

Estos tipos de ensayos son habituales en microbiología y son bien conocidos por el experto en la materia. Una descripción de la metodología empleada se encuentra por ejemplo en: Brüggemann et al, Ifosfamide cytotoxicity on human tumor and renal cells: role of chloroacetaldehyde in comparison to 4-hydroxyifosfamide. Cáncer Res. 1997, 57(13), 2676-2680; o en Puig et al, Fatty acid metabolism in breast cáncer cells: differential inhibitory effects of epigallocatechin gállate (EGCG) and C75. Breast Cáncer Research and Treatment 2008, 109(3), 471-479.

Para evaluar el efecto inhibidor del crecimiento de células cancerosas de los péptidos de la invención se emplearon las siguientes líneas celulares:

- MDA-MB-231 ATCC/HTB-26 (American Type Culture Collection),

- HeLa ATCC/CCL-2 (Eucellbank, Universidad de Barcelona, España),

- PANC-1 ATCC/CRL-1469 (Eucellbank, Universidad de Barcelona, España),

- HepG2 HB-8065 (Eucellbank, Universidad de Barcelona, España) ,

- A431 CRL-2592 (Eucellbank, Universidad de Barcelona, España), y

Las líneas celulares mencionadas resultan ser indicadores apropiados para determinar la actividad de los compuestos frente a tumores. La línea celular MDA-MB-231 es una línea celular tumoral de origen mamario. Estas células fueron aisladas de una paciente caucásica de 51 años y poseen una morfología epitelial. El tipo de tumor que desarrolla es adenocarcinoma y su crecimiento en cultivo es de tipo adherente. Para su proliferación en cultivo requieren del medio DMEM (Medio Eagle's modificado de Dulbecco) + 10% FBS (suero fetal bovino) y unas condiciones de 37° C y 5% C0 ₂ .

La línea celular HeLa es una línea de células epiteliales humanas procedentes de un carcinoma de cuello uterino. Fueron las primeras células humanas de las cuales se estableció una línea celular en 1951. Proceden de la paciente Henrietta Lacks, de ahí su nombre, una mujer afroamericana de 31 años. Se cultivan en DMEM + 10% FBS y unas condiciones de 37° C y 5% C0 ₂ .

La línea celular HepG2 es una línea celular procedente de tejido hepático de un chico caucásico de 15 años de edad con carcinoma hepático diferenciado. Estas células son epiteliales y en cultivo proliferan adheridas a la superficie. Se cultivan en DMEM + 10% FBS y unas condiciones de 37° C y 5% C0 ₂ .

La línea celular A431 , originada a partir de un carcinoma escamoso, fue establecida a partir de un tumor sólido de una mujer de 85 años. Son células similares a las epiteliales, adherentes y que crecen en monocapa. Además se caracterizan por sobre- expresar el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR). Se cultivan en DMEM + 10% FBS y unas condiciones de 37° C y 5% C0 ₂ .

La línea celular PANC-1 es una línea celular procedente de un adenocarcinoma pancreático de tipo epitelial. Estas células crecen de forma adherente y requieren de DMEM + 10% FBS y unas condiciones de 37° C y 5% C0 ₂ para su cultivo en el laboratorio.

Los detalles de la experimentación se describen en el apartado de Ejemplos.

En uno de los ensayos se determinó la actividad inhibidora del crecimiento de células cancerosas como el porcentaje (%) de inhibición del crecimiento celular de la línea celular MDA-MB-231 frente a una concentración 40 μΜ de los péptidos de la invención, y se observó que los péptidos de la invención inhiben el crecimiento celular de la línea celular tumoral de origen mamario MDA-MB-231. Como se verá en el apar- tado de Ejemplos, algunos de ellos llegan a una inhibición igual o superior al 50% a una concentración de 40 μΜ.

En otro ensayo se determinó la actividad citotóxica de los péptidos preferidos frente a las líneas de células tumorales mencionadas anteriormente. De los resulta- dos obtenidos se puede concluir que los péptidos de la invención presentan una considerable actividad inhibidora del crecimiento de estas células. Excepto en el caso del pépti- do BPC196 frente a la línea celular HepG2, todos los péptidos fueron activos a las concentraciones ensayadas frente a todas las líneas celulares con unos valores de IC50 comprendidos entre 18,5 y 57,5 μΜ.

En el caso de las células HeLa, cinco péptidos presentaron un valor de

IC ₅₀ igual o inferior a 30 μΜ, siendo esta línea celular la más susceptible frente a los péptidos de la invención.

El péptido BPC094 es el más activo frente a todas las líneas celulares ensayadas con un IC ₅₀ comprendido entre 18,5 y 23 μΜ.

El péptido BPC088 también es activo frente a todas las líneas celulares ensayadas, pero a concentraciones más elevadas (ICso comprendido entre 22,5 y 32,5 μΜ).

También se identificaron péptidos selectivos frente a una línea celular cancerosa: los péptidos BPC096 y BPC184 muestran selectividad frente a las células de HeLa y A431 respectivamente con un IC ₅₀ de 24,5 μΜ.

Se ha comprobado además que los péptidos de la invención tienen un efecto apoptótico en las células de carcinoma de cérvix. Por ello se realizó el análisis de la rotura de PARP, enzima final de la ruta de las caspasas, que se fragmenta en procesos apoptóticos. Además, se analizó el efecto de los péptidos seleccionados sobre la activa- ción (fosforilación) de una de las proteínas clave de la ruta de señalización celular de las MAPK (p-ERKl/2) y sobre el producto del factor de transcripción p53 (gen supresor tumoral). Una descripción de la metodología utilizada se encuentra en Puig et al, Breast Cáncer Research and Treatment, 2008, 109, 471-479.

Como se observa en la Figura 1 , los péptidos BPC88, BPC98 y BPC194 no muestran actividad bloqueadora de ERK1/2. Por el contrario, BPC96 y BPC198 bloquean la fosforilación (activación) de ERK 12h post-tratamiento de las células de carcinoma de cérvix con los compuestos. Como se observa en la Figura 2, los péptidos BPC96, BPC98, BPC194, BPC198 muestran claramente actividad apoptótica en células de carcinoma de cérvix puesto que, respecto a las células control, la rotura de PARP y posterior aparición del fragmento escindido (banda de 89 kD) es evidente en todos los péptidos anteriormente citados. Es importante subrayar que la actividad apoptótica ya se detecta 12h posttratamiento de las células tumorales con los nuevos compuestos. Las células HeLa expresan constitutivamente p53wt (http://p53.free.fr/p53_info/p53_info.html). Los resultados del western blot de p53 muestran que los péptidos BPC88 y BPC96 debido a su actividad citotóxica han producido un aumento de la proteína p53, producto del gen supresor de tumores p53.

De los resultados obtenidos se puede concluir que los péptidos de la invención presentan una considerable actividad inhibidora del crecimiento de células tumorales de características diversas.

La actividad hemolítica de los péptidos es una característica que gene- raímente se analiza para determinar su grado de toxicidad. La mencionada actividad hemolítica se ha evaluado mediante la determinación de la liberación de hemoglobina que se produce al poner en contacto una solución de dichos péptidos en tampón de TRIS con suspensiones de eritrocitos al 5% en volumen volumen procedentes de sangre humana fresca. El resultado de dicha determinación se expresa como el porcentaje de hemolisis que se produce para una determinada concentración de péptido. Una descripción de la metodología empleada para la determinación de la actividad hemolítica se encuentra en Oren et al, Biochemistry, 2000, 39, 6103-61 14, y en Raguse et al, J. Am. Chem. Soc, 2002, 124, 12774-12785.

Se ha comprobado que los péptidos de la invención presentan una activi- dad hemolítica que se puede clasificar como baja, ya que la mayoría de ellos presentan un porcentaje de hemolisis inferior al 33% a 375 μΜ. Se observa, pues, que los péptidos presentan hemolisis bajas incluso a una concentración entre 6 y 21 veces superior a la cual son activos para inhibir el crecimiento celular.

La estabilidad de los péptidos a la degradación se ha evaluado mediante el tratamiento del péptido con suero humano acuoso y la monitorización de su degradación por MALDI-TOF a diferentes intervalos de tiempo. Se ha comprobado que al cabo de 1,5 h a 2 h aún se detecta la presencia de péptido en el medio. Los péptidos de esta invención pueden ser procesados por métodos convencionales de farmacia galénica en composiciones farmacéuticas para administración oral, parenteral o tópica, por ejemplo a mamíferos, incluidos los humanos.

Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar por procedimientos conocidos en la técnica. Por ejemplo, los péptidos se pueden formular con excipientes, diluyentes o vehículos comunes, y formular en comprimidos, cápsulas, suspensiones, polvos y formulaciones similares. Ejemplos de excipientes, diluyentes y vehículos que son adecuados para dichas formulaciones incluyen los siguientes: cargas y diluyentes como almidón, azúcares, manitol y derivados silícicos; agentes aglutinantes como deri- vados de la celulosa, alginatos, gelatina y polivinilpirrolidona; agentes humectantes como glicerol; agentes disgregantes como carbonato cálcico y bicarbonato sódico; agentes retardantes de la disolución como parafina; agentes tensioactivos como monoestearato de glicerina; vehículos adsorbentes como caolín y bentonita; y lubrificantes como talco, estearato cálcico y magnésico, y polietilenglicoles sólidos.

Los péptidos se pueden formular también como elixires o soluciones para una administración oral conveniente.

Adicionalmente, los compuestos se adaptan bien a la formulación como formas de dosificación de liberación sostenida y similares.

Las composiciones farmacéuticas que incluyen los péptidos de la inven- ción se pueden preparar siguiendo procedimientos bien conocidos por el experto en la materia, como por ejemplo los descritos en el manual Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th Edition, Philadelphia, Lippincott, Williams & Wilkins, 2000 [ISBN 0 683 306472].

En manuales de consulta accesibles para el experto en la materia, como el libro Handbook of Pharmaceutical Excipients, 4th Edition, London, Pharmaceutical Press, 2003 [ISBN 0 85369 472 9], se encuentra información sobre las características de los agentes auxiliares descritos, y en la mayoría de los casos también figuran ejemplos de las denominaciones comerciales bajo las que se pueden encontrar dichos productos en el mercado.

En general, los péptidos de la invención son administrados en forma de dosis unitaria en un vehículo farmacéuticamente aceptable que contiene la dosis requerida. La dosificación de una composición farmacéutica que comprende los péptidos de la invención variará de acuerdo con la formulación farmacéutica, el modo de aplicación, y el sitio, huésped y tumor particulares que se estén tratando.

En general, las dosis y regímenes adecuados para un huésped dado pueden ser determinados mediante consideraciones convencionales, por ejemplo mediante la comparación de las actividades diferenciales del compuesto en cuestión y de un agente antitumoral conocido, por ejemplo mediante un protocolo farmacológico convencional apropiado. En este protocolo se tienen en cuenta otros factores como la edad, el peso corporal, el sexo, la dieta, el tiempo de administración, la velocidad de excreción, la condición del huésped, las combinaciones de fármacos, las sensibilidades de reacción, y la severidad de la enfermedad.

La administración de los péptidos de la invención se puede llevar a cabo continuamente o periódicamente dentro de la dosis máxima que se tolera.

Los ejemplos que se exponen a continuación se deben interpretar como un medio auxiliar para una mejor comprensión de la invención, y no como limitaciones al objeto de la misma.

Ejemplos

En los ejemplos que siguen se emplean las siguientes abreviaciones: Al: alilo; Boc: tert-butiloxicarbonilo; DIEA: Ν,Ν-diisopropiletilamina; DMEM: Medio Eagle's modificado de Dulbecco; EDTA, ácido etilendiaminotetracético; ERKl/2: Señal extracelular regulada por las quinasas 1/2; ESI-MS: espectrometría de masas con ionización por electropulverización; FAB-MS: espectrometría de masas por bombardeo con átomos rápidos (Fast Atom Bombardment - Mass Spectrometry); FBS: suero fetal bovino; Fmoc: 9-fiuorenilmetoxicarbonilo; HBTU: hexafluorofosfato de N-óxido de N- [(lH-benzotriazol-l-il)(dimetilamino)metilen]-N-metilmetanam inio; HOBt: 1- hidroxibenzotriazol; HPLC: cromatografía líquida de alta resolución; MALDI-TOF: ionización desorción por láser asistida por una matriz - Tiempo de vuelo (Matrix- Assisted Láser Desorption Ionization - Time-of-Flight); MBHA: 4-metilbencidrilamina; MTT: bromuro de 3-(4,5-dimetil-2-tiazolil)-2,5-difenil-2H-tetrazolio; NMM: N- metilmorfolina; NMP: N-metilpirrolidona; PAGE: gel de electroforesis de poliacrilami- da; PARP: Polimerasa de la poli-ADP ribosa; PBS: tampón fosfato salino; PBS-T: tam- pón fosfato salino-TRIS; Ph: fenilo; PMSF: fluoruro de fenilmetilsulfonilo; PyBOP: hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il-N-oxitris(pirrolidino)fosfonio; SDS: dodecilsul- fato sódico; TBS-T: solución de tampón TRIS con 0.05% Tween-20; TFA: ácido tri- fluoroacético; THF: tetrahidrofurano; TIS: triisopropilsilano; TRIS: tris(hidroximetil)aminometano; UV: ultravioleta.

Los productos Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Glu-OAl,

Fmoc-Leu-OH, la resina MBHA funcionalizada con grupos amino, el espaciador bifun- cional Fmoc-Rink-Linker (número CAS: 145469-56-3), HBTU, PyBOP, y HOBt se obtuvieron de Iris Biotech. Los productos TFA, NMP, Pd(PPh ₃ ) ₄ , N,N- dietilditiocarbamato sódico, y TIS se obtuvieron de Aldrich. Los productos piperidina, NMM, y DIEA se obtuvieron de Fluka.

Las siguientes indicaciones sobre el procedimiento para la preparación de los péptidos son de carácter general:

Se emplearon aminoácidos que tienen el grupo α-amino protegido con el grupo Fmoc.

- Para la protección de la cadena lateral de la lisina se empleó el grupo Boc.

- En las reacciones llevadas a cabo sobre soporte de resina se emplearon jeringas de 5 o 10 mi que tenían incorporado un filtro microporoso de polipropileno.

- Todas las transformaciones y lavados se llevaron a cabo a 25° C, a no ser que se indique lo contrario.

- El análisis por HPLC se llevó a cabo con un flujo de 1,0 ml/min empleando una columna de fase reversa Kromasil (4,6 x 40 mm; tamaño de partículas de 3,5 μιη). Se emplearon gradientes lineales con TFA acuoso al 0,1% y TFA en aceto- nitrilo al 0,1%, con una relación comprendida entre 0,98:0,02 y 0,98:0,1 durante un período de tiempo de 7 minutos con detección UV a una longitud de onda de 220 nm.

- Los espectros ESI-MS fueron adquiridos empleando un instrumento Esquire 6000 ESI ion trap LC/MS (Bruker Daltonics), operando en el modo positivo de iones (ES+).

Los espectros MALDI-TOF fueron adquiridos mediante un instrumento Ultra- flex de la empresa Bruker.

- Todas las relaciones entre los disolventes son volumen/volumen, a no ser que se especifique otra cosa. Ejemplo 1.- Preparación de ciclo(KKLLKFKKLQ), ciclo(Xys-Lys-Leu-Leu-

Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Glu), en fase sólida empleando como soporte sólido resina MBHA

En una jeringa de 5 mi de capacidad, equipada con un filtro microporoso en la parte inferior, se colocaron 200 mg de resina MBHA con una funcionalización de 0,3 mmol/g, equivalentes a 0,06 mmoles de grupos amino, y se llenó la jeringa con disolvente para hinchar-lavar la resina de acuerdo con la siguiente secuencia: CH ₂ C1 ₂ (5 ^χ 0,5 min), una mezcla de TFA y CH ₂ C1 ₂ (4:6, 1 x 20 min), CH ₂ C1 ₂ (5 ^χ 0,5 min), una mezcla de DIEA y CH ₂ C1 ₂ (5:95, 3 1 min), CH ₂ C1 ₂ (5 ^χ 0,5 min), y NMP (5 0,5 min). La expresión CH ₂ C1 ₂ (5 x 0,5 min) se refiere a que se realizaron 5 lavados con cloruro de metileno de 0,5 minutos cada uno. Después de cada etapa de lavado se elimina el disolvente mediante un filtrador de vacío múltiple (Vac Man Laboratory Vacuum Manifold de Promega Distribuidora).

El espaciador bifuncional se acopló a la resina por tratamiento con 97 mg de Fmoc-Rink-Linker (0,18 mmoles), 68 mg de HBTU (0,18 mmoles) y 31 μΐ de DIEA (0,18 mmoles) en 1 mi de NMP. Se mantuvo durante toda la noche y se comprobó que el test de ninhidrina era negativo (Kaiser et al, Anal. Biochem., 1970, 34, 595-598).

Después de lavar la resina con NMP (5 x 2 min), ésta se trató con una mezcla de piperidina y NMP (3:7, 2 x 8 min) para eliminar el grupo Fmoc presente en el grupo amino del espaciador bifuncional, y, a continuación, se lavó con NMP (5 x 2 min).

Seguidamente la resina se trató con 74 mg de Fmoc-Glu-OAl (0, 18 mmo- les), 68 mg de HBTU (0,18 mmoles) y 31 μΐ de DIEA (0,18 mmoles) en 1 mi de NMP. Después de 4 h se comprobó que el test de ninhidrina era negativo. A continuación se lavó con NMP (5 x 2 min).

La eliminación del grupo Fmoc y los lavados subsiguientes se realizaron como ya se ha descrito anteriormente.

El ciclo de acoplamiento-desprotección se repitió para el resto de los aminoácidos protegidos con el grupo N ^a -Fmoc: Fmoc-Lys(Boc)-OH, Fmoc-Phe-OH, y Fmoc-Leu-OH. En cada etapa se procedió al lavado con NMP (5 x 2 min). El éster alílico C-terminal del ácido glutámico incorporado al péptido fue eliminado bajo atmósfera de nitrógeno por tratamiento con 347 mg de Pd(PPh ₃ ) ₄ (0,3 mmoles) en 3 mi de una mezcla de cloroformo, ácido acético y NMM (37:2: 1) durante 5 h bajo agitación. Pasado este tiempo la resina fue lavada con THF (3 x 2 min), NMP (3 x 2 min), una mezcla de DIEA y CH ₂ C1 ₂ (1 : 19, 3 x 2 min), N,N-dietilditiocarbamato sódico (0,03 M en NMP, 3 x 15 min), NMP (10 x 1 min), CH ₂ C1 ₂ (3 x 2 min), y NMP (3 x 1 min).

Después de eliminar el grupo Fmoc del último aminoácido acoplado y proceder a los lavados como ya se ha descrito anteriormente, se obtuvo el péptido lineal KKLLKFKKLQ, Lys-Lys-Leu-Leu-Lys-Phe-Lys-Lys-Leu-Glu, unido a la resina. En este estadio, el péptido contiene aún el residuo de ácido glutámico, ya que la glutamina no se forma hasta la escisión del péptido cíclico de la resina.

La ciclación del péptido se llevó a cabo mediante tratamiento con 156 mg de PyBOP (0,3 mmoles), 40 mg de HOBt (0,3 mmoles), y 104 μΐ de DIEA (0,6 mmo- les) en 1 mi de NMP. Después de 24 horas a 25° C, el test de ninhidrina fue negativo.

A continuación se lavó la resina con NMP (6 x 1 min) y CH ₂ C1 ₂ (6 x 1 min), y se escindió el péptido cíclico de la resina mediante un tratamiento con 2 mi de una mezcla de TFA, agua y TIS (95:2,5:2,5) durante 2 horas. Se recogieron los filtrados en un vial mediante una presión positiva de nitrógeno. La resina se lavó con una mezcla de TFA, agua y TIS (95:2,5:2,5, 2 x 0,5 mi). Los filtrados se combinaron y se evaporaron casi a sequedad bajo una corriente de nitrógeno hasta obtener un aceite. Dicho aceite se precipitó con éter dietílico, se centrifugó, y el éter se decantó. Este proceso se repitió 3 o 4 veces. Finalmente, el producto sólido obtenido se disolvió en agua, y se liofili- zó.

Se obtuvo un sólido pulverulento cuya estructura se analizó por HPLC y se confirmó por ESI-MS, MALDI-TOF o FAB-MS.

Ejemplos 2 a 16.- Preparación de péptidos Siguiendo un procedimiento análogo al descrito en el Ejemplo 1 se prepararon los péptidos cíclicos que figuran en la Tabla II, en la que se incluye también el péptido del Ejemplo 1 : TABLA II

Ejemplo 17.- Ensayo de actividad inhibidora del crecimiento de células de cán- cer de mama

Se resuspendieron los péptidos en PBS IX estéril para tener una concentración final (stock) de 9600 μΜ. Se sembraron las células de cáncer de mama MD A-MB-231 en una placa de cultivo de 96 pocilios a una densidad de 7000 células/pocilio, de los cuales solamente 60 son pocilios útiles, ya que el perímetro de la placa se rellenó con agua para evitar evaporaciones. Después de 24 horas de estar en cultivo, las células tumorales estaban totalmente adheridas a la superficie del pozo y se trataron con cada uno de los péptidos a una concentración final de 40 μΜ.

Cada péptido de la invención se ensayó por triplicado a una concentración de 40 μΜ. Se dejó actuar el péptido durante 48 horas, después se sacó el medio de cultivo y se pusieron 100 μΐ de medio de cultivo fresco con 10 μΐ de MTT durante 3 horas.

Las células vivas metabolizaron esta sal (MTT) dando un metabolito soluble en DMSO que tiene una longitud de onda máxima de absorción a 570nm.

Se leyó la densidad óptica de la placa a 570 nm y se compararon los resultados con los pocilios control que no han sido tratados con el péptido.

En la Tabla III se presentan los resultados obtenidos para algunos de los péptidos de la invención:

TABLA III

SEQ_ID_NO: Referencia Péptido % inhibición a 40 μΜ

1 BPC088 Ciclo(K LL FKKLQ) 50

2 BPC202 Ciclo(KKKKKFKKLQ) 63

4 BPC198 Ciclo(KL KKFKKLQ) 56

5 BPC098 Ciclo(LLKKKFKKLQ) 60

6 BPC194 Ciclo(KKLKKF KLQ) 70

7 BPC096 Ciclo(L LKKFKKLQ) 59

8 BPC094 Ciclo(KLL F KLQ) 95

10 BPC186 Ciclo(KKKLKFKKLQ) 22

12 BPC090 Ciclo(KLKLKF KLQ) 23 13 BPC196 Ciclo(LLKLKFKKLQ) 18

14 BPC192 Ciclo(LKLLKFKKLQ) 20

15 BPC184 Ciclo(KLLLKFKKLQ) 88

Se puede observar que los péptidos ensayados inhiben el crecimiento celular de la línea celular tumoral de origen mamario MDA-MB-231. Entre ellos cabe destacar los péptidos BPC088, BPC202, BPC098, BPC198, BPC194, BPC096, BPC094, y BPC184 que muestran un porcentaje de inhibición igual o superior al 50% a una concentración de 40 μΜ.

Ejemplo 18.- Ensayos de actividad inhibidora del crecimiento de diversas líneas celulares cancerosas

El efecto inhibidor del crecimiento de células cancerosas de los péptidos de la invención se determinó frente a las siguientes líneas celulares: MDA-MB-231 ATCC/HTB-26 (American Type Culture Collection), HeLa ATCC/CCL-2, PANC-1 ATCC/CRL-1469, HepG2 HB-8065 (Eucellbank, Universidad de Barcelona, España), y A431 C L-2592 (Eucellbank, Universidad de Barcelona, España).

Las células tumorales de origen mamario MDA-MB-231, las células procedentes de un carcinoma de cuello uterino HeLa, y las células de un adenocarcinoma pancreático PANC-1 se cultivaron en medio DMEM (Gibco) que contenía un 10%) de suero fetal bovino (Bio-Whitakker), 1% de L-glutamina, 1% de piruvato sódico, 50 U/ml de penicilina, y 50 μg/ml de estreptomicina.

Las células procedentes de un carcinoma hepático diferenciado HepG2, y las células de un carcinoma escamoso A431 fueron pasadas en un medio DMEM que contenía un 10%> de suero fetal bovino, 1% de L-glutamina, 1% de piruvato sódico, 50 U/ml de penicilina, y 50 μ§/ηι1 de estreptomicina. Las células estaban exentas de Myco- plasma y fueron propagadas en un cultivo adherente de acuerdo con procedimientos bien establecidos y conocidos en los laboratorios de cultivo celular. Las células se mantuvieron a 37° C en una atmósfera húmeda que contenía un 95% de aire y un 5% de anhídrido carbónico. La sensibilidad de las células frente a los péptidos de la invención se determinó empleando el ensayo colorimétrico estándar MTT.

Las células se sembraron en una placa de 96 pocilios con una densidad de 7 x 10 ³ células/100 μΐ/pocillo y se mantuvieron toda la noche a una temperatura de 37° C para conseguir la adhesión de las células a la pared del pocilio.

A continuación se eliminó el medio de cultivo, se añadió medio de cultivo fresco con varias concentraciones del péptido de la invención a ensayar, y se mantuvo 48 horas a una temperatura de 37° C.

Seguidamente, las células se alimentaron con medio de cultivo exento de péptido (100 μΐ/pocillo) y con 10 μΐ de solución MTT (5 mg/ml; Sigma, St. Louis, MO), y se incubaron durante 3 h a 37° C.

Después de eliminar cuidadosamente los sobrenadantes, los cristales de MTT-formazan formados por las células viables metabólicamente, se disolvieron en dimetilsulfóxido (100 μΐ/pocillo) y se midió la absorbencia a 570 nm en un lector multi- pocilio modelo Anthos Labtec 2010 1.7 Reader.

A partir de las lecturas obtenidas para cada una de las concentraciones de los péptidos ensayados se determinó mediante un tratamiento matemático la concentración necesaria para inhibir el 50% del crecimiento celular, que se denomina IC50.

En la Tablas IV y V se presentan los resultados de los ensayos de inhibi- ción del crecimiento celular expresados como IC ₅₀ en μΜ:

TABLA IV

Ejemplo Referencia MDA-MB231 HeLa HepG2

1 BPC088 31,25 ± 5 22,5 ± 0 32,50 ± 4

2 BPC202 40,50 ± 9 54 ± 6 46 ± 8

4 BPC198 53,17 ± 13 35± 1 >60

5 BPC098 40,67 ± 3 38,5 ± 4 44 ± 3

6 BPC194 32,50 ± 0,5 29,50 ± 2 46 ±3 7 BPC096 40 ± 7 24,50 ± 0,7 34,50 ± 2

8 BPC094 22 ± 0,00 23 ± 3 20,50 ± 6

15 BPC184 32,25 ± 7 30,50 ± 12 42,25 ± 2

TABLA V

Se puede observar que los péptidos de la invención presentan una consi- derable actividad inhibidora del crecimiento de células tumorales de características diversas.

Ejemplo 19.- Ensayo de inmunoblot de p-ERKl 2 Las células tratadas se sometieron a una lisis en una solución tampón que contenía 1 mM EDTA, 150 mM NaCl, 100 μ^πιΐ PMSF, 50 mM Tris-HCl (pH 7.5) y una combinación de proteasa e inhibidor de fosfatasa (Sigma Chemical).

Una muestra se extrajo para la determinación del contenido de proteína mediante el ensayo de Lowry (BioRad). Los extractos de proteína total se sometieron a un inmunoblot con SDS-PAGE sobre un gel de SDS-poliacrilamida del 4-12% (phospo- ERK1/2, p53 y PARP), transferidos a membranas de nitrocelulosa y bloqueadas durante una hora a temperatura ambiente en un tampón bloqueante (2,5% leche descremada en polvo en PBS-T [10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl and 0,05% Tween-20]) para evitar el enlace de anticuerpos no específico.

Los blots fueron incubados con el anticuerpo primario correspondiente diluido en un tampón bloqueante durante toda la noche a 4 ^o C. Después de 3 lavados durante 5 minutos en PBS-T, los blots fueron incubados durante una hora con el anticuerpo secundario escogido de acuerdo con la especie de origen del anticuerpo primario, y revelados empleando un kit comercial (sustrato quimioluminiscente de West Pi- co).

Los blots se reinvestigaron con un anticuerpo para β-actina para controlar la carga y transferencia de proteínas.

Ejemplo 20.- Ensayos de actividad hemolítica

La actividad hemolítica de los péptidos de la invención se evaluó mediante la determinación de la liberación de hemoglobina que se produce al poner en contacto una solución de los péptidos con una suspensión de eritrocitos al 5% en volumen procedentes de sangre humana fresca.

La sangre se recogió asépticamente empleando un sistema Vacuntainer ^® 2E (Belliver, Gran Bretaña) con EDTA, y se almacenó a 4 ^o C durante un período inferior a 2 horas.

La sangre se centrifugó a 6.000 g durante 5 minutos para separar los eritrocitos. Estos se lavaron tres veces con tampón TRIS (10 mM TRIS, 150 mM NaCl, pH 7,2), y se suspendieron en tampón TRIS hasta obtener una suspensión que contenía un 10% en volumen de eritrocitos.

Los péptidos se solubilizaron en tampón TRIS hasta una concentración final 125, 250, 500 y 750 μΜ.

Se emplearon tres replicados para cada péptido y concentración.

Se mezclaron 65 μΐ de la suspensión de eritrocitos al 10% en volumen con 65 μΐ de la solución de péptido en cada pocilio de una placa de 96 pocilios Micro- Amp ^® (Applied Biosystems, EE.UU.) (5% en volumen de eritrocitos), y se incubó la mezcla durante 1 h a 37° C bajo agitación. De este modo las suspensiones de eritrocitos se sometieron a concentraciones de péptidos de 62,5, 125, 250 y 375 μΜ.

A continuación se centrifugaron las placas a 3.500 g durante 10 minutos, y se transfirieron alícuotas de 80 μΐ del sobrenadante a microplacas de 100 pocilios (Bioscreen), que se diluyeron con 80 μΐ de agua milli-Q.

El grado de hemolisis se determinó a partir de la absorbancia a 540 nm con un lector de placas Bioscreen.

El control positivo de hemolisis completa se determinó en una solución de tampón TRIS que contenía melitina (Sigma-Aldrich, España).

El porcentaje de hemolisis (H) se determinó empleando la ecuación:

H = 100x[(Op-Ob)/(Om-Ob)]

donde Op era la densidad óptica medida para una concentración de péptido determinada, Ob era la densidad óptica de la solución tampón, y Om era la densidad óptica para el control positivo con melitina.

La Tabla VI presenta los resultados de actividad hemolítica para una concentración de péptido de la invención de 375 μΜ, expresada como el porcentaje de hemolisis calculado según la ecuación anterior:

TABLA VI

Ejemplo Referencia Hemolisis (%)

a 375 μΜ

1 BPC088 33 ± 3,3

2 BPC202 2 ± 0,2

4 BPC198 14 ± 1,4

5 BPC098 28 ± 2,4

6 BPC194 17 ± 1,7

7 BPC096 24 ± 4,3

8 BPC094 75 ± 1 ,6

15 BPC184 89 ± 5,3 En todos los casos se observa que la concentración en la que se llegaría a producir una hemolisis significativa es aproximadamente entre 6 y 21 veces superior a la concentración en la que el péptido presenta actividad inhibidora del creci- miento celular.

Ejemplo 21.- Ensayos de estabilidad

La estabilidad de los péptidos de los Ejemplos 1, 4, 5, 6, y 7 en suero humano se determinó siguiendo el siguiente protocolo:

Para cada ensayo se preparó 1 mi de suero humano acuoso al 25% a partir de suero humano filtrado. A continuación se añadieron 2,5 mg de péptido cíclico y la mezcla se calentó a 37° C. La estabilidad se monitorizó al cabo de 30 min, 1 h, 1,5 h y 2 h. Para ello, después de cada intervalo de tiempo se tomó una alícuota de 200 μΐ a la que se añadieron 200 de acetonitrilo, y la muestra resultante se enfrío a 0 ^o C durante 15 min. A continuación, el precipitado se centrifugó a 1 1000 rpm durante 5 min, el sobrenadante se liofilizó. El sólido resultante se analizó por MALDI-TOF utilizando ácido a- ciano-4-hidroxicinámico como matriz.

Para los péptidos de los Ejemplos 1, 5, y 7, al cabo de 1,5 h aún se observa por MALDI-TOF la masa correspondiente al péptido cíclico. Para los péptidos de los Ejemplos 4 y 6, se observa la masa del péptido cíclico al cabo de 2 h de tratamiento.