Ces nouveau dérivés, que l'on désigne par"a, ß ou y-cyclodextrine- carbinols", ou"CD-carbinols"sont caractérisés par le fait que l'hydrogène porté par au moins l'un des atomes de carbone en position 3, en position 5 ou en position 6 d'une ou plusieurs des unités glucopyranosidiques entrant dans la constitution de la cyclodextrine, a été substitué par un groupement carbinol.

L'invention vise également le procédé de préparation et des applications des nouveaux dérivés, ainsi que les oligomères ou polymères obtenus par homopolymérisation ou copolymérisation des CD-carbinols convenablement fonctionnalisés et comportant une liaison carbone-carbone en position 3,5 ou 6 de leurs unités glucopyranosidiques constitutives.

Elle vise enfin les solutions, gels, supports ou préparations à usage pharmaceutique, cosmétique, agrochimique ou alimentaire ainsi que les préparations utilisées pour les parfums et les arômes, à base des CD-carbinols en question.

Parmi les applications, conformes à l'invention des susdits solutions, gels ou supports à base des CD-carbinols conformes à l'invention, on peut citer - le traitement des mélanges d'au moins deux constituants, choisis dans le groupe comprenant les molécules organiques, minérales ou organo-minérales, pour en retirer au moins une partie de l'un de ces constituants, ou pour séparer lesdits constituants par une méthode chromatographique, par technologie membranaire ou bien par mise en oeuvre d'un procédé d'extraction liquide- liquide ou liquide-solide ou bien par un procédé d'électrophorèse ou d'électrochromatographie préparative, - le traitement des mélanges d'au moins deux énantiomères, choisis dans le groupe comprenant les molécules organiques chirales ou organo-minérales

chirales, pour en retirer au moins une partie de l'un des énantiomères, autrement dit pour enrichir le mélange en l'une des molécules unichirales optiquement actives et obtenir ainsi l'un des énantiomères sous forme enrichie, - la séparation de molécules optiquement actives par chromatographie ou par technologie membranaire, par mise oeuvre d'un procédé d'extraction liquide- liquide ou liquide-solide ou par un procédé d'électrophorèse ou d'électrochromatographiepréparative, - le greffage de (3-cyclodextrines sur support solide par photochimie, - la fonctionalisation par photochimie de P-cyclodextrines sur support solide, ce qui permet de transformer une colonne garnie de (3-cyclodextrines en une colonne de chromatographie d'affinité et, plus particulièrement, de greffer sur la colonne des peptides, des protéines, des peptides nucléiques acides, des oligonucléotides et des oligosaccharides, - la glycosylation en général qui constitue un moyen d'augmenter la stabilité des principes actifs et d'augmenter leur solubilité.

Il est tout d'abord rappelé que les cyclodextrines, désignées ci-après par CD, sont des composés d'origine naturelle et plus précisément des oligosaccharides cycliques ou cyclomaltooligosaccharides, constitués de molécules de glucopyranose unies par des liaisons glycosidiques a 1< 4.

On distingue les alpha-, les bta-et les gamma-cyclodextrines respectivement désignées par a-CD, (3-CD et y-CD et qui sont constituées respectivement de 6,7 et 8 unités de glucopyranose.

La structure tronconique des CD, qui résulte de leur stabilisation par les liaisons hydrogène, en fait des molécules de choix pour réaliser avec des molécules hydrophobes, en particulier avec des composés pharmaceutiques ou aromatiques, des complexes de type"hôte-invité".

En effet, les fonctions alcools étant dirigées vers l'extérieur, les cyclodextrines ont un caractère hydrophile ; mais du fait que leur cavité est tapissée d'atomes de carbone, oxygène et d'hydrogène, elle possède un caractère hydrophobe.

Les cyclodextrines a-CD, P-CD et y-CD sont représentées par la formule générale

dans laquelle n est égale à 5, 6 ou 7.

Il a été montré que les cyclodextrines peuvent former des complexes d'inclusion avec des molécules hydrophobes rendant ainsi possible la solubilisation de ces dernières dans des milieux aqueux (Chemical Reviews, 1998, 98, 2035-2044).

Cette aptitude a donné lieu à des applications dans tous les domaines des sciences de la vie, en particulier en pharmacie, agrochimie, cosmétologie, dans l'industrie des parfums et des arômes, les propriétés recherchées comprenant la solubilisation de principes actifs insolubles dans l'eau, la stabilisation (dégradation chimique retardée), l'effet masquant (élimination de l'amertume), la réduction de volatilité (parfums, phéromones), la biodisponibilité améliorée (effet retard ou relargage contrôlé de médicaments dans l'organisme ou de principes agrochimiques dans l'environnement) et, enfin, un meilleur contrôle de certaines réactions chimiques (Chemical Reviews, 1998, 98, n°5, 1743-2076).

C'est la (3-cyclodextrine, qui est la plus adaptée, compte tenu de la taille de sa cavité, à l'encapsulation des molécules pharmaceutiques de petite taille comme le piroxicam ; cette application est illustrée par un médicament anti- inflammatoire commercialisé par Pierre Fabre Médicaments sous la marque BREXIN et dont la substance active est un complexe d'inclusion du piroxicam dans la (3-cyclodextrine.

Or, il se trouve que l'utilisation des cyclodextrines en général et, de la (3-cyclodextrine en particulier, pour former des complexes d'inclusion, autrement dit pour « encapsuler » des principes actifs, est limitée par leur faible solubilité qui, dans le cas de la ß-cyclodextrine est de 15 mmol/1 soit 15 g/1 à 25°C.

De nombreux travaux ont été réalisés en vue d'obtenir des dérivés de cyclodextrines et en particulier de (3-cyclodextrine, ayant des propriétés de solubilité améliorées.

Tous ces travaux ont eu recours à la mme stratégie qui réside dans la modification des hydroxyles portés par la cyclodextrine.

Et s'il a effectivement été possible d'obtenir ainsi des cyclodextrines ayant des propriétés de solubilité améliorées, la modification des hydroxyles a eu comme inconvénient de bloquer plus ou moins l'une ou les deux entrées de la cavité de la cyclodextrine.

C'est avec les mono-dérivés de cyclodextrines, tels que les mono-amino ou les mono-anhydro, qu'il a été possible de minimiser l'encombrement partiel de l'entrée de la cavité, mais les synthèses mises en oeuvre sont complexes et coûteuses du fait de la quasi-isoréactivité des hydroxyles portés par la cyclodextrine.

L'invention a donc pour but, surtout, de remédier aux inconvénients de l'état de la technique et de fournir des dérivés de cyclodextrine présentant des propriétés améliorées non seulement du point de vue de leur solubilité mais également du point de vue de leur capacité d'encapsulation au niveau moléculaire.

Et la Société Demanderesse a le mérite d'avoir trouvé, à l'issue de recherches longues et approfondies, que ce but était atteint dès lors qu'au moins l'un des atomes d'hydrogène portés par les atomes de carbone en position 3,5 ou 6 d'une ou plusieurs des unités glucopyranosidiques (ou glucose) entrant dans la constitution de la cyclodextrine, est substitué par un groupement carbinol.

L'invention a donc pour objet de nouveaux dérivés de cyclodextrines caractérisés par le fait qu'au moins l'un des atomes d'hydrogène portés par les atomes de carbone en position 3, et/ou 5 et/ou 6 des unités glucopyranosidiques (ou glucose) entrant dans la constitution de la cyclodextrine, est substitué par un groupement carbinol c'est-à-dire par un carbone tétravalent portant une fonction hydroxyle secondaire, les dérivés conformes à l'invention répondant à la formule générale :

dans laquelle - n est égal à 0, 1 ou 2, - R représente un groupement hydroxyle, un groupement méthyle ou un groupement de formule XR5, dans laquelle X représente l'oxygène, le soufre le phosphore ; le silicium, le sélénium ou l'azote et R5 un groupement alkyle, aryle, alkylaryle ou arylalkyle ayant de 1 à 60 atomes de carbone, éventuellement substitué par des hétéroatomes et/ou des fonctions acides carboxyliques,

sulfoniques, phosphoniques, ou encore par des fonctions aminées éthers, soufrées phosphorées silylées, R5 pouvant également représenter un groupement - C (OR5,-C (O)-NH-R5,-C (S)-R5 ou-C (S)-NH-R5 ou encore un groupement aminé, soufré, carboxylate, sulfate, phosphonate ou boronate, - R3 représente un atome d'hydrogène ou un groupement carbinol de formule R1-C (OH) -R2, dans laquelle RI et R2, qui sont identiques ou différents l'un de l'autre, représentent un groupement alkyle, aryle, alkylaryle ou arylalkyle ayant de 1 à 60 atomes de carbone, éventuellement substitué par des hétéroatomes et/ou par des fonctions acides carboxyliques, sulfoniques, phosphoniques ou encore par des fonctions aminées éthers, soufrées, phosphorées, silylées, et/ou éventuellement par des aminoacides, des peptides, des protéines, des nucléosides, ou des nucléotides étant entendu qu'au moins l'un des radicaux R3 représente un groupement carbinol R1-C (OH) -R2.

L'invention a également pour objet un procédé de préparation des nouveaux dérivés, c'est-à-dire des CD-carbinols.

La Société Demanderesse a en effet le mérite d'avoir trouvé que les nouveaux dérivés en question pouvaient tre obtenus conformément à l'invention en soumettant à une irradiation UV - soit le mélange d'une cyclodextrine avec un composé comportant un groupement cétonique photoactivable de formule Rl-CO-R2 dans laquelle RI et R2 ont les mmes signification que dans la formule (II) ; - soit une cyclodextrine préalablement modifiée par un composé comportant un groupement cétonique photoactivable ladite cyclodextrine et ledit composé étant reliés par une liaison convalente.

Suivant un mode de réalisation avantageux du procédé conforme à l'invention, c'est une solution aqueuse de la cyclodextrine et du composé à fonction cétonique que l'on soumet à l'irradiation.

Suivant un autre mode de réalisation du susdit procédé, on réalise un mélange la cyclodextrine et le composé à fonction cétonique tous deux à l'état de

poudres, le mélange pulvérulent ainsi obtenu étant maintenu, avant irradiation, pendant suffisamment longtemps pour permettre au composé à fonction cétonique de pénétrer dans la cavité de la cyclodextrine.

Suivant un autre mode de réalisation avantageux particulièrement préféré dudit procédé, il est également fait recours à une solution aqueuse de cyclodextrine et du composé à fonction cétonique, cette solution étant lyophylisée après avoir été maintenue, notamment à la température ambiante, pendant une durée suffisante pour permettre au composé à fonction cétonique de pénétrer dans la cavité de la cyclodextrine, le lyophylisat ainsi obtenu étant ensuite soumis à l'irradiation.

Si le mode de réalisation basé sur l'irradiation du lyophylisat est particulièrement préférée, c'est parce que, comme la Société Demanderesse a eu le mérite de le trouver, la substitution se fait alors essentiellement sur les atomes de carbone en position 3 alors qu'elle se fait essentiellement par parties égales sur les atomes de carbone en position 3 et 5 lorsque l'irradiation est mise en oeuvre sur la solution aqueuse de la cyclodextrine et du composé à fonction cétonique.

Or, dans le cas d'une substitution sur un atome de carbone en position 3, 1"'adduit"c'est-à-dire le composé à fonction cétonique fixé sur la cyclodextrine par cette fonction, est expulsé de la cavité de la cyclodextrine, rendant celle-ci plus apte à"encapsuler"par exemple des produits pharmaceutiques.

Au contraire, dans le cas de la substitution sur un carbone en position 5, cette expulsion se produit plus difficilement, rendant par conséquent moins aptes à des réactions d'encapsulation les cyclodextrines correspondantes.

Le procédé conforme à l'invention a été réalisé dans les exemples 1, 2 et 3 qui sont non limitatifs et relatifs à des modes de réalisation avantageux en mettant en oeuvre une a-, (3-ou y-cylodextrine et, au titre du composé à fonction cétonique Rl-CO-R2, trois peptides linéaires Pepl, Pep2 et Pep3 respectivement de formules

Ac-Lys-Arg-Val- (pBz) Phe-NH, (Pep 1).

Ac-Lys-Arg-Asp-Val- (pBz) Phe-NH2 (Pep2) H2N-Gly-Ala-Arg-Ala-Pro-(D) Pro-Gln-Thr-Glu-Gly-pBzPhe-CONH2 (Pep3) dans lesquelles"pBz"qui désigne le groupement parabenzoyle comporte la fonction cétonique.

Exemple 1 Préparation de CD-carbinols à partir du mélange en solution aqueuse d'une a-, 0-ou-y-cyclodextrine et d'un composé à fonction cétonique photoactivable constitué par Pep1 ou Pep2.

Une solution aqueuse millimolaire de pH 7 d'un mélange Pepl ou de Pep2 avec soit 5 équivalents de (3-cyclodextrine, soit 10 équivalents de y- cyclodextrine, est soumise pendant 40 minutes à une irradiation en lumière ultra violette (, = 365 nm, avec utilisation d'une ampoule Philipps HPR, 125W). Le mélange réactionnel est analysé par HPLC.

Exemple 2 Préparation de CD-carbinols à partir d'un lyophilisat de solutions aqueuses d'une part d'a-, (3-et y-cyclodextrines et d'autre part d'un composé à fonction cétonique photoactivable constitué par Pep 1 et Pep2.

Des solutions aqueuses millimolaires à pH7 de mélanges de Pep 1 ou de Pep2 avec soit 5 équivalents de p-cyclodextrine soit 10 équivalents de y- cyclodextrine soit encore 50 équivalents d'a-cyclodextrine sont lyophilisées. La poudre ainsi obtenue est placée dans une cuve en quartz, puis irradiée sous agitation pendant 60 minutes en lumière ultra violette (, = 365 nm, Philipps HPR, 125W). Après irradiation, la poudre est dissoute dans de l'eau et la solution est analysée par HPLC.

Exemple 3

Préparation de CD-carbinols par irradiation d'une cyclodextrine préalablement modifiée par un composé comportant un groupement cétonique photoactivable et relié à la cyclodextrine par une liaison covalente.

On prépare tout d'abord la cyclodextrine modifiée.

Pour ce faire, on place dans un ballon de 500 ml, 15 g de (3-CD (13,2 mmol) et 75 ml d'eau. Sous agitation, on ajoute goutte-à-goutte de la soude à 0,1 M jusqu'à la dissolution complète. On peut remarquer que la solution obtenue a un pH proche de 10. Puis sous forte agitation, on ajoute lentement 3,02 g de chlorure de tosyle (15,6 mmol soit 1, 2éq) préalablement dissous dans 15 ml d'acétonitrile (durée d'addition : 5 min) ; on remarque alors la formation d'un précipité blanc.

On laisse cette solution sous agitation pendant 10 min.

On neutralise ensuite la solution avec 2 ml d'acide chlorhydrique à 2 M.

Le ballon est maintenu à 4°C pendant 12h. Le précipité est alors filtré, puis il est dissous dans un minimum d'eau bouillante. On laisse le ballon refroidir à température ambiante puis on le maintient pendant 48h à 4°C.

Le produit recristallisé est alors filtré puis séché à l'évaporateur rotatif (on ajoute du toluène pour former un azéotrope avec l'eau).

On récupère 2, 3g de mono-6-o-p-tosylsulfonylcyclomaltoheptaose, c'est- à-dire de e-cyclodextrine monotosylée (=> 1, 78*10~3mmol).

Le rendement est de 13%.

L'analyse de ce produit par chromatographie en couche mince et par résonance magnétique nucléaire donne les résultats suivants.

CCM : Rf = 0, 54 RMN'H (DMSO, 500 MHz) => 8 =3, 2-3, 4 ppm (m, 14H) ; 3,4-3, 5 ppm (m, 18H) ; 4,2 ppm (dd, 1H) ; 4, 35 ppm (m, 2H) ; 4, 78 ppm (d, 1H) ; 4, 85 ppm (m, 6H) ; 5,6-5, 9 ppm (m, 140H) ; 7,42 ppm (d, 2H) ; 7,75 ppm (d, 2H).

On dissout la ß-CD monotosylée obtenue, à savoir 1, 78 103 mmol, dans 5ml de DMPU.

Par ailleurs, on introduit dans un ballon sous atmosphère inerte une solution d'acide thiopropionique (2,55 mmol) dans 5 ml de DMPU ; puis on ajoute 2 équivalents d'hydrure de sodium pour former le sel correspondant.

Ensuite on ajoute la susdite solution de ß-CD monotosylée dans DPMU.

On maintient sous agitation à 50°C pendant 18 heures sous atmosphère inerte.

On laisse ensuite la solution refroidir à température ambiante puis on ajoute de l'acétone. On observe alors la formation de précipité blanc. Celui-ci est filtré et lavé à l'acétone.

On obtient 1, 41g de mono-6-thiopropionyl-6-desoxycyclomaltoheptaose.

La purification de ce produit est réalisée à l'aide de DEAE-sépharose.

Pour purifier lg de produit il faut une hauteur de résine de 20cm (30m1).

La résine est régénérée par plusieurs cycles de lavages : 1*HCl 0, 5M (30 min) ; 5 jusqu'à pH=4 ; 2* NaOH 0, 5M (--20 min chacun) ; 4* H2O jusqu'à pH=9 ; 5*NH40Ac 0, 1M jusqu'à pH=8, 5 ; 5* NH40Ac 0, 01 M jusqu'à pH=7,5.

On dissout lg du produit purifié dans 5 ml d'eau, puis on ajoute 1 équivalent de NaOH 0, 5M (1,47 ml).

Le pH est ajusté à 8 avec de l'acide acétique à 10% et la solution est ensuite déposée sur la résine.

On effectue un gradient de pH entre 7,5 et 2 à l'aide de différentes solutions d'acide acétique. L'élution des produits est suivie par CCM.

Le mono-6-thiopropionyl-6-desoxycyclomaltoheptaose sort pour un pH proche de 3.

Après lyophilisation, on récupère 653 mg de produit recherché.

On forme ensuite la cyclodextrine modifiée en établissant une liaison amide entre le susdit produit purifié, à savoir le mono-6-thiopropionyl-6- desoxycyclomaltoheptaose de formule

dont la formule brute est C45H76037S et pour laquelle M=1223, 17g/mol.

Pour ce faire, on ajoute 2,18mg (l, léq. ) de mono-6-thiopropionyl-6- desoxycyclomaltoheptaose en solution dans zip de DMF à 0,615 mg (1 éq.) de HBTU dans 111 ut de DMF.

Puis on introduit 1 Oui de DIEA sous agitation.

Le mélange ainsi obtenu est ajouté au Pep3 et l'ensemble est agité pendant 15 min.

Le DMF est évaporé sans chauffer à l'aide d'une pompe à palettes.

Le produit est ensuite lyophilisé.

Pour 60mg de peptide traité, on obtient 45mg de cyclodextrine modifiée pure de formule.

dont M=2436g/mol.

Cette cyclodextrine modifiée est soumise à l'irradiation en lumière UV dans les mmes conditions que dans les exemples 1 et 2.

Dans le cas des trois exemples, l'analyse par chromatographie liquide haute performance ou HPLC montre que l'on obtient cinq isomères majoritaires avec chacun des deux-peptides Pep 1 et Pep2 et deux isomères majoritaires avec le peptide Pep3.

Les cinq isomères majoritaires des CD-carbinols issues de Pep1 et de Pep2 sont désignés respectivement par F1, F2, F3, F4 et F5 suivant leurs ordres d'élution en HPLC lorsqu'ils proviennent de Pepl, par F'1, F'2, F'3, F'4 et F'5 lorsqu'ils proviennent de Pep2.

Les deux isomères majoritaires des CD-carbinols issus de Pep3 sont désignés respectivement par F"1 et F"2 suivant les ordres d'évolution en HPLC.

Dans le tableau 1 ci-après, on a réuni les résultats des séparations chromatographiques en HPLC des CD-carbinols issus de Pep 1 obtenus en utilisant deux supports différents à savoir R P 8 et cyclose ce qui a donné les fractions correspondant aux isomères FI à F5, - des quantifications respectives de chacun des isomères ou-fractions FI à F5, - les spectrométries de masse de chacun des isomères ou des fractions, FI à F5 ce qui permet de constater que chacune des fractions correspondant aux isomères FI à F5 est un CD-carbinol, - des analyses RMN de chaque fraction ce qui permet de localiser la substitution (régioisomères) et d'attribuer la configuration absolue des centres chiraux.

Les conditions de la susdite élution en HPLC sont les suivantes : - colonne du type RP8 (Merck) ou du type commercialisé sous la marque CYCLOSE (g) (CHIRALSEP), - débit de lml/mn ; détection U. V. à 220 nm,

- gradient linéaire en 30 minutes en partant de 100% de A et en allant jusqu'au mélange de 70% de B avec 30% de A, sachant que A est constitué par un mélange d'eau avec 0, 1% d'acide trifluoroacétique (TFA) et que B est constitué par un mélange de 80% d'acétonitrile et de 20% d'eau contenant 0, 1% de TFA.

TABLEAU I Résultats pour le Peptide Pep 1

Fraction Fraction Fraction Fraction Fraction Peptide Produit de CD-CARBINOLS ISSUS DE Pepl Fl F2 F3 F4 F5 de photo- départ destruction Propriétés RP8 : Temps de rétention en minute 12.2 12.7 13.0 14.4 15.1 21.7 Cyclose : Temps de rétention en minute 26. 48 36.03 38.75 36.7 36 50.5 Distribution des produits après photomarquage solution aqueuse pH = 7 Rapport peptide/i-CD ; 1/3 Pourcentage 3 9 8 11 10 2 S7 Rapportpeptide/ß-CD ; 1/50 Pourcentage 6 8 6 14 _ 45 Etat solide : Rapportpeptide/ß-CD ; 1/3 Pourcentage 9 4 3 9 5 47 23 Rapport peptide/0-CD ; 1150 Pourcentage 13 7 5 15 20 6 34 Structure des glycopeptides Cyclodextrine-peptide Régioisomères 6 5 5 3 3 Configurations absolues glucopyranose R R R R R Configurations absolues Diphényle carbinole R S R R S

L'examen des résultats réunis dans le tableau 1 donne - les proportions respectives de chaque CD-carbinol (isomères correspondant aux fractions F1 à F5) et - les structures de ces carbinols qui sont des CD-carbinols correspondant aux isomères des fractions F4 et F5 dans lesquels la substitution s'est opérée sur la position 3.

Dans le cas des deux peptides Pep 1 et Pep2, les cinq isomères majoritaires formés ont été purifiés par HPLC (phase inverse), et les cinq fractions correspondantes de chaque peptide Pepl et Pep2 ont fait l'objet d'une élucidation structurale ; elles ont été analysées par spectrométrie de masse MALDI-Tof.

On a constaté que les CD-carbinols contenus dans ces fractions présentent la mme masse moléculaire (m/z =1828,19 pour le peptide Pep 1 et m/z 1943, 81 pour le peptide Pep2).

Ces valeurs confirment la formation d'une liaison carbone-carbone et l'absence de réaction d'élimination.

La détermination de la nature de ces isomères (régioisomères, diastéréoisomères, atropoisomères) a nécessité une analyse conformationnelle poussée par RMN (Résonance Magnétique Nucléaire).

Les nouveaux CD-carbinols obtenus à partir de la (3-cyclodextrine et des peptides Pep1, Pep2 et Pep3 ont été analysés par RMN multi-dimensionnelle (obtention des spectres COSY, TOCSY, HMBC, HSQC et NOESY), pour déterminer leur structure.

Tous ont été purifiés par HPLC.

Ils présentent tous des équilibres lents d'inter-conversion à l'échelle de temps de la RMN liés aux équilibres conformationnels du glucose (équilibres entre les formes"chaises"IC4 et 4CI et entre des formes"croisées"et"bateaux" et équilibres entre atropoisomères).

L'analyse de la partie glucopyranosidique d'un spectre TOCSY permet de déterminer si c'est le carbone en position 3 ou celui en position 5 ou 6 qui a été substituée.

Si la substitution se produit sur le carbone en position 3, celui-ci ne porte plus de proton.

Le transfert d'aimantation entre protons n'est plus possible ; par conséquent, un des protons anomériques ne présente qu'une seule tache de corrélation (H1/H2) sur le spectre TOCSY.

Si la modification chimique a lieu sur le carbone en position 5, c'est lui qui ne porte plus de proton, et l'un des protons anomériques n'a plus que trois taches de corrélation (H1/H2, H1/H3, H1/H4) sur le spectre TOSCY.

Si la modification a été réalisé sur le carbone 6, toutes les corrélations TOCSY sont conservées.

Tous les autres protons anomériques possèdent au moins cinq taches de corrélation (H1/H2, H1/H3, H1/H4, H1/H5, H1/H6 sur le spectre TOCSY).

Cette analyse TOCSY montre que l'isomère de la fraction FI ou F'1 (CD-carbinols issus de Pepl ou de Pep2) correspondant à une liaison C-C en position 6 et que les isomèresfractions respectivementF2 et F3 et F'2 et F'3 correspondent à la formation d'une liaison carbone-carbone sur le carbone en position 5, tandis que ceux des fractions F4 et F5 correspondent à une liaison sur le carbone en position 3.

La formation de la liaison carbone-carbone crée simultanément deux centres d'asymétrie.

L'analyse de la conformation du cycle de l'unité glucopyranosidique, substitué par le groupe diphenyl-carbinol, montre que la configuration des centres d'asymétrie des carbones en position 3 ou 5 est la mme que celle du glucose de départ.

Les produits obtenus par irradiation, que ce soit à partir des mélanges à l'état solide ou à l'état liquide, sont identiques.

Il se produit par conséquent pour les carbones de l'unité glucopyranosidique une rétention totale de configuration. La détermination de la configuration absolue du groupe carbinol a été réalisée en résolvant la structure tridimensionnelle de ces CD-carbinols par des calculs de dynamiques moléculaires sous contrainte RMN.

Les CD-carbinols contenus dans la fraction FI correspondent à la configuration absolue R à la fois sur le carbone 6 des glycopyranoses et du carbinol.

Les CD-carbinols contenus dans les fractions F3 et F4 correspondent à la configuration R du carbinol greffé respectivement sur un atome de carbone en position 5 ou 3. Les carbones du carbinol des CD-carbinols greffés sur des carbones en position 5 ou 3 (fractions F2 et F5) présentent une configuration S.

Les CD-carbinols obtenus à partir de cyclodextrine et de peptide Pep 1 sous forme de solution acqueuse sont majoritairement liés par le carbone en position 3 de l'unité glucopyranosidique et le carbone asymétrique du carbinol adopte indifféremment la configuration R ou S.

La stéréosélectivité est totale en position 6 ; le carbinol adopte à 100% la configuration R.

Par contre, lorsqu'on est en présence de la cyclodextrine et de Pep 1 sous forme de poudres autrement dit à l'état solide, une régiosélectivité de 72% en faveur des CD-carbinols liés en position 3 du glucose est observée.

La stéréosélectivité dépend des régio-isomères ; ainsi, dans les CD-carbinols liés en position 5, le carbinol adopte à 62% la configuration R tandis que dans ceux liés en position 3 le carbinol adopte à 65% la configuration S.

Comme indiqué ci-dessus, en toute généralité, on constate que dans le cadre de la mise en contact de la cyclodextrine et des peptides Pep 1 et Pep2, l'un des noyaux aromatiques reste dans la cavité hydrophobe des cyclodextrines dans le cas des régioisomères liés en position 5.

Par contre, dans le cas des régioisomères liés en position 3, le groupement benzophénone se localise à l'extérieur de la cavité qui est, par conséquent libérée.

La structure schématique de ces deux familles de CD-carbinols est montrée aux figures la, lb, lc, dans lesquelles CD désigne la cyclodextrine et Pep le peptide.

Les interactions stériques créées par le groupement diphenyl-carbinol dans la cavité hydrophobe d'une (3-cyclodextrine déstabilisent plus ou moins l'inclusion des noyaux aromatiques. L'équilibre, lent à l'échelle de temps de la RMN, entre le groupement diphenyl-carbinol localisé à l'intérieur ou à l'extérieur du CD-carbinol dépend des régioisomères et de la configuration absolue du carbinol.

Le peptide est localisé majoritairement sur la face étroite (isomère 5S), et sur la face large (isomère5R) ou sur le côté de la {3-cyclodextrine (isomères 3R et 3 S).

Ces structures révèlent des topologies différentes de celles qui sont obtenues par des modifications chimiques des fonctions hydroxyliques.

Les CD-carbinols liés en position 3, du fait que la cavité de cyclodextrine impliquée est libre, présentent des propriétés d'inclusion originales et nouvelles qui dépendent de la configuration absolue du groupement diphenyl carbinol.

Les études par RMN des complexes formés entre le CD-carbinol et le para-nitrophenol pris à titre d'exemple de composé d'inclusion font apparaître de forts effets d'anisotropie sur le déplacement chimique de certains protons en position 3 et 5 des sept unités glucopyranosidiques de la cyclodextrine ; ces effets d'anisotropie sont caractéristiques d'une insertion du para-nitrophenol dans la cavité hydrophobe de la p-cyclodextrine.

Dans le cas des y-cyclodextrines, la réaction photochimique qui vient d'tre décrite est observée aussi bien dans le cas de la préparation à partir des solutions qu'à partir des poudres ; dans ce dernier cas, trois CD-carbinols, à savoir les fractions FI (22,4%), F2 (34%) et F3 (43,6%) ont été caractérisés par spectrométrie de masse.

Ils présentent tous trois la masse attendue de 1990 pour un-CD-carbinol.

Une meilleure induction asymétrique est observée lorsqu'on part des lyophilisats, ce qui conduit aux fractions FI (15%), F2 (21%) et F3 (64%).

Par contre la formation d'une liaison carbone-carbone entre le peptide et une a-cyclodextrine ne se produit que lorsqu'on part des lyophilisats.

La réaction conforme à l'invention, qui implique la formation d'une liaison carbone-carbone entre un peptide et une cyclodextrine, a été utilisée pour reproduire les contraintes stériques présentées par certaines boucles de glycoprotéines à la surface des membranes biologiques.

La Société Demanderesse montre qu'il est possible de combiner la chimie des O-glycosides (modification chimique de l'hydroxyle du carbone en position 6) et celle des C-glycosides (modification chimique des carbones des positions 3, 5 ou 6).

Le schéma rétrosynthétique utilisé est, schématiquement, celui indiqué ci- après. H2N) H D 'C ? ON u praJi# pr'eduiL prodeit L procfUiE 2 prvuit 9 La séquence peptidique (AA) choisie dans le cas de ce schéma est celle identifiée plus haut par Pep3, à savoir : H2N-Gly-Ala-Arg-Ala-Pro- (D) Pro-Gln-Thr-Glu-Gly-pBzPhe-CONH2 qui possède les caractéristiques nécessaires pour faciliter la formation d'une boucle mimant celles des protéines globulaires ou membranaires (boucles impliquées dans les processus de reconnaissance moléculaire protéine/protéine, protéine/peptide, protéine/DNA ou protéine/polysaccharide).

La séquence en question répond donc à trois critères, suivant lesquels :

- le premier acide aminé, la Glycine, est faiblement encombré pour faciliter la formation de la liaison amide avec le produit (3), - le peptide choisi devrait préférentiellement adopter un feuillet permettant à la benzophénone de pénétrer dans la cavité de la (3-cyclodextrine et c'est le motif Pro- (D) Pro qui, en induisant un coude-P, permet un repliement de la chaîne peptidique de 180°, - le dernier acide aminé porte le groupement benzophénone capable de s'insérer dans la cavité de la P-cylodextrine.

L'utilisation d'une ß-cyclodextrine mono fonctionnalisée rompt la symétrie de la molécule et multiplie donc par 6 le nombre d'isomères, ceux-ci étant donc au nombre de 96. Les études par RMN du composé 4 avant photo irradiation montrent que contrairement aux peptides modèles Pep 1 et Pep2, la benzophénone pénètre par le petit côté de la (3-cyclodextrine.

Ce complexe d'inclusion réduit le nombre d'isomères à 48.

La réaction photochimique qui active la fonction cétone peut tre mise en oeuvre avec une lampe UV.

Le couplage entre le produit 3 et le peptide Pep3 est réalisé avec l'agent de couplage HBTU ou N, N, N', N'-tétraméthyl-O-(lH-benzotriazol-l-yl) uronium hexafluoropophosphate qui permet d'obtenir l'ester activé du produit 3 en 3 minutes.

Après la fin de la réaction, l'analyse HPLC du milieu réactionnel permet de détecter deux produits majoritaires et l'analyse par MALDI-TOF révèle que ces deux composés possèdent bien la masse attendue du produit 5 (m/z = 1831).

Les deux produits en question, qui sont des isomères issus du composé 4, ont été analysés par RMN.

Pour les deux isomères majoritaires correspondant aux fractions F"1 et F"2 qui sont issus du peptide Pep3, la liaison carbone-carbone s'effectue en C5.

Ce résultat est confirmé par une expérience HMBC qui met en évidence les

couplages 3J entre un proton et un carbone photomarqués a été réalisée en analysant d'une part les spectres de corrélation Carbone-Proton et les spectres NOESY.

Le séquençage des unités glucopyranosidiques via le spectre NOESY montre que c'est l'unité glucopyranosique G adjacente à l'unité glucopyranosique A qui a été modifiée.

Le mme type d'analyses a été réalisé sur le deuxième isomère généré après photoirradiation de Pep3. Les résultats de l'analyse RMN montrent que les deux isomères ne diffèrent que par la configuration absolue du carbinol.

De l'ensemble des constatations qui précèdent, il résulte que l'invention permet de construire des boucles peptidiques à la surface des cyclodextrines.

Le faible nombre d'isomères formés, qui sont au nombre de 2 au lieu des 96 théoriquement possibles, n'est pas une conséquence de la structuration du peptide.

La forte régiosélectivité (substitution très majoritaire de la position 3 de l'unité G), la rétention totale de configuration du carbone 5 et l'induction asymétrique sur le carbinol sont en accord avec une très forte contrainte spatiale de la benzophénone dans la cavité hydrophobe de la cyclodextrine.

Cette méthode doit tre donc généralisable à l'ingénierie des boucles de récepteurs trans-membranaires ou des protéines globulaires. La flexibilité structurale du peptide lié à la surface de la P-cyclodextrine est limitée par la topologie des deux liaisons peptide/ (3-cyclodextrine.

En résumé, - la réaction photochimique qui active la fonction cétone sous irradiation ultra violette est réalisable à partir des produits de départ en solution ou à l'état solide, - les restrictions conformationnelles lorsqu'on part des lyophylisats permettent d'obtenir une régioselectivité et une diastéréosélectivité plus fortes,

l'analyse HPLC des milieux réactionnels permet de détecter et de purifier les différents CD-carbinols, - l'analyse par MALDI-TOF permet de distinguer les CD-carbinols des produits de réarrangement intra-moléculaire des peptides, - l'analyse par RMN permet de déterminer les configurations absolues des centres chiraux, l'introduction dès paramètres RMN (couplages dipolaires et couplages scalaires) dans des calculs de dynamiques moléculaires permet d'accéder à la structure tridimensionnelle de ces CD-carbinols, - les CD-carbinols obtenus adoptent des structures spatiales originales et - les CD-carbinols, qui possèdent une liaison entre le composé à fonction cétonique et le carbone en position 3 des groupements glucopyranosidiques, présentent d'intéressantes propriétés d'inclusion.

L'exemple suivant illustre les applications des nouveaux CD-carbinols.

Exemple 4 Application des isomères majoritaires F2 (issu de Pepl), de F'4 (issu de Pep2) ou F"1 (issu de Pep3) en électrophorèse capillaire chirale.

Les conditions de l'expérience réalisée sur des solutés racémiques d'ELUDRINE, de KETOPROFENE et de DIPERODON sont comme suit : - l'appareillage utilisé est un appareillage d'électrophorèse capillaire commercialisé par la Société BECKMAN sous l'appellation MDQ, - on a recours-à un capillaire de silice fondue de 60cm, dont le diamètre interne est de 50hum, - on procède à une injection sous pression de 0,5 à 1,0 Psi pendant 5 secondes, sous mode cationique à 25°C, la différence de potentiel étant de 20 kilovolts.

- la concentration à l'injection est de 50lig par ml, - la détection est effectuée à 194nm, - la concentration en CD-carbinol est de 12 mM,

- on met en oeuvre un tampon d'élution constitué par 50mM de tampon phosphate à pH 3.0.

Les résultats obtenus sont réunis dans le Tableau II ci-après dans lequel Tml (minutes), Tm2 (minutes) signifient respectivement le temps de migration en minutes des couples d'énantiomères de l'Ephédrine, du Kétoprofène et du Diperodon et dans lequel RS désigne le facteur de résolution.

TABLEAU II SOLUTE RACEMIQUE CD-CARBINOL Tml (min) Tm2 (min) RS ; EPHEDRINE Pep 1-F2 13, 6 13, 7 0, 6 Pep 2-F'4 13,5 14,4 4,1 Pep 3-F'1 13,7 14,0 3,3 KETOPROFENE Pep 1-F2 14, 0 14, 1 0, 4 Pep 2-F'4 20, 6 20,8 0,2 Pep 3-F'1 23,1 24,3 3,7 DIPERODON Pep 1-F2 8, 76 8, 93 1, 3 Pep 2-F'4 11,62 11,74 1,1 Pep 3-F'1 12,86 13,68 3,2

L'examen des résultats réunis dans le tableau II permet de conclure que les CD-CARBINOLS sont utiles en séparation chromatographique d'énantiomères constitutifs de molécules chirales et également en caractérisation (par homologie de leurs temps de rétention respectifs) et en quantification de chaque énantiomère par rapport à l'autre.