本发明属于天然产物领域，具体涉及三个环七 肽类化合物及其在制备抗肿瘤 药物中的应用。 背景技术:

恶性肿瘤是目前严重危害人类生命和生活质量 的主要疾病之一，现已成为我 国居民的主要死因， 占死亡原因 20 %以上。 20世纪下半叶以来， 世界恶性肿瘤 与死亡均呈上升趋势， 尤其是 70年代以后， 恶性肿瘤以年均 3 %〜5 %的速度递 增。 世界卫生组织预测， 到 2020年， 将有 2000万新发恶性肿瘤病例， 其中死亡 人数达 1200万， 且绝大部分将发生在发展中国家。 在恶性肿瘤的三大疗法中， 药物治疗占用重要的地位。在合成化学类药物 中多数都是以天然抗肿瘤活性成分 为先导化合物的。据报道， 1984年到 1995年， 天然产物占上市抗肿瘤药物的 60 %以上， 1995-1999年， 3 个天然产物衍生物作为新的抗肿瘤药物上市， 由此可 见， 天然产物是结构新颖和作用独特的抗肿瘤药物 的重要来源。 发明内容:

本发明的第一个目的是提供三个具有抗肿瘤活 性的环七肽类化合物及其药 用盐。

本发明的环七肽类化合物及其药用盐， 其结构如式 （ I ) 所示：

式 （ I ) 其中， 化合物 1 : Ri=H， R ₂ =H; 或化合物 2: Ri=OH, R ₂ =H; 或化合物 3 : Ri=OH, R ₂ =Me。

本发明人在海洋真菌活性次级代谢产物筛选的 基础上， 发现真菌 Acremonium persicinum SCSIO 115的发酵提取物对神经胶质瘤细胞株 （SF-268 ) 和乳腺癌细胞株（MCF-7 )有抑制活性， 以活性跟踪为指导， 分离纯化到 3个活 性化合物， 经结构分析， 3个活性化合物为环七肽类化合物， 具体结构如式（ I ) 所示，其中化合物 1 : Ri=H， R ₂ =H;化合物 2: Ri=OH, R ₂ =H;化合物 3 : Ri=OH, R ₂ =Me。 通过对化合物 1、 化合物 2和化合物 3的抗肿瘤活性评价， 发现化合物 1、化合物 2和化合物 3对神经胶质瘤细胞株（SF-268)、乳腺癌细胞株� ��MCF-7 ) 和人大细胞肺癌细胞株 （NCI-H460 ) 具有明显抑制作用， 尤其是化合物 1 和化 合物 3对肿瘤细胞株 SF-268和 MCF-7的抑制作用要强于临床一线化疗药物顺 铂。

因此本发明的第二个目的是提供如式 （ I )所示的化合物 1、 化合物 2或化 合物 3， 或其药用盐在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种抗肿瘤药物， 其特征在于， 包括有效量的作 为活性成份的如式 （ I ) 所示的化合物 1、 化合物 2或化合物 3， 或其药用盐， 和药学上可以接受的载体。

本发明的环七肽类化合物-化合物 1、化合物 2和化合物 3是新的化合物，对 肿瘤细胞具有明显的抑制作用， 可以用于制备抗肿瘤药物， 用于治疗肿瘤， 因此 本发明为开发新的抗肿瘤药物提供了备选化合 物，对开发中国海洋药物资源具有 重要的意义。

本发明的真菌 Acremom' m pera'dm m SCSIO 115， 该菌株保存于中国科学院 南海海洋研究所海洋生物资源可继续利用重点 实验室，地址： 中国广东省广州市 海珠区新港西路 164号， 邮编： 510301， 该菌株是对外销售的， 公众可以从该保 藏中心购买到该菌株。 具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明， 而不是对本发明的限制。

实施例 1 : 如式 （ I ) 所示的化合物 1、 化合物 2和化合物 3的制备和结构鉴定 一、 如式 （ I ) 所示的化合物 1、 化合物 2和化合物 3的制备

1. 种子培养：

( 1 ) 配制种子培养基： 土豆 （去皮） 200 g， 葡萄糖 20 g， 海盐 30 g， 加水 定容到 1 L， 平均分装于 10个 500mL的锥形瓶中， 121 °C灭菌 25分钟， 获得灭 菌的种子培养基。

(2)种子的培养： 将海洋真菌 Acremom' m pera dm m SCSIO 115的菌株接 入到上述种子培养基中， 在 28 °C的温度下， 置摇床上以 150 rpm的转速， 培养 48小时得种子培养液。

2. 发酵培养：

( 1 ) 配制发酵培养基： 土豆 （去皮） 1500 g， 葡萄糖 150 g， 海盐 225 g， 蛋白胨 37.5 g， 加水定容到 7.5 L， 平均分装于 30个 1000 mL的锥形瓶， 121 V 灭菌 25分钟， 获得灭菌的发酵培养基。

(2) 发酵培养：

在超净工作台中，将 50 mL种子培养液接入装有 250 mL发酵培养基的 1000 mL锥形瓶中， 置于 28 °C摇床上， 以 150 rpm的转速， 培养 7天， 获得海洋真菌 Acremonium persicinum SCSIO 115的发酉孝培养物。

3. 提取分离：

将上述发酵培养物过滤得菌体和发酵液， 发酵液用 2 kg大孔树脂吸附三次， 然后用乙醇 （2 L) 洗脱大孔吸附树脂 3次， 乙醇洗脱液在低于 50°C下减压浓縮 得发酵液浸膏； 菌体用丙酮 （1 L) 提取三次， 丙酮提取液在低于 50°C下减压浓 縮得菌体浸膏， 合并发酵液浸膏和菌体浸膏 （8.28 g) 。 该浸膏经硅胶 （100-200 目） 柱层析分离， 采用氯仿 -甲醇 (体积比 100:0， 95:5， 9: 1， 8:2， 1 : 1， 0: 100) 梯度淋洗， 经减压浓縮后， 相应的得到馏分 Fr. l〜Fr.6。 馏分 Fr.2 (体积比为 95:5 的氯仿 -甲醇洗脱的馏分）， 经凝胶 sephadex LH-20柱层析， 采用氯仿 -甲醇（体 积比为 1 : 1 ) 作为洗脱剂恒梯度洗脱， 经 TLC指导合并获得馏分 Fr.2-l〜Fr.2-4。

Fr.2-1 (主点 RF值 0.2-0.3之间， 展开剂为体积比为 95:5的氯仿-甲醇）， 经硅胶 ( 100-200目） 柱层析， 以氯仿 -甲醇作为洗脱剂， 从体积比 100:0→95:5梯度洗 脱， 经 TLC指导合并获得馏分 Fr.2-1-1〜 Fr.2-l-7。 Fr.2-1 -6 (体积分数为 96:4的 氯仿-甲醇洗脱的馏分）， 经反相中压柱层析， 用 ODS色谱柱 (20 x 90 mm, 40-63 μηι, YMC), 以甲醇-水作为洗脱剂， 流速 15 mL/min， 0-50min, 体积比 30:70→ 80:20， 得到化合物 1 (t _R 24 min， 15.6 mg)。 Fr.2- 1-7 (体积分数为 95 :5的氯仿 -甲醇洗脱的馏分），经硅胶（100-200目）柱层� ��， 以乙酸乙酯 -甲醇作为洗脱剂， 从体积比 98:2→95 :5梯度洗脱， 获得馏分 Fr.2- 1 -7- l〜Fr.2- 1-7-4。 Fr.2- 1-7-2 (体积 分数为 97:3的乙酸乙酯 -甲醇洗脱的馏分） ， 再经反相制备液相， 用 ODS色谱 柱 （YMC-Pack ODS-A, 250 10 mm, 5 μ)， 以 CH ₃ CN-H ₂ 0作为洗脱剂梯度洗 脱， 流速 2.5mL/min， 0-30min, 体积比 50:50→100:0， 得化合物 3 (t _R 14.9 min, 6.7 mg)。 Fr.2-1-7-3 (体积分数为 96:4的乙酸乙酯 -甲醇洗脱的馏分） ， 再经反 相中压柱层析， 用 ODS色谱柱 C20 90 mm, 40-63 μηι, YMC), 以甲醇-水作为洗 脱齐 [J，流速 15 mL/min, 0-60min,体积比 40:60→ 100: 0，得到化合物 2 (t _R 33 min, 86.2 mg

二、 化合物 1、 化合物 2和化合物 3的结构鉴定

对化合物 1、 化合物 2和化合物 3进行结构分析测试， 得到以下理化性质数 据：

化合物 1 · 白色晶体； [c¾ ⁵ = - 80 ( c = 0.2, CHC1 ₃ ); 1H NMR (500MHz， CDC1 ₃ ) 禾口 ¹³ C NMR (500MHz, CDC1 ₃ ) 数据， 见表 1 ; HR-ESI-MS mJz 864.4648 ([M-H]—， C ₄₈ H ₆₃ N ₇ 0 ₈ ， 理论值 864.4665)。

化合物 2. 白色针状固体； [α]η = - 85 ( c = 0.2, CHCl ₃ -MeOH = 1 : 1); 1H NMR (500MHz, CDC1 ₃ ) 禾卩 ¹³ C NMR (500MHz， CDC1 ₃ )数据， 见表 1 ; HR-ESI-MS mJz 882.4777 ([M+H] ⁺ , C ₄₈ H ₆₃ N ₇ 0 ₉ ， 理论值 861.4687)。

化合物 3. 白色针状固体； [ ]η = - 60 ( c = 0.2, CHC1 ₃ ); 1H NMR (500MHz， CDC1 ₃ )和 ¹³ C NMR (500MHz, CDC1 ₃ )数据， 见表 1 ; HR-ESI-MS m/z 896.4925 ([M+H]+， C ₄₉ H ₆₅ N ₇ 0 ₉ ， 理论值 896.4917)。

化合物 1的 X晶体衍射结构分析： C ₄₉ H ₆₉ N ₇ 0 _1Q ， M 864， 空间群为 1^2^ 晶胞 参数 a = 12.4995(14) A, b = 13.3874(14) A, c = 14.8616(15) A, a = 90。， β = 99.9697(11)°, γ = 90。， V = 2449.31(5) A ³ , Z = 2， D _calcd = 1.242 g/cm ³ , μ = 0.711 mm" ¹ , F(000) = 984. 晶胞体积 0.34 0.23 0.18 mm ³ . 独立衍射点 8779 [R _in , = 0.0881]. 最终指数 Ri = 0.0426, wR ₂ = 0.1061 [I > 2σ(Ι)] . 表 1: 环七肽化合物 1、 2、 3的 NMR数据 （500/125 MHz, TMS 为内标， ppm)

1 2 3

multi . (J in multi. (J in

multi. . (J in Hz) position Hz) Hz)

遍 ePhe/丽 eTyr

168.7

CO 168.4 C 168.6 C

C

5.56 (1H， dd， 54.6 5.40 (1H， dd，

α 54.5 CH 54.9 CH 5.46 (1H， dd， 11.5， 5.0)

12.0, 4.5) CH 11.5， 5.0)

35.2 3.28 (1H， dd， 14.7, 34.1

β 3.09 (1H， m) 34.3 CH 3.18 (1H， dd， 15.0， 5.0)

CH ₂ 12.0) CH ₂

2.90 (1H， dd，

3.02 ^a 2.97 (1H， dd， 15.0， 5.0)

15.0， 5.0)

127.3

1 136.8 C 127.2 C

C

129.7 130.6

2,6 7.15-7.16 (2H, m) 6.93 (2H, d， 8.3) 130.7 CH 6.98 (2H, d, 8.0)

CH CH

128.6 115.3

3,5 7.38-7.40 (2H, m) 6.54 (2H, d， 8.3) 115.7 CH 6.59 (2H, d, 8.0)

CH CH

126.8 155.3

4 7.35 (1H， m) 155.3 C

CH C

30.1 29.9

遍 e 3.03 (3H, s) 2.97 (3H, s) 29.8 CH ₃ 3.02 (3H, s)

CH ₃ CH ₃

Leu

174.1

CO 174.1 C 174.3 C

C

47.6

a 47.6 CH 4.92 (1H， t， 9.5) 4.87 (1H， m) 47.8 CH 4.97 (1H， dd， 12.5, 9.0)

CH

39.9 39.9 I.39 (IH, t，

β 1.34 (1H， t， 12.0) 40.0 CH ₂ 1.44 (1H， t, 12.5 )

CH ₂ CH ₂ II.5)

0.21 (IH, t，

0.12 (1H， t， 12.0) 0.23 (1H， t, 12.5)

11.5)

24.8

y 24.8 CH 1.55 (1H， m) 1.51 (1H， m) 24.9 CH 1.56 (1H， m)

CH

23.7 23.5

6 _A -Me 0.91 (3H, d， 7.0) 0.91 (3H, d， 7.0) 23.8 CH ₃ 0.95 (3H, d, 6.5)

CH ₃ CH ₃

20.8 19.5

6 -Me 0.84 (3H, d， 7.0) 0.86 (3H, d， 7.0) 21.0 CH ₃ 0.85 (3H, d, 6.5 )

CH ₃ CH ₃

M 8.20 (d, 9.5) 8.16 (d， 8.0) 8.20 (1H， d, 9.0 )

Val/IIe

171.1

CO 170.9 C 171.4 C

C

4. 0 (1H， 9.5， 58.2 4.33 (1H， dd，

a 58.1 CH 56.0 CH 4.57 (1H， dd， 9.5， 3.0)

2.5) CH 9.5， 3.2)

28.4

β 28.5 CH 2.63 (1H， m) 2.60 (1H， m) 35.2 CH 2.39 (1H， m)

CH

16.3 20.7

y 0.80 (3H, d， 7.0) 0.81 (3H, d， 7.0) 26.6 CH ₂ 1.22 (2H, m) ;

CH ₃ CH ₃

19.6 16.2

δ- Me 0.89 (3H, d， 7.0) 0.78 (3H, d， 7.0) 12.0 CH ₃ 0.89 (3H, t, 7.4)

CH ₃ CH ₃

β- Me 14.4 CH ₃ 0.80 (3H, d, 7.0)

NH 5.88 (1H， d， 9.5) 5.94 (1H， d， 9.5) 5.87 (1H， d, 9.5)

NMeTyr

170.7

CO 170.4 C 170.4 C

C

a 69.2 CH 3.40 (1H， dd， 69.0 3.40 (1H， m) 69.3 CH 3.39 (1H， m) 11.5, 3.5) CH

32.4 32.4

3.16 (1H， 3.14 (1H， m) 32.1 CH ₂ 3.16 (1H， d， 11.5)

CH ₂ CH ₂

2.72 (1H， 2.71 (1H， m) 2.70 (1H， m)

126.7

127.0 C 127.0 C

C

129.8 129.7

2,6 6.22 (2H, 6.21 (2H, d， 8.4) 130.0 CH 6.21 (2H, d， 6.5)

CH CH

115.7 115.6

6.53 (2H, 6.47 (2H, d， 8.4) 115.8 CH 6.53 (2H, d， 6.5)

CH CH

155.3

155.3 C 155.7 C

C

40.4 40.3

丽 e 2.61 (3H, 2.59 (3H, br s) 40.5 CH ₃ 2.56 (3H, s )

CH ₃ CH ₃

Phe

170.2

CO 170.5 C 170.3 C

C

49.8

50.1 CH 5.36 (1H， m) 5.26 (1H， m) 50.2 CH 5.29 (1H， m) CH

3.05 (1H， dd， 12.3, 38.0 3.04 (1H， dd，

38.1 CH ₂ 3.06 (1H， d， 12.5)

11.7) CH ₂ 12.5, 11.5 )

2.82 (1H， dd， 2.74 (1H， dd，

2.71 (1H， d， 12.5)

12.3, 3.0) 12.5, 3.0)

137.3

137.4 C

C

130.1

2,6 7.12-7.15 (2H, m) .30 (2H, m) 130.1 CH 7.25 (2H, t， 6.5)

CH

128.5

7.31-7.32 (2H, m) .36 (2H, m) 128.6 CH 7.33 (2H, t， 6.5)

CH

126.6

4 7.05 (1H， m) .28 (1H， m) 126.7 CH 7.31 (1H， m)

CH

NH 8.61 (1H， d， 9.5) 8.55 (1H， d， 8.0) 8.59 (1H， d， 10.0) 丽 eGly

168.0

CO 168.2 C 168.1 C

C

50.8 50.8 5.29 (1H， d，

5.40 (1H， d， 18.0) 50.8 CH ₂ 3.30 (1H， d， 17.5)

CH ₂ CH ₂ 17.5)

3.28 (1H， d，

3.33 (1H， d， 18.0) 5.34 (1H， d， 17.0)

17.5)

35.5 35.5

丽 e 2.91 (3H, s) 2.85 (3H, s) 35.8 CH ₃ 2.87 (3H, s)

CH ₃ CH

Pro

172.5

CO 172.3 C 172.6 C

C

58.1 38 (1H， dd，

a 57.8 CH 4. 39 (1H， 57.7 CH 4.37 (1H， dd， 9.0， 2.5)

CH 2, 3.2)

31.4 31.4

β 2. 42 (1H， 40 (1H， rr 31.5 CH ₂ 2.42 (IH, m)

CH ₂ CH ₂

2. 04 (1H， 98 (1H， rr 2.02 (IH, m)

22.0 22.0

y 1. 78 (1H， 84 (1H， rr 22.2 CH ₂ 1.87 (IH, m)

CH ₂ CH ₂

1. 85 (1H， 77 (1H， rr 1.77 (IH, m)

48.4 48.4

δ 3. 60 (1H， 70 (1H， rr 48.6 CH ₂ 3.75 (IH, m

CH ₂ CH ₂

3. 77 (1H， 55 (1H， rr 3.58 (IH, m)

³ Overlapped with 3.03.

根据以上理化数据分析可知， 化合物 1、 化合物 2和化合物 3的具体结构如 式 （ I ) 所示:

式 （ I )

其中， 化合物 1 : Ri=H， R ₂ =H; 或化合物 2: Ri=OH, R ₂ =H; 或化合物 3: Ri=OH, R ₂ =Me。

实施例 2:

对实施例 1的环七肽类化合物-化合物 1、化合物 2和化合物 3的抗肿瘤细胞 的实验

采用国际通用的肿瘤细胞株， 即： 神经胶质瘤细胞株 （SF-268), 乳腺癌细 胞株 （MCF-7), 和人大细胞肺癌细胞株 （NCI-H460)。 试验方法为国际通用的 SRB法： 根据细胞生长速度， 将处于对数生长期的肿瘤细胞以 180 μΙ7孔接种于 96孔板， 贴壁生长 24小时再加药 （不同浓度的化合物 1、 化合物 2和化合物 3 的生理盐水溶液） 20 μΙ7孔。 每个浓度设 3复孔。 并设相应浓度的生理盐水溶媒 对照及无细胞凋零孔。 肿瘤细胞在 37 °C、 5%的 C0 ₂ 条件下培养 72小时， 倾去 培养液， 每孔加入 50 μΐ的 50 %冷 TCA固体细胞， 然后采用 0.4%的 SRB染色 30分钟， 用 1%的乙酸洗涤 5次， 空气干燥。 最后加入 200μΙ7孔的 Tris溶液， 酶 标仪 570 nm波长测定 OD值。 以顺铂作为阳性对照。 实验结果见表 2: 表 2 化合物 1、 2、 3对肿瘤细胞株的抑制作用 （Κ: ₅ 。, μΜ)

SF-268 MCF-7 NCI-H460

化合物 1 3.66士 0.28 2.95士0.16 11.65士 0.54

化合物 2 45.63士 5.43 82.66士 1.77 NA ^a 化合物 3 3.22士 0.16 2.68士0.16 4.46士 0.31

顺铂 （Cispaltin ^b ) 4.59士 0.12 10.23士0.41 1.56士 0.13

>100μΜ. Positive control.

上述实验结果表明， 化合物 1、 化合物 2和化合物 3对肿瘤细胞有明显抑制 作用，尤其是化合物 1和 3对肿瘤细胞株 SF-268和 MCF-7的抑制作用要强于临 床一线化疗药物顺铂。

因此本发明为研制新的抗肿瘤药物提供了新的 先导化合物，对开发中国海洋 药物资源具有重要的意义。