Die vorliegende Erfindung betrifft Verbindungen der weiter unten abgebildeten Formel I und Indikator-gekoppelte

Verbindungen, die beide Cyclosporinderivate sind. Die

erfindungsgemäßen Verbindungen zeigen keine immunosuppressive Wirkung und finden Verwendung in der Medizin, insbesondere in der Behandlung von Erkrankungen wie viralen Infektionen, entzündlichen Erkrankungen, Krebs, degenerativen

Muskelerkrankungen, neurodegenerativen Erkrankungen und

Schädigungen, welche mit Beeinträchtigung der Calcium-

Homöostase einhergehen. Die vorliegende Erfindung betrifft zudem eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine erfindungsgemäße Verbindung und optional verschiedene

Zusatzmittel. Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Anreicherung von Wirkstoffen in einem extrazellulären Raum eines multizellularen Objekts. Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die

Verwendung diverser Cyclosporinderivate zur Herstellung von erfindungsgemäßen Verbindungen.

Biologisch wirksame Moleküle, sogenannte „Wirkstoffe", bei denen es sich in der Regel um pharmazeutische Wirkstoffe handelt, entfalten ihre Wirkung meist sowohl innerhalb wie auch außerhalb von biologischen Zellen. Dabei ist bisher vornehmlich das Problem aufgetreten, dass Wirkstoffe, die ihre Wirkung nur innerhalb der Zelle entfalten sollen, bereits vor Durchtritt durch die Zellmembran unerwünschte Veränderungen im extrazellulären Raum verursachen. Hierbei tritt zusätzlich das Problem auf, dass ein und derselbe Wirkstoff innerhalb und außerhalb der Zelle eine unterschiedliche Wirkung entfalten kann. Die eigentliche Wirkung umfasst somit zwei Komponenten - die erwünschte intrazelluläre und die nicht erwünschte

extrazelluläre Wirkung. Um die intrazelluläre Wirkung zu erreichen, musste - da der Transport zur Zelle in der Regel die Durchquerung eines extrazellulären Raumes beinhaltet - notwendigerweise oft auch die extrazelluläre (Neben) Wirkung in Kauf genommen werden. Ebenso kann auch nur die extrazelluläre Wirkung erwünscht und die intrazelluläre Wirkung unerwünscht sein. Vor allem in der Medizin ist eine Reihe von Wirkstoffen bekannt, die in der Zelle nicht nur nicht die beabsichtigte Wirkung entfalten, sondern sogar toxisch wirken bzw. eine anderweitig schädigende Wirkung verursachen. Hinzu kommt, dass zur Erzielung einer bestimmten, extrazellulären Wirkung eine weit höhere Dosis verabreicht werden muss als eigentlich benötigt, um den

„Verlust" der in das Zellinnere abgewanderten Wirkstoffe zu kompensieren .

Wirkstoffe können extrazellulär und/oder intrazellulär auf Moleküle oder Strukturen wirken. Solche biologischen Moleküle können beispielsweise Enzyme, Inhibitoren, Aktivatoren oder Rezeptoren sein. Unter „Strukturen" ist beispielsweise die extrazelluläre Matrix zu verstehen, die aus der Gesamtheit der Makromoleküle, die sich außerhalb der Plasmamembran von Zellen in Geweben und Organen befinden, gebildet ist. Mehrere Veröffentlichungen zeigen, dass Cyclosporine sowohl intrazelluläre als auch extrazelluläre Wirkungen entfalten können. Cyclosporine können sowohl intrazellulär als auch extrazellulär an Proteine, wie Cyclophiline binden. Diese Proteine sind in der wissenschaftlichen und Patent-Literatur umfassend beschrieben, wie z.B. in WO 2010/012073. Cyclosporine und ihre Derivate bewirken eine Vielzahl von Effekten, die therapeutisch genutzt werden können. So können sie

beispielsweise einen Einfluss auf

Neuroprotektion/Neurogeneration, Chaperon-Aktivität , HIV- Infektion, Krebs oder Alzheimer haben. Ein Beispiel für die erwünschte Wirkung dieser Verbindungen ist die PPIase- Inhibition. Die PPIase (Peptidyl-Prolyl-Isomerase) -Inhibitoren können zwar zwischen den einzelnen PPIase-Familien (Nature Chemical Biology. 3 (10) : 619-29, 2007; Cellular & Molecular Life Sciences. 63 (24) : 2889-900, 2006; Current Topics in

Medicinal Chemistry. 3 ( 12 ): 1315-47 , 2003; Advances in Protein Chemistry. 59:243-82, 2001) unterscheiden, haben aber oft ähnliche Hemmkraft gegenüber Sequenz-ähnlichen

Familienmitgliedern. Da PPIasen innerhalb einer Familie unterschiedlichste biochemische Reaktionen beeinflussen können, hängt die diagnostische oder pharmakologische Wirkung verabreichter Wirkstoffe unmittelbar von der erreichten

Konzentration in unterschiedlichsten Verteilungsräumen ab. So sind z.B. einige dieser PPIase-Inhibitoren (z.B. Biopolymers 84(2006)125-146; Chemical & Pharmaceutical Bulletin.

54 (3) : 372-376, 2006; Chemistry & Biology. 10(l):15-24, 2003; Nucleic Acids Research. 29 (3) : 767-773, 2001), wie z.B. das therapeutisch verwendete Cyclosporin A, in Wasser nur schwer löslich. (DE 19859910) .

Das ursprünglich aus dem Pilz Tolypocladium inflatum isolierte Cyclosporin A wird beispielsweise in medizinischen Anwendungen zur Unterdrückung von Immunreaktionen verwendet. Cyclosporine sind im Sinne dieser Erfindung zyklische Peptide aus 11 Aminosäuren (Undecapeptide) . Darunter sollen alle

Cyclosporine A bis I sowie deren Derivate wie in Helvetica Chimica Acta _65_ (1982), 1655-1677 beschrieben und alle

Cyclosporine K bis Z sowie deren Derivate wie in Helvetica

Chimica Acta 7_0 (1987), 13-36 beschrieben verstanden werden. Die Cyclosporine können erfindungsgemäß auch - wie in der WO 99/18120 beschrieben - deuteriert sein. Cyclosporin A (auch Ciclosporin) ist ein zyklisches

Oligopeptid, welches intrazellulär eine Calcineurin-hemmende Wirkung entfaltet. Ein so wirkendes Cyclosporin zeichnet sich durch einen selektiven und reversiblen Mechanismus der

Immunosuppression aus. Es blockiert selektiv die Aktivierung von T-Lymphozyten über die Produktion von bestimmten

Zytokinen, die an der Regulierung dieser T-Zellen beteiligt sind. Dabei wird vor allem die Synthese von Interleukin-2 gehemmt, wodurch gleichzeitig die Proliferation von

zytotoxischen T-Lymphozyten, die z. B. für die Abstoßung von fremdem Gewebe verantwortlich sind, supprimiert wird. Das Cyclosporin wirkt intrazellulär durch Bindung an die so genannten Cyclophiline oder Immunophiline, die zur Familie der Cyclosporin-bindenden Proteine gehören. Es ist erfindungsgemäß bevorzugt, dass die erfindungsgemäßen Verbindungen diese intrazelluläre Wirkung nicht aufweisen.

Inhibitoren von Cyclophilinen weisen ein sehr großes

therapeutisches Spektrum auf, wie z.B. die Behandlung von Erkrankungen des Atmungstraktes, wie z.B. Asthma, chronisch obstruktive Lungenerkrankung (COPD) , Lungenentzündung oder

Emphysem (Expert Opinion on Investigational Drugs 12 (2003) 647- 653, Biodrugs 8(1997) 205-215, American Journal of Respiratory Cell & Molecular Biology 20(1999)481-492), StoffWechselerkrankungen wie Diabetes (Transplantation

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Verdauungstraktes (Bone Marrow Transplantation 26 (2000) : 545- 551, Pharmaceutical Research 20(2003)910-917), Störungen des Immunsystems (Immunology Letters 84(2002)137-143, Acta

Biochimica Polonica 49(2002)233-247, Entzündungen (Journal of Periodontal Research 42(2007)580-588, Journal of Neurology, Neurosurgery & Psychiatry 76(2005)1115-1120, Transplant

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Immunantwort bei Organtransplantation (Bone Marrow

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Experimental Ophthalmology 34(2006)347-353), bei multipler Sklerose ( Immunopharmacology & Immunotoxicology 21(1999)527- 549, Journal of Neuroimaging 7(1997)1-7), Erkrankungen die durch Ischemie verursacht wurden, wie z.B. Infarkte des

Herzens (Annais of Thoracic Surgery 86(2008)1286-1292, Acta Anaesthesiologica Scandinavica 51(2007)^-909-913), des Pankreas (Pancreas 32(2006)145-151) oder des Hirns (Annais of Vascular Surgery 20(2006)243-249, Neurological Research 27(2005)827- 834), Nierenerkrankungen wie z.B. Glomerulonephritis

(Nephrology Dialysis Transplantation 19(2004)3207, Nephron 91(2002)509-511), Geschwulste (Journal of Investigative

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chronischer Leukemie (Cancer Chemotherapy & Pharmacology

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Förderung des Haarwachstums (Archives of Dermatological

Research 296 ( 6) : 265-269, 2004, Annales de Dermatologie et de Venereologie 127(2000)769). Aufgrund der therapeutischen

Anwendungsbreite stellen sie in der Medizin eine wichtige Substanzklasse dar. Sollen Cyclosporine oder deren Derivate für die Behandlung der genannten Krankheiten eingesetzt werden, so ist ein Nachteil vieler bisher bekannter Cyclosporinderivate, dass sie neben der erwünschten therapeutischen Wirkung auch immunsuppressiv wirken. Die immunsuppressive Wirkung ist in diesen Fällen jedoch eine unerwünschte Nebenwirkung, die es zu unterdrücken gilt. Es ist bekannt, dass Cyclosporine und ihre Derivate in der Lage sind Cyclophiline zu inhibieren. Dringen die

Cyclosporinverbindungen jedoch in eine Zelle ein, so können die Komplexe aus Cyclosporinverbindung und Cyclophilin die Serin-Threonin-Phosphatase Calcineurin inhibieren. Die

Inhibition von Calcineurin führt dann zu der unerwünschten Nebenwirkung der Immunsuppression. Es existieren jedoch auch Cyclophiline im extrazellulären Raum, deren Inhibition mit Cyclosporinverbindungen zu erwünschten therapeutischen

Wirkungen führt. Ist es also möglich, Cyclosporinverbindungen bereitzustellen, die sowohl hinsichtlich des erwünschten therapeutischen Zwecks Wirkung zeigen, als auch nicht in der Lage sind in Zellen einzudringen, dann könnten die

unerwünschten Nebenwirkungen vermieden werden.

Es war somit die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Cyclosporinderivate bereitzustellen, die die erwünschten therapeutischen Wirkungen aufweisen, ohne dass es zu der

Nebenwirkung der Immunsuppression kommt. Insbesondere war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung Wirkstoffe

bereitzustellen, die therapeutisch wirksam sind, jedoch nicht in das Zellinnere eindringen können.

Insbesondere war es eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung Verbindungen bereitzustellen, die gegen folgende Erkrankungen therapeutisch helfen, ohne dabei immunsuppressiv zu wirken: a) virale Infektionen b) akute und chronische entzündliche Erkrankungen

c) Krebs

d) degenerative Muskelerkrankungen

e) neurodegenerative Erkrankungen, und

f) Schädigungen, welche mit Beeinträchtigung der Calcium-

Homöostase einhergehen, wobei die virale Infektion durch Viren wie HIV, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis D und Hepatitis E

ausgelöst werden kann, wobei die entzündliche Erkrankung vorzugsweise Asthma, chronische Entzündungen, chronische Prostatitis,

Glomerulonephritis, multiple chemische Empfindlichkeit, entzündliche Darmerkrankungen, Sepsis, Entzündungen der vaskulären glatten Muskelzellen, Aneurysma, Entzündungen im Beckenbereich, Reperfusionsschäden, rheumatoide Arthritis, Vasculitis, Psoriasis und ulzerative Kolitis einschliesst , wobei die Krebserkrankung vorzugsweise Lungenkrebs,

Blasenkrebs, Leberkrebs, Pankreaskrebs und Brustkrebs umfaßt, wobei die degenerative Muskelerkrankung vorzugsweise

Muskeldystrophy, Kollagen IV-Myopathien und den myokardialen Reperfusionsschäden betrifft, wobei die neurodegenerative Erkrankung vorzugsweise ausgewählt ist aus der Alzheimer Erkrankung, Parkinson, Huntington, multiple systemische Atrophie, multiple Sklerose, zerebrale Kinderlähmung, Schlaganfall, diabetische Neuropathie,

amyotrophe Lateral-Sklerose, Rückenmarkschäden und

ZerebralSklerose, wobei die Erkrankung, die mit einem Verlust der zellulären Calcium-Homöostase einhergeht, vorzugsweise Herzinfarkt,

Schlaganfall, akute Hepatotoxizität , Cholestase und

Reperfusionsschäden von transplantierten Organen betrifft, und

Überraschenderweise wurde gefunden, dass die Derivatisierung der Aminosäure 1 von Cyclosporinen mit geeigneten Imidazol-, Oxazol- oder Thiazolderivaten deren Eigenschaften so verändern kann, dass die so veränderten Ciclosporine eine veränderte Zellpermeabilität aufweisen. Insbesondere die Einführung von chemischen Gruppierungen in die oben beschriebenen

erfindungsgemäßen Imidazol-, Oxazol- oder Thiazolderivate, wie z.B. einer Säuregruppierung, kann die Eigenschaften der

Cyclosporine so verändern, dass sie sich im extrazellulären Raum anreichern und nicht in die Zellen eindringen.

Eine wesentliche Eigenschaft, welche durch die Derivatisierung von Cyclosporinen mit geeigneten Imidazol-, Oxazol- oder

Thiazolderivaten erhalten wird, ist die Fähigkeit der so erhaltenen neuen Cyclosporin-Derivate die Peptidyl-Prolyl- cis/trans-Isomeraseaktivität von humanen Cyclophilinen

weiterhin zu hemmen, vorzugsweise mit einem ICso-Wert von < 100 nMol, ohne dabei die Serin-Threonin-Phosphatase Calcineurin zu hemmen und ohne dabei in die Zellen einzudringen. Die oben genannte Aufgabe wird durch die Bereitstellung von Verbindungen der folgenden Formel I gelöst:

worin A eine Aminosäure der folgenden Formel II ist,

wobei die Bindungen, die an den gewellten Linien enden,

Verknüpfungen zu den Einheiten B und K darstellen und

R9 eine Gruppe der folgenden Formel III ist, und

bei der R ₈ einer Gruppe der folgenden Formel IV entspricht, oder

bei der R ₈ einer Gruppe der folgenden Formel V entspricht, oder

bei der Rg einer Gruppe der folgenden Formel VI entspricht, oder

bei der Rg einer Gruppe der folgenden Formel VII entspricht, oder

bei der Rg einer Gruppe der folgenden Formel VIII entspricht, in der die Reste L-R ₂ und R ₃ an den gleichen oder verschiedenen Phenylringen gebunden sein können, oder

bei der Rg einer Gruppe der folgenden Formel IX entspricht, und in der die Reste L-R ₂ und R ₃ an den gleichen oder an

verschiedenen Ringen Q ₂ oder Q3 gebunden sein können, oder

bei der Rg einer Gruppe der folgenden Formel X entspricht, in der die Reste L-R ₂ und R ₃ an den gleichen oder an verschiedenen Ringen Q ₂ oder Q3 gebunden sein können, oder

bei der Rg einer Gruppe der folgenden Formel XI entspricht, in der die Reste L-R ₂ und R ₃ an den gleichen oder an verschiedenen Ringen Q ₂ oder Q3 gebunden sein können, oder

bei der Rg einer Gruppe der folgenden Formel XII entspricht, in der die Reste L-R ₂ und R ₃ an den gleichen oder verschiedenen Phenylringen gebunden sein können, oder

bei der Rg einer Gruppe der folgenden Formel XIII entspricht,

wobei

die Bindungen in den Formeln IV bis XIII, die an den gewellten Linien enden, an die CH ₂ ~Gruppe der Formel III binden, an der R ₈ verknüpft ist; wobei

die Gruppe der Formel II über ihr CO kovalent zu der alpha- Aminosäure B in Formel I unter Ausbildung einer Amidbindung gebunden ist und N-R ₀ in der Formel II kovalent zu einer

Carboxylgruppe von K unter Ausbildung einer Amidbindung gebunden ist, wobei

B eine Aminosäure ist, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist :

alpha-Aminobuttersäure ;

Alanin;

Threonin;

Valin;

Norvalin; und

in der Seitenkette mit einer Hydroxylgruppe modifizierte Moleküle von alpha-Aminobuttersäure,

Alanin, Threonin, Valin oder Norvalin;

C für Sarkosin steht; D eine Aminosäure ist, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist :

Leucin;

N-Methylleucin;

Valin;

Gamma-Hydroxy-N-Methylleucin; und

Gamma-Hydroxyleucin;r E eine Aminosäure ist, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:

Valin;

Norvalin; und

einem modifizierten Valin oder Norvalin, bei dem ein Kohlenstoffatom der Seitenkette mit einer Hydroxylgruppe substituiert ist; F eine Aminosäure ist, die aus der folgenden Gruppe ausgewählt ist:

Leucin;

N-Methylleucin;

Gamma-Hydroxy-N-Methylleucin; und

Gamma-Hydroxyleucin;

G gleich alpha-Aminobuttersäure oder Alanin ist;

H gleich D-Alanin oder D-Serin ist;

I und J Aminosäuren sind, die unabhängig voneinander aus der folgenden Gruppe ausgewählt sind:

Leucin;

N-Methylleucin;

Gamma-Hydroxy-N-Methylleucin; und

Gamma-Hydroxyleucin; K gleich N-Methylvalin oder Valin ist; wobei

die Aminosäuren B bis K unter Ausbildung von Amidbindungen miteinander verknüpft sind; wobei

die verwendeten Symbole und Indices die folgenden Bedeutungen aufweisen :

X steht für O, S, oder N-Ri ;

Y steht für O, S, N-Ri, -CH ₂ - oder -CH ₂ CH ₂ -; A steht für CH oder N;

L steht für eine Bindung, -CH ₂ -, -CH ₂ CH ₂ -, -CH ₂ CH ₂ CH ₂ -, - CH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂ -, -CH=CH-, -CH=CHCH ₂ -, -CH ₂ CH=CH-, - CH ₂ CH ₂ CH=CH-, -CH ₂ CH=CHCH ₂ -, -CH=CHCH ₂ CH ₂ - , -OCH ₂ -,

-OCH ₂ CH ₂ -, -OCH ₂ CH ₂ CH ₂ -, -OCH ₂ CH=CH-, -CONH-, -CONHCH ₂ -, -

CONHCH ₂ CH ₂ -, -CONHCH ₂ CH ₂ OCH ₂ CH ₂ -, -CONHCH ₂ CH ₂ OCH ₂ CH ₂ OCH ₂ CH ₂ - ;

Q1 steht zusammen mit den beiden Atomen des ankondensierten Rings für einen aromatischen oder heteroaromatischen Ring aus der Gruppe Benzol, Pyridin, Pyrimidin, Pyridazin,

Pyrazin, Triazin, Thiophen, Furan, Pyrrol, Thiazol,

Isothiazol, Oxazol, Isoxazol, Imidazol, Pyrazol;

Q ₂ steht zusammen mit den beiden Atomen des ankondensierten Rings für einen aromatischen oder heteroaromatischen Ring aus der Gruppe Benzol, Pyridin, Pyrimidin, Pyridazin, Pyrazin, Triazin, Thiophen, Furan, Pyrrol, Thiazol, Isothiazol, Oxazol, Isoxazol, Imidazol, Pyrazol, Thiadiazol, Oxadiazol, Triazol; Q3 bezeichnet jeweils den Sechsring in dessen Mitte es steht; R0 steht für H oder CH ₃ ; R1 steht für H, (C1-C4) -Alkyl oder Benzyl, die auch durch

eine Gruppe -COOH substituiert sein können; R2 steht für eine polare deprotonierbare Gruppe P _s , oder

eine Gruppe P _s die unter physiologischen Bedingungen in P _s umgewandelt werden kann, oder

eine polare protonierbare Gruppe P _b , oder

eine Gruppe P _b die unter physiologischen Bedingungen in P _b umgewandelt werden kann; R3 steht für H, (C1-C6) -Alkyl, (C1-C6) -Alkoxy, -OH, (C1-C6) - Alkylthio, (C1-C6) -Alkylsulfonyl, -SH, -CF ₃ , -COOH,

-COO ( (C1-C6) Alkyl) ) , -CONH ₂ , -CONH ( (C1-C6) Alkyl) , - CO ( (C1-C6) Alkyl) 2, Nitro, Halogen, Cyano, Amino, (Cl- C6) Alkyl-amino, (C1-C6) Dialkyl-amino ; R3 kann auch in Form eines freien Elektronenpaares vorliegen, insbesondere dann, wenn es an ein Heteroatom des Ringes Qi, Q ₂ oder Q3 bindet/binden würde; R4 und R5 stehen unabhängig voneinander für H, (C1-C6) -Alkyl,

(C1-C6) -Alkoxy, -CF ₃ , Halogen oder können zusammen eine Gruppe -OCH ₂ O- oder -OCH ₂ CH ₂ O- bilden, wenn R ₄ und R5 in Positionen ortho zueinander am Ring gebunden sind; R4 und R5 können auch unabhängig voneinander in Form eines freien Elektronenpaares vorliegen, insbesondere dann, wenn R ₄ oder R ₅ an ein Heteroatom des Ringes Qi bindet/binden würde; R ₇ steht für H, -OH, -OCOOR12, -OCOR13, -OCONRi ₄ Ri5#

-0- (tetrahydropyran-2-yl) , -0- (tetrahydrofuran-2-yl) , -0-

CHR16-OR17, -SiRi ₈ Ri9R2o; R10 und R ₁₁ stehen unabhängig voneinander für H, (C1-C6)-

Alkyl, -CF3, Halogen oder können zusammen eine Gruppe -CH ₂ CH ₂ -, -CH ₂ CH ₂ CH ₂ -, -CH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂ - oder - CH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₂ - bilden; R1 ₂ steht für (C1-C6) -Alkyl, Benzyl oder Phenyl, wobei die Alkylgruppe gegebenenfalls durch Fluor oder Chlor

substituiert und Benzyl und Phenyl gegebenenfalls durch einen oder mehrere Substituenten aus der Gruppe (C1-C6) - Alkyl, (C1-C6) -Alkoxy, -CF3, Cyano, Nitro oder Halogen substituiert sein kann;

R13 steht für H oder R _i2 ;

R14 und R15 stehen unabhängig voneinander für H, (C1-C6) - Alkyl, Benzyl oder Phenyl, wobei Benzyl und

Phenyl gegebenenfalls durch einen oder mehrere Substituenten aus der Gruppe (C1-C6) -Alkyl, (Cl- C6) -Alkoxy, -CF3, Cyano, Nitro oder Halogen substituiert sein können;

R16 steht für H oder (C1-C6) -Alkyl;

R17 steht für (C1-C6) -Alkyl, Benzyl oder Phenyl; und R18, R19 und R ₂₀ stehen unabhängig voneinander für (C1-C6) -

Alkyl, Benzyl oder Phenyl. Die Erfindung beinhaltet auch alle pharmazeutisch akzeptablen Salze, sowie tautomere, enantiomere und andere stereoisomere Formen von Verbindungen der Formel I .

Wenn Namen von Aminosäuren ohne die Nomenklatur-Zusätze D- und L- nach Fischer verwendet werden, so sind erfindungsgemäß beide Varianten denkbar, vorzugsweise ist es jedoch das in der Natur natürlich vorkommende Isomer (meist L-Isomer) . Wird ein entsprechender Nomenklatur-Zusatz verwendet, so ist das entsprechende Isomer erfindungsgemäß bevorzugt.

Die Gruppen P _s und P sind entweder ionische Gruppen, d.h.

anionische Gruppen P _s oder kationische Gruppen P _b , oder

Gruppen, die in Lösung leicht in ionische Gruppen P _s oder P _b übergehen. Vorzugsweise liegen diese Gruppen im Bereich von pH6 bis pH8 ganz oder teilweise in ionischer Form vor. Gruppen P _s können aber auch polare Gruppen sein, die ein

Wasserstoffatom tragen, welches mit stärkeren Basen

abgespalten werden kann, wobei dieses Wasserstoffatom

vorzugsweise an ein Heteroatom gebunden ist.

Beispiele von sauren Gruppen P _s sind die folgenden: a) -COOH, -S0 ₃ H, -CONH2, -CONHNH2, -SO2NH2, -PO3H2, -

PO(OH) (NH ₂ ), -CO(NHOH), -CO (NH (0-Cl-C4-Alkyl) ) , -CSNH ₂ , - NHCONH2, -N(OH)CONH ₂ , -NHCO (NHOH) - , -NHCSNH ₂ , -CSNHNH ₂ ; b)

und R = - (Cl-C4-Alkyl) ,

-0 (Cl-C4-Alkyl) , -NH (Cl-C4-Alkyl) , -NH (Cl-C4-Alkenyl) (substituiertes) Aryl, (substituiertes) O-Aryl,

(substituiertes) NH-Aryl, -CF ₃ und andere fluorierte

C4-Alkyl) gruppen; c)

d) und R = (Cl-C4-Alkyl) , (substituiertes) Aryl, -CF ₃ und andere fluorierte (Cl-C4-Alkyl) gruppen;

e)

und R = - (Cl-C4-Alkyl) , -0 (Cl-C4-Alkyl) , - NH (Cl-C4-Alkyl) , -NH (Cl-C4-Alkenyl) , (substituiertes) Aryl, (substituiertes) O-Aryl, (substituiertes) NH-Aryl, -CF ₃ und andere fluorierte (Cl-C4-Alkyl) gruppen;

, in denen und R = H, - (Cl-C4-Alkyl)

-CF ₃ und andere fluorierte (Cl-C4-Alkyl) gruppen .

-OH und -SH, mit den Maßgaben, dass L eine kovalente Einfachbindung darstellt, und dass-OH oder -SH nur als Substituent an einem Ring Qi, Q ₂ oder Q ₃ auftreten kann und dabei an ein Kohlenstoffatom gebunden ist, das in Nachbarschaft zu einem Stickstoffatom steht. Es ist erfindungsgemäß besonders bevorzugt, dass die Gruppe P _s eine der folgenden Gruppen ist, welche vorzugsweise direkt über eine kovalente Bindung an den Heterocyclus der Formeln IV - XII gebunden ist: -COOH, - -SH, -CONH ₂ , -CONHNH ₂ , -SO3H, -S0 ₂ NH ₂ , und die

Gruppe , mit den Maßgaben, dass, wenn P _s gleich -OH oder -SH ist, L eine kovalente Einfachbindung darstellt, und - OH oder -SH an einem Ring Qi, Q ₂ oder Q ₃ an ein Kohlenstoffatom gebunden ist, das in Nachbarschaft zu einem Stickstoffatom steht .

Beispiele von basischen Gruppen P _b sind die folgenden: a)

, in der R _a , R _b und R _c für H und - (Cl-C4-Alkyl) stehen, R _a und R _b zusammen - (CH2CH2) - oder - (CH2CH2CH2) - und R und R _c zusammen mit dem Stickstoffatom Pyrrolidin, Piperidin oder Morpholin sein können; b)

, in der R _a , R _b , R _c und R _d für H und - (C1-C4-

Alkyl) stehen, R _a und R _b , R _a und R _d sowie R _b und R _d

zusammen - (CH2CH2) - oder - (CH2CH2CH2) - und R _b und R _c zusammen mit dem Stickstoffatom Pyrrolidin, Piperidin oder Morpholin sein können; c) eine Aminogruppe ausgewählt aus -NH ₂ , (C1-C6) Alkyl-amino, (C1-C6) Dialkyl-amino, Pyrrolidin, Piperidin, Morpholin oder Piperazin, welches in Position 4 durch (C1-C6) Alkyl, - (C1-C6) Alkanoyl, Benzyl, Benzoyl oder Phenyl

substituiert sein kann, wobei diese Substituenten

optional eine Gruppe -COOH tragen können.

Es ist erfindungsgemäß besonders bevorzugt, dass die Gruppe P _b eine der folgenden Gruppen ist, welche direkt über eine kovalente Bindung an den Heterocyclus der Formeln IV - XII gebunden ist:

Gruppen P _s oder P _b können auch eine Grupp sein, in der R eine Aminosäure oder ein Aminosäureamid ist, die über ihre Aminogruppe gebunden sind, oder ein Peptid, welches aus 2 - 10 Aminosäuren besteht und in dem die

endständige Aminosäure auch ein Aminosäureamid sein kann.

Bevorzugte Peptidgruppen enthalten mindestens eine Aminosäure aus der Gruppe D-Glutaminsäure, L-Glutaminsäure, D- Asparaginsäure, L-Asparaginsäure, D-Glutamin, L-Glutamin, D- Asparagin, L-Asparagin, D-Cysteinsulfonsäure, L- Cysteinsulfonsäure, D-Arginin oder L-Arginin. Bevorzugt sind Peptidgruppen der Formel

Unter einer Aminosäure wird in der vorliegenden Anmeldung jegliche organische Verbindung verstanden, die eine Aminogruppe und eine Carbonsäuregruppe oder Sulfonsäuregruppe enthält. Bevorzugt sind in der vorliegenden Anmeldung jedoch die natürlich vorkommenden Aminosäuren.

Die Gruppen P _s ^λ und P _b ^λ sind Gruppen, die unter physiologischen Bedingungen in Gruppen P _s bzw. P _b umgewandelt werden können. Verbindungen, die Gruppen P _s ^λ oder P _b ^λ enthalten, werden als „Prodrugs" bezeichnet. Solche Verbindungen müssen nicht zwangsläufig nicht-zellgängig sein, aber sie wandeln sich idealerweise nach Applikation in nicht-zellgängige Derivate um, vorzugsweise nach oraler Applikation, so dass sie dann am Wirkort nicht in die Zelle penetrieren können.

Beispielsweise können Carbonsäueester als Prodrugs für

Carbonsäuren (P _s = -COOH) verwendet werden (K. Beaumont, et al., Current Drug Metabolism (2003), 461-485). Beispiele von Carbonsäureestern P _s ^λ = -COOR enthalten die Reste R a) (Cl-C6-Alkyl) , (C2-C6-Alkenyl) , Phenyl oder Benzyl, in denen der aromatische Ring weitere Substituenten tragen kann, vorzugsweise -CH ₃ , -CH ₂ CH ₃ , -CH ₂ CH ₂ CH ₃ , -CH(CH ₃ ) ₂ , -

CH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₃ , -CH (CH ₃ ) CH ₂ CH ₃ , -CH ₂ CH=CH ₂ , Benzyl; b) (Cl-C6-Alkyl) , in welchem Wasserstoffatome durch Halogen ersetzt sind, vorzugsweise -CF ₃ , -CH ₂ CC1 ₃ ; c) (Cl-C6-Alkyl) , in welchem ein Wasserstoffatom durch -OH,

(Cl-C6-Alkoxy) oder eine substituierte Aminogruppe ersetzt ist, vorzugsweise -CH ₂ OCH ₃ , -CH ₂ CH ₂ OCH ₃ , -CH ₂ CH ₂ OH,

-CH ₂ CH ₂ N (CH ₃ ) ₂ , -CH ₂ CH ₂ (morpholin-4-yl) ; , in denen R _e für H oder

(Cl-C4-Alkyl) und R _f für (Cl-C4-Alkyl) oder (C3-C6- Cycloalkyl) steht, vorzugsweise R _e = H, -CH ₃ , -CH ₂ CH ₃ , - CH(CH ₃ ) ₂ und R _f = -CH ₃ , -CH ₂ CH ₃ , -CH(CH ₃ ) ₂ , -C(CH ₃ ) ₃ ,

Cyclohexyl ;

Es ist besonders bevorzugt, dass die Gruppe P _s ^λ eine der folgenden Gruppen ist: -COOCH ₃ , -COOCH ₂ CH ₃ , -COOCH ₂ CH ₂ CH ₃ ,

-COOCH ₂ CH ₂ CH ₂ CH ₃ , -COOCH ₂ CH (CH ₂ CH ₃ ) ₂ , -COOCH (CH ₃ ) ₂ , -COOC(CH ₃ ) ₃ , -COOCH ₂ CH ₂ N (CH ₃ ) ₂ oder -COOCH ₂ CH ₂ (morpholin-4-yl) .

Als Prodrugs von basischen Gruppen P _b wie Amidine und Guanidine können ihre acylierten Derivate P _t , ^λ =

denen Z = 0, S, NH oder NCH ₃ und R _g = (Cl-C4-Alkyl) , (C3-C6- Cycloalkyl) oder Benzyl ist, vorzugweise Z = 0 und R _g = -CH ₃ , - CH ₂ CH ₃ , -CH ₂ CH ₂ CH ₃ , -CH(CH ₃ ) ₂ , Benzyl.

Es ist insbesondere bevorzugt, dass R ₂ aus der Gruppe von

Resten ausgewählt ist, die aus folgendem besteht: -COOH, -OH, -SH, -CONH ₂ , -CONHNH2, -SO3H, -SO2NH2, -COOCH3, - COOCH2CH3, -COOCH2CH2CH3, -COOCH2CH2CH2CH3, -COOCH2CH (CH2CH3) 2, -COOCH (CH ₃ ) 2, -COOC(CH ₃ ) ₃ , -COOCH ₂ CH ₂ N (CH ₃ ) 2 oder - COOCH2CH2 (morpholin-4-yl) , die Gruppen

Weiterhin bevorzugt ist in der erfindungsgemäßen Verbindung nach Formel I der Rest Ro gleich -CH ₃ . Die Gruppe R ₇ ist bevorzugt aus der Gruppe ausgewählt, die aus -OH, -OCOCH3, -OCOOCH3, -OCH2OCH3, -Si(CH ₃ ) ₃ und -Si (CH ₃ ) ₂ C (CH ₃ ) 3 besteht. R ₇ steht besonders bevorzugt für -OH.

Die bivalente Gruppe L ist vorzugsweise aus der Gruppe

ausgewählt, die aus einer Bindung, vorzugsweise einer

kovalenten Einfachbindung, -CH ₂ -, -CH ₂ CH ₂ -, -CH=CH-, -CONH- und -OCH2- besteht. Besonders bevorzugt ist L eine kovalente

Einfachbindung . Weiterhin besonders bevorzugt ist es, dass R2 für -COOH, -SO3H, -SO2NH2, Tetrazol-5-yl, -C=NH(NH ₂ ) oder -NH-C=NH (NH ₂ ) steht und die bivalente Gruppe L eine kovalente Bindung darstellt.

Die Gruppe Ri steht besonders bevorzugt für H oder CH3, noch stärker bevorzugt für H. Desweiteren ist es bevorzugt, dass X für N-Ri, stärker

bevorzugt für NH, steht.

Der Ring Qi ist besonders bevorzugt Benzol, Pyridin oder

Pyrimidin, am stärksten bevorzugt Benzol.

Die Ringe Q ₂ und Q3 sind jeweils unabhängig voneinander

bevorzugt Benzol. Am meisten bevorzugt ist es, wenn in einer Verbindung, die beide Ringe trägt, beide Ringe Q ₂ und Q3 Benzol sind .

Die bivalente Einheit Y ist besonders bevorzugt 0, S, -CH ₂ - oder -CH2CH2-.

Bevorzugt ist es zudem, wenn R ₃ aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus H, -COOH, CH ₃ , OCH ₃ , F, Cl, Br und CN besteht.

Besonders bevorzugt steht R ₃ für H und F, ganz besonders bevorzugt für H.

R ₄ und R5 sind besonders bevorzugt jeweils unabhängig

voneinander gleich H oder F, noch stärker bevorzugt gleich H.

Die Gruppe A steht besonders bevorzugt für CH.

Die Gruppen Rio und RH sind besonders bevorzugt jeweils unabhängig voneinander gleich H oder CH ₃ , noch stärker

bevorzugt gleich H.

Desweiteren ist es bevorzugt, dass die Gruppe Rs eine Gruppe der Formel IV, V, VII, IX oder XI ist. Besonders bevorzugt ist die Gruppe Rs eine Gruppe der Formel IV.

Ist die Gruppe Rs eine Gruppe der Formel IV, so ist in einer bevorzugten Ausführungsform Qi gleich Benzol und X gleich NH, L gleich eine kovalente Einfachbindung oder -CH=CH-, R2 gleich - COOH, -CONH2, -CONHNH2, -SO3H, -SO2NH2, -COOCH3, -COOCH2CH3, - COOCH2CH2CH3, -COOCH2CH2CH2CH3, -COOCH2CH (CH2CH3) 2, -COOCH (CH ₃ ) 2, - COOC(CH ₃ ) ₃ , -COOCH ₂ CH ₂ N (CH ₃ ) 2 oder -COOCH ₂ CH ₂ (morpholin-4-yl) oder eine der Gruppen

R ₃ gleich H, -COOH, -COOMe oder F, vorzugsweise H, R ₄ gleich H oder F, vorzugsweise H, und R5 gleich H.

Ist die Gruppe Rs eine Gruppe der Formel IV, so ist in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform Qi gleich Pyridin oder Pyrimidin und X gleich NH. Dabei ist es besonders bevorzugt, dass Qi gleich Pyrimidin, L gleich eine kovalente

Einfachbindung, R2 gleich SH, OH oder NH2, vorzugsweise SH oder OH, R ₃ gleich H, SH, OH oder NH ₂ , vorzugsweise H, SH oder OH, und R4 und R5 vorzugsweise nicht vorhanden sind (da an dieser Stelle die Heteroatome im Pyrimidinring sitzen) . Ist die Gruppe Rs eine Gruppe der Formel IX, X oder XI, so ist in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform X gleich NH, A gleich CH, Q2 gleich Benzol, L gleich eine kovalente

Einfachbindung, R2 gleich -SO ₃ H oder -COOH und R3 gleich H. Ist die Gruppe Rs eine Gruppe der Formel XIII, so sind in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform Ri, Rio und RH gleich H. Desweiteren ist es bevorzugt, dass das Grundgerüst der Formel I eine substituierte Cyclosporin A Verbindung ist, die der folgenden Formel entspricht:

wobei R9 die gleichen Bedeutungen wie weiter oben oder weiter unten definiert aufweist.

Zudem ist es besonders bevorzugt, dass die Verbindung der Formel I ein substituiertes Cyclosporin A-Derivat der

folgenden Formel ist:

Alle in den verschiedenen Ausführungsformen angeführten

Merkmale der Verbindung der voranstehenden Formel I können - sofern sie sich nicht gegenseitig ausschließen - miteinander erfindungsgemäß kombiniert werden. Sofern in den genannten Ausführungsformen Reste der Verbindung der voranstehenden Formel I nicht explizit in der genannten Ausführungsform definiert sind, so können sie erfindungsgemäß jedwede in dieser Anmeldung angegebene allgemeine oder spezielle

Definition innehaben.

Beispielhaft für Verbindungen der voranstehenden Formel I werden die folgenden Verbindungen Ac-CsA-Aldehyd, TBDMS-CsA- Aldehyd und Ac-CsA-Säure angeführt, welche als

Ausgangsverbindungen zur Synthese von Verbindungen der Formel I dienen können, die sich vom Cyclosporin A ableiten:

Verbindungen 1, 2 und 3: Ac-CsA-Aldehyd, TBDMS-CsA-Aldehyd und Ac-CsA-Säure (CsA heißt Cyclosporin A) (nachstehend) :

wobei R9 folgender Struktur entspricht:

und wobei im Falle der Verbindung 1 PG gleich eine

Acetylgruppe (Ac) und W = H, im Falle von der Verbindung 2 PG gleich eine tert-Butyldimethylsilylgruppe (TBDMS) und W = H, und im Falle von der Verbindung 3 PG gleich eine Acetylgruppe (Ac) und W = OH ist.

Besonders bevorzugt sind in der vorliegenden Erfindung die folgenden Verbindungen 4 bis 68 als Verbindungen der Formel I





Die vorstehend und nachstehend aufgelisteten Gruppen in dieser Anmeldung binden an der Stelle, an der die Bindung mit der gewellten Linie endet.

Wenn bei den Verbindungen 4 bis 68 tautomere Formen denkbar sind, sollen diese ebenso mit dem angegebenen Tautomer

abgedeckt und Gegenstand der vorliegenden Anmeldung sein.

Als erfindungsgemäß besonders bevorzugt haben sich die

Verbindungen 5, 13, 20, 22, 28, 31, 33, 34, 35, 37, 42, 43, 45, 46 und 48, insbesondere die Verbindungen 5 und 33,

erwiesen .

Unter einem (C1-C4 ) -Alkyl bzw. (C1-C6) -Alkyl versteht man in der vorliegenden Anmeldung eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 4 bzw. 1 bis 6 C-Atomen, stärker

bevorzugt 1 bis 4 C-Atomen und noch stärker bevorzugt 1 bis 3 C-Atomen. Einzelne -CH- oder -CH ₂ ~Gruppen können durch N, NH, 0 oder S ersetzt sein. Ebenso können 1 oder mehrere H-Atome der Alkylgruppe durch Fluoratome ersetzt sein. Beispiele für diese Gruppen sind die folgenden: Methyl, Ethyl, n-Propyl, iso-

Propyl, n-Butyl, iso-Butyl, s-Butyl, t-Butyl, 2-Methylbutyl, n-Pentyl, s-Pentyl, t-Pentyl, n-Hexyl, 2, 2- (Di-ethyl) -ethyl, Trifluormethyl , Pentafluorethyl und 2, 2, 2-Trifluorethyl, wobei Methyl und Ethyl bevorzugt sind.

Unter einem (C2-C6) -Alkenyl versteht man in der vorliegenden Anmeldung eine geradkettige oder verzweigte Gruppe aus

Kohlenwasserstoffeinheiten mit 2 bis 6 C-Atomen, vorzugsweise 2 bis 4 C-Atomen und besonders bevorzugt 2 bis 3 C-Atomen, bei denen eine oder mehrere Doppelbindungen, vorzugsweise eine

Doppelbindung, zwischen zwei C-Atomen vorliegt. Einzelne -CH- oder -CH ₂ ~Gruppen können durch N, NH, 0 oder S ersetzt sein. Ebenso können 1 oder mehrere H-Atome der Alkenylgruppe durch Fluoratome ersetzt sein. Beispiele für diese Gruppen sind die folgenden: Ethenyl, Propenyl, Butenyl, Pentenyl, Hexenyl, Insbesondere bevorzugt sind die Reste Ethenyl und Propenyl.

Unter einem -NH (Cl-C4-Alkenyl) versteht man in der

vorliegenden Erfindung ein wie vorstehend definiertes (C1-C4)- Alkenyl das über eine Einheit -NH- gebunden ist. Es gelten die gleichen Bevorzugungen wie sie für (C1-C4 ) -Alkenyl genannt sind . Unter einem (C3-C6) -Cycloalkyl versteht man in der

vorliegenden Erfindung eine cyclische Kohlenwasserstoffgruppe mit 3 bis 6 Ring-C-Atomen . Einzelne -CH ₂ ~Gruppen können durch N, NH, 0 oder S ersetzt sein. Ebenso können 1 oder mehrere H- Atome der Alkylgruppe durch Fluoratome ersetzt sein. Beispiele für diese Gruppen sind die folgenden: Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl und Cyclohexyl. Besonders bevorzugt ist

Cyclohexyl .

Unter einem (C1-C6) -Alkoxy bzw. einem -0 (Cl-C4-Alkyl) versteht man in der vorliegenden Erfindung ein (C1-C6) -Alkyl bzw. ein (C1-C4 ) -Alkyl wie vorstehend definiert, das über ein

Sauerstoffatom gebunden ist. Besonders bevorzugt sind hier Methoxy und Ethoxy. Unter einem (C1-C6) -Alkylthio versteht man in der vorliegenden Erfindung ein (C1-C6) -Alkyl wie vorstehend definiert, das über ein Schwefelatom gebunden ist. Besonders bevorzugt sind hier Methylthio und Ethylthio. Unter einem (C1-C6) -Alkylsulfonyl versteht man in der

vorliegenden Erfindung ein (C1-C6) -Alkyl wie vorstehend definiert, das über eine Sulfonylgruppe gebunden ist. Besonders bevorzugt sind hier Methylsulfonyl und

Ethylsulfonyl .

Unter einem -COO ( (C1-C4) Alkyl) ) versteht man in der

vorliegenden Erfindung ein (C1-C4 ) -Alkyl wie vorstehend definiert, das über eine -COO-Gruppe gebunden ist, wobei das (C1-C4 ) -Alkyl an dem Sauerstoffatom bindet. Besonders

bevorzugt sind hier -COO-Methyl und -COO-Ethyl .

Unter einem (C1-C6) Alkyl-amino bzw. einem -NH (Cl-C4-Alkyl) versteht man in der vorliegenden Erfindung ein (C1-C6) -Alkyl bzw. (C1-C4 ) -Alkyl wie vorstehende definiert, das über eine Einheit -NH- bindet. Beispiele hierfür sind Methylamino oder Ethylamino . Unter einem (C1-C6) Dialkyl-amino versteht man eine sekundäre Aminogruppe, die zwei (C1-C6) -Alkyle wie vorstehend definiert trägt. Beispiele hierfür sind Dimethylamino und Diethylamino .

Unter einem (substituierten) Aryl versteht man in der

vorliegenden Erfindung einen mono- oder polycyclischen

(vorzugsweise mono-, bi- oder tricyclischen) aromatischen oder heteroaromatischen Kohlenwasserstoffrest mit vorzugsweise 5 bzw. 6 bis 10, stärker bevorzugt 5 oder 6 aromatischen

Ringatomen. Der aromatische oder heteroaromatische

Kohlenwasserstoffrest kann weiterhin Substituenten tragen.

Dabei wird unter einer aromatischen bzw. heteroaromatischen Einheit entweder ein einfacher aromatischer Cyclus, also

Benzol, bzw. ein einfacher heteroaromatischer Cyclus,

beispielsweise Pyridin, Pyrimidin, Thiophen, etc., oder eine kondensierte Aryl- oder Heteroarylgruppe, beispielsweise

Naphthalin, Chinolin, Isochinolin, Benzothiophen, Benzofuran und Indol etc., verstanden. Erfindungsgemäße Beispiele für die aromatische oder heteroaromatische Einheit sind demgemäß:

Benzol, Naphthalin, Furan, Benzofuran, Isobenzofuran,

Thiophen, Benzothiophen, Isobenzothiophen, Pyrrol, Indol, Isoindol, Pyridin, Chinolin, Isochinolin, Pyrazol, Indazol, Imidazol, Benzimidazol , Oxazol, 1,2-Thiazol, 1,3-Thiazol, Benzothiazol , Pyridazin, Benzopyridazin, Pyrimidin,

Benzpyrimidin, Chinoxalin, Pyrazin, Phenazin, 1 , 2 , 3-Triazol ,

1.2.4-Triazol, Benzotriazol , 1 , 2 , 3-Oxadiazol , 1, 2, 4-Oxadiazol,

1.2.5-Oxadiazol , 1, 3, 4-Oxadiazol, 1 , 2 , 3-Thiadiazol , 1,2,4- Thiadiazol, 1 , 2 , 5-Thiadiazol , 1, 3, 4-Thiadiazol, 1 , 3 , 5-Triazin, 1 , 2 , 4-Triazin, 1 , 2 , 3-Triazin, Tetrazol, 1 , 2 , 4 , 5-Tetrazin, 1, 2, 3, 4-Tetrazin, 1 , 2 , 3 , 5-Tetrazin, Purin, Pteridin und

Indolizin. Bevorzugt sind dabei Benzol, Naphthalin, Furan, Thiophen, Pyrrol, Pyrimidin, Pyrazin, 1 , 2 , 3-Triazol , 1,2,4- Triazol, Benzotriazol, 1 , 2 , 3-Oxadiazol , 1, 2, 4-Oxadiazol,

1 , 2 , 5-Oxadiazol , 1, 3, 4-Oxadiazol, 1 , 2 , 3-Thiadiazol , 1,2,4-

Thiadiazol, 1 , 2 , 5-Thiadiazol , 1, 3, 4-Thiadiazol, 1 , 3 , 5-Triazin, 1 , 2 , 4-Triazin, 1 , 2 , 3-Triazin, Tetrazol, 1 , 2 , 4 , 5-Tetrazin, 1, 2, 3, 4-Tetrazin, 1 , 2 , 3 , 5-Tetrazin, Purin, Pteridin, besonders bevorzugt Benzol.

Unter (substituiertes) O-Aryl bzw. (substituiertes) NH-Aryl versteht man in der vorliegenden Erfindung ein wie vorstehend definiertes (substituiertes) Aryl, das über ein Sauerstoffatom oder eine Einheit -NH- bindet.

Der Substituent am substituierten Aryl kann beispielsweise Methyl, Ethyl, Methoxy, Ethoxy, Fluor, Chlor, Brom,

Trifluormethyl, Pentafluorethyl , -OH, -SH, -NH ₂ , -CN oder -N0 ₂ sein .

Wie bereits weiter oben erwähnt, betrifft eine weitere

Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Indikatorgekoppelte Verbindung, die eine Verbindung der voranstehenden Formel I und eine Indikatorverbindung (Indikator) umfasst, wobei diese über eine kovalente Bindung miteinander verknüpft sind. Die Verknüpfung der Verbindung mit der Formel I liegt so vor, dass anstelle eines endständigen Atoms oder einer

endständigen Gruppe der Verbindung der Formel I eine Bindung zu dem Indikator, gegebenenfalls über einen Linker, vorliegt.

Der Indikator ist vorzugsweise an die Verbindung der Formel I kovalent gebunden. Der Indikator kann jedoch grundsätzlich mit dem Wirkstoff auf jede Art verbunden werden, die dem Fachmann als für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet bekannt ist.

Besonders bevorzugt ist der Indikator kovalent über einen Linker an die Verbindung der Formel I gebunden.

Bei dem Linker kann es sich im Rahmen der vorliegenden

Erfindung um jede Gruppe handeln, die dem Fachmann als für den erfindungsgemäßen Zweck geeignet bekannt ist. Bevorzugt handelt es sich dabei jedoch um eine Gruppe, die frei von einer Protease-Schnittstelle ist. Besonders bevorzugt wird der Linker ausgewählt aus Gruppen, welche einen Atomabstand von vier bis 40 Atomen, vorzugsweise 5 bis 30 und am

bevorzugtesten 6 bis 20 Atomen ausbilden.

Unter dem Begriff „Indikator" sind im Sinne der Erfindung Stoffe wie z.B. Farbstoffe, Spannungs-sensitive Indikatoren, pH-Wert Indikatoren, Calcium-sensitive Indikatoren,

radioaktive Elemente, NMR-Label oder aber Elektronenspinlabel zusammengefasst und in der wissenschaftlichen Literatur mehrfach beschrieben (WO/2005/022158, EP 0649022, US

6,596,499, US 7,090,995, US 4,672,044). Der Begriff Indikator umfasst im Sinne der Erfindung einzelne Atome oder Moleküle, welche kovalent mit dem Wirkstoffmolekül verbunden sind. Dabei kann ein Indikator oder auch mehrere Indikatoren direkt an das Wirkstoffmolekül kovalent gebunden sein. Der Indikator oder auch mehrere Indikatoren können aber auch an einen mehrfunktionellen Linker gebunden sein oder der Indikator oder auch mehrere Indikatoren können auch innerhalb eines sauren Peptids oder endständig an ein saures Peptid kovalent gebunden sein .

"Farbstoffe" sind im Sinne der Erfindung Stoffe, die optisch durch Detektion der von ihnen ausgesandten oder der durch sie nicht absorbierten elektromagnetischen Strahlung nachgewiesen werden können. Dazu gehören z.B. Farbstoffe wie

Fluoresceinisocyanat (FIC) , Flouresceinisothiocyanat (FITC) , Dimethylaminonaphthalen-S-sulphonylchlorid (DANSC) ,

Tetramethylrhodaminisothiocyanat (TRITC) , Lissaminrhodamin B200-Sulphonylchlorid (RB 200 SC) usw. Eine Beschreibung zahlreicher geeigneter Moleküle ist z.B. zu finden bei DeLuca, " Immunofluorescence Analysis", in „Antibody As A Tool",

Marchalonis et al . , Eds., John Wiley & Sons, Ltd., pp . 189- 231, (1985) .

"Spannungs-sensitive Indikatoren" sind im Sinne der Erfindung Stoffe, die in Abhängigkeit einer anliegenden elektrischen Potentialdifferenz oder des vorliegenden elektrischen

Potentials derart ihre physikalischen, optischen oder

katalytischen Eigenschaften ändern, dass diese ein

detektierbares Signal hervorrufen. Dem Fachmann bekannt sind spannungs-sensitive Indikatoren wie z. B. DIBAC [Japanese

Journal of Pharmacology 86(2001)342-350, American Journal of Physiology - Heart & Circulatory Physiology 287 (2004) H985- H993) . "pH-Wert-sensitive Indikatoren" sind im Sinne der Erfindung Stoffe, die in Abhängigkeit des pH-Wertes derart ihre

physikalischen, optischen oder katalytischen Eigenschaften ändern, dass diese ein detektierbares Signal hervorrufen. Solche Indikatorfarbstoffe, wie z.B. Phenolrot,

Bromthymolblau, Bromphenolblau u. v. a. sind dem Fachmann zahlreich bekannt.

"Calcium-sensitive Indikatoren" sind im Sinne der Erfindung Stoffe, die in Anwesenheit von Calcium derart ihre

physikalischen, optischen oder katalytischen Eigenschaften ändern, dass diese ein detektierbares Signal hervorrufen. Dem Fachmann bekannte Calcium-sensitive Indikatoren sind z.B. das Aequorin und andere Calcium-sensitive Farbstoffe wie z.B.

FURA-2.

"Radioaktive Elemente" im Sinne der Erfindung erzeugen z.B. Gammastrahlung, wie z.B. folgende Isotope ¹²⁴ J, ¹²⁵ J, ¹²⁸ J, ¹³¹ J, J oder Cr, wobei besonders das J bevorzugt sein soll. Andere, wie z.B. ^X1 C, ¹⁸ F, ¹⁵ 0 oder ¹³ N, können mittels ihrer

Positronenstrahlung und entsprechender Detektoren (Positronen- Emissions-Tomographie) nachgewiesen werden und andere, wie z.B. ¹¹¹ In, lassen sich mittels Elektroneneinfang („electron capture") nachweisen.

„NMR-Label" im Sinne der Erfindung sind Substanzen, in denen Atome mit ungerader Nukleonenanzahl (Summe der Protonen und Neutronen) enthalten sind. Solche Atomkerne, z.B. ¹³ C, ¹⁵ N oder ¹⁹ F, besitzen einen Kernspin und damit ein kernmagnetisches Moment.

„Elektronenspinlabel" dienen im Sinne der Erfindung der

Messung der „Electron Paramagnetic Resonance" mittels

Elektronenspinresonanz . Dabei wird die resonante

Mikrowellenabsorption einer Probe in einem äußeren Magnetfeld gemessen. Damit lassen sich Moleküle nachweisen, die über ein permanentes magnetisches Moment (ungepaarte Elektronen) verfügen (Physics in Medicine & Biology. 43(1998)U 3-U 4,

Clinical Chemistry & Laboratory Medicine. 46(2008)1203-1210)

Die Verwendung von Indikatoren ist besonders vorteilhaft, wenn die Indikator-gekoppelte Verbindung der voranstehenden Formel I in einem Diagnoseverfahren eingesetzt werden soll (z.B.

Anamneseerhebung, körperliche Untersuchung, Anwendung

bildgebender Verfahren wie Röntgen/MRT oder Analytik mit Laborwerten des Bluts und anderen Körperflüssigkeiten) .

Enthalten die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formel I noch einen oder mehrere Indikatoren, kann der Verteilungsraum des Wirkstoffs anhand dieser Indikatoren erkannt werden.

Indikatoren können überdies genutzt werden, um den Wirkstoff zu quantifizieren. Eine solche - beispielhaft erwähnte - erfindungsgemäße

Indikator-gekoppelte Verbindung ist beispielsweise die

folgende Verbindung 69:

wobei R9 folgender Struktur entspricht:

Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine Verbindung nach der voranstehenden Formel I oder die erfindungsgemäße Indikator-gekoppelte Verbindung zur

Verwendung in der Medizin. In anderen Worten wird eine

Verbindung der Formel I als pharmazeutisch-aktive Substanz bzw. als Arzneimittel, die erfindungsgemäße Indikator- gekoppelte Verbindung als Diagnosemittel in der Medizin eingesetzt. Die erfindungsgemäße Verbindung kann dabei zur Herstellung jedes Arzneimittels verwendet werden, das dem Fachmann als für die erfindungsgemäße Verbindung geeignet erscheint. Bevorzugt wird die erfindungsgemäße Verbindung zur Herstellung eines nicht-immunosuppressiv wirkenden

Arzneimittels verwendet. Arzneimittel werden als nicht- immunosuppressiv verstanden, wenn sie die Funktionen des Immunsystems nicht vermindern. Das Arzneimittel bzw. die erfindungsgemäße Verbindung (im folgenden nur Arzneimittel genannt) kann dabei in jeder Form verabreicht werden, die dem Fachmann als für den

beabsichtigten Zweck geeignet bekannt ist. Beispielsweise kann das Arzneimittel in einer Form, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Injektionen, Infusionen, Tabletten, Cremes,

Gels, Salben, Sprays, Kapseln, Sirupen, Emulsionen, Pudern, Pulvern, Zäpfchen oder Ähnlichen eingesetzt werden. Besonders bevorzugt ist dabei, dass das Arzneimittel in Form von Sprays, Salben, Injektionen oder Tabletten eingesetzt wird. Hierbei werden oft Zusatzmittel benötigt, die das Arzneimittel in eine verabreichbare Darreichungsform bringen.

Deshalb betrifft eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eine

Verbindung nach der voranstehenden Formel I und vorzugsweise ein oder mehrere Zusatzmittel enthält.

Die Wahl des Zusatzmittels hängt hierbei besonders von der Art der Verabreichungsform ab. Die Zusatzmittel sind vorzugsweise solche, die physiologisch verträglich sind und selbst nicht pharmazeutisch aktiv sind.

Bei der pharmazeutischen Zusammensetzung kann es sich um jede pharmazeutische Zusammensetzung handeln, die dem Fachmann als geeignet bekannt ist. In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der pharmazeutischen Zusammensetzung um Sprays, Salben, Injektionen oder Tabletten.

Anwendungsbereich der Verbindungen der voranstehenden Formel I, der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung und der erfindungsgemäßen Indikator-gekoppelten Verbindung können Therapie und Diagnose von Krankheiten aber auch kosmetischer

Art sein. Unter Therapie wird in erster Linie die Therapie von Krankheiten von Menschen und Tieren verstanden.

Besondere Vorteile der Verbindung nach der voranstehenden Formel I, der erfindungsgemäßen pharmazeutischen

Zusammensetzung und der erfindungsgemäßen Indikatorgekoppelten Verbindung liegen dabei in der Tier- und

Humanmedizin, bei der Applikation von Stoffen auf oder in Zellsuspensionen, Gewebekulturen, Transplantaten oder dem gesamten Säugetier.

Die vorliegende Erfindung betrifft des Weiteren die Verwendung von Verbindungen der voranstehenden Formel I bzw. der

erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung,

insbesondere der erfindungsgemäßen Indikator-gekoppelten

Verbindungen als Mittel zur Diagnosefindung.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Verbindung nach der voranstehenden Formel I oder eine erfindungsgemäße pharmazeutische Zusammensetzung zur Behandlung von folgenden Erkrankungen: a) virale Infektionen

b) akute und chronische entzündliche Erkrankungen

c) Krebs

d) degenerative Muskelerkrankungen

e) neurodegenerative Erkrankungen, und

f) Schädigungen, welche mit Beeinträchtigung der Calcium- Homöostase einhergehen.

In anderen Worten betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung einer Verbindung der voranstehenden Formel I oder der erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der oben unter a) bis f) genannten Erkrankungen. In noch anderen Worten betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Behandlung einer der unter a) bis f) genannten Erkrankung in einem

behandlungsbedürftigen Individuum umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Arzneimittels umfassend/bestehend aus eine (r) Verbindung nach der

voranstehenden Formel I oder die/der erfindungsgemäße (n) pharmazeutische (n) Zusammensetzung. Das zu behandelnde Individuum ist vorzugsweise ein Säugetier. Säugetiere können Menschen und Tiere sein.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine erfindungsgemäße Indikator-gekoppelte

Verbindung zur Diagnose von folgenden Erkrankungen: a) eine virale Infektionen

b) akute und chronische entzündliche Erkrankungen c) Krebs

d) degenerative Muskelerkrankungen

e) neurodegenerative Erkrankungen, und

f) Schädigungen, welche mit Beeinträchtigung der Calcium Homöostase einhergehen.

In anderen Worten betrifft die vorliegende Erfindung auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen Indikator-gekoppelten Verbindung zur Herstellung eines Medikaments zur Diagnose der oben unter a) bis f) genannten Erkrankungen. In noch anderen Worten betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Diagnose einer der unter a) bis f) genannten Erkrankung in einem behandlungsbedürftigen Individuum umfassend die

Verabreichung einer diagnostisch wirksamen Menge eines

Arzneimittels umfassend/bestehend aus eine (r)

erfindungsgemäßen Indikator-gekoppelten Verbindung. Das zu behandelnde Individuum ist vorzugsweise ein Säugetier.

Säugetiere können Menschen und Tiere sein.

Die zuvor genannte virale Infektion wird erfindungsgemäß vorzugsweise durch Viren wie HIV, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis D und Hepatitis E ausgelöst.

Die zuvor genannten entzündlichen Erkrankungen schließt erfindungsgemäß vorzugsweise Asthma, chronische Entzündungen, chronische Prostatitis, Glomerulonephritis, multiple chemische Emfindlichkeit , entzündliche Darmerkrankungen, Sepsis,

Entzündungen der vaskulären glatten Muskelzellen, Aneurysma, Entzündungen im Beckenbereich, Reperfusionsschaden,

rheumatoide Arthritis und Vasculitis ein.

Unter der zuvor genannten Krebserkrankung versteht man

erfindungsgemäß vorzugsweise - aber nicht abschließend - Lungenkrebs, Blasenkrebs, Leberkrebs, Pankreaskrebs und/oder Brustkrebs .

Die zuvor genannte degenerative Muskelerkrankung betrifft erfindungsgemäß vorzugsweise Muskeldystrophy, Kollagen IV- Myopathien und den myokardialen Reperfusionsschaden . Die zuvor genannten neurodegenerativen Erkrankungen werden erfindungsgemäß vorzugsweise ausgewählt aus: der Alzheimer Erkrankung, Parkinson, Huntington, multiple systemische

Atrophie, multiple Sklerose, zerebrale Kinderlähmung,

Schlaganfall, diabetische Neuropathie, amyotrophe laterale Sklerose, Rückenmarkschäden und Zerebralsklerose.

Die zuvor genannte Erkrankung, die mit einem Verlust der zellulären Calcium-Homöostase einhergeht, betrifft

erfindungsgemäß vorzugsweise Herzinfarkt, Schlaganfall, akute Hepatotoxizität , Cholestase und Reperfusionsschäden von transplantierten Organen.

Verbindungen der vorstehenden Formel I aus der vorliegenden Erfindung sind nicht-immunsuppressive, extrazellulär wirksame Inhibitoren der enzymatischen Aktivität von extrazellulären Cyclophilinen . Als solche sind die Verbindungen geeignet zur Behandlung und/oder Prävention von Cyclophilin-vermittelten akuten und chronischen Erkrankungen. Die Verbindungen sind bevorzugt aber nicht ausschließlich geeignet zur Behandlung oder Prävention von persistent oder chronisch entzündlichen Erkrankungen, neurogener Entzündung sowie

entzündungsassoziierter Fibrose und Ödembildung. Dies

beinhaltet, ist aber nicht beschränkt auf akut überschießende Entzündungsreaktionen (Verbrennungen, post-operative

Entzündung) , gastrointestinale Entzündung (Colitis, Morbus Crohn) , Sepsis, Erkrankungen des respiratorischen Systems (Asthma, chronisch obstruktive Lungenerkrankung) , entzündliche Vaskulopathien (Atherosklerose, Reperfusionsschaden) ,

rheumatoide Arthritis, entzündliche Hauterkrankungen

(Psoriasis, atopische Dermatitis) , Augenerkrankungen

(Keratokonj unktivitis ) und entzündliche Erkrankungen des peripheren und zentralen Nervensystems (Parkinson,

Schlaganfall, Multiple Sklerose) .

In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Anreicherung von Wirkstoffen in einem extrazellulären Raum eines multizellulären Objekts, umfassend die Schritte: - Bereitstellen einer Verbindung nach der voranstehenden

Formel I oder der erfindungsgemäßen Indikator-gekoppelten Verbindung;

- Inkontaktbringen einer der genannten Verbindungen mit

einem multizellulären Objekt.

Insbesondere handelt es sich bei der Anreicherung in dem erfindungsgemäßen Verfahren um eine in-vitro-Anreicherung . Darunter versteht man, dass das multizelluläre Objekt ein vom lebenden Organismus abgetrenntes Objekt ist.

Unter einem „extrazellulären Raum" sollen all die Bereiche verstanden werden, welche sich außerhalb des Zytosols und der das Zytosol umschließenden Membran befinden. Dazu gehört auch die beispielsweise in Zellsuspensionen vorhandene

Kulturlösung .

Bei dem multizellulären Objekt kann es sich um jedes Objekt handeln, das aus mindestens zwei gleichen oder

unterschiedlichen biologischen Zellen besteht.

Der Begriff „biologische Zelle" umfasst dabei sowohl

menschliche, tierische als auch pflanzliche und bakterielle Zellen sowie einzellige Lebewesen. Handelt es sich bei den biologischen Zellen um bakterielle Zellen oder einzellige Lebewesen, so wird unter dem Begriff „multizelluläres Objekt" eine Ansammlung mehrerer Zellen, wie beispielsweise eine

Zellkolonie einer Bakterienkultur verstanden. Handelt es sich bei den biologischen Zellen um menschliche oder tierische

Zellen, so wird unter dem Begriff „multizelluläres Objekt" ein separiertes Körperteil, wie beispielsweise ein Transplantat, insbesondere ein Organ-, ein Zell-, ein Gliedmaßen- oder ein Gewebetransplantat, Blut oder eine Blutfraktion, wie

beispielsweise Blutplasma oder eine in-vitro Kultur

menschlicher und/oder tierischer Zellen, wie beispielsweise eine zweidimensionale Gewebekultur oder eine Spheroidkultur der Zellen verstanden. Handelt es sich bei den biologischen Zellen um Pflanzenzellen, so wird unter dem Begriff

„multizelluläres Objekt" ein Teil einer Pflanze, wie

Beispielsweise Blätter, Wurzel oder Stängel oder auch eine ganze Pflanze verstanden.

Erfindungsgemäß handelt es sich bei dem multizellulären Objekt um ein separiertes Organ oder Körperteil, Blut oder eine

Blutfraktion, eine Zellkultur oder eine Pflanze. Desweiteren betrifft die vorliegende Erfindung auch die

Verwendung einer Verbindung der unten abgebildeten Formel XIV - unter die die Verbindungen 1 bis 3 fallen - zur Herstellung einer Verbindung nach der voranstehenden Formel I oder der erfindungsgemäßen Indikator-gekoppelten Verbindung, die sich von Cyclosporin A ableiten. In anderen Worten betrifft die vorliegende Erfindung also auch ein Verfahren zur Herstellung einer solchen Verbindung nach der voranstehenden Formel I oder erfindungsgemäßen Indikator-gekoppelten Verbindung unter

Verwendung einer Verbindung der Formel XIV.

Verbindung der Formel XIV:

worin Rg einen Rest der folgenden Formel darstellt

wobei R8 für -CHO oder -COOH steht; und wobei PG eine Alkohol-Schutzgruppe darstellt. Die Schutzgruppe PG ist in der Lage, eine Hydroxylgruppe zu schützen, so dass diese bei Umwandlungen an anderen funktionellen Gruppen im Molekül unverändert bleibt oder die ungeschützte

Hydroxylgruppe diese Umwandlungen nicht stört. Beispiele derartiger Schutzgruppen sowie Methoden zu ihrer Einführung und ihrer Abspaltung sind beschrieben in P.G.M.Wuts und

T.W.Greene: „Protective Groups in Organic Synthesis",

4. Aufläge, 2006; Kapitel „Schutz der Hydroxylgruppe".

Bevorzugte Schutzgruppen sind

Ether, insbesondere substituierte Ether wie z.B.

Methoxymethyl- , Methylthiomethyl- , Benzyloxymethyl- , tert- Butoxymethyl- , 2-Methoxyethoxymethyl-, 2-

(Trimethylsilyl) ethoxymethyl- , 2,2, 2-Trichlorethoxymethyl-, Tetrahydropyranyl- , Tetrahydrofuranyl- , 1-Ethoxyethyl-, 1- Methyl-l-methoxyethyl-, 1 -Methyl—1-benzyloxyethyl-, 2,2,2-

Trichlorethyl- , 2- (Trimethylsilyl) ethyl-, Allyl-, Benzyl-, 4- Methoxybenzyl- , 3, 4-Dimethoxybenzyl-, Diphenylmethyl- oder Triphenylmethylether;

Silylether wie z.B. Trimethylsilyl-, Triethylsilyl- ,

Triisopropylsilyl- , tert-Butyldimethylsilyl- , tert- Butyldiphenylsilyl- , Triphenylsilyl- oder

Diphenylmethylsilylether;

Ester wie z.B. Ester der Ameisen-, Essig-, Chloressig-,

Dichloressig- , Trichloressig- , Trifluoressig- , Pivalin- oder Benzoesäure;

Carbonate wie z.B. Methyl-, 9-Fluorenylmethyl- , Ethyl-, 2,2,2- Trichlorethyl- , 2- (Trimethylsilyl) ethyl-, Isobutyl-, Allyl-, 2-Propenyl-, 4-Nitrophenyl-, Benzyl-, 4-Methoxybenzyl- oder 3, 4-Dimethoxybenzylcarbonat .

Besonders bevorzugt sind Ether wie Methoxymethylether oder

Tetrahydropyranylether, Silylether wie Trimethylsilyl- (TMS) , tert-Butyldiphenylsilyl- (TBDPS) oder tert- Butyldimethylsilylether (TBDMS) oder eine Esterschutzgruppe wie Acetyl . Ganz besonders bevorzugt sind TBDMS oder Acetyl .

Derivate des Cyclosporin A der allgeneinen Formel I, welche Substituenten Rg der Formel IV bis Formel XIII tragen, können aus einer Verbindung der Formel XIV mit geeigneten

aromatischen, heteroaromatischen, aliphatischen oder

heteroaliphatischen primären Aminen hergestellt werden, welche an einem benachbarten Kohlenstoffatom eine unsubstituierte oder substituierte Aminogruppe (X = NRi) , eine Hydroxylgruppe (X = 0) oder eine Thiolgruppe (X = S) tragen. Vorzugsweise können die Aldehyde der Formel XIV (Rg = -CHO) verwendet werden. Im Falle dieser Umsetzung von Aldehyden der Formel XIV mit den Aminen wird die Reaktion in einem inerten

Lösungsmittel wie z.B. Ethanol, Methanol, Isopropanol,

Tetrahydrofuran (THF) , Dichlormethan, Chloroform,

Dimethylformamid (DMF) , N, -Dimethylacetamid (DMA),

Acetonitril oder Ethylylacetat , oder auch in Gemischen dieser Lösungsmittel, gegebenenfalls auch in Gegenwart von Wasser durchgeführt. Bevorzugte Lösungsmittel sind Methanol,

Acetonitril oder DMF. Die Reaktion kann bei Raumtemperatur oder erhöhter Temperatur bis zum Sieden des Reaktionsgemisches erfolgen. Gegebenenfalls wird zur Vervollständigung der

Reaktion ein Oxidationsmittel hinzugegeben. Beispiele für Oxidationsmittel sind Chinone wie 2, 3-Dichlor-5, 6-dicyano-l, 4- benzochinon (DDQ) ; Diacetoxyiodbenzol ; Benzofuroxan;

Nitrobenzol ; Dimethylsulfoxid (DMSO) ; Metallverbindungen mit Metallen erhöhter Oxidationsstufe wie z.B. Bariummanganat , Mangandioxid, Nickeloxid, Bleitetraacetat ,

Pyridiniumchlorochromat , Scandium (III) triflat,

Ytterbium (III) triflat, Kupfer (II) triflat, Mangantriacetat ; Halogene wie z.B. Iod; tert-Butylhypochlorid;

Schwefelverbindungen höherer Oxidationsstufe wie Oxone,

Natriumdisulfit, Natriumhydrogensulfit, Kaliumhydrogensulfat, Kaliummonopersulfat ; N-Bromsuccinimid; N-Chlorsuccinimid; N- Iodsuccinimid oder Sauerstoff der Luft. Bevorzugte

Oxidationsmittel sind N-Bromsuccinimid oder Luftsauerstoff. Die Umsetzung der Amine mit Carbonsäuren der Formel XIV (Rg = - COOH) kann in Gegenwart starker Säuren erfolgen wie z.B.

Polyphosphorsäure, vorzugsweise bei erhöhter Temperatur. In einer bevorzugten Variante wird die Umsetzung in zwei Stufen durchgeführt, wobei zunächst aus einer Carbonsäure der Formel XIV und dem Amin unter Abspaltung von Wasser ein Amid erhalten wird, aus dem in einem zweiten Schritt unter erneuter

Abspaltung von Wasser die heterocyclische Verbindung der

Formel I gebildet wird. Für die Bildung des Amids können

Reagenzien verwendet werden, die dem Fachmann zur Knüpfung einer Amid-Bindung unter Bedingungen der Dehydratisierung bekannt sind, z.B. unter Verwendung von (Benzotriazol-1- yl ) oxytripyrrolidinophosphonium Hexafluorphosphat (PyBOP) in Gegenwart einer Base wie z.B. Diisopropylethylamin (DIPEA) . Der zweite Schritt kann beispielsweise erfolgen durch Erhitzen mit einem anorganischen Säurechlorid wie Thionylchlorid oder POCI3, durch Erhitzen in Gegenwart einer Säure wie p- Toluolsulfonsäure in einem Lösungsmittel wie Toluol oder

Xylol, durch Erhitzen in einer organischen Carbonsäure wie Essigsäure oder Propionsäure oder in Gegenwart von Wasser entziehenden Reagenzien wie z.B. Dicyclohexylcarbodiimid

(DCC) . Verbindungen der Formel I können auch in andere

Verbindungen der Formel I überführt werden, indem

Substituenten R ₂ , R3, R ₄ , R5, Rio oder RH, die an Gruppen R ₈ der Formel IV bis Formel XIII gebunden sind, unter Verwendung von Standardreaktionen der organischen Synthese umgewandelt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Beispielsweise können Nitrogruppen zu Aminogruppen reduziert werden. Aminogruppen können mit Sulfonylchloriden zu Sulfonamiden oder mit

Acylchloriden oder anderen aktivierten Carbonsäure-Derivaten zu Amiden umgesetzt werden. Carbonsäuren R2 = -COOH können mit Alkylhalogeniden in ihre Ester überführt werden. Ebenso kann unter ähnlichen Reaktionsbedingungen eine Verbindung der

Formel I, in der X = NH, in eine Verbindung X = (Cl-C4-Alkyl) oder N-Benzyl überführt werden. Ferner können Carbonsäuren R ₂ -COOH mit primären oder mit sekundären Aminen unter

Standardbedingungen der Amidkupplung in entsprechende

Carbonsäureamide überführt werden.

Eine Ausführungsform (i) der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zusammensetzung enthaltend eine

erfindungsgemäße Verbindung nach Formel I oder eine

erfindungsgemäße Indikator-gekoppelte Verbindung.

Eine weitere Ausführungsform (ii) der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung/Diagnose von/der

folgenden Erkrankungen a) bis f) in einem

behandlungsbedürftigen Individuum umfassend die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge eines Arzneimittels umfassend eine Verbindung nach Formel I oder einer

erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung nach

Ausführungsform (i) : a) virale Infektionen

b) akute und chronische entzündliche Erkrankungen

c) Krebs

d) degenerative Muskelerkrankungen

e) neurodegenerative Erkrankungen,

f) Schädigungen, welche mit Beeinträchtigung der Calcium- Homöostase einhergehen, und

Eine weitere Ausführungsform (iii) der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren nach Ausführungsform (ii) zur

Behandlung von viralen Infektionen, die durch Viren wie HIV, Hepatitis A, Hepatitis B, Hepatitis C, Hepatitis D und Hepatitis E ausgelöst werden, Asthma, chronischen

Entzündungen, chronischer Prostatitis, Glomerulonephritis, multipler chemischer Emfindlichkeit , entzündlichen

Darmerkrankungen, Sepsis, Entzündungen der vaskulären glatten Muskelzellen, Aneurysma, Entzündungen im Beckenbereich,

Peritonitis, Reperfusionsschäden, rheumatoider Arthritis, Vasculitis, Lungenkrebs, Blasenkrebs, Leberkrebs,

Pankreaskrebs , Bruskrebs, Muskeldystrophy, Kollagen IV- Myopathien, myokardialem Reperfusionsschäden, Alzheimer

Erkrankung, Parkinson, Huntington, multipler systemischer Atrophie, multipler Sklerose, zerebraler Kinderlähmung,

Schlaganfall, diabetischer Neuropathie, amyotrophe laterale Sklerose, Rückenmarksschäden, Zerebralsklerose, Herzinfarkt, Schlaganfall, akuter Hepatotoxizität , Cholestase,

Reperfusionsschäden von transplantierten Organen, Asthma, Psoriasis, atopischer Dermatitis und ulzerativer Colitis.

Eine weitere Ausführungsform (iv) der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Anreicherung von

Wirkstoffen/Diagnosestoffen in einem extrazellulären Raum eines multizellulären Objekts, umfassend die Schritte:

- Bereitstellen einer erfindungsgemäßen Verbindung der

Formel I oder einer erfindungsgemäßen Indikatorgekoppelten Verbindung;

- Inkontaktbringen einer der Verbindungen mit dem

multizellulären Objekt.

Eine weitere Ausführungsform (v) der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines erfindungsgemäßen Derivats von Cyclosporin A durch Umsetzung einer Verbindung der folgenden Formel

worin Rg einen Rest der folgenden Formel darstellt:

wobei PG eine Alkohol-Schutzgruppe und W gleich H oder OH darstellt und der jeweilige Rest über die Bindung, an deren Ende eine gewellte Linie eingezeichnet ist, verknüpft ist.

Eine weitere Ausführungsform (vi) der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Indikatorgekoppelten Verbindung durch Umsetzung einer Verbindung nach Formel I mit einer einen Indikator enthaltenden Verbindung. Figuren und Beispiele

Die vorliegende Erfindung soll nun anhand der folgenden

Figuren und Beispiele näher beschrieben werden. Die Figuren und Beispiele haben dabei rein veranschaulichenden Charakter und sollen den Rahmen der vorliegenden Erfindung keinesfalls einschränken .

Es zeigen Fig. 1: Figur 1 zeigt zwei Diagramme, in denen die jeweilige

Konzentration der Verbindungen 5 und 33 gegen die Prozent der Kontrolle aufgetragen ist. In anderen Worten zeigen die Diagramme in Figur 1 die Zellpermeabilität von Verbindungen 5 und 33 sowie von Cyclosporin A in Jurkat-Zellen . Fig. 2: Überprüfung der immunsuppressiven Wirkung von

Verbindung 5 im Vergleich zu Cyclosporin A im

Proliferationsassay. Fig. 3: Einfluß von 200 yg der Verbindung 5 auf die Anzahl der eosinophilen Granulozyten (Eosinophile) in der Bronchiallavage . Fig. 4: Einfluß von 200 yg der Verbindung 5 auf die Anzahl der eosinophilen Granulozyten (Eosinophile) im

Lungengewebe . Fig. 5: Einfluß von der Verbindung 5 auf die Anzahl der CD4 positiven T-Zellen in der Bronchiallavage.

Fig. 6: Einfluß von der Verbindung 5 auf die Anzahl der CD4 positiven T-Zellen im Lungengewebe. Beispiele :

Die folgenden Abkürzungen werden in den Beispielen verwendet:

CsA Cyclosporin A

DBU 1,8-Diazabicyclo[5.4.0] undec-7-en

DCM Dichlormethan

DIC Ν,Ν' -Diisopropylcarbodiimid

DIPEA Diisopropylethylamin

DMAP 4-Dimethylamino) pyridin

DMEM Dulbecco ^x s Modified Eagle Medium

DMF N, -Dimethylformamid

DMSO Dirnethy1sulfoxid

DTT Dithiothreitol

EDO Ethylendioxid

ES Elektronenspray

FACS Fluorescence Activated Cell Sorter

FCS Fetal Calve Serum

FITC Fluoresceinisothiocyanat

Fmoc Fluorenylmethoxycarbonyl

FSC Forward Scatter

HATU 2- (7-Aza-lH-benzotriazol-l-yl) -1,1,3,3- tetramethyluronium Hexafluorophosphat

HBSS Hank' s Buffered Salt Solution

HOAc Essigsäure

HPLC High-performance Liquid Chromatography

MeOH Methanol

MS Massenspektrum

MTT (Methylthiazol-2-yl) -diphenyltetrazolium Bromid NMP N-Methylpyrrolidon

OVA Ovalbumin

Pbf 2,2,4,6, 7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5- sulfonyl

PBS Phosphate Buffered Saline PMA Phorbol Myristate Acetate

PyBOP (Benzotriazol-l-yl) oxytripyrrolidinophosphonium

Hexafluorphosphat

SSC Side Scatter

TAMRA Tetramethyl- 6-Carboxyrhodamine

TBDMS tert-Butyldimethylsilyl

TFA Trifluoressigsäure

THF Tetrahydrofuran

Trt Trityl

Beispiel 1: Synthese von Verbindung 1 (Acetyl-CsA-Aldehyd) :

Zu einer Lösung von Acetyl-Cyclosporin A (3.0 g; 2.4 mmol) und Ruthenium ( I I I ) chloridhydrat (25 mg; 0.125 mmol) in einem Gemisch aus Acetonitril (30 ml) und Wasser (4 ml) wurde eine Lösung von Natriumperiodat (1.03 mg; 4.81 mmol) in Wasser (7 ml) vorsichtig tropfenweise zugegeben. Anschließend wurde die Mischung über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Danach wurde Ethylacetat (225 ml) zugegeben und mittels gesättigter Kochsalzlösung (3x110 ml) extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSC^ und anschließend im Vakuum getrocknet. Die Verbindung 1 konnten mittels Flash-Chromatographie (300 g Silicagel, 0.043-0.063 mm; Laufmittel: 0.1 % Essigsäure in Ethylacetat) von der als Nebenprodukt entstandenen Acetyl-CsA- Carbonsäure (Verbindung 3) getrennt werden. Es wurde eine Ausbeute von 1.76 g (60 %) für Verbindung 1 erhalten.

Beispiel 2: Synthese von Verbindung 2 ( BDMS-CsA-Aldehyd) : Stufe 1:

Eine Lösung von Cyclosporin A (4,0 g; 3,33 mmol) in trockenem Dichlormethan (20 ml) wurde unter einer Schutzgasatmosphäre von Stickstoff auf -20°C gekühlt. Anschließend wurden bei dieser Temperatur langsam nacheinander 2,6-Lutidin (1,43 g; 13,3 mmol) und tert . -Butyldimethylsilyl Trifluormethansulfonat (1,76 g; 6,66 mmol) hinzugegeben. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde noch einmal die gleiche Menge von der Silylverbindung zugesetzt und weitere 3 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt, der Rückstand

chromatographiert (Kieselgel; Dichlormethan / Methanol 100:0 - 90:10) und 4,2 g TBDMS-CsA erhalten.

Stufe 2 : Zu einer Lösung von TBDMS-CsA (4,2 g; 3,19 mmol) in einem Gemisch aus Acetonitril (80 ml) und Wasser (10 ml) wurde Ruthenium ( I I I ) chloridhydrat (33 mg; 0,16 mmol) gegeben und anschließend langsam eine Lösung von Natriumperiodat (1,36 g; 6,36 mmol) in Wasser (30 ml) zugetropft. Nach Rühren über Nacht wurde filtriert, das Filtrat im Vakuum weitgehend eingeengt und mit Essigester versetzt. Die organische Phase wurde mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, über Na ₂ SÜ ₄ getrocknet und eingeengt. Der Rückstand wurde an Kieselgel chromatographiert (Cyclohexan/Essigester-Gradient) und dabei TBDMS-CsA-Aldehyd erhalten, der ohne weitere Reinigung für die folgenden Umsetzungen verwendet wurde. Ausbeute: 2,78 g (64 % über beide Stufen); MS (ES) CeeH^iNndsSi berechnet 1304, gefunden 1305 (M+H) ⁺ .

Beispiel 3: Synthese von Verbindung 3 (Acetyl-CsA- Carbonsäure) :

Die Verbindung wurde nach einer Literaturvorschrift (Bioconj ugate Chem 3_ (1992), 32-36) durch Oxidation von Acetyl-Cyclosporin A mit Natriumperiodat / Kaliumpermanganat dargestellt .

Beispiel 4: Synthese von Verbindung 4:

50 mg (0.041 mmol) Verbindung 1 und 11.25 mg cis-Diaminobiotin in 20 ml MeOH wurden für lh unter Rückfluss erwärmt und anschließend über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Evaporation des Methanols wurde der Rückstand in 10 ml DCM aufgenommen, mit 9 mg N-Bromsuccinimid versetzt und danach für eine Stunde gerührt. Das Acetyl-geschützte Produkt wurde anschließend mittels präparativer HPLC abgetrennt und lyophilisiert. Danach wurde die Acetyl-Schutzgruppe mit 3 ml 0. IM LiOH in 50% Tetrahydrofuran entfernt und das Endprodukt mittels präparativer HPLC isoliert. Ausbeute: 10 mg (18 %) .

Beispiel 5: Synthese von Verbindung 5: Methode A:

Eine Lösung von 100 mg (0.081mmol) Verbindung 1 und 190 mg (1.215 mmol, 15 eq) 3, 4-Diaminobenzoesäure in MeOH (10 ml) wurde bis zum Reaktionsende (Kontrolle mittels analytischer

HPLC) für 12-48 Stunden verrührt. Anschließend wurde filtiert und der Feststoff mit 10 ml MeOH gewaschen. 1.5 ml der

methanolischen Lösung wurde für die nächste Stufe abgetrennt und der Rest des Filtrats im Vakuum eingeengt. Die Acetyl- Verbindung wurde anschließend mittels präparativer HPLC

gereinigt (Säule RP C18 250x25mm; Gradient Wasser+0.05% TFA / Acetonitril+0.05% TFA) und nach Lyophilisieren als weißer

Feststoff erhalten. Ausbeute: 70 mg (69 %) . Zu 1.5 ml der methanolischen Lösung der vorstehend

beschriebenen Acetyl-Verbindung (~6.1ymol) wurden 1.5 ml 0.2 M LiOH zugegeben und bis zum Ende der Hydrolyse verrührt (ca. 3 Stunden; Kontrolle mittels analytischer HPLC) . Nach Ansäuern mit verdünnter Salzsäure wurde Verbindung 5 mittels

präparativer HPLC gereinigt (Säule RP C18 250x25mm; Gradient Wasser+0.05% TFA / Acetonitril+0.05% TFA), lyophilisiert und als weißer Feststoff isoliert. Ausbeute: 7 mg (87 %) .

Methode B:

Stufe 1:

Zu einer Lösung von TBDMS-CsA-Aldehyd (2,78 g; 2,13 mmol) in Methanol (10 ml) wurde ein Überschuss an 3,4-

Diaminobenzoesäure (4,86 g; 31,9 mmol) gegeben und das Gemisch über Nacht unter Durchleiten eines schwachen Luftstroms

gerührt. Es wurde filtriert, das Filtrat eingeengt und der Rückstand ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe

eingesetzt. MS (ES) C ₇₃ H ₁ 2 _{5 13} O ₁₄ S1 berechnet 1436, gefunden 1437 (M+H) ⁺ .

Stufe 2 :

Der Rückstand aus der vorherigen Stufe wurde mit einer 1M- Lösung von Tetrabutylammonium Fluorid in THF (15 ml; 15 mmol) versetzt und das Gemisch 2,5 Stunden gerührt bis die TBDMS- Verbindung nicht mehr nachweisbar war. Die Lösung wurde direkt ohne Entfernen des Lösungsmittels zur Auftrennung über RP-HPLC (Säule C18; Gradient H ₂ 0 (0,1% TFA) / MeOH (0,1% TFA) )

verwendet und die Titelverbindung nach Gefriertrocknung als farbloser Feststoff erhalten. Ausbeute: 909 mg (32 % über beide Stufen); MS (ES) C ₆₇ H _{111 13} O ₁₄ berechnet 1322, gefunden 1323 (M+H) ⁺ .

Beispiel 6: Synthese von Verbindung 6:

Ein Gemisch aus Acetyl-CsA-Carbonsäure (50 mg; 0,04 mmol), 3- Amino-4-hydroxybenzoesäure Methylester (10 mg; 0,06 mmol), (Benzotriazol-l-yl) oxytripyrrolidinophosphonium

Hexafluorphosphat (PyBOP) (23 mg; 0,044 mmol) und DIPEA (21 μΐ) in DMF (3 ml) wurde über Nacht gerührt und anschließend die Zwischenstufe des Carbonsäureamids durch präparative HPLC gereinigt. Das Amid wurde in Toluol (10 ml) gelöst, mit Thionylchlorid (3 μΐ) versetzt und die Lösung für einige Stunden unter Rückfluss erhitzt. Es wurde nochmals Thionylchlorid (10 μΐ) hinzugegeben und nach Erhitzen für weitere 24 Stunden konnte ein Umsatz zum Benzoxazol von ca. 80% durch analytische HPLC nachgewiesen werden. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand mit MeOH (1 ml) und 0,2M NaOH (1 ml) versetzt. Das Gemisch wurde auf 5°C gekühlt und über Nacht gerührt. Es wurde mit 18%iger Salzsäure (100 μΐ) angesäuert und Verbindung 6 nach Reinigung über präparative HPLC isoliert.

Beispiel 7: Synthese von Verbindung 7 und Verbindung 8: Methode A:

Eine Lösung von 10 mg (0.00732 mmol) der Verbindung 5 in trockenem THF wurde mit 17 mg CH ₃ I und 5-6 mg Benzyltriethylammoniumchlorid versetzt und über Nacht bei Raumtemperatur geschüttelt. Nach Zugabe von Wasser wurde die Lösung auf ca. pH 2-3 eingestellt und anschließend im Vakuum lyophilisiert. Es wurden 0. IM LiOH (4 ml) und MeOH (4 ml) hinzugegeben, zwei Stunden gerührt. Neben der Verbindung 7 wurde mittels präparativer HPLC auch die Verbindung 8 isoliert. Ausbeute: Verbindung 7: 3.5 mg (36 %) und Verbindung 8 : 1 mg (9 % ) . Methode B:

Verbindung 7 wurde wie Verbindung 5 (Methode B) hergestellt , mit dem Unterschied, dass die folgenden Substanzen in den folgenden Mengen verwendet wurden: TBDMS-CsA-Aldehyd (300 mg; 0,23 mmol) und 3, 4-Diaminobenzoesäure Methylester (38 mg; 0,23 mmol); Ausbeute: 52,3 mg (17 %) , farbloser Feststoff; MS (ES) C ₆₈ Hii ₃ N ₁₃ 0i ₄ berechnet 1336, gefunden 1337 (M+H) ⁺ .

Beispiel 8: Synthese von Verbindung 9:

Methode A:

Verbindung 9 wurde wie Verbindung 5 (Methode B) hergestellt, mit dem Unterschied, dass die folgenden Substanzen in den folgenden Mengen verwendet wurden: TBDMS-CsA-Aldehyd (300 mg; 0,23 mmol) und 3, 4-Diaminobenzoesäure Ethylester (42 mg; 0,23 mmol); Ausbeute: 46 mg (15 %) , farbloser Feststoff; MS (ES) C ₆ 9Hii5 ₁₃ 0i ₄ berechnet 1350, gefunden 1351 (M+H) ⁺ . Methode B:

25 mg der Verbindung 5 wurden in trockenem THF gelöst, mit 20 mg Ethylbromid, 8 mg K ₂ CO ₃ und 5-6 mg

Benzyltriethylammoniumchlorid versetzt und für 12-48 Stunden bis zum Reaktionsende geschüttelt (Kontrolle mittels

analytischer HPLC) . Danach wurde das Gemisch im Vakuum

eingeengt und mittels präparativer HPLC getrennt. Die

Acetylgruppe wurde innerhalb von 2h bei Raumtemperatur mittels 4 ml 0.1 M NaOH in 50% THF abgespalten und das Endprodukt mittels präparativer HPLC isoliert. Ausbeute: 10 mg (40 %) .

Beispiel 9: Synthese von Verbindung 10:

Verbindung 10 wurde wie Verbindung 9 in Beispiel 8 (Methode B) hergestellt, mit dem Unterschied, dass nicht Ethylbromid sondern l-Brom-2-Ethylbutan als Alkylierungsreagenz eingesetzt wurde .

Beispiel 10: Synthese von Verbindung 11:

Aus 25 mg Verbindung 5 und zugesetztem 1-Brombutan konnten mittels der im Beispiel 7 angegebenen Prozedur (Methode A) 7 mg der Verbindung 11 hergestellt werden. Ausbeute: 7 mg (28 %) .

Beispiel 11: Synthese von Verbindung 12: Aus 25 mg Verbindung 5 und zugesetztem Isobutylbromid konnte mittels der im Beispiel 7 angegeben Prozedur (Methode A) 5 mg der Verbindung 12 hergestellt werden. Ausbeute: 5 mg (20 %) .

Beispiel 12: Synthese von Verbindung 13:

Das Dipeptid H-D-Glu (Ot-Bu) -D-Glu (Ot-Bu) -OH wurde über Standard Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) -Peptid-Synthese an ein 2-Chlor-tritylchlorid-Harz gebunden. Zu einer Lösung aus 13 mg der Verbindung 5 und 4 mg HATU in einem Gemisch aus DMF (1 ml) und DCM (1 ml) wurden nacheinander 152 mg des Dipeptid-Harzes und DIPEA (10 μΐ) hinzugegeben. Es wurde eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt, danach der Feststoff abfiltriert und nacheinander mit DMF (3x) und DCM (3x) gewaschen. Verbindung 13 wurde durch Rühren mit 2 ml 100 % Trifluoressigsäure (TFA) über 2h bei 5 °C vom Harz abgespalten. Nach Entfernen der TFA im Vakuum wurde das Endprodukt mittels präparativer HPLC gereinigt. Ausbeute: 4 mg (27 %) .

Beispiel 13: Synthese von Verbindung 14:

Eine Lösung von Acetyl-CsA-Aldehyd (Verbindung 1; 20 mg) und 3- (3, 4-Diamino-phenyl) -acrylsäure-tert-butylester (50 mg; 0,21 mmol) in MeOH (1 ml) wurde bis zum Reaktionsende (Kontrolle mittels analytischer HPLC) bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 5°C gekühlt, 0.2M NaOH (1 ml) zugegeben und das Reaktionsgemisch bei 5°C bis zum Ende der Hydrolyse geschüttelt (Kontrolle mittels analytischer HPLC) . Danach wurde mit 18%iger Salzsäure (100 μΐ) angesäuert und das Produkt mittels präparativer HPLC gereinigt. Ausbeute: 5 mg (22.2 %) . Beispiel 14: Synthese von Verbindung 15:

Zu -2.5 mg Verbindung 14 wurde Trifluoressigsäure ( 1 ml) gegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 30 min geschüttelt. Nach Abdampfen der TFA im Vakuum wurde das Produkt mittels präparativer HPLC gereinigt. Ausbeute: 0,3 mg (11.1 %) .

Beispiel 15: Synthese von Verbindung 16:

Eine Lösung von Acetyl-CsA-Aldehyd (Verbindung 1; 10 mg; 8 ymol) und 4 , 5-Diamino-2 , 6-dimercaptopyrimidin (6,9 mg; 40 ymol) in MeOH (1 ml) wurde bis zum Reaktionsende (Kontrolle mittels analytischer HPLC) bei Raumtemperatur geschüttelt.

Hydrolyse des Acetats, Aufarbeitung des Reaktionsansatzes und Reinigung von Verbindung 16 wurden in der gleichen Weise durchgeführt wie für Verbindung 14 beschrieben. Ausbeute: 3.1 mg (28.8 % ) .

Beispiel 16: Synthese von Verbindung 17: Eine Lösung von Acetyl-CsA-Aldehyd (Verbindung 1; 10 mg; 8 ymol) und 4, 5-Diamino-6-hydroxy-2-mercaptopyrimidin (3,2 mg; 18 ymol) in DMF (1 ml) wurde über Nacht bei einer Temperatur von 100 °C gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels im

Vakuum wurde die Hydrolyse des Acetats, die Aufarbeitung des Reaktionsansatzes und die Reinigung der Verbindung 17 in der gleichen Weise durchgeführt wie für Verbindung 14 beschrieben. Ausbeute 1.5 mg (14 %) . Beispiel 17: Synthese von Verbindung 18:

Eine Lösung von Acetyl-CsA-Aldehyd (Verbindung 1; 10 mg; 8 ymol) und 5, 6-Diamino-lH-pyrimidin-4-on Hemisulfat (7,3 mg; 21 ymol) in MeOH (1 ml) wurde bis zum Reaktionsende (Kontrolle mittels analytischer HPLC) bei Raumtemperatur geschüttelt. Hydrolyse des Acetats, Aufarbeitung des Reaktionsansatzes und Reinigung von Verbindung 18 wurden in der gleichen Weise durchgeführt wie für Verbindung 14 beschrieben. Ausbeute: 0.83 mg (8 %) .

Beispiel 18: Synthese von Verbindung 19: Verbindung 19 wurde in der gleichen Weise hergestellt wie in Beispiel 17 beschrieben, mit dem Unterschied, dass als Diamin 3, 4-Diaminobenzoesäurehydrazid (4.4 mg; 26 ymol) eingesetzt wurde. Ausbeute: 2.5 mg (23.4 %).

Beispiel 19: Synthese von Verbindung 20:

Verbindung 20 wurde in der gleichen Weise hergestellt wie in Beispiel 17 beschrieben, mit dem Unterschied, dass als Diamin 2 , 3-Diamino-4 , 5-difluorbenzolsulfonsäure (3.4 mg; 15 ymol) eingesetzt wurde. Ausbeute: 2.5 mg (22.4 %) .

Beispiel 20: Synthese von Verbindung 21:

Verbindung 21 wurde in der gleichen Weise hergestellt wie in Beispiel 17 beschrieben, mit dem Unterschied, dass als Diamin 2 , 3-Diamino-5-fluorbenzoesäure (3.8 mg; 22 ymol) eingesetzt wurde. Ausbeute: 7.6 mg (70.9 %).

Beispiel 21: Synthese von Verbindung 22:

Methode A:

Verbindung 22 wurde wie Verbindung 5 (Methode B) hergestellt, mit dem Unterschied, dass die folgenden Substanzen in den folgenden Mengen verwendet wurden: TBDMS-CsA-Aldehyd (300 mg; 0,23 mmol) und 3, 4-Diaminobenzolsulfonsäure (51,8 mg; 0,275 mmol); Ausbeute: 116,1 mg (37 %) , farbloser Feststoff; MS (ES) C ₆ 6Hiii ₁₃ 0i ₅ S berechnet 1358, gefunden 1359 (M+H) ⁺ .

Methode B:

Eine Lösung von 10 mg (8 ymol) von Verbindung 1 und 4.9 mg (26 ymol) 3, 4-Diaminobenzolsulfonsäure wurde in 1 ml MeOH bis zum Reaktionsende (Kontrolle mittels analytischer HPLC) bei

Raumtemperatur geschüttelt. Das Reaktionsgemisch wurde auf 5°C abgekühlt und zur Abspaltung der Acetyl-Schutzgruppe 1.0 ml 0.2M NaOH zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 5°C bis zum Ende der Hydrolyse geschüttelt (Kontrolle mittels

analytischer HPLC) . Danach wurden 100 ml 18% HCl zugegeben und das Produkt mittels präparativer HPLC gereinigt. Ausbeute: 2.3 mg (21.1 % ) .

Beispiel 22: Synthese von Verbindung 23: Methode A:

3, 4-Diaminobenzamid wurde nach Literaturvorschrift erhalten (J. Med. Chem. 4S3 (2005), 1873-1885) und das Diamin (35 mg; 0,23 mmol) mit TBDMS-CsA-Aldehyd (300 mg; 0,30 mmol) umgesetzt in der gleichen Weise wie für Verbindung 5 (Methode B) beschrieben. Ausbeute: 43,7 mg (14 %) , bräunlicher Feststoff; MS (ES) C ₆₇ Hii2 ₁₄ 0i ₃ berechnet 1321, gefunden 1322 (M+H) ⁺ .

Methode B:

Verbindung 23 wurde in der gleichen Weise hergestellt wie in Beispiel 17 beschrieben, mit dem Unterschied, dass als Diamin 3, 4-Diaminobenzonitril (2.3 mg; 17 ymol) eingesetzt wurde. Ausbeute: 0.4 mg (3.8 %) .

Beispiel 23: Synthese von Verbindung 24:

Eine Lösung von Acetyl-CsA-Aldehyd (Verbindung 1; 10 mg; 8 ymol) und 5, 6-Diaminouracil Sulfat (3.2 mg; 14 ymol) in DMF (1 ml) wurde über Nacht bei einer Temperatur von 100 °C gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wurde die

Hydrolyse des Acetats, die Aufarbeitung des Reaktionsansatzes und die Reinigung der Verbindung 24 in der gleichen Weise durchgeführt wie für Verbindung 14 beschrieben. Ausbeute: 1.7 mg (16.2 % ) .

Beispiel 24: Synthese von Verbindung 25:

Verbindung 25 wurde wie Verbindung 5 (Methode B) hergestellt, mit dem Unterschied, dass die folgenden Substanzen in den folgenden Mengen verwendet wurden: 3, 4-Diaminobenzoesäure

Isopropylester wurde nach Literaturvorschrift (US2007/0032525) hergestellt und der Ester (45 mg; 0,23 mmol) mit TBDMS-CsA- Aldehyd (300 mg; 0,23 mmol) umgesetzt; Ausbeute: 99,1 mg (32 %), farbloser Feststoff; MS (ES) C ₇ oHii7N ₁₃ Oi4 berechnet 1364, gefunden 1365 (M+H) ⁺ . Beispiel 25: Synthese von Verbindung 26:

Stufe 1:

Zu 3, 4-Diaminobenzoesäure (300 mg; 1,97 mmol) wurden

nacheinander konz. Schwefelsäure (2 ml) und 2- (Dimethylamino) ethanol (176 mg; 1,97 mmol) gegeben. Das

Gemisch wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur verrührt,

anschließend auf Eis gegeben und mit 20%iger Natronlauge auf pH14 gebracht. Es wurde mit Essigester extrahiert, die

organische Phase über MgSC^ getrocknet, zur Trockene eingeengt und als Rückstand 3, 4-Diaminobenzoesäure 2-

(Dimethylamino) ethylester erhalten (154 mg; 35 %) , der ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt wurde.

Stufe 2 :

Die Verbindung 26 wurde in der gleichen Weise wie Verbindung 5 (Methode B) aus TBDMS-CsA-Aldehyd (300 mg; 0,23 mmol) und 3,4- Diaminobenzoesäure 2- (Dimethylamino) ethylester (52 mg; 0,23 mmol) hergestellt. Ausbeute: 4,3 mg (1,3 %) , farbloser

Feststoff; MS (ES) C ₇ iH ₁₂ o i ₄ Oi ₄ berechnet 1393, gefunden 1394 (M+H) ⁺ .

Beispiel 26: Synthese von Verbindung 27: Stufe 1:

3, 4-Diaminobenzoesäure 2- (Morpholin-4-yl) ethylester wurde aus 3, 4-Diaminobenzoesäure (300 mg; 1,97 mmol) und 2- (Morpholin-4- yl) ethanol (258 mg; 1,97 mmol) hergestellt wie unter Stufe 1 des Beispiels 25 beschrieben. Ausbeute: 61 mg (12 %) .

Stufe 2 :

Die Verbindung 27 wurde in der gleichen Weise wie Verbindung 5 (Methode B) aus TBDMS-CsA-Aldehyd (300 mg; 0,23 mmol) und 3,4- Diaminobenzoesäure 2- (Morpholin-4-yl) ethylester (61 mg; 0,23 mmol) hergestellt. Ausbeute: 8,5 mg (2,6 %) , farbloser

Feststoff; MS (ES) C73H122N14O15 berechnet 1435, gefunden 1436 (M+H) ⁺ .

Beispiel 27: Synthese von Verbindung 28:

Verbindung 28 wurde wie Verbindung 5 (Methode B) hergestellt, mit dem Unterschied, dass die folgenden Substanzen In den folgenden Mengen verwendet wurden: TBDMS-CsA-Aldehyd (300 mg; 0,23 mmol) und 2, 3-Dlamlnobenzoesäure (35 mg; 0,23 mmol);

Ausbeute: 65 mg (21 %) , farbloser Feststoff; MS (ES)

C67H111N13O14 berechnet 1322, gefunden 1323 (M+H) ⁺ .

Beispiel 28: Synthese von Verbindung 29:

Verbindung 29 wurde wie Verbindung 5 (Methode B) hergestellt, mit dem Unterschied, dass die folgenden Substanzen In den folgenden Mengen verwendet wurden: TBDMS-CsA-Aldehyd (300 mg; 0,23 mmol) und 2, 3-Dlamlnobenzoesäure Methylester (38 mg; 0,23 mmol); Ausbeute: 50,8 mg (17 %) , farbloser Feststoff; MS (ES) C68H113N13O14 berechnet 1336, gefunden 1337 (M+H) ⁺ .

Beispiel 29: Synthese von Verbindung 30:

3, 4-Dlamlnophthalsäure Dlmethylester wurde nach

Literaturvorschrift hergestellt (J. Heterocyclic Chem. 10 _^ (1973), 891-898) und der Ester (30 mg; 0,13 mmol) mit TBDMS- CsA-Aldehyd (175 mg; 0,13 mmol) in der gleichen Weise

umgesetzt wie für Verbindung 5 beschrieben (Methode B) . Ausbeute: 38,6 mg (21 %) , farbloser Feststoff; MS (ES)

C ₇ oHii5 ₁₃ Oi6 berechnet 1394, gefunden 1395 (M+H) ⁺ .

Beispiel 30: Synthese von Verbindung 31:

Stufe 1:

Eine ethanolische Lösung von Na-Ethanolat , hergestellt aus Natrium (181 mg, 7,87 mmol) in Ethanol (5 ml), wurde zu einer Suspension von 4 , 5-Diaminophthalsäure Dimethylester (820 mg; 3,66 mmol) in Ethanol (3,5 ml) und Wasser (0,15 ml) gegeben und das Gemisch 2 Stunden unter Rückfluss erhitzt. Nach

Abkühlen wurde der Feststoff abfiltriert, in Wasser (7 ml) gelöst und die Lösung mit IM HCl neutralisiert. Es wurde lyophilisiert und der Rückstand mit Methanol (50 ml) verrührt. Nach erneuter Filtration wurde das Filtrat im Vakuum eingeengt und 4 , 5-Diaminophthalsäure aus dem Rückstand nach RP-HPLC (Säule C18; Gradient H ₂ 0 / MeOH 95:5) und Gefriertrocknung erhalten. Ausbeute: 553 mg (77 %) . Stufe 2:

Die Verbindung 31 wurde in der gleichen Weise wie Verbindung 5 (Methode B) aus TBDMS-CsA-Aldehyd (300 mg; 0,23 mmol) und 4,5- Diaminophthalsäure (45 mg; 0,23 mmol) hergestellt. Ausbeute: 16,5 mg (5,3 %) , farbloser Feststoff; MS (ES) C ₆ 8HiiiN ₁₃ 0i6 berechnet 1366, gefunden 1367 (M+H) ⁺ .

Beispiel 31: Synthese von Verbindung 32: 4 , 5-Diaminophthalsäure Dimethylester wurde nach

Literaturvorschrift hergestellt (J. Heterocyclic Chem. 1_0 (1973), 891-898) und der Ester (51 mg; 0,23 mmol) mit TBDMS- CsA-Aldehyd (300 mg; 0,23 mmol) in der gleichen Weise umgesetzt wie für Verbindung 5 (Methode B) beschrieben.

Ausbeute: 63,9 mg (20 %) , farbloser Feststoff; MS (ES)

C70H115N13O16 berechnet 1394, gefunden 1395 (M+H) ⁺ .

Beispiel 32: Synthese von Verbindung 33:

5- (3, -Diaminophenyl) tetrazol Dihydrochlorid wurde nach

Literaturvorschrift hergestellt (EP1944311) und das Tetrazol (57 mg; 0,23 mmol) mit TBDMS-CsA-Aldehyd (300 mg; 0,23 mmol) in der gleichen Weise umgesetzt wie für Verbindung 5 (Methode B) beschrieben. Ausbeute: 32,9 mg (11 %) , farbloser Feststoff; MS (ES) C67H111N17O12 berechnet 1346, gefunden 1346 (M ⁺ ) .

Beispiel 33: Synthese von Verbindung 34:

Verbindung 34 wurde wie Verbindung 5 (Methode B) hergestellt, mit dem Unterschied, dass die folgenden Substanzen in den folgenden Mengen verwendet wurden: TBDMS-CsA-Aldehyd (174 mg; 0,13 mmol) und 3, 4-Diaminobenzolsulfonsäureamid (25 mg; 0,13 mmol); Ausbeute: 14,5 mg (8 %) , farbloser Feststoff; MS (ES) C66Hii ₂ Ni ₄ 0i ₄ S berechnet 1357, gefunden 1358 (M+H) ⁺ .

Beispiel 34: Synthese von Verbindung 35:

3, 4-Diaminobenzamidin wurde nach Literaturvorschrift

hergestellt (W01999/24395) und das Amidin (35 mg; 0,23 mmol) mit TBDMS-CsA-Aldehyd (300 mg; 0,23 mmol) in der gleichen Weise um gesetzt wie für Verbindung 5 (Methode B) beschrieben. Ausbeute: 86,9 mg (29 %) , farbloser Feststoff; MS (ES)

C67H113N15O12 berechnet 1320, gefunden 1321 (M+H) ⁺ . Beispiel 35: Synthese von Verbindung 36: 3-Amino-4- (methylamino)benzoesäure wurde nach

Literaturvorschrift hergestellt (WO2005/030704) und das Diamin (39 mg; 0,23 mmol) mit TBDMS-CsA-Aldehyd (300 mg; 0,23 mmol) in der gleichen Weise umgesetzt wie für Verbindung 5 (Methode B) beschrieben. Ausbeute: 87,7 mg (29 %) , farbloser Feststoff; MS (ES) C68H113N13O14 berechnet 1336, gefunden 1337 (M+H) ⁺ .

Beispiel 36: Synthese von Verbindung 37:

4-Amino-3- (methylamino)benzoesäure wurde nach

Literaturvorschrift hergestellt (WO2000/020400) und das Diamin (39 mg; 0,23 mmol) mit TBDMS-CsA-Aldehyd (300 mg; 0,23 mmol) umgesetzt in der gleichen Weise wie für Verbindung 5 (Methode B) beschrieben. Ausbeute: 80,2 mg (26 %) , farbloser Feststoff; MS (ES) C68H113N13O14 berechnet 1336, gefunden 1337 (M+H) ⁺ .

Beispiel 37: Synthese von Verbindung 38:

N- (3, 4-Diaminophenyl) trifluoracetamid wurde nach

Literaturvorschrift hergestellt (WO2004/039318) und das Diamin (51 mg; 0,23 mmol) mit TBDMS-CsA-Aldehyd (300 mg; 0,23 mmol) umgesetzt in der gleichen Weise wie für Verbindung 5 (Methode B) beschrieben. Ausbeute: 23,7 mg (7,4 %) , farbloser

Feststoff; MS (ES) C68Hi F ₃ Ni ₄ 0i3 berechnet 1389, gefunden 1390 (M+H) ⁺ . Beispiel 38: Synthese von Verbindung 39:

Verbindung 39 wurde in der gleichen Weise hergestellt wie in Beispiel 17 beschrieben, mit dem Unterschied, dass als Diamin 3 , 3 ' -Diaminobenzidin Tetrahydrochlorid Dihydrat (18.3 mg; 46 ymol) eingesetzt wurde. Ausbeute: 4.5 mg (40.6 %) .

Beispiel 39: Synthese von Verbindung 40:

Verbindung 40 wurde in der gleichen Weise hergestellt wie in Beispiel 17 beschrieben, mit dem Unterschied, dass als Diamin 1 , 2 , 4 , 5-Tetraaminobenzol Tetrahydrochlorid (5.4 mg; 19 ymol) eingesetzt wurde. Ausbeute: 4.3 mg (41.1 %) .

Beispiel 40: Synthese von Verbindung 41:

Verbindung 41 wurde in der gleichen Weise hergestellt wie in Beispiel 17 beschrieben, mit dem Unterschied, dass als Diamin 4- (4-Methylpiperazin-l-yl) -1, 2-diaminobenzol (4.1 mg; 20 ymol) eingesetzt wurde. Ausbeute: 2.3 mg (20.9 %) .

Beispiel 41: Synthese von Verbindung 42:

Eine Lösung von Acetyl-CsA-Aldehyd (25 mg; 20 ymol) und Ethylendiamin (1.5 μΐ) in Dichlormethan (5 ml) wurde 1 h bei Raumtemperatur und danach für 20 min bei 5°C gerührt. Anschließend wurde N-Bromsuccinimid (4 mg) hinzugegeben und über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und der Rückstand mit Ethylacetat (30 ml) aufgenommen. Es wurde nacheinander mit gesättigter NaHCC>3- (2 x 10ml) , 5%iger KHSO ₄ - (2 x 10ml) und gesättigter Kochsalz-Lösung (2 x 10ml) gewaschen. Nach Trocknen über MgSC^ wurde das Lösungsmittel im Vakuum entfernt und anschließend der Rückstand mit einer Lösung von 0. IM NaOH (4 ml) in dem gleichen Volumen Tetrahydrofuran aufgenommen. Es wurde bis zur Komplettierung der Reaktion (Kontrolle mittels analytischer HPLC) für 2-5 Stunden gerührt. Das Produkt konnte mittels präparativer HPLC abgetrennt werden. Ausbeute: 7 mg (28 %) .

Beispiel 42: Synthese von Verbindung 43:

Acetyl-CsA-Carbonsäure (50 mg; 0.04 mmol), L-Serin Methylester Hydrochlorid (7 mg) und (Benzotriazol-1- yl ) oxytripyrrolidinophosphonium Hexafluorphosphat (PyBOP) (23 mg; 0, 044 mmol) wurden in DMF (3 ml) gelöst und anschließend mit DIPEA (21 μΐ) versetzt. Nach 50 min Rühren bei Raumtemperatur konnte das Zwischenprodukt mittels präparativer HPLC abgetrennt werden. Ausbeute: 27 mg (50 %) . 27 mg des Amid-Zwischenprodukts wurden in Toluol (20 ml) gelöst und danach Triethylamin (20 μΐ) und

Methansulfonylchlorid (10 μΐ) hinzugegeben. Nach Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum wurde der Rückstand mit 0.2M NaOH (2 ml) und THF (2 ml) versetzt und das Gemisch bis zur Komplettierung der Reaktion gerührt (Kontrolle mittels analytischer HPLC) . Das Endprodukt wurde durch präparative HPLC isoliert. Ausbeute: 7 mg (27 %) .

Beispiel 43: Synthese von Verbindung 44:

Verbindung 44 wurde in der gleichen Weise hergestellt wie in Beispiel 17 beschrieben, mit dem Unterschied, dass als Diamin (R,R) - (-) -trans-1, 2-Diaminocyclohexan Hydrochlorid (3.3 mg; 22 ymol) eingesetzt wurde. Ausbeute: 5.8 mg (56.4 %) .

Beispiel 44: Synthese von Verbindung 45:

Eine Lösung von Acetyl-CsA-Aldehyd (11 mg; 8.8 ymol) und 5,6- Diamino-naphthalin-l-sulfonsäure (2.8 mg; 12 ymol)in DMF (1 ml) wurde bei Raumtemperatur über Nacht geschüttelt. Das Lösungsmittel wurde im Vakuum entfernt und zu dem Rest wurde MeOH (1 ml) und 0.2M NaOH (1 ml) gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 5°C über Nacht geschüttelt und das Produkt mittels präparativer HPLC gereinigt. Ausbeute: 8.0 mg (71.0 %) .

Beispiel 45: Synthese von Verbindung 46:

N- (3, 4-Diaminophenyl) guanidin Hydrochlorid wurde nach

Literaturvorschrift hergestellt (WO1998/045275) und das Diamin (62 mg; 0,307 mmol) mit TBDMS-CsA-Aldehyd (400 mg; 0,307 mmol) umgesetzt in der gleichen Weise wie für Verbindung 5 (Methode B) beschrieben. Ausbeute: 121,7 mg (30 %) , farbloser

Feststoff; MS (ES) C ₆ 7Hii ₄ N ₁₆ 0i2 berechnet 1335, gefunden 1336 (M+H) ⁺ .

Beispiel 46: Synthese von Verbindung 47: Stufe 1:

Eine Lösung von 2 , 4-Diaminonitrobenzol (8 g; 52,2 mmol) und DIPEA (9,9 g; 76,6 mmol) in DCM (300 ml) wurde auf 0°C gekühlt und bei dieser Temperatur Trifluormethansulfonsäureanhydrid (23 g; 81,5 mmol) innerhalb von 90 min zugetropft. Es wurde über Nacht gerührt, mit DCM verdünnt, mit gesättigter NaHCC>3- Lsg. gewaschen, über MgSC^ getrocknet und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde mit Ether verrührt (3 x 400 ml) . Die vereinigten überstehenden Lösungen wurden eingeengt und N- (4- Amino-3-nitrophenyl ) trifluormethansulfonamid nach

chromatographischer Reinigung an Kieselgel mit DCM erhalten; Ausbeute: 12,2 g (82 %) .

Stufe 2 :

Zu einer Lösung der vorstehenden Nitroverbindung (12,2 g; 42,8 mmol) in MeOH (150 ml) wurde 10% Pd-C (1,2 g) gegeben. Das Gemisch wurde über Nacht unter ^-Atmosphäre bei Raumtemperatur gerührt, die Feststoffe abfiltriert und mit MeOH gewaschen. Es wurde im Vakuum eingeengt, an Kieselgel chromatographiert

(DCM/MeOH-Gradient) und N- (3, 4-Diaminophenyl) - trifluormethansulfonamid erhalten; Ausbeute: 3,87 g (35 %) .

Stufe 3:

Verbindung 47 wurde aus N- (3, 4-Diaminophenyl) - trifluormethansulfonamid (40 mg; 0,157 mmol) und TBDMS-CsA- Aldehyd (205 mg; 0,157 mmol) in der gleichen Weise erhalten wie für Verbindung 5 (Methode B) beschrieben. Ausbeute: 14 mg (6,3 %), rötlicher Feststoff; MS (ES) CevHmFsN^O^S berechnet 1425, gefunden 1426 (M+H) ⁺ .

Beispiel 47: Synthese von Verbindung 48: Stufe 1:

Eine Lösung von 1 , 2-Diamino-3-fluorbenzol (100 mg; 0,8 mmol) in 100%iger Schwefelsäure (5 ml) wird in einer Mikrowelle für 30 min auf 150°C erhitzt und der Ablauf der Reaktion über HPLC kontrolliert. Danach wird die Lösung in 200 g Eis eingerührt und mit 40%iger NaOH neutralisiert. Der gefriergetrocknete Rückstand wird in Acetonitril (100 ml) suspendiert. Nach Filtrieren und anschließendem Abziehen des Lösungsmittels wird die 3, 4-Diamino-5-fluor-benzolsulfonsäure in Wasser (5 ml) gelöst und über eine Dowex Cl ^~ Säule gereinigt. Ausbeute: 148 mg (90 %) . Stufe 2:

Eine Lösung von Ac-CsA-Aldehyd (Verbindung 1; 12 mg; -10 ymol) in DMF (3 ml) wird zu 3, 4-Diamino-5-fluor-benzolsulfonsäure (3.6 mg; 17.5 ymol) in DMF (1 ml) gegeben. Nach Zugabe einer Lösung von Kaliummonopersulfat (6.1 mg; -10 ymol) in Wasser (0.1 ml) wird das Gemisch gerührt. Die Reaktion ist nach 3h beendet und das Produkt wird über eine präparative HPLC gereinigt. Ausbeute: 7 mg (49 %) .

Zur gereinigten Fraktion wird MeOH (1 ml) und eiskalte 0.2M NaOH (1 ml) gegeben und die Mischung über Nacht bei 5°C geschüttelt. Danach wird angesäuert und der Rückstand über präparative HPLC gereinigt. Ausbeute: 4.9 mg (72 %) .

Beispiel 48: Synthese von Verbindung 49:

Stufe 1 : Synthese des Hexapeptids H- (L-Pro) 6~OH

Das Hexapeptid H- (L-Pro) 6~OH wurde über ein Standard-Protokoll zur Fmoc-Festphasen-Peptidsynthese an einem 2-Chlor- tritylchlorid-Harz hergestellt. In jedem Synthesezyklus wurde Fmoc-geschütztes L-Prolin mit PyBOP und DIPEA in DMF aktiviert und für 2 h gekuppelt. Die Fmoc-Schutzgruppe wurde mit einer 20%igen Lösung von Piperidin in DMF abgespalten und dabei für je einmal 5 min und einmal 15 min mit dem Amin gerührt. Nach dem letzten Kupplungsschritt wurde das Peptid vom Harz mit 100%iger TFA abgespalten und über präparative HPLC gereinigt. Stufe 2:

Zu einer Lösung der Verbindung 5 (10 mg; 7.6 μπιοΐ) und HATU (3.3 mg; 8.7 μmol) in NMP (1 ml) wurde DIPEA (5 μΐ; 29 μπιοΐ) gegeben. Das Gemisch wurde für 5 min geschüttelt und

anschließend mit H- (L-Pro) 6-OH (10 mg; 16 μπιοΐ) versetzt. Nach Schütteln des Gemischs für 2h wurde das Produkt mittels präparativer HPLC gereinigt. Ausbeute: 8.7 mg (60%).

Beispiel 49: Synthese von Verbindung 50:

Stufe 1: Synthese des Hexapeptids H- (L-Ala) 6-OH

Das Hexapeptid wurde aus Fmoc-geschütztem L-Alanin analog dem Protokoll zur Herstellung von H- (L-Pro) 6-OH synthetisiert wie unter der Stufe 1 des Beispiels 48 beschrieben.

Stufe 2:

Verbindung 50 wurde aus der Verbindung 5 (10 mg; 7.6 ymol) und H- (L-Ala) 6-OH (10 mg; 23 μπιοΐ) in der gleichen Weise erhalten wie unter Beispiel 48 (Stufe 2) beschrieben. Ausbeute: 8.1 mg (61%).

Beispiel 50: Synthese von Verbindung 51: Stufe 1: Synthese des Hexapeptids H- (ß-Ala) 6-OH

Das Hexapeptid wurde aus Fmoc-geschütztem ß-Alanin analog dem Protokoll zur Herstellung von H- (L-Pro) 6-OH synthetisiert wie unter der Stufe 1 des Beispiels 48 beschrieben. Stufe 2:

Verbindung 51 wurde aus der Verbindung 5 (10 mg; 7.6 ymol) und H- (ß-Ala) 6-OH (10 mg; 23 μπιοΐ) in der gleichen Weise erhalten wie unter Beispiel 48 (Stufe 2) beschrieben. Ausbeute: 4.2 mg (32 %) .

Beispiel 51: Synthese von Verbindung 52:

Zu einer Lösung von Verbindung 5 (10 mg; 7.6 ymol) und HATU (3.3 mg; 8.7 ymol) in NMP (1 ml) und wurde DIPEA (5 μΐ; 29 ymol) gegeben und das Gemisch 5 min geschüttelt. Nach Zugabe von 2- (N, -Dimethylamino) ethylamin (2.3 μΐ; 21 ymol) wurde für weitere 2h geschüttelt und das Produkt anschließend mittels präparativer HPLC gereinigt. Ausbeute: 7.9 mg (75 %) .

Beispiel 52: Synthese von Verbindung 53:

Verbindung 53 wurde aus Verbindung 5 (10 mg; 7.6 ymol) und 4- (2-Aminoethyl) morpholin (2.1 μΐ; 16 ymol) nach der unter

Beispiel 51 beschriebenen Methode erhalten. Ausbeute: 9.0 mg (83 %) .

Beispiel 53: Synthese von Verbindung 54:

Stufe 1 : N- (2- (Piperazin-l-yl) ethyl) -tritylamin

Eine Lösung von 1- (2-Aminoethyl) -piperazin (100 μΐ; 0.76 mmol) und Triethylamin (106 μΐ; 0.76 mmol) in DCM (20 ml) wurden auf 5°C gekühlt und mit Tritylchlorid (212 mg; 0.76 mmol) versetzt. Das Gemisch wurde bei 20 °C über Nacht gerührt und nach Entfernen des Lösungsmittels das Produkt über eine präparative HPLC gereinigt. Ausbeute: 84 mg (30 %) .

Stufe 2 : 4- [4- (2-Aminoethyl) piperazin-l-yl] -4-oxo-buttersäure Zu einer Lösung von N- (2- (Piperazin-l-yl) ethyl) -tritylamin (55 mg; 0.15 mmol) in DMF (2 ml) wurden Bernsteinsäureanhydrid (30 mg; 0.30 mmol) und DIPEA (51 μΐ; 0.3 mmol) gegeben. Das Gemisch wurde für 2h gerührt und das Produkt 4-Oxo-4- { 4- [2- ( trityl-amino) ethyl ] piperazin-l-yl } -buttersäure über präparative HPLC gereinigt. Nach Gefriertrocknung wurde zu diesem Produkt TFA (2 ml) gegeben und das Gemisch für 30 min gerührt. Die TFA wurde im Vakuum abdestilliert und der Rückstand mittels präparativer HPLC gereinigt. Ausbeute: 25 mg (36 %) .

Stufe 3:

Eine Lösung von Verbindung 5 (10 mg; 7.6 ymol) , HATU (8 mg; 8.7 ymol) und DIPEA (10 μΐ; 29 ymol) in NMP (1 ml) wurde 5 min geschüttelt. Nach Zusatz von 4- [4- (2-Aminoethyl) piperazin-1- yl ] -4-oxo-buttersäure (24 mg; 106 ymol) wurde für weitere 2h geschüttelt. Das Produkt wurde mittels präparativer HPLC gereinigt. Ausbeute: 18 mg (67 %) .

Beispiel 54: Synthese von Verbindung 55:

3-Amino-2- (methylamino) benzoesäure wurde nach

Literaturvorschrift hergestellt (WO2008/008431) und die Säure (38 mg; 0,23 mmol) mit TBDMS-CsA-Aldehyd (300 mg; 0,23 mmol) umgesetzt in der gleichen Weise wie für Verbindung 5 (Methode B) beschrieben. Ausbeute: 60,3 mg (20 %) , farbloser Feststoff; MS (ES) C ₆₈ Hii ₃ N ₁₃ 0i ₄ berechnet 1336, gefunden 1337 (M+H) ⁺ .

Beispiel 55: Synthese von Verbindung 56:

Stufe 1:

3- (N-Acetyl-N-methyl-amino) -2-nitrobenzoesäure wurde nach

Literaturvorschrift hergestellt (W01998/24771) und die Säure (5,35 g; 22,46 mmol) zusammen mit 6N HCl (46 ml) 90 min in einem Bombenrohr auf 120°C erhitzt. Nach Abdestillieren des Lösungsmittels wurde in Methanol aufgenommen, auf

Diatomeenerde aufgezogen, an Kieselgel chromatographiert

(CHCl ₃ /MeOH 19:1 + 0,5% HOAc) und 3,4 g (77 %) 3- (Methylamino) - 2-nitrobenzoesäure erhalten.

Stufe 2 :

Eine Lösung der vorstehend beschriebenen Nitroverbindung (3,35 g; 17,1 mmol) und Hydrazin Hydrat (2,5 ml; 51,2 mmol) in trockenem MeOH (100 ml) wurde vorsichtig portionsweise mit einer Suspension von Raney-Ni (3,4 g) in dem gleichen

Lösungsmittel versetzt. Das Gemisch wurde 30 min bei 50°C gerührt, eingeengt, danach der Rückstand mit MeOH über

Kieselgel filtriert und 1,24 g (44 %) 2-Amino-3- (methylamino) benzoesäure als dunkler Feststoff erhalten.

Stufe 3:

Die Benzoesäure aus der vorstehenden Stufe (32 mg; 0,19 mmol) wurde mit TBDMS-CsA-Aldehyd (250 mg; 0,19 mmol) umgesetzt in der gleichen Weise wie für Verbindung 5 (Methode B)

beschrieben. Ausbeute: 89 mg (35 %) , brauner Feststoff; MS (ES) C ₆₈ Hii ₃ N ₁₃ 0i ₄ berechnet 1336, gefunden 1337 (M+H) ⁺ .

Beispiel 56: Synthese von Verbindung 57:

Das Dipeptid H-L-Glu (OCH ₂ Ph) -L-Glu (OCH ₂ Ph) -NH ₂ wurde über

Standard Fluorenylmethoxycarbonyl (Fmoc) -Peptid-Synthese an ein Rink-Amid-Harz gebunden (Aktivierung von Fmoc-L-Glu (OCH ₂ Ph) -OH mit PyBOP / DIPEA und Abspaltung der Fmoc-Gruppe mit 2% DBU in DMF und 2% Piperidin in DMF) . Zu dem Harz wurde eine Lösung der Verbindung 5 (16 mg; 0,012 mmol), HATU (7 mg; 0,18 mmol) und DIPEA (6 μΐ) in DMF (2 ml) gegeben. Nach Schütteln über Nacht wurde das Reaktionsprodukt mit TFA/DCM 1:1 (2 ml) innerhalb von 1 h bei Raumtemperatur vom Harz abgespalten. Es wurde filtriert, Toluol (2 x 2 ml) hinzugegeben und das

Lösungsmittel jeweils im Vakuum entfernt. Das Endprodukt wurde aus dem Rückstand mittels präparativer HPLC abgetrennt.

Ausbeute: 6 mg (28 %) .

Beispiel 57: Synthese von Verbindung 58: Verbindung 58 wurde nach der unter Beispiel 56 beschriebenen Methode aus Fmoc-L-Leu-OH, Fmoc-L-Arg ( Pbf) -OH, Verbindung 5 (35 mg; 0,0265 mmol), HATU (11 mg; 0,029 mmol) und DIPEA (9 μΐ) erhalten. Nach Waschen des Harzes mit DMF und DCM wurde die Titelverbindung mit TFA abgespalten und aus dem Rückstand mittels präparativer HPLC isoliert. Ausbeute: 2 mg (5 %) .

Beispiel 58: Synthese von Verbindung 59: Verbindung 59 wurde in der gleichen Weise wie unter Beispiel 57 beschrieben aus Fmoc-L-Pro-OH, Fmoc-L-Asn (Trt ) -OH und

Verbindung 5 (35 mg; 0,0265 mmol) erhalten. Ausbeute: 28 mg (69 %) .

Beispiel 59: Synthese von Verbindung 60:

Verbindung 60 wurde in der gleichen Weise wie unter Beispiel 57 beschrieben aus Fmoc-L-Cys (Trt) -OH, Fmoc-L-Ala-OH und

Verbindung 5 (35 mg; 0,0265 mmol) hergestellt. Die Abspaltung der Endverbindung vom Harz erfolgte durch TFA (3 ml) , welches DTT (100 mg) enthielt. Ausbeute: 12 mg (30 %) . Beispiel 60: Synthese von Verbindung 61:

Verbindung 61 wurde in der gleichen Weise wie unter Beispiel 59 beschrieben aus Fmoc-L-Cys (Trt) -OH und Verbindung 5 (35 mg; 0,0265 mmol) hergestellt. Ausbeute: 4,4 mg (11 %) .

Beispiel 61: Synthese von Verbindung 62: Verbindung 62 wurde in der gleichen Weise wie unter Beispiel 57 beschrieben aus Fmoc-L-Ser ( t-Bu) -OH, Fmoc-L-Glu (Ot-Bu) -OH und Verbindung 5 (35 mg; 0,0265 mmol) hergestellt. Ausbeute: 11, 6 mg (28 %) .

Beispiel 62: Synthese von Verbindung 63:

Verbindung 62 wurde in der gleichen Weise wie unter Beispiel 57 beschrieben aus Fmoc-L-Glu (Ot-Bu) -OH und Verbindung 5 (35 mg; 0,0265 mmol) hergestellt. Ausbeute: 13 mg (31 %) .

Beispiel 63: Synthese von Verbindung 64: Zu einer Lösung von Verbindung 5 (10 mg; 7,6 ymol) in NMP (1 ml) wurden HATU (3,3 mg; 8,7 ymol) und DIPEA (5 μΐ) gegeben. Nachdem das Gemisch 2 Minuten verrührt worden war, wurde 1- (2- Aminoethyl ) -piperazin (1,2 mg; 9,4 ymol) hinzugegeben und 3 Stunden geschüttelt. Verbindung 64 wurde durch präparative HPLC abgetrennt. Ausbeute: 3,7 mg (34 %) .

Beispiel 64: Synthese von Verbindung 65: Zu einer Lösung von Verbindung 5 (10 mg; 7,6 ymol) in DCM (1 ml) wurden DIC (2 μΐ) und DMAP (1,4 mg; 11,4 ymol) gegeben. Es wurde 30 Minuten gerührt und das Lösungsmittel im Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde mit einer Lösung von

Salicyclsäure (2 mg; 14,5 ymol) in NMP (1 ml) versetzt, das

Gemisch über Nacht geschüttelt und anschließend Verbindung 65 durch präparative HPLC isoliert. Ausbeute: 1,5 mg (13 %) .

Beispiel 65: Synthese von Verbindung 66: Stufe 1:

N- (Trityl) -2- (2- (2-aminoethoxy) ethoxy) ethylamin wurde nach einer Literaturvorschrift (Eur. J. Org. Chem. 2009, 3953-3963) dargestellt.

Stufe 2 :

Verbindung 5 (50 mg; 0,038 mmol) und PyBOP (19,7 mg; 0,038 mmol) wurden in NMP (3 ml) gelöst und nacheinander DIPEA (19,3 μΐ) und das Amin der Stufe 1 (17,7 mg; 0,045 mmol)

hinzugegeben. Es wurde 1 Stunde gerührt, mit Essigester (50 ml) verdünnt und nacheinander jeweils zweimal mit 5%iger KHSO ₄ - , 5%iger NaHC0 ₃ - und gesättigter Kochsalz-Lösung gewaschen. Die organische Phase wurde über MgSC^ getrocknet, im Vakuum

eingeengt und mit TFA (2 ml) versetzt. Nach 15 Minuten bei

Raumtemperatur wurde eingeengt und anschließend Verbindung 66 durch präparative HPLC isoliert. Ausbeute: 29 mg (52 %) .

Beispiel 66: Synthese von Verbindung 67:

Zu einer Lösung von eis, cis-1, 3, 5-Cyclohexantricarbonsäure (22 mg; 0,1 mmol), Verbindung 66 (7,3 mg; 0,005 mmol) und PyBOP (3 mg; 0,0058 mmol) in NMP (1 ml) wurde DIPEA (10 μΐ) gegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und Verbindung 67 anschließend mittels präparativer HPLC isoliert. Ausbeute: 5 mg (61 %) .

Beispiel 67: Synthese von Verbindung 68:

Zu einer Lösung von Bernsteinsäureanhydrid (20 mg; 0,2 mmol) und Verbindung 66 (7,3 mg; 0,005 mmol) in NMP (1 ml) wurde DIPEA (10 μΐ) gegeben und das Gemisch über Nacht bei

Raumtemperatur gerührt. Verbindung 68 wurde anschließend mittels präparativer HPLC isoliert. Ausbeute: 2,9 mg (37 %) .

Beispiel 68: Herstellung von Verbindung 69 durch Derivatisierung von Verbindung 5 mit einem Farbstoffmolekül : a) Synthese von TAMRA-EDO (Indikator) : Eine Lösung von 5 ( 6) -Carboxytetramethylrhodamin (20 mg; 46,5 μιηοΐ) in DMF (5 ml) wurde mit 2- (7-Aza-lH-benzotriazole-l-yl) - 1 , 1 , 3 , 3-tetramethyluronium Hexafluorophosphate (HATU) (19 mg; 8,3 μιηοΐ) versetzt und für 5 min zur Präaktivierung gerührt. Zu dieser Lösung wurde anschließend) 2,2- (Ethylenedioxy) ethyldiamin (68μ1; 465 μιηοΐ) zugegeben. Es wurde für 2h gerührt und das Produkt mittels präparativer HPLC isoliert. Ausbeute: 15 mg (57.6%). b) Synthese von Verbindung 69:

Verbindung 5 (10 mg; 7.56 μιηοΐ) wurde in DMF (1 ml) gelöst und nach Zugabe von HATU (3,2 mg; 8.3 μιηοΐ) und DIPEA (3.9 μΐ; 22.68 μιηοΐ) zur Präaktivierung für 5 min gerührt. Danach wurde die Lösung zu TAMRA-EDO (8.5 mg; 15.12 ymol) , gelöst in DMF (1 ml), gegeben. Es wurde für 2 h gerührt und das Produkt (Verbindung 69) mittels präparativer HPLC isoliert. Ausbeute: 7 mg (50%) .

Beispiel 69: Hemmung der Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerase (PPIase) Aktivität des Cyclophilins Cypl8wt

Die Bestimmung wurde an einem UV/Vis Spektrometer bei 10 °C Küvettentemperatur durchgeführt, wobei das Gerät bei 390 nm im Kinetik-Modus betrieben wurde (Meßpuffer: 35 mM HEPES/NaOH pH 7.8 (AppliChem A1069)). In der Küvette befanden 0.58 nM

rekombinantes humanes Wildtyp Cypl8 (Cypl8wt) , 2.33 nM

Rinderserumalbumin (BSA) und lmg/ml Chymotrypsin (Merck) , gelöst in 35 mM HEPES/NaOH pH 7.8, sowie gegebenenfalls

unterschiedliche Konzentrationen der jeweiligen Testsubstanz. Die Reaktion wurde gestartet mit einer Stammlösung von Suc- Ala-Ala-Pro-Phe-4-nitroanilid (Bachem, 10 mg/ml DMSO) als

Substrat, so dass eine finale Substratkonzentration von 32 μΜ resultierte. Die Extinktions-Zeit-Kurven wurden nach Ablauf der schnellen Phase der Reaktion nach ca. 60 sec nach einem Geschwindigkeitsgesetz 1. Ordnung ausgewertet. ICso-Werte der Inhibitoren resultieren aus der Geschwindigkeitskonstanten 1. Ordnung der nicht-inhibierten Reaktion im Verhältnis zur inhibierten ReaktΪOΠ ( "6 Inhibition) , gemessen in Abhängigkeit von der Inhibitorkonzentration in der Küvette. Die

resultierenden ICso-Werte der Testverbindungen sind in der Tabelle 1 aufgeführt.

Beispiel 70: Hemmung der Phosphataseaktivität von Calcineurin Die Bestimmung der dephosphorylierenden Calcineurinaktivität in Gegenwart und in Abwesenheit von Inhibitoren wurde in einem Scintillations-Proximity-Assay durchgeführt (siehe auch R.

Baumgrass, et al . ; J. Biol. Chem. 276 (2001), 47914-47921). Die Messung wurde durch Inkubation von 10 pMol des ³³ P

markierten, biotinylierten Phosphopeptids Asp-Leu-Asp-Val-Pro- Ile-Pro-Gly-Arg-Phe-Asp-Arg-Arg-Val-pSer-Val-Ala-Ala-Glu (MW = 2192.0) (RII-Peptid) in einem Probepuffer (40 mM Tris-HCl, pH 7.5, 100 mM NaCl, 6 mM MgCl ₂ , 0.5 mM Dithiothreitol , 1 mM CaCl ₂ , 0.1 mg/ml Rinderserumalbumin) in Gegenwart von 50 nM Calmodulin und 1.32 nM Calcineurin bei 30 °C für 20 min in einer 96-well Mikrotiterplatte (Costar, Bodenheim, Germany) durchgeführt. Das Gesamtvolumen des Assays/well betrug 100 μΐ . Nach dieser Reaktionszeit wurde ein 90 μΐ Aliquot der

Reaktionsmischung in eine mit Streptavidin beschichtete

Scintillationskavität überführt und für 20 min bei 22°C inkubiert. Nach einem Waschschritt wurde die RH

Phosphopeptid-assoziierte ³³ P Radioaktivität an einem MicroBeta Top Counter (Wallac) vermessen und die Enzymaktivität als Mittelwert von drei Messungen ± S.D. angegeben. Die

uninhibierte Dephosphorylierungsaktivität wurde auf 100 % gesetzt. Die Calcineurin-Inhibition potentieller Cyclophilin- Inhibitor-Komplexe wurde in Gegenwart von ΙΟηΜ bis 50 μΜ Cypl8 Konzentrationen bei konstanter Inhibitorkonzentration von 10- 50 μΜ (typische 1 mM Stammlösungen in DMSO) gemessen. Die Ergebnisse für die Testverbindungen sind in der Tabelle 1 aufgeführt .

Beispiel 71: Überprüfung der immunsuppressiven Wirkung im zellulären NFAT-Reporter-Gen Assay

Eine antigenspezifische Stimulation des T-Zell-Rezeptors bewirkt die Aktivierung von Transkriptionsfaktoren wie z.B. NFAT (nuclear factor of activated T cells) . NFAT-Aktivierung ist essentiell für die Expression von Interleukin-2 und damit für die Proliferation von T-Zellen im Rahmen der Immunantwort. Eine stabile NFAT-Reporter-Gen Zelllinie ermöglicht die

Analyse von Modulatoren des NFAT-Pathways und damit die

Untersuchung der immunsuppressiven Wirkung von Verbindungen.

Die stabil transfizierte Reporter-Gen Zelllinie GloResponse NFAT-RE-luc2P HEK293 (Promega Corp. USA) wurde in DMEM (10% FCS; 2mM Glutamin; 200yg/ml Hygromycin) kultiviert und auf 96well-Platten (20.000 Zellen/well) ausgelegt. Die zu

testenden Verbindungen wurden entweder in einer 2-Punkt- Bestimmung (5μΜ und 10μΜ) oder einer ICso-Bestimmung

(Konzentrationsreihe 4.1 nM - 1 μΜ) zu den Zellen gegeben. Als immunsuppressive Referenzverbindung wurde unmodifiziertes Cyclosporin A verwendet. Unmittelbar danach wurden die Zellen mit 5 nM PMA und 2 μΜ Ionomycin stimuliert und für 16h

inkubiert (37°C; Zellinkubator). Diese Doppelstimulation simuliert eine T-Zellrezeptor-Stimulation und bewirkt eine NFAT-Aktivierung mit anschließender Expression des Luziferase- Reporter-Gens. Die Menge an Luziferase wurde nach 16h

quantitativ durch Messung der Biolumineszenz mittels Bright- Glo Luziferase-Assay-System (Promega Corp., USA) bestimmt. Die gemittelten Luziferase-Werte der mit Vehikel (1% DMSO)

behandelten und mit PMA/Ionomycin stimulierten Zellen wurden als Positivkontrolle und Referenzwert (100% Aktivität; 0%

Inhibition) verwendet. Die Ergebnisse für die Testverbindungen sind in der Tabelle 1 aufgeführt.

In der folgenden Tabelle 1 sind die erfindungsgemäßen

Verbindungen 4-68 im Vergleich zu Cyclosporin A bezügl. ihrer Aktivität zur Inhibierung von Cypl8 und Calcineurin sowie ihrer Aktivität im NFAT-Reporter-Gen Assay aufgelistet:

Beispiel 72: Bestimmung der Zellpermeabilität in Jurkat-Zellen

Jurkat-Zellen der Zellzucht wurden geerntet und zentrifugiert . Das Medium wurde verworfen und die Zellen einmal mit RPMI (ohne Phenolrot, 10%FCS, Hepes, Gentamycin) gewaschen. Die Zellen wurden in einem Medium re-suspendiert , auf eine Zellkonzentration von 1.0xl0 ⁵ -3.0xl0 ⁵ Zellen/ml eingestellt und anschließend mit einem fluoreszierenden CsA-Derivat (0.5μΜ- 2.0μΜ) bei 37°C, 5-10% C0 ₂ und 100% Luftfeuchtigkeit inkubiert. Die Zellen wurden danach zentrifugiert , das Medium verworfen, das Zellpellet einmal mit Medium gewaschen und die Zellen in einem neuen Medium re-suspendiert . Anschließend wurden die Zellen mit den entsprechenden Konzentration (0.01 μΜ bis 100 μΜ) der zu untersuchenden Testverbindung für eine halbe bis vier Stunden inkubiert und danach erneut zentrifugiert . Das Medium wurde verworfen, einmal mit 1 ml PBS gewaschen und in 500 μΐ PBS suspendiert. Die Analyse erfolgte mittels FACS- Messung durch Quantifizierung des verdrängten fluoreszierenden CsA-Derivats . Die Referenz (ohne Inhibitor) wurde dabei als 100% gesetzt. Die Ergebnisse für Verbindung 5 und für Cyclosporin A aus diesem Testsystem zeigen (Figur 1), dass die Verbindung 5 im Vergleich zu CsA nicht-zellgängig ist.

Beispiel 73: Bestimmung der Zellpermeabilität in Caco2- Zellmembranen

Die Testsubstanzen wurden von einer 10 mM DMSO-Lösung auf eine finale Konzentration von 5 μΜ in HBSS Puffer pH 7.4 verdünnt. Anschließend wurde für 2 Stunden bei 37 °C und 5% CO ₂ auf einer differenzierten Monoschicht aus Caco2-Zellen inkubiert, die für 10 Tage auf einer Transwell-Membran gewachsen war. Die Konzentration der Testsubstanz wurde im Ausgangs- als auch im Empfänger-Well bestimmt. Die apparente Permeabilität (P _app ) in Richtung apikal nach basolateral (A-B) und umgekehrt (B-A) wurde nach folgender Formel berechnet: P _app = 1/ACo (dQ/dt) , wobei A die Fläche der Transwell-Membran, Co die

Substanzkonzentration zum Zeitpunkt t = 0 und dQ/dt die pro Zeiteinheit migrierende Substanzmenge darstellt. Die

Ergebnisse für die Testverbindungen sind in der Tabelle 2 aufgeführt . Beispiel 74: Bestimmung der Zellpermeabilität in PAMPA- Zellmembranen (Parallel-artifi zieller

Membranpermeabilitätsassay)

Die Testsubstanzen wurden von einer 10 mM DMSO-Lösung auf eine finale Konzentration von 500 μΜ in 50 mM Hepes Puffer pH 7.4 verdünnt und auf eine Transwell-Membran überführt, die mit einer Membran-bildenden Lösung aus 10% 1 , 2-Dioleyl-sn-glycer- 3-phosphocholin und 0.5% (w/v) Cholesterol in Dodecan bedeckt war. Nach einer Inkubation von 16 Stunden bei Raumtemperatur in einer Feuchtkammer wurde nach Filtration die optische

Dichte der Lösung in einem Bereich von 250 bis 500 nm in

Schritten von je 10 nm gemessen. Der Prozentsatz „Flux" wurde aus dem Integral des Graphen zwischen 250 und 500 nm berechnet und auf die im Parallelansatz ohne künstliche Membran

ermittelte optische Dichte standardisiert. Die Ergebnisse für die Testverbindungen sind in der Tabelle 2 aufgeführt.

Tabelle 2 : Zellpermeabilität ausgewählter erfindungsgemäßer Verbindungen im Vergleich zu Cyclosporin A in Caco2- und in PAMPA-Zellmembranen :

Beispiel 75: Überprüfung der immunsuppressiven Wirkung im Proliferationsassay

Für die Isolierung der Immunzellen aus der Milz von Mäusen wurde der Stamm C57BL/6 verwendet und über CHARLES RIVER Laboratories bezogen. Vor der Sektion wurden die 14 Wochen alten Tiere für 15 min in einen mit CO ₂ gefluteten Tank gestellt. Nachdem keine Lebenszeichen mehr an den Mäusen zu erkennen waren, erfolgte ein Genickbruch und die Sektion mit der Entnahme der Milz. Die Isolierung der Milzzellen erfolgte bei Raumtemperatur in 5 mL HBSS (PAA) durch Zerdrücken des Organs und Ausstreichen der Zellen mittels der Rückseite des Kolbens einer 1 mL Spritze. Anschließend wurden die Zellen durch ein 40 ym Zellsieb gegeben und vereinzelt. Das Sieb wurde erneut mit 5 mL HBSS gewaschen. Für die Separation der Immunzellen wurde ein Dichtegradient verwendet, wobei 5 mL Lymphocyte Separation Medium (Mediatech, Inc.) mit 5 mL der Zellsuspension überschichtet wurden. Die weiteren Schritte erfolgten nach Angaben des Herstellers.

Die Untersuchung auf Inhibierung der Proliferation von

Milzzellen durch die Testsubstanzen wurde in Mikrotiterplatten (96well plate) in dreifacher Anordnung durchgeführt. Dafür wurden 2 μΜ der zu testenden Verbindungen oder adäquate

Kontrollen (Medium, DMSO, CsA) in RPMI-1640 Medium (PAA) mit 3,04 x 10 ⁵ Zellen in 90 yL inkubiert (Gesamtvolumen 100 yL) . Die Aktivierung der Proliferation erfolgte durch Zugabe von 0,01 mg/mL Concanavalin A (ConA) in PBS (Sigma) . Die Zellen wurden anschließend bei 37°C für 72 Stunden inkubiert. Die Proliferation wurde im Anschluss kolorimetrisch ermittelt. Dazu wurden 11 yL MTT Reagenz (5mg/ mL,

Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium-bromid; Sigma) zu den Zellen gegeben und für weitere 5 Stunden bei 37°C inkubiert. Im Anschluss wurde das Medium abgenommen, die Zellen in 100 yL DMSO resuspendiert und die Absorption bei 550 nm und 630 nm mit einem Multiplate Reader (VERSmax, Molecular Devices) ermittelt. Das Testergebnis für Verbindung 5 im Vergleich zu Cyclosporin A ist beispielhaft in Figur 2 gezeigt.

Beispiel 76: Asthma-Untersuchungen:

Durch Gabe von Ovalbumin zusammen mit Aluminiumhydroxid wird eine Immunantwort gegen Ovalbumin provoziert. Die Immunantwort kann anhand der in die Bronchialschleimhaut eingewanderten T- Helferzellen-Population (CD4+) und der eingewanderten

eosinophilen Granulozyten verfolgt werden. Weibliche Mäuse (BALB/c-Linie) wurden durch intraperitonale (i.p.) Gabe von 50 g Ovalbumin gelöst in Phosphatpuffer (PBS) gelöst ( (OVA) plus 100 L Aluminiumhydroxid) bei einem Gesamtvolumen von 200 L per Maus an Tag 0 sensibilisiert. Den Ovalbum-sensibilisierten Mäusen wurde dann unter milder Anästhesie (Isoflurane) an den Tagen 7-10 intranasal jeweils 100 μg OVA in PBS (50 μL

Gesamtvolumen) verabreicht. Aus diesen Tieren wurden Gruppen gebildet, welche zusätzlich an den Tagen 7, 9 und 11 entweder 200 yg der Testverbindung in PBS (i.p.), nur PBS (Diluent) oder keinen weiteren Zusatz (-) erhielten. Am Tag 12 wurden alle Tiere durch C02-Exposition getötet und Zellen des

Bronchialtraktes durch Bronchiallavage (BAL) mittels einer in die Trachea eingeführten Kanüle bei dreimaligem Waschen mit je 1 ml von kaltem PBS erhalten. Die erhaltenen Zellen der BAL wurden dann doppelt angefärbt (a) mit Cy-Chrome-konj ugierten anti-Maus-CD4 -Antikörpern und (b) mit FITC-konj ugierten anti- Maus-CD62L-Antikörpern . Anschließend wurden die Zellen mittels FACS analysiert. Effector/Memory-CD4 ⁺ -T-Zellen wurden als

CD4 ⁺ /CD62L ^~ -Lymphocyten und eosinophile Zellen anhand ihrer Streulichteigenschaften (FSC/SSC) unterschieden. Die mit der Verbindung 5 erhaltenen Ergebnisse sind in den Abbildungen Fig. 3 bis 6 zusammengefasst .

Fig. 3 zeigt den Einfluss von Verbindung 5 auf die Anzahl der eosinophilen Granulozyten (Eosinophile) , welche durch die Ovalbuminsensibiliserung in die Bronchialschleimhäute einwanderten und sich in der Lungenspülflüssigkeit (Lavage) nachweisen lassen. Die Gabe von Verbindung 5 reduzierte hochsignifikant die Anzahl der eosinophilen Granulozyten.

Fig. 4 zeigt den Einfluss von Verbindung 5 auf die Anzahl der eosinophilen Granulozyten (Eosinophile) im Lungengewebe, welche durch die Ovalbuminsensibiliserung in die

Bronchialschleimhäute einwanderten. Die Gabe von 200 yg der Verbindung 5 reduzierte hoch-signifikant die Anzahl der eosinophilen Granulozyten.

Fig. 5 zeigt den Einfluss von Verbindung 5 auf die Anzahl der CD4 positiven T-Zellen, die durch die Ovalbuminsensibiliserung in die Bronchialschleimhäute einwanderten und sich mittels Lungenspülung in die Lungenspülflüssigkeit (BAL) auswaschen lassen. Auch hier reduzierte die Gabe von 200 yg der

Verbindung 5 die Anzahl der CD4 positiven T-Zellen hochsignifikant .

Fig. 6 zeigt den Einfluss der Verbindung 5 auf die Anzahl der CD4 positiven T-Zellen im Lungengewebe, die durch die

Ovalbuminsensibilisierung in die Bronchialschleimhäute

einwanderten und sich dort nachweisen lassen. Die Gabe von 200 μΜ der Verbindung 5 reduzierte hoch-signifikant die Anzahl der CD4 positiven T-Zellen.