CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere al campo de la química medicinal con énfasis en los efectos terapéuticos de la combinación de compuestos antioxidantes y anticancerigenos .

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Actualmente el cáncer es una de las enfermedades de mayor preocupación a nivel mundial y un reto para los sistemas de salud pública en especial para países en desarrollo debido a los aspectos económicos y sociales que conlleva la enfermedad.

En México, esta enfermedad es una causa importante de morbilidad y mortalidad debido a las deficiencias nutricionales y enfermedades inf ecto-contagiosas propias de la región. El padecimiento se mantiene entre la segunda y tercera causa de muerte desde el año 2000 a la fecha. En el 2013 el cáncer causó el 12.84% de las muertes registradas en México, posicionándose como la tercera causa de muerte tan solo después de las enfermedades cardiacas (24.3%) y diabetes (14.3%) . Entre los principales tipos de cáncer que han causado el 45% de las muertes por esta enfermedad, entre el año 2000 y 2013, se encuentran: el cáncer de pulmón, cáncer de estómago, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer de mama y cáncer cervicouterino . Se ha observado que la tasa de mortalidad de la enfermedad (por cada 100,000 habitantes) va en aumento. En el 2000 se estimó en 58.7, mientras que en el 2013 la tasa de mortalidad reportada fue de 65.1 y se ha calculado que para el año 2020 esta tasa será de 79 por cada 100,000 habitantes (IC 95% 76.51 a 81.48) y que habrá 1,262,861 mexicanos (IC 95% 1,079,419 a 1,446,303) diagnosticados con algún tipo de cáncer ¹ . Existen distintas opciones de tratamiento para el cáncer y su utilización dependerá del tipo de cáncer y del estadio de la enfermedad. Lo más común es utilizar combinación de la cirugía con quimioterapia y/o radioterapia, o también utilizar tratamientos inumnoterapéuticos , terapia hormonal o terapia blanco-especifica. En México, las instituciones de salud incluyen en sus guias de práctica clínica distintas opciones de quimioterapia para el tratamiento de los principales tipos de cáncer, entre ellos se incluyen: cisplatino, 5-fluorouracilo, oxaliplatino , epirrubicina, mitomycin-C, vinorelbine, gemcitabine, capecitabine , paclitaxel, docetaxel, carboplatino , etopósido, tamoxifeno, cetuximab, trastuzumab, gefitnib, erlotinib. Estos fármacos presentan distintos mecanismos de acción para inhibir el crecimiento de las células tumorales, no obstante, algunos pueden presentar costos muy elevados y otros presentan asociadas reacciones adversas de distintos grados de severidad. Por tanto, en la experiencia clínica del tratamiento quimioterapéutico del cáncer se presentan con frecuencia dos relevantes áreas de oportunidad en la mejora de los tratamientos disponibles: 1) aspectos relacionados con la seguridad y eficacia del medicamento; y 2) el costo de los tratamientos disponibles. En general el costo de los fármacos quimioterapéuticos disponibles en México como los también distribuidos en el mundo es elevado .

Respecto a la seguridad de los fármacos antineoplásicos , los del tipo citotóxicos son los considerados los fármacos más tóxicos que se pueden prescribir a un ser humano y entre ellos se encuentran los fármacos más utilizados en México (por ejemplo, cisplatino, 5- fluorouracilo , epirrubicina , gemcitabine, capecitabine , paclitaxel , etopósido, entre otros) . Muchos de estos tienen un indice terapéutico de 1, lo que significa que la dosis terapéutica es prácticamente la misma que la dosis tóxica. Principalmente, los fármacos citotóxicos pueden afectar la médula ósea, la mucosa gastrointestinal y los folículos pilosos debido a que estos tejidos tienen un factor de crecimiento elevado y es precisamente en donde este tipo de fármacos ejercen su mecanismo de acción. Dependiendo del tipo de fármaco citotóxico también puede presentarse cardiotoxicidad, ototoxicidad, hepatotoxicidad y nef rotoxicidad ² .

La alta toxicidad de los compuestos citotóxicos está asociada a su mecanismo de acción, ya que éstos intervienen en la sintesis del DNA de la célula cancerosa, pero su selectividad queda limitada ya que este proceso también se lleva a cabo en las células no malignas y algunas de ellas pueden tener tasas de crecimiento similares a las malignas. La alteración en la sintesis de DNA generada por los fármacos citotóxicos puede ser a distintos niveles, por ejemplo: en la biosintesis de bases nitrogenadas púricas o pirimidicas, en la formación de ribonucleótidos , en la biosintesis de DNA, directamente sobre el DNA, en la formación de mRNA y/o proteínas, o sobre las proteínas sintetizadas ² . Por el contrario, el efecto de los compuestos descritos en la presente invención ejerce un efecto antitumoral al promover un proceso de senescencia celular especifico para las células tumorales.

Las terapias dirigidas contra el cáncer son otras alternativas farmacológicas para este padecimiento que consisten en anticuerpos monoclonales (bevacizumab , cetuximab, trastuzumab, rituximab) o moléculas pequeñas inhibidoras (erlotinib, gefítíníb, imatinib, sorafenib) que difieren mucho del mecanismo de acción utilizado por los fármacos citotóxicos. En general, los fármacos de terapia dirigida presentan mejor tolerancia que los citotóxicos y pueden ser utilizados para distintos tipos de cáncer comunes como de mama, pulmón, colon, páncreas, linfoma, leucemia y mieloma múltiple. Este tipo de terapia está dirigido a moléculas particulares que se expresan en las células cancerosas por lo que representan los inicios de una terapia personalizada. No obstante, no parece ser la mejor opción para todos los pacientes, ya que en primer lugar las células cancerosas deben contener la molécula y/o receptor especifico para los cuales esté dirigido el fármaco de lo contrario este no podría ejercer un efecto sobre la tumoración. Asimismo, el costo parece elevarse por mucho en este tipo de fármacos.

Es por ello que los trabajos de investigación en cáncer se han enfocado en el desarrollo de nuevos tratamientos eficaces que presenten un mejor perfil de seguridad y un menor costo que los actualmente disponibles. En este sentido el uso de productos naturales se ha convertido en un área de oportunidad para el descubrimiento de fitofármacos con actividad anti-carcinogénica ya que se ha observado que pueden interferir en el inicio, desarrollo y progresión del cáncer a través de la modulación de diversos mecanismos celulares (proliferación, diferenciación, apoptosis, angiogénesis y metástasis) . Y se ha sugerido que el uso de productos naturales puede ofrecer una alternativa costo-efectiva en el tratamiento de las neoplasias ³ .

Pero también hay que considerar que un gran reto al que se enfrentan las distintas terapias contra el cáncer es la relacionada a la heterogeneidad tumoral, la cual determinará la sensibilidad del tumor a los diferentes fármacos utilizados. Asimismo, la heterogeneidad tumoral es un reflejo de la evolución de la célula tumoral, la cual depende de una gran diversidad de procesos que son individuales de cada persona que desarrolla cáncer. Lo anterior indica la necesidad de personalizar los tratamientos para cada paciente. Sin embargo, en nuestro pais, las limitaciones son varias para que de manera general se pueda llegar a los tratamientos personalizados. Por lo tanto, aún se requiere utilizar los fármacos tradicionales de manera convencional. Aunado a lo anterior, en la mayoría de los casos, la toxicidad de los fármacos anticancerosos actualmente utilizados en la clínica sigue siendo una limitación critica que justifica la búsqueda de nuevos tratamientos.

A lo largo del tiempo se han identificado y aislado distintos metabolites secundarios del guayule, que significa "árbol de hule". El Parthenium argentatum es un arbusto que crece en las zonas áridas del norte del pais y sur de los Estados Unidos el cual fue referido por primera vez por J. M. Bigelow en 1852, y sus características botánicas fueron descritas por Asa Gray de la Universidad de Harvard en 1859 ⁴ . En este árbol el hule está almacenado como una suspensión coloidal de látex confinado en células individuales y se ubica prácticamente en todos los órganos de la planta, tallos, ralees y hojas ⁵ . Entre los compuestos aislados del guayule se encuentran el parteniol, aceites esenciales (a- pineno, limoneno felandral, entre otros) , flavonoides metoxilados, sesquiterpenes llamados guayulinas A, B, C y D a partir del extracto etanólico, triterpenos del tipo cicloartano nombrados argentatinas A y C, la isoargentina B y la argentatina D, entre otros.

Durante el proceso químico para la obtención del hule a partir del guayule se obtiene una resina con un notable rendimiento ya que por cada kilogramo de hule se obtiene un kilogramo de resina de la cual las argentatinas representan el 27% ⁶ . Las argentatinas son triterpenos los cuales han sido considerados en la literatura científica como buenos candidatos para la búsqueda de compuestos activos que interfieren con el proceso inflamatorio y tienen actividad antitumoral en lineas celulares de cáncer humano ⁷ .

De manera particular el estudio de las argentatinas procedentes del guayule ha demostrado que estos compuestos presentan una actividad antimicrobiana contra Candida albicans , Torulopsis glabrata, Hansenulla sp. , Klebsiella pneumoniae y Pseudomonas aeruginosa ⁸ . Asimismo, otro estudio evaluó la actividad citotóxica de las argentantinas A y B en lineas celulares de cáncer humano (próstata, leucemia, sistema nervioso central, mama y colon) y se encontró que las argentatinas presentaban diferencias en su actividad citoestática de las células cancerosas, pero sin mostrar ci totoxicidad ni genotoxicidad sobre células linfociticas sanas ⁹ .

De este modo, la argentatina A presenta una oportunidad nueva ya que es un compuesto que ha demostrado tener actividad antitumoral . En la solicitud de patente mexicana MX/a/2019/006749 se describe la relevante y novedosa actividad antitumoral de la argentatina A con una nula toxicidad y genotoxicidad sobre células linfociticas sanas se debe a que actúa sobre mecanismos de regulación del ciclo celular. Dicho compuesto activo interfiere con el proceso inflamatorio y tiene actividad antitumoral en lineas celulares de cáncer humano ya que inhiben su crecimiento a través de un proceso de senescencia, que además, de manera indirecta se ha visto que no causa un efecto anti-proli f erativo sobre las células sanas. Asimismo, la baja toxicidad de la argentatina A se refleja en su actividad citotóxica, pero sobre todo en pruebas in vivo, donde los animales tratados con diferentes dosis de argentatina A no mostraron toxicidad ni sistémica ni aguda. Por otro lado, los hallazgos indican que la argentatina A induce muerte celular por apoptosis, la cual puede provenir de la actividad senescente de la argentatina A confirmada tanto in vivo como in vitro. Este estudio confirma que la argentatina A posee actividad antitumoral en el modelo de ratones xenotransplantados . Incluso, se demostró que tres administraciones semanales de argentatina A la dosis de 250 mg/kg fueron suficientes para inducir una desaceleración significativa del crecimiento tumoral y no produjeron efectos tóxicos en los animales experimentales. Asimismo, se comprobó, tanto in vitro como in vivo, que la argentatina A es capaz de promover dos tipos de respuesta celular, ya que induce muerte celular por apoptosis y también impulsa senescencia. Estas cualidades son un punto de partida para nuevas hipótesis y experimentos para analizar los mecanismos que regulan o intervienen en el delicado equilibrio entre estas dos respuestas celulares.

Estos hallazgos proponen continuar evaluando a la argentatina A en combinación con moléculas citotóxicas y/o antioxidantes para determinar si aumenta el efecto antitumoral en terapias combinadas.

Por otra parte, el ácido nordihidroguaiarético (NDGA) es un lignano fenólico obtenido de gobernadora (Larrea tridentata) ¹⁰ , un arbusto que se encuentra en los desiertos de México y Estados Unidos. La gobernadora se ha utilizado en la medicina tradicional para el tratamiento de numerosas enfermedades, sin ser limitativos a, cáncer, trastornos renales, cardiovasculares, inmunológicos y neurológicos , e incluso envejecimiento.

La estructura del NDGA presenta dos anillos de catecol que confieren una actividad antioxidante muy potente al eliminar los radicales libres de oxigeno (ROS) y esto puede explicar parte de su acción terapéutica. Los efectos adicionales incluyen la inhibición de las lipoxigenasas (LOX) y la activación de las vias de señalización que inciden en el factor de transcripción Factor nuclear relacionado con eritroide 2 (NRF2) . Por otro lado, la oxidación de los catecoles a las quinonas correspondientes puede provocar alteraciones en las proteínas y al ADN que plantean problemas de seguridad ¹¹ .

El NDGA se ha utilizado como conservante antioxidante de alimentos y como suplemento nutricional, principalmente en forma de té de chaparral .

Los efectos mejor caracterizados de NDGA son:

1) La eliminación de ROS por NDGA disminuyendo los efectos prooxidantes de la inflamación;

2) los efectos inhibidores sobre la actividad de las lipoxigenasas (LOX) , que conducen a la reducción de los hidroperóxidos lipidióos (5-HEPE (ácido 5-Hidroxieicosapentanoico) y 5-HETE (ácido 5- hidroxieicosatetraenoico ) a 50 pM NDGA) que podrían tanto desencadenar el estrés oxidativo debido a su descomposición en radicales libres, asi como la inducción de la producción de ROS a través de la activación de NADPH-oxidasas , MAPK (Mi togen-Activated Protein Kinases) , etc ¹² ; la activación de respuestas antioxidantes endógenas mediadas por NRF2.

Por lo anterior se postula que la principal función del NDGA es su carácter antioxidante. Sin embargo, se ha propuesto que, en células cancerosas actúa como agente oxidante e induce la apoptosis ¹³ . El aumento de la producción de ROS y la disrupción del potencial de la membrana mitocondrial (DOm) inducida por varios compuestos naturales se han asociado con la inhibición del crecimiento de diferentes modelos de cáncer ¹⁴ . Por ejemplo, en las células cancerosas T24 de tumor en la vejiga, el NDGA promovió el estrés mitocondrial al inducir alteraciones en el consumo de oxigeno. El daño mitocondrial se caracteriza por un aumento de la fuga respiratoria y, asi como la pérdida de DOm. Estas alteraciones finalmente indujeron la muerte de las células cancerosas T24. Sin embargo, se requieren más estudios para caracterizar completamente las alteraciones bioenergéticas mitocondriales inducidas por NDGA, asi como para determinar si el NDGA altera otros procesos mitocondriales como la biogénesis y la dinámica mitocondrial ¹⁵ .

Estos datos se contraponen con resultados in vivo, donde se ha reportado que el pretratamiento durante 5 días de NDGA a una dosis diaria de 10 mg/kg a ratas con cáncer de mama, químicamente inducido, y posterior tratamiento solamente de cis platino a una dosis de 7.5 mg/kg mostró una sorprendente inhibición tumoral. Los análisis bioquímicos de los tumores indicaron un incremento de enzimas antioxidantes, demostrando que el NDGA indujo un ambiente reductor y que este fue factor importante en el incremento antitumoral del cisplatino. Cabe señalar que la administración del NDGA y el cisplatino fue secuencial y no al unisono ¹⁶ .

La metástasis tumoral es una de las principales causas de muerte de pacientes con cáncer. Adicionalmente a las propiedades reductores del NDGA se ha reportado que este ácido puede inhibir la migración celular y la metástasis tumoral mediante la supresión de la neuropilina 1 (NRP1) . La NRP1 es una proteina transmembrana de un solo paso que desempeña un papel importante en el desarrollo, la angiogénesis, la inmunidad y el cáncer. La supresión de NRP1 por NDGA conduce a una motilidad celular atenuada, adhesión celular a ECM y señalización FAK en células cancerosas. Lo que constituye un mecanismo novedoso.

Además, de la supresión de NRP1, el NDGA también altera la función de angiogénesis de las células endoteliales y el ensamblaje de fibronectina por los fibroblastos, los cuales son críticos para promover la metástasis. Como resultado se tiene que el NDGA suprime eficazmente la metástasis tumoral en el modelo de ratones desnudos. Estos hallazgos revelan un mecanismo novedoso subyacente a la función anti-metástasis de NDGA e indican el valor potencial de NDGA en la terapia dirigida a subtipos seleccionados de cáncer que involucran NRP1 ¹⁷ .

En conclusión, existen varios mecanismos de acción para la citotoxicidad del NDGA, aunque controversial se ha informado de la posible actividad oxidante del NDGA en cierto tipo de células. Sin embargo, el mecanismo con mucho mayor apoyo experimental es el relacionado a sus propiedades antioxidantes del NDGA. Adicionalmente, se reportado la supresión por el NDGA de la neuropilina 1, una proteina que está involucrada en el cáncer. Lo que constituye un mecanismo novedoso del NDGA.

En este sentido, cabe recalcar que las especies reactivas de oxigeno (ROS) inducidas, es un importante mecanismo de acción que está presente en varios fármacos como el cisplatino, trióxido de arsénico y algunos triterpenos. Inclusive, se ha demostrado que existe un vinculo entre la citotoxicidad de los triterpenos y la producción de ROS, se conoce que los triterpenos disminuyen el potencial de membrana mitocondrial y como consecuencia hay inducción de ROS ¹⁸ .

En la presente invención se describe como la adición de un antioxidante, en un modelo in vitro, favorece la acción citotóxica de agentes antineoplásicos en lugar de su inhibición - es decir, en lugar de la inhibición de la acción citotóxica - lo cual es, no sólo inesperado, sino algo imposible de haber anticipado con el conocimiento que hoy dia se tiene asi como muy importante ya que refleja que la producción de ROS puede no ser la via o mecanismo de acción citotóxica de compuestos anticancerigenos como los triterpenos, lo que favorece el uso de estos últimos en combinación con antioxidantes para obtener el efecto deseado en la inhibición de los procesos cancerígenos. La argentatina A en cantidades industriales hace de este triterpeno un prototipo adecuado para la obtención de un nuevo fármaco que, en combinación con agentes antioxidantes como el NDGA, cumple con estas características.

SUMARIO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a combinaciones citotóxicas y anti tumorales de las argentatinas A y B con el ácido nordihidroguaiaretico (NDGA) y algunos de sus derivados. Para tal efecto se seleccionaron el ditiotritol, un antioxidante sintético y el ácido nordihidroguarético (NDGA) , un antioxidante natural aislado de la gobernadora (Larrea tridentata) para evaluarlos junto a la argentatina A.

Un primer objeto de la presente invención es la combinación, por un lado, del triterpeno (Argentatina A) con propiedades citotóxicas y antitumoral en una concentración desde 25 pm hasta 200 pm y, por otro lado, del agente antioxidante ácido norhdihidroguaiarético

(NDGA) en una concentración desde 3 hasta 5pm.

En un segundo aspecto, se presenta la combinación del triterpeno (argentatina A) con propiedades citotóxicas y antitumoral y el agente antioxidante (NDGA) para uso como agente citotóxico y antitumoral .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Ensayo de ci totoxicidad en linea celular HCT116 a 48 h de estimulo con Cisplatino, 5FU y Argentatina A, con y sin DTT .

Figura 2. Ensayo de citotoxicidad en linea celular HCT116 a 48 h de estimulo de Cisplatino, 5 Fu y Argentatina A, con y sin NDGA

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos que se utilizan en este documento tienen el mismo significado comúnmente entendido por un experto en la materia a la que se refiere esta descripción.

Se ha demostrado que existe un vinculo entre la citotoxicidad de los triterpenos y la producción de ROS. Se ha postulado que la adición de un antioxidante, en un modelo in vitro, inhibirla la acción tanto de los fármacos anticancerosos como la acción citotóxica de los triterpenos. La hipótesis bajo la cual se trabajó fue el suponer que la adición de un antioxidante reducirla la actividad citotóxica de la argentatina A, como previamente se habla informado para varios triterpenos ¹⁰ . Una forma de validar lo anterior es en un modelo in vitro en donde se adiciona a las células cancerosas (HCT116, linea celular de cáncer de colon) un antioxidante sintético como el ditiotreitol (DTT) y el ácido nordihidroguaiarético (NDGA) un antioxidante natural aislado de la gobernadora (Larrea tridentata) (2) para evaluarlos junto a la argentatina A. Como compuesto de referencia se utilizó el cisplatino, ya que se conoce que uno de los mecanismos de este compuesto es la producción de ROS.

En la Figura 1 se observa el ensayo de citotoxicidad con cristal violeta en linea celular HCT116 con los antioxidante Ditiotreitol (DTT) y ácido nordihidroguayarético (NDGA) demuestra que la argentatina A + DTT aumenta su actividad citotóxica en la linea celular HCT116. Por otro lado, tanto el cisplatino el 5-FU disminuyen su efecto citotóxico cuando se le agrega en antioxidante DTT (Figura 1) .

El ácido nordihidroguayarético (NDGA) es un importante antioxidante que se encuentra en la resina de la hoja de la planta medicinal conocida como gobernadora (Larrea tridentata) . La presente invención describe ensayos de citotoxicidad de la combinación argentatina A con el antioxidante NDGA, siguiendo la metodología anteriormente descrita sustituyendo entonces el uso del DTT y remplazándolo por el NDGA en concentraciones de 5pm. La Figura 2 muestra los resultados donde se puede observar que aumentó la actividad citotóxica de la argentatina A con la adición de NDGA, no asi para el cisplatino y el 5-FU, donde su actividad citotóxica disminuye, en la linea celular HCT116 (Figura 2) . Estos resultados indican que la combinación de la argentatina A y el NDGA a una concentración desde 3 hasta 5pm en la linea celular HCT116 presenta mayor actividad citotóxica en comparación de la combinación de la argentatina A con 0.125mM de DTT. El cisplatino en adición con los 2 antioxidantes utilizados disminuye su actividad citotóxica. Los resultados están totalmente de acuerdo con aquellos donde se señala que la producción de radicales por el cisplatino es uno de sus principales mecanismos de muerte. Sin embargo, un hallazgo importante es que la potencia como agente citotóxico de la argentatina A se incrementa de manera notable en presencia de un antioxidante (siendo más efectivo con un antioxidante de origen natural como el NDGA) en la linea celular de cáncer de colon HCT116, lo que podría implicar que la presencia de ROS en las células inhibe la acción de la argentina A.

La presente invención describe y da a conocer que la dosis utilizada de NDGA no mostró ninguna toxicidad a las células HTC-116. También resultados similares se obtuvieron al utilizar un antioxidante sintético en una dosis inocua a las células cancerosas. Por lo tanto, es evidente que en la combinación de la argentatina A con el NDGA, las propiedades antioxidantes de este ácido son fundamentales para la actividad citotóxica de la combinación.

La importancia de realizar combinaciones de la argentatina A con el ácido nordihidriguaiaretico (NDGA) reside en el hecho en que ambas moléculas tienen dos mecanismos de acción muy diferentes. La argentatina A induce a un estado de senescencia de las células cancerosas las que eventualmente las llevara a una muerte por apoptosis. Como se puede ver la argentatina A induce fenómenos naturales de muerte celular y no un daño masivo como el que propician los quimioterapéuticos en la clínica, este daño da como resultado daño colaterales muy importantes. En cuanto al NDGA se han informado varios mecanismos de acción a continuación, se mencionan algunos de ellos. NDGA es un componente de "Chaparral", un producto natural propuesto hace varias décadas como tratamiento para algunos cánceres, pero fue eliminado de la lista de la FDA "generalmente reconocido como seguro" (GRAS) en 1970. Desde entonces, NDGA, también como masoprocol, recibió la aprobación de la FDA para su inclusión en una crema tópica Actinex, bajo la Solicitud de la FDA No. (NDA) 019940, para el tratamiento de las queratosis actinicas. Estudios recientes de sus propiedades han reavivado el interés en sus propiedades bioquímicas y quimioterapéuticas, como lo demuestra un ensayo clínico en curso, "Estudio de fase I de NDGA en pacientes con cáncer de próstata no metastásico, bioquímicamente recidivante sobre cáncer de próstata dependiente de andrógenos (ADPC) " (UCSF- 035510) ¹⁹ . Se han publicado diversas actividades biológicas exhibidas por NDGA con respecto a los receptores de la tirosin- cinasas (RTK) oncogénicas como IFG-1R y HER2 del cáncer de mama ²⁰ .

También se ha informado los efectos de NDGA sobre el crecimiento de células MCF-7 positivas al receptor de estrógeno (ER) . Los efectos inhibidores del crecimiento de NDGA se asociaron con una detención de la fase S en el ciclo celular y la inducción de apoptosis. NDGA inhibió las actividades de las quinases en las células de cáncer de mama IGF-1R y HER2. Se sabe que las células MCF-7 / HER2-18 son resistentes a los efectos del inhibidor del receptor de estrógenos, el fármaco anticanceroso tamoxifeno. Curiosamente, NDGA no solo inhibió el crecimiento de MCF-7 / HER2- 18 por si solo, sino que también demostró efectos inhibidores del crecimiento aditivo cuando se combinó con tamoxifeno. Estos estudios sugieren que NDGA puede tener beneficios terapéuticos en cánceres de mama HER2 positivos, resistentes al tamoxifeno en humanos ²¹ . En conjunto, los resultados indican que NDGA, que actúa por múltiples mecanismos, incluida la inhibición directa de la actividad quinasa, la interrupción de la via secretora, la inhibición de las vias de señalización y el aumento de la apoptosis y posee atributos potencialmente beneficiosos. Esto es particularmente cierto para aquellos cánceres en los que la proliferación celular depende de la estimulación continua de FGFR3 por activación de ligando o por activación mutacional, como en el carcinoma de vejiga y el mieloma múltiple ²² .

Por otro lado, el NDGA impacta la metástasis de las células tumorales a través de la inhibición de LOX, pero también debido a la regulación negativa de la neuropilina 1, una proteina transmembrana de un solo paso que funciona como una "plataforma de señalización" en la superficie celular. La neuropilina 1 se sobreexpresa en cánceres de mama, próstata, páncreas, colon y riñón, y desempeña funciones importantes en la progresión tumoral, la angiogénesis y la inmunidad contra el cáncer. Como se muestra en las células de próstata PC3 humanas, la disminución de los niveles de neuropilina 1, inducida por el tratamiento con NDGA, conduce a alteraciones en la motilidad y la adhesión de la matriz celular, y atenúa la metástasis tumoral en un modelo de ratón desnudo de cáncer de próstata. Por lo tanto, la supresión de la neuropilina 1 afecta tanto a las células tumorales como al microambiente tumoral al regular a la baja la angiogénesis y la formación de la matriz extracelular durante la progresión de la metástasis ²³ .

Nuestros resultados indican un efecto de sinergia entre la argentatina A y el NDGA donde sus diferentes mecanismos de acción se complementan. El experto en la técnica encontrará que múltiples variaciones y modalidades son posibles en la realización de la presente invención sin alejarse del espíritu y alcance de la misma.

La descripción se ilustrará con más detalle en los ejemplos siguientes .

EJEMPLO 1. Aislamiento de la argentatina A

La argentatina A fue aislada de la resina de Parthenium argentatum mediante procesos cromatográf icos como se informó anteriormente ²⁴ . El aislamiento de argentatina A se logró mediante una cromatografía en columna de vidrio abierta. Para la fase estacionaria se utilizó gel de sílice. Inicialmente se depositó sobre la parte superior una mezcla de 110 gr de resina y gel de sílice, en proporción 1:1 como punto de aplicación. Posteriormente la columna fue diluida con mezclas de disolventes de polaridad ascendente (hexano, AcOEt y MeOH) . A partir de una mezcla de hexano y acetato de etilo en proporción 9:1 se obtuvieron un total de 120 fracciones de 200 mL . Se reunieron las fracciones obtenidas del proceso de la destilación a presión reducida, y se obtuvieron 8.04 g de argentatina A, la cual se purificó por cristalizaciones sucesivas. La identificación de la argentatina A se realizó mediante análisis de los espectros de resonancia magnética nuclear de hidrógeno y carbono 13 y mediante la comparación de constantes físicas y espectroscópicas y fueron comparados por los reportados por Martinez y cois ²⁴ . La argentatina A pura total obtenida fue 7.98 g.

EJEMPLO 2. AISLAMIENTO DEL ÁCIDO NORHIDROGUARÉTICO (NDGA)

Las partes aéreas secas y molidas de la gobernadora (Larrea tridentata) se extrajeron sucesivamente con hexano, acetato de etilo y metanol . El extracto de acetato de etilo de Larrea tridentata (10.11 g) , fue sometido a fraccionamiento mediante cromatografía en columna (CC) , empacada con sílice gel (200 g) utilizando como eluyentes mezclas de polaridades crecientes de hexano, acetato de etilo y metanol, recolectando eluatos de 100 mi aproximadamente, los cuales se reunieron con base en la semejanza de sus componentes determinada en cromatografía en capa fina analítica (CCFa) , obteniéndose 254 fracciones primarias.

De la fracción 170-172 se obtuvo un sólido color beige (ppl70-172, 14.9 mg) , soluble en MeOH con un p.f. de 178-180 DC. El análisis de los datos espectroscópicos de resonancia magnética nuclear indico que este compuesto correspondía al ácido norhidroguaiarético (NDGA) de acuerdo con las siguientes evidencias. En el espectro de RMN ¹ H del compuesto 170-172 se observa un doblete a 5 0.81 (6H, d, J = 8 Hz, H-9, H-9' ) de dos metilos unidos cada uno a un metino, un multiplete a 5 1.70 (2H, m, H-8 y H- 8" ) , dos dobles de dobles de dos protones bencílicos a 5 2.17 (2H, dd, J = 13.4, 9.2 Hz, H- 7b, 7b' ) y 2.65 (2H, dd, J =13.3, 5.0 Hz, H-7a, 7a' ) que se acoplan entre si; un singulete a 5 4.84 (2H, s, OH-4, OH-4' ) de dos hidroxilos, un doblete a 5 6.58 (2H, d, J =2 Hz H-2 y H-2' ) que resulta del acoplamiento entre dos protones meta-relacionados (H- 2 y H-6; H-2 ' y H-6' ) , un doble de doble a 5 6.46 (2H, dd, J= 2, 8 Hz, H-6 y H-6' ) que corresponde al acoplamiento de H-6 con H-5 y H-2 asi como H-6' con H-5' y H-2' y finalmente un doblete a 5 6.66 (2H, d, J = 7.5 Hz, H-5, H-5' ) resultante del acoplamiento entre

H-5/H-6 y H-5 ' /H-6 ' .

EJEMPLO 3. Ensayo de citotoxicidad con cristal violeta en linea celular HCT116 con los antioxidante Ditiotreitol (DTT) y ácido nordihidroguayarético (NDGA) La linea celular de cáncer de colon humano HCT116 fue sembrada en placas de 48 pozos con una densidad de 4xl0 ⁴ células por pozo. Las células fueron incubadas por 24 horas en una atmósfera de 5% de CO ₂ y 95% de humedad a 37°C, posterior a 24 horas de incubación las células fueron tratadas con concentraciones seriadas de 200, 100, 50 y 25 pM de argentatina A la cual se disolvió en DMSO (<0.1%) y medio de cultivo. Como control positivo se utilizaron 2 quimioterapéuticos : Cisplatino [ Sigma-Aldrich dicloruro de cis- diaminaplatino (II) 479306-5G] a concentraciones de 100, 50, 25 y 12.5 pM, y 5-f luorouracilo (5 FU) [adquirido en Sigma-Aldrich] a concentraciones de 100, 50, 25 y 12.5 pM. En el control negativo se adicionó medio de cultivo DMEM y DMSO <0.1%. El mismo esquema de tratamiento con las diferentes concentraciones tanto de los controles positivos como de la argentatina A y el control negativo se realizó adicionando 0.125 Mm de DTT o 5 pM de NDGA. Todos los experimentos se realizaron por cuadruplicado. La viabilidad celular se evaluó a las 48 horas después del tratamiento. Las células adheridas a los pozos fueron fijadas por 15 minutos y posteriormente se les retiró el medio de fijación, se dejaron secar y fueron teñidas con 200 pL de cristal violeta por 15 minutos, se retiró el cristal violeta y finalmente la proteina teñida fue solubilizada con 500 pL de ácido acético al 10 %. Los valores de densidad óptica fueron obtenidos en un lector de microplacas con una longitud de onda de 595 nm. Una curva dosis respuesta fue graficada para cada compuesto y la CI 50 fue estimada usando el programa estadístico Excel mediante una regresión lineal.

Ventajas y aplicaciones de la invención

En la presente invención se emplea la combinación citotóxica y antitumoral de la argentatina A con el ácido nordihidroguaiaretico (NDGA) Los resultados indicaron que la adición a las células HCT116 de dosis inocuas de ditiotrei tol , que es un antioxidante sintético, o el ácido nordihidroguaiaretico (NDGA) , que es un antioxidante aislado de la planta medicinal gobernadora (Larrea tridentata) , no disminuyen la actividad citotóxica de la argentatina A, sino por el contrario aumentan este efecto.

Estos resultados son de importancia ya que abre la posibilidad de emplear compuestos triterpenos con actividad anticancerigena en un ambiente reductor y no oxidante, favorable para la acción citotóxica por ejemplo de la argentatina A. La disponibilidad de la argentatina A en cantidades industriales hace de este triterpeno un prototipo adecuado para la obtención de un nuevo fármaco. A su vez, abre la posibilidad de evaluar estas combinaciones y desencadenar nuevas terapias contra el cáncer no exploradas hasta ahora .

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