Kessler, Brigitte (Terofalstrasse 3, M�nchen, D-80689, DE)
Oesterhelt, Dieter (F�rstenrieder Strasse 280, M�nchen, D-81377, DE)
Kessler, Brigitte (Terofalstrasse 3, M�nchen, D-80689, DE)
Oesterhelt, Dieter (F�rstenrieder Strasse 280, M�nchen, D-81377, DE)
| 1. | Verfahren zum zumindest partiellen Abbau von halogenier ten organischen Verbindungen, dadurch gekennzeichnet, daß man die Verbindungen mit halophilen Archaea oder mit Ex¬ trakten oder Bestandteilen davon in Kontakt bringt und unter Bedingungen mkubiert, bei denen em Abbau der or¬ ganischen Verbindungen stattfindet. |
| 2. | Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die halophilen Archaea ausgewählt werden aus Organismen der Gattungen Haloarcula, Halobacterium, Halococcus, Ha¬ loferax, Halorubrum, Natronobacterium und Natronococcus. |
| 3. | Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die halophilen Archaea ausgewählt werden aus Organismen der Gattung Haloarcula, Halobacterium, Haloferax und Halorubrum. |
| 4. | Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man Organismen aus der Gattung Halobacterium verwendet. |
| 5. | Verfanren nach einem der Ansprüche 14, dadurch gekenn zeichnet, daß man Organismen verwendet, die einem Selek¬ tionsprozeß zur Adaption an halogenierte organische Ver¬ bindungen unterworfen worden sind. |
| 6. | Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Organismus ausgewählt aus Halobacterium CBl (DSM 11147) , Haloferax HfXl (DSM 11795) und Haloarcula HcU2 (DSM 11794) , oder einen an spezielle Verbindungen adaptierten Abkömmimg davon verwendet. |
| 7. | Verfahren nach einem der Ansprüche 16, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß man einen Organismus verwendet, der eine Toleranz gegenüber den abzubauenden Verbindungen m einer Konzentration von mindestens 10 μM im Medium aufweist . |
| 8. | Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Organismus verwendet, der eine Toleranz gegen¬ über den abzubauenden Verbindungen m einer Konzentration von mindestens 100 μM im Medium aufweist. |
| 9. | Verfahren nach einem der Ansprüche 18, dadurch gekenn zeichnet, daß die abzubauenden Verbindungen ausgewählt werden aus organischen Verbindungen, die Kohlenstoff, ge¬ gebenenfalls Wasserstoff und Heteroatome sowie mindestens em Halogenatom enthalten. |
| 10. | Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die abzubauenden Verbindungen mindestens em Chloratom enthalten. |
| 11. | Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeich net, daß die Halogenatome an aliphatische, aromatische oder/und olefmische Kohlenstoffatome gebunden sind. |
| 12. | Verfahren nach einem der Ansprüche 911, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß die abzubauenden Verbindungen aus gegebe nenfalls mehrfach halogierten aromatischen Verbindungen ausgewählt werden. |
| 13. | Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die abzubauenden Verbindungen aus halogierten Phenolen, 3enzolen, Diox en und Furanen ausgewählt werden. |
| 14. | Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man 2, 4, 6Trιhalogenphenol (Halogen = Fluor, Chlor, Brom Jod) , 2, 3, 4Trichlorphenol, 2, 3 , 4Trifluorphenol, 2,3,5 Trichlorphenol, 2 , 3 , 6Trichlorphenol , 2, 4 , 5Tπchlorphe nol, 3, 4, 5Trichlorphenol, 2, 3 , 4, 5Tetrachlorphenol,2 3 , 4 , 6Tetrachlorphenol oder/und Pentahalogenphenol (Halogen = Fluor, Chlor, Brom) abbaut . |
| 15. | Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß man 2Chlordibenzodioxm (2MCDD) oder/und 1,2,3,4 Tetracnlordibenzodiox (1, 2, 3, 4TCDD) abbaut. |
| 16. | Verfahren nach Anspruch 12, dadurcn gekennzeichnet, daß man DDT, DDE oder/und DDD abbaut. |
| 17. | Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man Lmdan (γHexachlorcyclohexan) abbaut. |
| 18. | Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 17, dadurch ge kennzeichnet, daß man αen Abbau Gegenwart losungsver¬ mittelnder Substanzen durchfuhrt . |
| 19. | Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, daß die losungsvermittelnden Substanzen aus Cyclodextr en, Alkylglycosiden und Cholaten ausgewählt werden. |
| 20. | Verfahren nach Anspruch 18 oder 19, dadurch gekennzeich¬ net, daß man die losungsvermittelnden Substanzen in einer Menge von mindestens 0,01 Molaquivalent pro Mol der ab zubauenden Verbindungen verwendet. |
| 21. | Verfahren zur Herstellung von an halogenierte organische Verbindungen adaptierten halophilen Archaea, dadurch gekennzeichnet, 0 daß man einen Ausgangsorganismus auswählt, der eine Tole¬ ranz gegenüber einer vorbestimmten Konzentration einer oder mehrerer ausgewählter halogenierter organischer Ver¬ bindungen aufweist, und diesen Ausgangsorganismus einem Selektionsprozeß unterwirft, wobei e adaptierter Orga s nismus erhalten wird, der gegenüber dem Ausgangsorganis¬ mus eine erhöhte Toleranz oder/und Abbauleistung bezüg¬ lich den ausgewählten Verbindungen aufweist. |
| 22. | Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß der Selektionsprozeß das Ausplattieren des Ausgangsorga¬ nismus auf einem festen Kulturmedium m Gegenwart von halogenierten organischen Verbindungen, das Identifizie s ren eines bei der gewählten Giftstoffkonzentration noch wachsenden Organismus und gegebenenfalls ein em oder mehrmaliges Wiederholen dieser Prozedur bei steigenden Giftstoffkonzentrationen umfaßt. |
| 23. | ιo. |
| 24. | Verfahren nach Anspruch 21 oder 22, dadurch gekennzeich¬ net, daß man als adaptierten Organismus Halobacterium CBl (DSM 11147) oder einen Organismus mit mindestens gleicher Toleranz oder/und Abbauleistung erhält. |
| 25. | 15 24. Verfahren nach einem der Ansprüche 2123, dadurch gekenn¬ zeichnet, daß man den adaptierten Organismus einem weite¬ ren Selektionsprozeß zur Erhöhung der Toleranz oder/und Abbauleistung bezüglich spezieller halogenierter organi¬ scher Verbindungen unterwirft.*& 20. |
| 26. | Halophiler Archaeaorganismus, der an halogenierte orga¬ nische Verbindungen adaptiert ist, erhältlich durch em Verfahren nach einem der Ansprüche 2124. |
| 27. | 25 26. Organismus nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß er Halobacterium CBl (DSM 11147) oder ein Organismus mit mindestens gleicher Toleranz oder/und Abbauleistung be¬ züglich halogenierten organischen Verbindungen ist. |
| 28. | 30 27. Organismus nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß er Haloferax HfXl (DSM 11795) oder em Organismus mit mindestens gleicher Toleranz oder/und Abbauleistung be¬ züglich halogenierten organischen Verbindungen ist. |
| 29. | 35 28. Organismus nach Anspruch 25, dadurch gekennzeichnet, daß er Haloarcula HcU2 (DSM 11794) oder e Organismus mit mindestens gleicher Toleranz oder/und Abbauleistung be¬ züglich halogenierten organischen Verbindungen ist. |
Beschreibung
5
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum zumindest partiellen Abbau von halogenierten organischen Verbindungen durch halo¬ phile Archaea, Extrakte oder Bestandteile davon. Weiterhin werden Verfahren zur Gewinnung von an halogenierte Verbindun- o gen adaptierten Organismen sowie die durch das Verfahren er¬ hältlichen Organismen offenbart .
Halogenierte Kohlenwasserstoffe, insbesondere Rückstände aus Pflanzenschutzmitteln und Industrieabfallen, stellen wegen 5 ihrer Toxizität und Persistenz ein weltweit wachsendes Umwelt¬ problem dar. Die herkömmlichen Entsorgungsmethoden beinhalten sehr aufwendige Bodenextraktionen und die Endlagerung der ver¬ siegelten Giftstoffe auf Deponien bzw. die Verbrennung in spe¬ ziellen Hochtemperaturöfen. Das Problem bei der Endlagerung 0 auf Deponien besteht insbesondere darin, daß zur Zeit völlig unklar ist, ob eine dauerhafte Versiegelung der Giftstoffe wirklich gewährleistet werden kann. Bei der Verbrennung unter nicht optimalen Bedingungen werden extrem giftige Substanzen, wie Dioxine und Dibenzofurane gebildet . 5
Über die letzten 15 Jahre hin wurde deshalb eine Reihe von Mikroorganismen auf ihre Fähigkeit untersucht, chlorierte Koh¬ lenwasserstoffe biologisch abzubauen (vgl. den Übersichtsarti- kel von Fetzner und Lingens, Micorbiological Rewievs 58 0 (1994) , 641-685) . Die untersuchten Mikroorganismen, bei denen es sich im allgemeinen um bakterielle Organismen aus den Gat¬ tungen Pseudomonas, Alcaligenes, Flavobacterium, Rhodococcus, Streptomyces, Hyphomicrobium und Methylobacterium handelt, transformieren die jeweiligen halogenierten Kohlenwasserstoffe s nur mit geringer Effizienz, in geringen Konzentrationen und meist unvollständig.
Es besteht somit ein großes Bedürfnis, Verfahren zum Abbau von halogenierten organischen Verbindungen bereitzustellen, bei denen die Nachteile des Standes der Technik mindestens teil¬ weise beseitigt sind Insbesondere soll das Verfahren einen s möglichst vollständigen Abbau zu nicht toxischen Endprodukten ermöglichen.
Überraschenderweise wurde festgestellt, daß halophile Archaea an halogenierte organische Verbindungen m bis zu illimolaren 0 Konzentrationen angepaßt werden können Die Organismen sind in der Lage, die Halogenatome der halogenierten Verbindungen ohne Anreicherung von toxischen Metaboliten, vorzugsweise zu an¬ organischen Verbindungen wie etwa Mineralsalzen abzubauen. Dieser Abbau konnte exemplarisch an mehreren isomeren Tπ- 5 chlorphenolen, Lmdan und DDT in Flussigkultur durch eine kombinierte gaschromatographisch-massenspektroskopische Ana¬ lyse der organischen Extrakte aus Fermentationsbruhen belegt werden Für }eden Abbauweg konnte jeweils mindestens ein In- termediat massenspektroskopisch identifiziert werden. 0
Der Abbau von halogenierten organischen Verbindungen kann durch vollständige Zellen, Zellextrakte, Zeilfraktionen oder isolierte Zellbestandteile wie etwa Enzyme erfolgen Er kann auch unter Hochsalzbedingungen oder in Gegenwart von organi- 5 sehen Lösungsmitteln stattfinden.
Der erfmdungsgemaße Abbau von halogenierten organischen Ver¬ bindungen durch halophile Archaea stellt eine wesentliche Ver¬ besserung bestehender Methoden dar Die hohe Toleranz der ha- 0 lophilen Archaea gegenüber hohen Konzentrationen an haloge¬ nierten organischen Verbindungen sowie die Fähigkeit, diese Verbindungen abzubauen, ist angesichts der bekannten Empfind¬ lichkeit von Halobakterien gegenüber Fremdsubstanzen wie Gal¬ lensauren und Antibiotika m höchstem Maße überraschend (vgl. 5 z. B. Kamekura et al , Appl Environ Microbiol. 54 (1988) , 990-995 und Oren, Arch. Microbiol 165 (1996) , 354-358)
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist somit ein Ver¬ fahren zum zumindest partiellen Abbau von halogenierten orga¬ nischen Verbindungen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß man die Verbindungen mit halophilen Archaea oder mit Extrakten 5 oder Bestandteilen davon in Kontakt bringt und unter Bedingun¬ gen inkubiert, bei denen ein Abbau der organischen Verbindun¬ gen stattfindet.
Halophile Archaea sind eine Unterklasse der Euryarchaeota o (vgl. z. B. Woese, Microbiological Rev. 58 (1994) , 1-9) . Vor¬ zugsweise sind unter dieser Bezeichnung Organismen aus der Ordnung Halobacteriales und besonders bevorzugt Organismen aus der Familie Halobacteπaceae zu verstehen. Beispiele für ge¬ eignete Gattungen sind Haloarcula, Halobacterium, Halococcus, s Haloferax, Halorubrum, Natronobacterium und Natronococcus. Besonders bevorzugt werden Organismen der Gattungen Haloarcu¬ la, Halobacterium und Haloferax verwendet.
Beispiele für geeignete Spezies aus der Gattung Haloarcula 0 sind H.hispanica, H.japonica, H.marismortui, H.vallismortis, H.califormae und H. sinaiiensis. Geeignete Spezies aus der Gattung Halobacterium sind H. salinarium, H.cutirubrum, H.tra- panicum, H.sodo ense, H.lacusprofundis, H.distributum und Amoebobacter morrhuae (Torreblanca, System. Appl . Microbiol. 8 s (1986) , 89-99) . Geeignete Spezies aus der Gattung Halococcus sind H.morrhuae, H. turkmemcus und H. saccharolyticus . Geeig¬ nete Spezies aus der Gattung Haloferax sind H.demtrificans, H.mediterranei, H.gibbonsu und H.volcann. Eine geeignete Spezies aus der Gattung Halorubrum ist H. saccharovorum. Geeig- 0 nete Spezies aus der Gattung Natronobacterium sind N.gregoryi, N.magadii und N.pharaonis. Eine geeignete Spezies aus der Gattung Natronococcus ist N.occultus. Bezüglich der Klassif- zierung der Organismen wird - sofern nichts anderes angegeben ist - auf den Übersichtsartikel von T dall (The Procaryonts, 5 Vol 1 (1991) , 768-808) oder die Klassifizierung der DSMZ (on¬ line Katalog: http://www.gbf-braunschweig.de/DSMZ/species/ archaea.htm) verwiesen.
Obwohl zahlreiche naturlich vorkommende Stamme von halophilen Archaea zum Abbau halogenierter organischer Substanzen geeig¬ net sind, werden vorzugsweise solche Organismen verwendet, die einem zusätzlichen Selektionsprozeß zur Adaption an haloge- nierte organische Verbindungen unterworfen worden sind. Hierzu wird zunächst e natürlich vorkommender Organismus ausge¬ wählt, der gegenüber bestimmten halogenierten Substanzen wie Chlorphenol oder Lmdan, z. B. in Konzentrationen von 1 μM, 10 μM oder 100 μM, Wachstum zeigt. Dieser Stamm wird als Aus- gangsmaterial für einen Adaptionsprozeß verwendet, der bei¬ spielsweise durch Ausplattierung Gegenwart steigender Kon¬ zentrationen von Giftstoffen wie Lmdan oder Chlorjoenzol er¬ folgen kann.
Durch einen solchen Adaptionsprozeß erhält man einen Organis¬ mus, der gegenüber dem natürlichen Ausgangsorganismus eine we¬ sentlich höhere Toleranz und Abbauleistung gegenüber haloge¬ nierten organischen Substanzen zeigt. E Beispiel für einen solchen adaptierten Organismus ist der Stammm Halobacterium CB1, der am 10.09.1996 bei der Deutschen Sammlung von Mikroor¬ ganismen und Zellkulturen GmbH, Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, gemäß den Vorschriften des Budapester Vertrags unter dem Aktenzeichen DSM 11147 hinterlegt worden ist E solcher adaptierter Organismus kann anschließend einem weite- ren Selektionsprozeß unterzogen werden, bei dem die Toleranz gegenüber speziellen Verbindungen, wie Trichlorphenolen, DDT oder Lmdan, nochmals erhöht wird. Der auf diese Weise erhal¬ tene Abkommimg des adaptierten Ausgangsorganismus kann spezi¬ fisch dann zum Abbau dieser Verbindungen eingesetzt werden.
Weitere Beispiele für geeignete adaptierte Organismen sind der Stamm Hf-Xl, der aus einem Stamm der Art Haloferax mediterra- nei hervorgegangen ist und am 24 09.1997 bei der DSMZ unter dem Aktenzeichen DSM 11795 hinterlegt wurde, und der Stamm Hc- U2 , der aus einem Stamm der Art Haloarcula californiae hervor¬ gegangen ist und am 24.09.1997 bei der DSMZ unter dem Akten¬ zeichen DSM 11794 hinterlegt wurde. Hf-Xl eignet sich beson-
ders zum Abbau hochchlorierter Phenole, z.B. Tn-, Tetra und Pentachlorphenole. Hc-U2 eignet sich besonders zum Abbau bro- mierter Kohlenwasserstoffe wie etwa dem Flammschutzmittel Bis- 2,2- (3 , 5-dιbrom-hydroxyphenyl) -propan.
Durch Auswahl geeigneter naturlicher Organismen, wie zuvor angegeben, oder/und durch Anwendung der zuvor beschriebenen Selektionsprozesse können Organismen bereitgestellt werden, die eine Toleranz gegenüber der abzubauenden Verbindung bzw. den abzubauenden Verbindungen in einer Konzentration von min¬ destens 10 μM, vorzugsweise mindestens 50 μM, besonders be¬ vorzugt mindestens 100 μM und am meisten bevorzugt mindestens 1 mM aufweisen.
Die abzubauenden Verbindungen werden vorzugsweise ausgewählt aus organischen Verbindungen, die Kohlenstoff, gegebenenfalls Wasserstoff und Heteroatome, wie etwa 0, N, S und P, sowie mindestens em Halogenatom enthalten. Vorzugsweise enthalten die Verbindungen mindestens em Fluor-, Jod-, Brom- oder/und Chloratom, besonders bevorzugt mindestens em Fluor-, Brom¬ oder/und Chloratom. Durch das erfindungsgemäße Abbauverfahren werden organisch gebundene Halogenatome anorganische Halo¬ genide über uhrt .
Die Halogenatome können an die verschiedensten Arten von Koh¬ lenstoffatomen gebunden sein, z. B. aliphatische (linear oder zyklisch) , aromatische oder/und olefmische Kohlenstoff tome. Besonders oevorzugt sind die abzubauenden Verbindungen aus ge¬ gebenenfalls mehrfach chlorierten aromatischen Verbindungen, wie etwa chlorierten Phenolen oder Benzolen oder aromatischen Dioxmen oder Furanen wie etwa Dibenzodioxmen oder Dibenzofu- ranen, z. B. 2, 3, 4-Trιchlorphenol, 2, 3 , 5-Trιchlorphenol , 2,4 , 5-Trιchlorphenol, 2-Chlordιbenzodιoxm (2-MCDD) oder 1,2, 3 , 4-Tetrachlordιbenzodιoxιn (1, 2, 3, 4-TCDD) ausgewählt. Andere Beispiele für geeignete Verbindungen enthalten mehrere Halogenatome, die an aliphatische oder olefmische Kohlen¬ stoffatome und an aromatische Kohlenstoffatome gebunden sind,
z. B. DDT oder dessen Abbauprodukt DDE. Noch eine weitere bevorzugte Klasse von abzubauenden Verbindungen sind mehrfach chlorierte alicyclische Verbindungen, wie etwa Lindan (7-Hexa- chlorcyclohexan) .
Weitere spezifische Beispiele für abzubauende Verbindungen sind 2 , 3, 6-Trιchlorphenol, 2 ,4, 6-Tπhalogenphenol (wobei Halo¬ gen = Fluor, Chlor, Brom, Jod), Chlorbenzol, Benzylchlorid, Phenylethylchlorid, Hexachlorcyklohexane, z.B. α-HCH, ß-HCH, 7-HCH und δ-HCH, 2, 3, 4-Trifluorphenol, 2, 3 , 5-Trιfluorphenol, 2,2-Bιs- (4-chlorphenyl) -1, 1-Dιchlorethan (DDD) , Chlorparaffm- fraktionen, Decabromdiphenylether, Pentahalogenphenol (wobei Halogen = Chlor, Fluor, Brom), Bis-2, 2- (3, 5-dibrom-4-hydroxy- phenyl) -propan, 3 , 4, 5-Trιchlorphenol, 2,3 , 4 , 5-Tetrachlorphe- nol , 2 , 3, 4 , 6-Tetrachlorphenol, Atraz , Aldrin, Dieldrm, Endrm und Derivate davon wie etwa Endrm-Aldehyd oder Endrm- Keton, Endosulfan I und II, Endosulfan-Sulfat, Heptachlor, Heptachlorepoxid und Methoxychlor sowie Mischungen, die meh¬ rere der genannten Verbindungen enthalten.
Bei besonders lipophilen Giftstoffen wie etwa 2-MCDD, 1,2,3,4- TCDD oder Decabromdiphenylether kann durch Zugabe lösungsver¬ mittelnder Agenzien die Bioverfügbarkeit drastisch erhöht und der Abbau stark beschleunigt werden. Beispiele für solche Agenzien sind Cyclodextrme wie etwa ß- oder -Cyclodextrme, z.B. Heptakιs-2, 6-dι-O-methyl-ß-cyclodextnn. Ebenfalls können als lösungsvermittelnde Agenzien oberflächenaktive Substanzen, z.B. vom Typ der Alkylglykoside oder Cholate verwendet werden. Die lösungsvermittelnden Agenzien werden vorzugsweise m einer Menge von mindestens 0,01 Moläquivalent, besonders bevorzugt von 0,1 -1 Moläquivalent bezogen auf em Moläquivalent des Giftstoffs der wachsenden Kultur zugesetzt. Besonders tolerant gegenüber höheren Konzentrationen solcher lösungsvermittelnden Agenzien sind z.B. Stämme, die aus Organismen der Gattung Haloarcula, insbesondere H.hispanica, oder Haloferax, insbe¬ sondere Haloferox gibbonsu hervorgegangen sind.
Der erfindungsgemäße Abbau kann unter aeroben, mikroaeroben oder anaeroben Bedingungen erfolgen. Unter mikoraeroben Bedin¬ gungen ist eine Fermentation in einem versiegelten Reaktionε- gefäß zu verstehen, dessen Luftraum nicht entgast wurde. Zu Beginn der Fermentation steht Sauerstoff zur Verfügung, nach einigen Stunden aber fast keiner mehr. Das Wachstum der Orga¬ nismen kann unter diesen mikroaeroben Bedingungen je nach Stamm durch Zugabe von Arginin oder/und Nitrat verbessert werden. Besonders bevorzugt für den mikroaeroben Abbau sind Stämme, die noch über photosynthetisch aktives Bakteriorhodop- sin verfügen, z.B. der Stamm CB1. Hier können bei gleichzeiti¬ ger Bestrahlung mit Licht ähnlich hohe Zelldichten wie unter aeroben Fermentauionsbedingungen erreicht werden. Bei bestimm¬ ten Giftstoffen, z.B. Pentachlorphenol , kann die Toleranz und die Abbaurate auf diese Weise um mindestens e ne Größenordnung erhöht werden.
Weiterhin kann die Raum-Zeit-Ausbeute der Abbaureaktionen - insbesondere bei sehr toxischen Substanzen - durch Pulsfütte- rung oder Zugabe der Substanz bei einer bereits hohen Zell- dichte verbessert werden.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von an halogenierte organische Ver- bindungen adaptierten halophilen Archaea-Organismen. Hierbei wählt man einen halophilen Archaea-Ausgangsorganismus aus, der bereits eine Toleranz gegenüber einer vorbestimmten Konzentra¬ tion einer oder mehrerer ausgewählter halogenierter organi¬ scher Verbindungen aufweist, und unterwirft diesen Ausgangs- Organismus einem Selektionsprozeß, wobei ein adaptierter Orga¬ nismus erhalten wird, der gegenüber dem Ausgangsorganismus eine erhöhte Toleranz oder/und Abbauleistung bezüglich den ausgewählten Verbindungen aufweist. Dieser Selektionsprozeß umfaßt vorzugsweise das Ausplattieren des Organismus auf einem festen Kulturmedium in Gegenwart von Giftstoffen, das Identi¬ fizieren von Organismen, die bei der jeweiligen Giftstoffkon- zentration noch wachsen und gegebenenfalls ein ein- oder mehr-
maliges Wiederholen dieser Prozedur bei steigenden Giftstoff¬ konzentrationen. Als Giftstoffe für diese Primarselekt on können z. B. Lmdan oder Chlorphenol verwendet werden.
Beispiele für adaptierte Organismen, die auf diese Weise er¬ halten werden können, sind Halobacterium CB1 (DSM 11147) , Haloferax Hf-Xl (DSM 11795) , Haloarcula Hc-U2 (DSM 11794) oder Organismen mit einer mindestens gleichen Toleranz oder/und Abbauleistung gegenüber ausgewählten halogenierten organischen Verbindungen, wie etwa Trichlorphenolen, DDT oder Lmdan. Den adaptierten Organismus kann man anschließend einem weiteren Selektionsprozeß zur nochmaligen Erhöhung der Toleranz oder/ und Aobauleistung bezüglich spezieller halogenierter organi¬ scher Verbindung unterwerfen, wobei man vorzugsweise αen Orga- nismus m Gegenwart einer bestimmten Konzentration einer spe¬ ziellen halogenierten organischen Verbindung kultiviert und diese Kultivierung überlebende Zellen einem oder mehreren wei¬ teren Kultivierungsschritten bei einer höheren Konzentration der Verbindung unterzieht . Dieser Sekundärselektionsprozeß wird vorzugsweise einem flüssigen Kulturmedium durchge¬ führt .
Noch em weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist e nalophiler Archaea-Orgamsmus, der an halogenierte orga- niscne Verbindungen adaptiert und durch das zuvor beschriebene Selektionsverfahren erhältlich ist.
Das erfmdungsgemaße Verfahren zum Abbau der halogenierten or¬ ganischen Verbindungen kann sowohl mit vollständigen Zellen als auch mit Extrakten oder Bestandteilen dieser Zellen, z. B. Enzympraparationen, durchgeführt werden. Die Praparation, Isolierung oder Anreicherung von Extrakten oder Enzymen aus halophilen Archaea ist beispielsweise bei Zhang und Poulter, J. Org Chem. 58 (1993) , 3919-3922, Kerscher und Oesterhelt, J. Biocnem 116 (1981), 587-594 und S. DasSarma und E.M. Fleiscnmann (Hrsg.) Archaea: A laboratory manual . Halophiles. xvi - 280 p Cold Spring Harbor Laboratory Press, Pla view,
New York, USA, 1995 und Ryu et al . , Enzyme M crob. Technol . 16 (1994) , 266-275) beschrieben. Der Fachmann kann zur Herstel¬ lung von Extrakten, Enzympräparationen oder Enzymen auf die in diesen Publikationen beschriebenen allgemeinen Methoden zu- rückgreifen.
Die Zellen, Extrakte oder Bestandteile davon können beim er¬ findungsgemäßen Abbauverfahren sowohl in gelöster Form, aber auch in immobilisierter Form eingesetzt werden. Weiterhin ist es möglich, Zellen, Extrakte und Bestandteile von mehreren Or¬ ganismen zu kombinieren. Diese Vorgehensweise dürfte insbeson¬ dere dann zu empfehlen sein, wenn mehrere halogenierte Ver¬ bindungen gleichzeitig vorhanden sind.
Der Abbau wird vorzugsweise unter solchen Bedingungen durch¬ geführt, bei denen die Zellen, Extrakte oder Bestandteile da¬ von ausreichende Abbauleistungen zeigen. Der Abbau kann in wässrigen Medien, organischen Medien oder Mischungen davon er¬ folgen. Die Abbautemperatur kann über einen breiten Bereich variiert werden, z. B. 20-60°C. Weiterhin ist bevorzugt, wenn der Abbau unter aeroben Bedingungen, z. B. mit Belüftung durchgeführt wird.
Beispielsweise kann der Abbau in einem Bioreaktor durchgeführt werden, welcher die Zellen, Zellextrakte oder Zellbestandteile in immobilisierter Form enthält . In diesen Bioreaktor werden die abzubauenden organischen Verbindungen in einem Abwasser- stro eingeleitet und im Reaktor für eine ausreichende Zeit gehalten, um den gewünschten Abbaugrad zu erreichen. Der aus dem Bioreaktor abgeleitete Abwasserström, der vorzugsweise im wesentlichen frei von organisch gebundenen Halogenatomen ist, kann anschließend entsorgt und beispielsweise in eine Klär¬ anlage eingeleitet werden.
Weiterhin soll die vorliegende Erfindung durch die nachstehen¬ den Beispiele erläutert werden.
Beispiel 1
Herstellung von adaptierten Mikroorganismen
10 Isolate der Gattung Halobacterium H.trapanicum, H.salina- rium und H.cutirubrum wurden durch Inkubation auf Agarplatten Gegenwart von Chlorbenzol oder Lmdan mit oder ohne Belich¬ tung m Konzentrationen von 0,1 μM - 10 mM auf ihre Toleranz gegenüber halogenierten organischen Verbindungen getestet. 4 der 10 getesteten Stämme, von denen jeweils 2 aus H.salmarium und H. trapanicum Isolaten hervorgingen, konnten bis zu Konzen¬ trationen von 10 μM wachsen.
Einer der aus H.trapanicum hervorgegangenen Stämme war der Mikroorganismus Halobacterium CBl (DSM 11147) .
Halobacterium CBl wurde zur weiteren Adaption an spezielle Verbindungen, wie Trichlorphenole, DDT oder Lmdan einem wei¬ teren Selektionsprozeß unterzogen. Hierzu wurde CBl in Flüs- sigkultur (Fermentationsbedingungen wie Beispiel 2 be¬ schrieben) Gegenwart einer Konzentration von 1 μM des je¬ weiligen Giftstoffes angezogen und uberimpf , bis die finale Zelldichte der Kultur die Zelldichte einer Vergle chskultur erreicht hatte, die n Abwesenheit des Giftstoffs angezogen worden war. Anschließend wurde die Konzentration des Gift¬ stoffs auf 10 μM erhöht. Dieser Prozeß wurde entsprechend wie¬ derholt, bis die maximal tolerable Konzentration oder die Lös- lichkeitsgrenze des Giftstoffs erreicht war.
Dabei wurden Abkömmlinge von CBl erhalten, d e an spezielle Verbindungen adaptiert sind. So ist CB1-H an 2 , 3 , 4-Tnchlor- phenol bis zu einer Maximaikonzentration von 50 μM adaptiert. Die Stamme CB1-G und CB1-K sind an Lmdan bzw. DDT bis zur Löslichkeitsgrenze dieser Giftstoffe im Kulturmedium adap- tiert Die Stamme CBl-N und CB1-0 sind an 2-Chlordιbenzodιoxm bzw. 1, 2 , 3, -Tetrachlordιbenzodιoxm bis zu einer Maximalkon- zentration > 100 μM adaptiert.
Auch Isolate der Gattungen Haloarcula und Haloferax konnten an Lindan, DDT und Dioxme im Kulturmedium adaptiert werden.
Einer der aus Haloferax editerranei hervorgegangenen Stämme s war der Mikororganismus Hf-Xl (DSM 11795) , der besonders zum Abbau von Tri-, Tetra- und Pentachlorphenolen geeignet ist.
Einer der aus Haloarcula californiae hervorgegangenen Stämme war der Mikroorganismus Hc-U2 (DSM 11794) , der besonders ge- ιo eignet zum Abbau bromierter Kohlenwasserstoffe ist.
Beispiel 2
Abbau von Trichlorpnenolen
15
Die Zellen wurden als 35 ml Kulturen in 100 ml Erlenmeyerkol- ben, angeimpft mit 1 ml Impfkultur, in einem geeigneten Wachs¬ tumsmedium (250 g NaCl, 20 g Mg S0 4 • 7 H 2 0, 3 g Trinatriumci- trat, 2 g KCl, 10 g Oxid bacteriologisches Pepton, 1 1 H 2 0) bei
20 40 °C unter aeroben oder mikroaeroben Bedingungen kultiviert. Dem Kolben wurden die Giftstoffe 2,3,4-, 2,3,5- oder 2,4,5- Tricnlorpnenol, gelöst in geringen Mengen Ethanol oder Isoprcpanol , zu Beginn der Fermentation zugesetzt. Die Endkon¬ zentration der Giftstoffe war 50 μM. Nach 7-10 Tagen Inkuba-
25 tion bei 40 °C auf einem Schüttler mit 100 Up wurde die ge¬ samte Kulturbrühe mit 2 x 20 ml einer Lösung von 5 % Essig¬ säure in Essigsäureethylester extrahiert. Der Kolben wurde nochmals m t der gleichen Extraktionslösung gespült.
30 Die vereinigten organischen Extrakte wurden gegebenenfalls nach Einengen im StickstoffStrom mittels kombinierter Gaschro- matographie/ei-Massenspektrometrie analysiert. Weiterhin wur¬ den während der Fermentation Kontrollproben von jeweils 600 μl Kultur rüne m t 800 μl Extraktionslösung extrahiert und analy-
35 siert . Parallel hierzu wurden negative Kontrollen (Inkubation des Gifts-offs im Medium m Abwesenheit von Zellen) durchge-
führt, bei denen kein signifikanter Abbau des Giftstoffes gefunden wurde.
Zur GC-MS-Analyse wurde ein 1 μl des Essigesterestrakts über em Kaltaufgabesystem (Gerstel KAS-502) direkt auf eine semi¬ polare 30 m DP-1-Säule (J & W Scientific Inc.) aufgespritzt und über einen Gradienten (80-250 °C, 10 °C/Mm) chromatogra- phiert . Der Nachweis erfolgte "splitless" mit einem Fmnigan MAT312 Elektronenaufprall-Massenspektro eter.
Bei Fermentation des an Trichlorphenole adaptierten Mikroorga¬ nismus Halobacterium CB1-H konnten nach einer Inkubationsdauer von 7-8 Tagen unter aeroDen Bedingungen keine chlorierten or¬ ganischen Substanzen mehr nacngewiesen werden. Unter mikro- aeroben Bedingungen wurde em langsamerer Abbau gefunden.
Abb. la zeigt e Gaschromatogram des organischen Extrakts einer Fermentation von Halobacterium CB1-H in Gegenwart von 2, 3 , 4-Trιchlorphenol (10 μM) nach 0 Tagen. Aus Abb. lb ist ersichtlich, daß nach 5-tägιger Inkubation unter mikroaeroben Bedingungen em fast vollständiger Abbau von 2, 3 , 4-Trichlor- phenol stattgefunden hat.
Abb. 2 zeigt das Massenspektrum von 2, 3 , -Trichlorphenol (m/e = 196/198/200) und Abb. 3 das MassenspeKtrum eines unter mi¬ kroaeroben Bedingungen identifizierten mutmaßlichen Metaboli- ten, nämlich 3 ,4 , 5-Trιchlor-O-methylbrenzcatechm (m/e 226/228/230) .
Beispiel 3
Abbau von Lmdan
Der Abbau von Lmdan wurde mit dem Organismus Halobacterium CB1-G in Gegenwart von 1 mM Lmdan durcngeführt . Die Herstel¬ lung und Analyse von Fermentationsextrakten erfolgte wie Beisoiel 2 Geschrieben.
Abb. 4a und 4b zeigen Gaschromatogramme der organischen Ex¬ trakte einer Fermentation in Gegenwart von 1 mM Lmdan nach 2 bzw. 15 Tagen unter aeroben Bedingungen Es ist eine deutliche Verringerung des Lmdan-Peaks zu erkennen.
Abb. 5 zeigt das Massenspektrum von Lmdan (m/e 288/290/292) . Abb. 6 zeigt das Massenspektrum eines unter mikroaeroben Bedingungen nachweisbaren mutmaßlichen Metaboli¬ ten von Lmdan, nämlich 1, 3 , 4, 5, 6-Pentachlorcyclohexen (m/e = 252/254/256) .
Beispiel 4
Abbau von DDT
Der Abbau von 2, 2-Bιs (4-chiorphenyl) -1, 1, 1-trιchlorethan (DDT) wurde durcn Fermentation mit dem Organismus Halobacterium CB1- K Gegenwart von 1 mM DDT wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt. Auch die Herstellung der Extrakte und die Analy- tik erfolgte wie m Beispiel 2 beschrieben.
Abb 7a und 7b zeigen Gaschromatogramme der organischen Ex¬ trakte einer Fermentation Gegenwart von 1 mM DDT nach 2 bzw. 8 Tagen Neben dem Peak von DDT ist Abb. 7a auch der Peak des Metaboliten 2, 2-Bιs- ( -chiorphenyl) -1, 1-dιchlorethy- len (DDE) zu erkennen. In Abb 7b ist noch ein weiterer Meta- bolit (vgl. Abb. 9) zu erkennen.
Das m Abb. 7a gezeigte Chromatogramm stammt aus einem Extrakt, der aus analytischen Gründen (zu große DDT-Konzen¬ tration) 10-fach verdünnt wurde. Aus einem Vergleich der Chro- matogramme in Abb. 7a und 7b geht hervor, daß mit zunehmender Inkubationsdauer die DDT-Konzentration im Extrakt abnimmt und em verändertes Metabolitenspektrum auftritt.
Abb. B zeigt das Massenspektrum von DDT (m/e = 352/354/356) Abb. 9 zeigt das Massenspektrum eines bei mikroaerober Fer en-
tation auftretenden weiteren mutmaßlichen Metabol iten , nämlich 2 - ( 4 - Chi orphenyl ) - 2 -phenyl - l , 1 - dichlorethylen (m/ e
282 / 284 /286 ) .
Bei spiel 5
Analog den in den Beispielen 2 bis 4 beschriebenen Verfahren wurden weitere organische Verbindungen und Mikroorganismen¬ stämme getestet.
Die Ergebnisse waren wie folgt:
Stämme hervorgegangen aus Halobacterium CBl (DSM 11147) und Haloferax mediterranei waren besonders für den Abbau von 2 , 3, 6-Trichlorphenol, 2, 4 , 6-Trιhalogenphenol (Halogen = Fluor, Chlor, Brom, Jod) , 2, 4 , 5-Trichlorphenol, 2, 3, 4-Trichlorphenol, 2, 3, -Trifluorphenol, 2, 3, 5-Trichlorphenol , 2, 3, 5-Trifluorphe¬ nol und 3 , 4, 5-Trichlorphenol geeignet.
Stämme hervorgegangen aus Halobacterium CBl waren besonders geeignet zum Abbau von Lmdan.
Stämme hervorgegangen aus Haloarcula hispanica und Haloferax gibbonsu waren besonders geeignet zum Abbau von DDT, DDE und DDD.
Stamme hervorgegangen aus Haloferax volcann waren besonders geeignet zum Abbau von Chlorparaffmfraktionen.
Stamme hervorgegangen aus Haloarcula californiae und Haloru¬ brum saccharovorum waren besonders geeignet zum Abbau bromier- ter Kohlenwasserstoffe wie etwa Decabromdiphenylether und Bis- 2,2- (3, 5-dιbrom-4-hydroxyphenyl) -propan.
Stämme hervorgegangen aus Haloferax mediterranei und Halobac¬ terium CBl waren - insbesondere unter mikroaeroben Fermenta-
tionsbedingungen - für den Abbau von Pentahalogenphenol (Halo¬ gen = Chlor, Fluor, Brom) geeignet.
Stämme hervorgegangen aus Haloferax mediterranei waren beson- ders zum Abbau von 2, 3 , 4, 5-Tetrachlorphenol und 2, 3 , 4, 6-Tetra- chlorphenol geeignet .
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