LA DECORINE POUR SON UTILISATION DANS LE TRAITEMENT DU DIABETE

DOMAINE TECHNIQUE

La présente invention se rapporte au domaine de la santé et concerne plus particulièrement le traitement du diabète.

ARRIERE PLAN TECHNOLOGIQUE

Actuellement, une personne meurt du diabète toutes les six secondes. En 2017, l'estimation de l'OMS fait état de 466 millions de personnes atteintes du diabète dans le monde et de 3,5 millions en France (à cela s'ajoute entre 500 000 et 800 000 diabétiques qui s'ignorent). Le diabète est une maladie chronique qui apparaît lorsque le pancréas ne produit pas suffisamment d'insuline ou que l'organisme n'utilise pas correctement l'insuline qu'il produit. S'en suit un trouble de l'assimilation, de l'utilisation et du stockage du glucose apporté lors des différents repas de la journée. Il en résulte alors une augmentation du taux de glucose dans le sang, c'est l'hyperglycémie. Selon l'Organisation Mondiale de la Santé (OMS), si la glycémie est supérieure à 1,26 g/L à jeun, alors le patient est diabétique. Il existe de nombreuses formes de diabètes, les principales étant le diabète de type 1, le diabète de type 2 et le diabète gestationnel.

Le diabète de type 1, aussi appelé diabète insulino-dépendant, se déclare après la destruction des cellules du pancréas productrices d'insuline par le système immunitaire du malade : les cellules bêta. Il en résulte alors une diminution importante de la quantité d'insuline produite par le corps, provoquant ainsi une augmentation du taux de glucose dans le sang. Les symptômes aigus sont nombreux, notamment une polyurie (excrétion excessive d'urine), une polydipsie (soif intense), une faim constante ainsi qu'une perte de poids.

Pour traiter les patients diabétiques, plusieurs solutions thérapeutiques existent.

La première option est l'insulinothérapie, reposant sur l'administration pluriquotidienne d'insuline en injection par un stylo à insuline ou en perfusion par des pompes à insuline. Ce type de traitement est très contraignant et impacte fortement la qualité de vie des patients.

La deuxième option est la transplantation de pancréas. Ce traitement chirurgical est réservé aux patients diabétiques atteints de graves complications rénales et devant subir des dialyses. Dans ce cas, la greffe de pancréas est généralement associée à la greffe d'un autre organe, en général le rein. L'opération a pour avantage de remplacer totalement les injections d'insuline. Elle permet donc une qualité et une espérance de vie améliorée, ainsi qu'une diminution des complications liées au diabète. Malheureusement, cette technique connaît de nombreuses limites comme le rejet du greffon, la nécessité d'un traitement immunosuppresseur à vie, des infections ou encore des hémorragies internes. A ceci s'ajoute un acte chirurgical très lourd sous anesthésie générale, présentant un risque de morbidité non négligeable. La troisième option est la transplantation d'îlots pancréatiques. Cette approche consiste à transplanter les cellules sécrétrices du pancréas chez un receveur diabétique. Cette technique permet de s'affranchir de certaines limites de la greffe de pancréas, en transplantant seulement la fraction endocrine du pancréas : les cellules des îlots pancréatiques. Cette alternative a l'avantage d'être peu invasive, rapide et provoque moins de complications liées à l'intervention chirurgicale. Elle assure la stabilisation du métabolisme du glucose, une diminution significative des épisodes hypoglycémiques sévères et la normalisation des niveaux d’hémoglobine glyquée (Shapiro A.M. et al., 2000, The New England Journal of Medecine, N°343, p. 230-238. ; Pepper A.R. et al., 2013, World Journal of Transplantation, N°3, p. 48-53). Cette technique est particulièrement recommandée pour les patients dont le diabète est particulièrement instable (hypoglycémies sévères, épisodes de coma) mettant ainsi en jeu leur pronostic vital, pour lesquels les injections d'insuline ne sont pas une piste thérapeutique envisageable.

La transplantation d'îlots pancréatiques se déroule en plusieurs étapes. Tout d'abord, le pancréas du donneur est prélevé chirurgicalement et transporté jusqu'à un établissement capable d'effectuer l'isolement des îlots pancréatiques. Une digestion mécanique et enzymatique est réalisée pour séparer les différents tissus qui composent le pancréas. Les îlots sont purifiés et séparés des autres tissus grâce à un gradient discontinu de Ficoll. Les îlots ainsi isolés sont mis en culture pendant 12 à 48h avant d'être transplantés. Chez le patient receveur, la transplantation d'îlots pancréatiques est une procédure s'effectuant sous anesthésie locale en 30 à 45 minutes. Les îlots pancréatiques sont injectés dans le foie du patient receveur grâce à un cathéter placé dans la veine porte. Les îlots s'embolisent ensuite dans le foie où ils libérèrent de l'insuline.

Bien que la transplantation d'îlots pancréatiques soit une méthode prometteuse, elle connaît aujourd'hui plusieurs limites, notamment liées à la survie des îlots pancréatiques. En effet, lors des différentes étapes de cette transplantation, les cellules ne sont plus vascularisées et le taux de mortalité cellulaire est élevé. En particulier, la quantité de cellules vivantes diminue après la mort cérébrale du donneur, lors de la préservation du pancréas, lors de la digestion de l'organe et de l'isolement des îlots, puis lors de l'implantation chez le patient receveur. Ainsi, avant la transplantation d'îlots chez le receveur, seulement 50% des îlots pancréatiques du donneur sont encore viables. La perte d'îlots encore fonctionnels est également très importante à l'implantation, notamment en raison d'une réaction inflammatoire, de stress oxydant et surtout d'un défaut de vascularisation chez le patient receveur. C'est pour ces raisons qu'à l'heure actuelle, il faut recourir à deux ou trois donneurs pour transplanter une quantité suffisante d'îlots chez le receveur et obtenir une insulinodépendance durable.

Ainsi, il existe un besoin de développer de nouvelles stratégies de traitement du diabète, et notamment de mettre à disposition un médicament et une méthode permettant la préservation des cellules des îlots pancréatiques avant et/ou après leur transplantation pour favoriser le traitement du diabète. RESUME DE L'INVENTION

Face au problème posé par la diminution d'ilots pancréatiques viables lors d'une transplantation, les inventeurs montrent ici que la décorine est une candidate intéressante pour résoudre le problème de mortalité précoce des cellules transplantées en favorisant une réaction anti-inflammatoire, une revascularisation plus rapide des îlots pancréatiques dans les patients receveurs ainsi que la sécrétion d'insuline par les cellules de ces îlots, permettant ainsi le traitement du diabète et l'insulino-indépendance des patients. Plus généralement, les inventeurs ont démontré l'intérêt de la décorine dans le traitement du diabète pour sa capacité à diminuer la mortalité des cellules des îlots pancréatiques et améliorer la synthèse et la sécrétion d'insuline par ces cellules. De plus, les inventeurs montrent que la décorine protège les cellules pancréatiques de la perte de fonction et la mort cellulaire observés dans un diabète de type 2.

Un aspect de l'invention concerne de la décorine ou une composition pharmaceutique comprenant de la décorine, pour son utilisation en tant que médicament dans le traitement du diabète. De préférence, le diabète est le diabète de type 1, le diabète de type 2 ou le diabète gestationnel.

Particulièrement, l'invention concerne de la décorine ou une composition pharmaceutique comprenant de la décorine, pour son utilisation dans le traitement d'un sujet greffé ou susceptible d'être greffé avec des cellules d’îlots pancréatiques.

L'invention concerne également de la décorine ou une composition pharmaceutique comprenant de la décorine, pour son utilisation en combinaison avec une thérapie immunosuppressive et/ou un traitement anti-inflammatoire concomitant ou suivant la transplantation de cellules d’îlots pancréatiques chez un sujet, ou pour son utilisation en combinaison avec un principe actif antidiabétique.

De préférence, la thérapie immunosuppressives et/ou le traitement anti-inflammatoires sont choisis parmi de la thymoglobuline, des anti-TNFa, de la rapamune, des inhibiteurs des calcineurines, des agents dépléteurs de lymphocyte T ou des combinaisons de ceux-ci. De manière préférée, la thérapie immunosuppressives et/ou le traitement anti-inflammatoires est une combinaison de thymoglobuline et de rituximab.

De préférence, l'actif antidiabétique est choisi parmi l'insuline, la metformine, des sulfonylurées, le tolbutamide, l'acétohexamide, le tolazamide, le chlorpropamide, le glibenclamide, le glimépiride, le glipizide, le glicazide, le glycopyramide, le gliquidone, des inhibiteurs d'alpha-glucosidase, l'acarbose, le miglitol, le voglibose, des thiazolidinediones, le pioglitazone, le rosiglitazone, des méglitinides, le répaglinide, le natéglinide, un incrétino-mimétique, un analogue du glucagon-like peptide, l'exénatide ou ses dérivés, le taspoglutide, le liraglutide, le semaglutide, un inhibiteur de la dipeptidyl peptidase-4, le vildagliptine, le sitagliptine, le saxagliptine, le linagliptine, l'allogliptine, le septagliptine, un analogue de l'amyline, le pamlintide, un inhibiteur du transporteur de sodium glucose, l'empaglifozine, la dapaglifozine, la canamycine, ou une combinaison de ceux-ci. L'invention est aussi relative à de la décorine ou une composition pharmaceutique pour son utilisation dans le traitement d'un sujet donneur de cellules d’îlots pancréatiques avant les prélèvements desdites cellules.

En particulier, l'invention est aussi relative à de la décorine ou une composition pharmaceutique pour son utilisation dans le traitement d'un sujet greffé avec des cellules d’îlots pancréatiques. De préférence, les cellules d’îlots pancréatiques greffées ont été traitées avec de la décorine.

La composition pharmaceutique utilisée selon l'invention peut comprendre des cellules humaines et de la décorine en tant que substance active. En particulier, les cellules sont choisies parmi des cellules endocrines et des cellules d'ilots pancréatiques.

Bien entendu, les différentes caractéristiques, variantes et formes de réalisation de l’invention peuvent être associées les unes avec les autres selon diverses combinaisons dans la mesure où elles ne sont pas incompatibles ou exclusives les unes des autres.

De plus, diverses autres caractéristiques de l’invention ressortent de la description annexée effectuée en référence aux dessins qui illustrent des formes, non limitatives, de réalisation de l’invention.

DESCRIPTION DES DESSINS

[Fig 1] représente l'impact de la décorine sur la viabilité des îlots pancréatiques. Evaluation de l'apoptose par mesure des cellules TUNEL positives réalisée sur coupes d'îlots pancréatiques de 10 pm. Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=6 expérimentations indépendantes ; * p < 0.05 versus CTL.

[Fig 2] représente l'effet de la décorine sur la fonctionnalité des îlots pancréatiques. A. Sécrétion de glucagon par les îlots pancréatiques traités avec de la décorine (Décorine) ou non (CTL) et incubés en présence de 2.8 mM (Colonne noire) ou de 16.7 mM de glucose (Colonne blanche). La sécrétion est représentée en pourcentage par rapport au contenu total en glucagon des îlots. B. Sécrétion d'insuline par les îlots pancréatiques traités avec de la décorine (Décorine) ou non (CTL) et incubés en présence de 2.8 mM (Colonne noire) ou de 16.7 mM de glucose (Colonne blanche). La sécrétion est représentée en pourcentage par rapport au contenu total en insuline des îlots. C. Contenu total en glucagon des îlots pancréatiques. Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. D. Contenu total en insuline des îlots pancréatiques. Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=10 et 12 expérimentations indépendante ; * p < 0.05, ** p < 0.01 16.7mM versus 2.8mM de glucose. [Fig 3] représente l'évaluation de l'index de stimulation des îlots pancréatiques. A. Rapport entre la sécrétion d'insuline obtenue lors de l'incubation des îlots pancréatiques avec 16.7 mM versus 2.8 mM de glucose. B. Rapport entre la sécrétion de glucagon obtenue lors de l'incubation des îlots pancréatiques avec 2.8 mM versus 16.7 mM de glucose. Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=8 et 10 expérimentations indépendantes.

[Fig 4] représente l'expression protéique d'IGF-lR (A) et de p-IGFR-lR (B). Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=6 expérimentations indépendantes ; * p < 0.05 versus CTL.

[Fig 5] représente l'étude de l'activation du récepteur IGF-1R. Rapport entre l'expression de p-IGF-lR et IGF-1R. Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=6 expérimentations indépendantes ; ** p < 0.01 versus CTL.

[Fig 6] représente l'expression protéique d'IRS-l (A) et de p-IRS-1 (B). Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=6 et n=7 expérimentations indépendantes ; * p < 0.05 versus CTL.

[Fig 7] représente l'étude de l'activation d'IRS-l. Rapport entre l'expression de p-IRS-1 et IRS-1. Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=6 expérimentations indépendantes ; * p < 0.05 versus CTL.

[Fig 8] représente l'expression protéique d'IRS-2 (A) et de p-IRS-2 (B). Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec de la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=6 expérimentations indépendantes ; ** p < 0.01 versus CTL.

[Fig 9] représente l'étude de l'activation d'IRS-2. Rapport entre l'expression de p-IRS-2 et IRS-2. Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=6 expérimentations indépendantes.

[Fig 10] représente l'expression protéique d'Akt (A) et de p-Akt (B). Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=12 expérimentations indépendantes.

[Fig 11] représente l'étude de l'activation d'Akt. Rapport entre l'expression de p-Akt et Akt. Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=ll expérimentations indépendantes ; *** p < 0.001 versus CTL.

[Fig 12] représente l'expression protéique de FoxOl (A) et de p-FoxOl (B). Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=7 expérimentations indépendantes ; ** p < 0.01 versus CTL.

[Fig 13] représente l'étude de l'activation de FoxOl. Rapport entre l'expression de p-FoxOl et FoxOl. Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=7 expérimentations indépendantes ; ** p < 0.01 versus CTL.

[Fig 14] représente l'expression protéique de NF-kB p65 (A) et de p-NF-kB p65 (Ser536) (B). Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=7 et n=8 expérimentations indépendantes ; * p < 0.05 versus CTL.

[Fig 15] représente l'étude de l'activation de NF-kB p65. Rapport entre l'expression de p-NF-kB p65 (Ser536) et NF-kB p65. Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=7 expérimentations indépendantes.

[Fig 16] représente l'expression protéique de SIRT1 (A) et de PGCla (B). Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=4 et n=7 expérimentations indépendantes ; * p < 0.05 versus CTL.

[Fig 17] représente l'expression protéique de HIF-Ia (A) et de HIF-2a (B). Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=12 et n=ll expérimentations indépendantes ; *** p < 0.001 versus CTL.

[Fig 18] représente l'expression protéique de PHD1 (A), de PHD2 (B) et de PHD3 (C). Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=12 expérimentations indépendantes.

[Fig 19] représente l'expression protéique du récepteur VEGFR2 (A) et de sa forme phosphorylée (B). Les colonnes noires et blanches représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=6 et n=7 expérimentations indépendantes ; * p < 0.05 versus CTL.

[Fig 20] représente l'étude de la sécrétion de VEGF-A au cours du temps. Les courbes noires et en pointillés représentent respectivement les conditions contrôle (CTL) et traitement des îlots pancréatiques avec la décorine. La sécrétion de VEGF est représentée en pourcentage par rapport au temps, 2h post traitement. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=6 expérimentations indépendantes.

[Fig 21A] représente l'augmentation la prise de poids corporel des rats STZ post transplantation avec la décorine. A. Gain de poids corporel au cours du temps mesuré en gramme par rapport à t=0 post transplantation (10000 IEQ : opti) pour les groupes SHAM (·), contrôle (■), décorine (A ), contrôle + décorine ( T ) et décorine + décorine (¨).

[Fig 21B] représente l'augmentation la prise de poids corporel des rats STZ post transplantation avec la décorine. B. Gain de poids corporel évalué sur l'ensemble des 56 jours de suivi métabolique et représenté par l'aire sous la courbe pour les groupes SHAM, contrôle, décorine, contrôle + décorine et décorine + décorine ayant été transplanté avec 5000 (sub) ou 10000 IEQ. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=3 à 5 expérimentations indépendante ; * p < 0.05, ** p < 0.01 versus décorine opti. La décorine est abrégée sous le terme « decorin ».

[Fig 22A] représente l'amélioration de la régulation glycémique des rats STZ post transplantation avec la décorine. A. Evolution de la glycémie au cours du temps mesuré en g/L pour les groupes SHAM (·), contrôle (■), décorine ( A ), contrôle + décorine ( T ) et décorine + décorine (¨).

[Fig 22B] représente l'amélioration de la régulation glycémique des rats STZ post transplantation avec la décorine. B. Glycémie évaluée sur l'ensemble des 56 jours de suivi métabolique et représentée par l'aire sous la courbe pour les groupes SHAM, contrôle, décorine, contrôle + décorine et décorine + décorine ayant été transplanté avec 5000 (sub) ou 10000 IEQ. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=3 à 5 expérimentations indépendante ; * p < 0.05, ** p < 0.01 versus décorine opti. La décorine est abrégée sous le terme « decorin ».

[Fig 23A] représente l'effet de la décorine sur la c-peptidémie des rats STZ post transplantation. Evolution de la c-petidémie au cours du temps mesuré en pmol/L pour les groupes SHAM (·), contrôle (■), décorine ( A ), contrôle + décorine ( T ) et décorine + décorine (¨). [Fig 23B] représente l'effet de la décorine sur la c-peptidémie des rats STZ post transplantation. C- peptidémie évaluée sur l'ensemble des 56 jours de suivi métabolique et représentée par l'aire sous la courbe pour les groupes SHAM, contrôle, décorine, contrôle + décorine et décorine + décorine ayant été transplanté avec 5000 (sub) ou 10000 IEQ. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM. n=3 à 5 expérimentations indépendante ; * p < 0.05, ** p < 0.01 versus décorine opti. Dans la figure 23B, la décorine est abrégée sous le terme «decorin».

[Fig 24] représente l'augmentation de l'insulino-indépendance des rats STZ post transplantation avec traitement à la décorine : Insulino-indépendance exprimée en pourcentage d'animaux ayant atteint une normoglycéme (Glycémie < 2 g/L) par rapport à l'ensemble des animaux de chaque des groupes SHAM ou transplantés (Contrôle ou décorine ayant reçu 5000 (sub) ou 10000 IEQ (opti)). n=3 à 5 expérimentations indépendantes. La décorine est abrégée sous le terme « decorin ».

[Fig 25] représente l'impact de la décorine sur les besoins en insuline des rats STZ post transplantation. Répartition spatiale des besoins en insuline quotidiens reçu tout au long de l'étude par les animaux SHAM ou transplantés (Contrôle ou décorine ayant reçu 10000 IEQ (opti)) selon 3 axes représentant les doses en insuline injectées (0 Ul, 3 Ul ou 6 Ul). Cette répartition est représentée en pourcentage d'animaux ayant reçu l'une des 3 doses par rapport à l'ensemble des animaux de chacun des groupes représentés. n=3 à 5 expérimentations indépendantes.

[Fig 26] représente le besoin en insuline des rats après induction d'un diabète par destruction des cellules beta pancréatiques et greffe d'ilots. Les groupes suivants sont étudiés: SHAM: destruction des cellules beta et pas de transplantation; contrôle: destruction de cellules beta + transplantation îlots, Décorine: destruction de cellules beta + transplantation îlots prétraités à la décorine 24h; contrôle+décorine: destruction de cellules beta + transplantation d'ilots avec injection du receveur à la décorine toutes les 24h; décorine+décorine: destruction de cellules beta + transplantation d'ilots prétraités avec injection du receveur toutes les 24h. La décorine est abrégée sous le terme « decorin».

[Fig 27] représente l'impact chez l'homme de la décorine sur la sécrétion d'insuline en situation contrôle et inflammatoire (48h TNF-ALPHA).

[Fig 28] représente l'impact chez l'homme de la décorine sur la survie et l'apoptose en situation contrôle et inflammatoire (Cytomix 48h TNF-alpha + Interféron gamma+ILl-beta). La décorine est abrégée sous le terme « decorin ».

[Fig 29] représente l'impact chez l'homme de la décorine sur la sécrétion d'insuline en situation contrôle et riche en gras (palmitate 48H). La décorine est abrégée sous le terme « decorin ».

[Fig 30] représente l'impact chez l'homme de la décorine sur la survie et l'apoptose en situation contrôle et riche en gras (48h). La décorine est abrégée sous le terme « decorin ». [Fig 31] représente l'impact chez l'homme de la décorine sur la sécrétion d'insuline en situation contrôle et riche en sucre (glucose 16,7 mM 48H). La décorine est abrégée sous le terme « decorin ».

[Fig 32] représente l'impact chez l'homme de la décorine sur la sécrétion d'insuline chez des îlots isolés à partir de donneurs atteints de diabète de type 2.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

Introduction

La présente invention concerne de la décorine ou une composition pharmaceutique comprenant de la décorine, pour son utilisation en tant que médicament dans le traitement du diabète, le traitement du diabète pouvant comprendre en outre la transplantation d'ilots pancréatiques.

Il faut noter que toutes les études de la présente demande ont été réalisées sur des îlots humains non altérés non dissociés, non triés et non manipulés chimiquement. Ceci se distingue d'études réalisées sur des cellules betas pures triées par FACS et par exemple mises en culture sur matrice extracellulaire (804G), riche en laminine 5. En effet, cette matrice permet de protéger les cellules bêta-pancréatiques de la mort cellulaire et augmente la sécrétion d'insuline induite par le glucose en activant la voie des intégrines B1 et perturbant ainsi la signalisation intracellulaire et la physiologie de la cellule. Les résultats obtenus par ces méthodes permettent d'identifier un effet direct ou indirect sur la cellule bêta-pancréatique en tant que telle mais ne reflète absolument pas les effets sur l'ilot entier qui est composé d'un mélange de différents types cellulaires (alpha, beta, delta, cellule exocrine). Les résultats obtenus sur le modèle de cellule béta trié ne permettent pas de prédire un quelconque effet sur l'ilot natif. A contrario, les inventeurs démontrent ici l'importance de l'effet de la décorine au niveau d'ilots complets natifs.

Définitions

Le terme « décorine » se rapporte ici à une myokine. La décorine appartient à la famille des petits protéoglycanes riches en leucine (SLRP) et consiste en un noyau protéique contenant des répétitions de leucine avec une chaîne glycosaminoglycane (GAG) constituée de chondroïtine sulfate (CS) ou de dermatane sulfate (DS). Les résidus leucine lui permettent de se fixer à un grand nombre de récepteurs cellulaires. Elle est ainsi capable de déclencher les cascades de signalisation correspondantes. En particulier, la décorine est un facteur endocrinien produit par les muscles, qui est capable de se fixer à la surface des cellules bêta du pancréas. Les noms alternatifs de cette protéine sont PG-S2, PG40 ou Protéoglycane osseux II. La décorine peut se retrouver sous la forme de différents isoformes produits par épissage alternatif. Il s'agit des isoformes A (séquence consensus), B, C, D et E. La décorine est décrite dans les bases de données sous les numéros d'accessions suivants : Gene ID : 1634, UniGene : Hs.156316 et Hs.530910. Cette protéine est également décrite sous le numéro d'accession UniProt P07585. Les références des séquences ARN pour la décorine humaine sont par exemple NM_001920.4 (isoforme A), NM_133503.3 (isoforme A), NM_133504.3 (isoforme B), NM_133505.3 (isoforme C), NM_133506.3 (isoforme D) et NM_133507.3 (isoforme E). Les références des séquences protéiques sont par exemple NP_001911.1 (isoforme A), NP_598010.1 (isoforme A), NP_598011.1 (isoforme B), NP_598012.1 (isoforme C), NP_598013.1 (isoforme D) et NP_598014.1 (isoforme E). De préférence, la décorine selon l'invention est l'isoforme de type A. La décorine comprend généralement un peptide signal en position 1- 16 et un propeptide en position 17-30. La décorine comprend de préférence la séquence entre les positions 17-359 ou 31-359. La décorine comprend facultativement le peptide signal et/ou le propeptide.

Une séquence de la décorine humaine est en particulier décrite dans la SEQ. ID NO : 1.

Le terme « substitution », tel qu’utilisé ici désigne le remplacement d’un résidu d’acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d’acides aminés standard naturels, les résidus d’acides aminés naturels rares et d’acides aminés non naturels. De préférence, le terme « substitution » se réfère au remplacement d’un résidu d’acide aminé par un autre choisi parmi les 20 résidus d’acides aminés standards naturels (G, P, A, V, L, I, M, C, F, Y, W, H, K, R, Q, N, E, D, S et T). La ou les substitutions peuvent être des substitutions conservatives ou non conservatives. Le terme « substitution conservative » tel qu'utilisé dans ce document, se réfère à une substitution d'un résidu d'acide aminépar un autre qui présente des propriétés chimiques ou physiques similaires (taille, charge ou polarité). Des exemples de substitutions conservatives sont présentés dans les tableaux suivants.

[Table 1]

[Table 2]

Groupes de substitution conservative alternatifs [Table 3]

Classification fonctionnelle et physique supplémentaire des acides aminés

Par « myokine », on entend une substance soluble produite et libérée par les cellules des muscles en réponse aux contractions musculaires. Ces molécules ont la capacité d'agir directement ou indirectement sur plusieurs organes, conduisant aux changements métaboliques nécessaires pendant ou après un exercice physique.

Le terme « diabète » se rapporte ici à une maladie chronique qui survient lorsque le pancréas neproduit pas assez d’insuline ou lorsque l’organisme n’est pas capable d’utiliser efficacement l’insuline qu’il produit. Le diabète est un trouble de l'assimilation, de l'utilisation et du stockage des sucres apportés par l'alimentation. Ceci se traduit par une hyperglycémie, caractérisée par un taux de glucose élevé dans le sang, généralement supérieur à 1,26 g/L de sang. On distingue principalement deux types de diabète : le diabète de type 1 qui touche environ 6% des diabétiques et le diabète de type 2 qui en touche 92 %. Les autres types de diabète concernent les 2 % restants (MODY, LADA ou diabète secondaire à certaines maladies ou prises de médicaments).

On entend par « diabète de type 1 » ou « diabète insulino-dépendant » une forme particulière de diabète, généralement considérée comme une maladie auto-immune, qui résulte de la disparition des cellules bêta du pancréas, entraînant une carence totale en insuline. Le glucose ne pouvant entrer dans les cellules retourne dans le sang, ceci entraîne une forte augmentation de la glycémie, caractérisée par un taux de glucose bien supérieur à 1,26 g/L de sang.

On entend par « diabète de type 2 » ou « diabète non insulino-dépendant » une forme particulière de diabète, résultant soit d'une insulinopénie lorsque le pancréas fabrique insuffisamment de l'insuline, soit d'une insulinorésistance lorsque cette insuline n'est pas capable d'agir suffisamment pour réguler la glycémie. Dans les deux cas, la glycémie n'est pas régulée.

On entend par « diabète gestationnel » une forme particulière de diabète qui est un trouble de la tolérance glucidique conduisant à une hyperglycémie de sévérité variable, débutant ou diagnostiqué pour la première fois chez une femme pendant la grossesse. Le diabète gestationnel apparaît en particulier chez des femmes qui ont un diabète méconnu et que la grossesse va révéler ou chez des femmes qui développent un diabète uniquement à l'occasion de la grossesse, trouble qui disparaît le plus souvent après la naissance du bébé.

Par « complication du diabète » sont entendus tous les états, conditions, troubles ou maladies qui résultent des conséquences d'une hyperglycémie relative au diabète. Pratiquement toutes les parties du corps et des organes peuvent subir les contrecoups d’un diabète et/ ou d'une glycémie mal contrôlée. L'hyperglycémie peut en particulier affaiblir les parois des vaisseaux sanguins qui approvisionnent les tissus et/ou les organes en oxygène et en éléments nutritifs. Les complications du diabète englobent les complications aigües telles que l'acidocétose diabétique et les états hyperosmolaires, ainsi que les complications à long terme telles que les troubles oculaires, les néphropathies et les maladies cardio vasculaires. Les complications sont plus particulièrement décrites ci-après dans le paragraphe « Diabètes et complications ciblées par la présente invention ».

Par « insuline », on entend ici une hormone protéique sécrétée par les cellules b des îlots pancréatiques. Elle permet de réguler la glycémie en favorisant la captation du glucose dans les cellules du muscle, du foie ou dans les cellules adipeuses. C'est une hormone hypoglycémiante.

Par « hypoglycémie » est entendu ici un taux de glucose bas dans le sang, généralement inférieur à 0,60 g/L de sang. Les termes « cellules d'îlots pancréatiques » ou « cellules d'îlots de Langerhans » se rapporte ici aux cellules endocrines du pancréas, regroupées en amas sphériques. Les îlots sont composés en majorité de cellule bêta et de cellule alpha. Ces dernières sécrètent respectivement l'insuline et le glucagon.

Le terme "traitement" se rapporte ici à l’obtention d’un effet pharmacologique et/ou physiologique souhaité. L’effet peut être prophylactique en termes de prévention totale ou partielle d’une maladie ou d’un symptôme et/ou peut être thérapeutique en termes de guérison partielle ou complète d’une maladie et/ou d’un effet indésirable attribuable à la maladie. Le terme « traitement » tel qu'utilisé ici couvre tout traitement d’une maladie chez un mammifère, en particulier chez un humain, pour : réduire l’incidence et/ou le risque de rechute de la maladie pendant une période sans symptômes; soulager ou réduire un symptôme de la maladie; empêcher la maladie de se produire chez un sujet qui peut être prédisposé à la maladie mais qui n’a pas encore été diagnostiqué comme l’ayant; inhiber la maladie, c'est-à-dire stopper son développement (par exemple, réduire le taux de progression de la maladie); réduire la fréquence des épisodes de la maladie; ralentir le développement de la maladie et soulager la maladie, c'est-à-dire provoquer une régression totale ou partielle de la maladie.

L'expression "quantité thérapeutiquement efficace", telle qu’utilisée ici, se réfère à une quantité qui résulte en une amélioration de l'état d'un organe ou d'un sujet, ou en une diminution de la maladie, du trouble ou des symptômes de la maladie ou du trouble en question.

Les termes «individu», «hôte», «sujet» et «patient», sont utilisés ici de manière interchangeable, et désignent un mammifère, plus particulièrement un sujet animal et plus particulièrement encore un humain. Le sujet peut souffrir de diabète.

Les termes « donneur », « patient donneur » et « sujet donneur » sont utilisés ici de manière interchangeable et réfère aux personnes chez qui les îlots pancréatiques sont prélevés. Il peut s'agir de personnes décédées, particulièrement en état de mort encéphalique (principalement due à des traumatismes, accidents vasculaires cérébraux, anoxies ou intoxications) ou de sujet vivant.

Les termes « receveur », « patient receveur », « sujet receveur », « sujet greffé », « sujet susceptible d'être greffé » réfèrent à un sujet ayant subi ou étant susceptible de subir une transplantation de cellules d'îlots pancréatiques, lesdites cellules provenant d'un donneur. De préférence, le receveur souffre de diabète.

Telle qu’utilisée ici, une "composition pharmaceutique" désigne une préparation d’un ou plusieurs des agents actifs avec d’autres composants chimiques optionnels tels que des supports physiologiquement appropriés et/ou des excipients. Le but d’une composition pharmaceutique est de faciliter l’administration de l’agent actif à un organisme. Les compositions de la présente invention peuvent se présenter sous une forme appropriée pour toute voie d’administration ou d’utilisation conventionnelle. La composition pharmaceutique selon l'invention englobe les compositions pharmaceutiques utilisées en médecine humaine et les compositions pharmaceutiques utilisées en médecine animale, c'est à dire les compositions vétérinaires. Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique comprend en outre un véhicule pharmaceutiquement acceptable.

Tel qu’utilisé ici, les termes « support pharmaceutiquement acceptable » ou « excipient pharmaceutiquement acceptable » ou « véhicule pharmaceutiquement acceptable » sont interchangeables et comprennent tous composés ou combinaisons de composés qui sont connus de l’homme de l’art comme étant utiles dans la formulation de compositions pharmaceutiques ou vétérinaires. Dans le contexte de la présente invention, on entend par « physiologiquement acceptable » ou « pharmaceutiquement acceptable », tout milieu ou additif qui n’interfère pas avec l’efficacité de l’activité biologique de la substance active (ici, la décorine), et qui n’est pas excessivement toxique pour le patient ou sujet, aux concentrations auxquelles il est administré et/ou qui ne produisent pas de réaction indésirable lorsqu'elles sont administrées à un humain ou à un animal. Un véhicule, un support ou un excipient physiologiquement acceptable peut être approprié à l'administration aux humains et/ou aux animaux (en particulier aux mammifères).

Le terme « substance active », tel qu'utilisé ici, désigne une substance ou molécule qui, dans une composition, un mélange ou un milieu engendre un effet particulier et recherché sur des cellules ou sur un sujet. La substance active s'oppose aux ingrédients « inertes » n'ayant pas d’activité pharmacologique particulière, notamment les excipients ainsi qu'aux composés secondaires, ayant ou non un effet pharmacologique, qui servent de support ou d'adjuvant à la substance active principale, et qui n'agissent seulement que pour renforcer l'effet de la substance active de manière directe (en agissant sur la substance active) ou de manière indirecte (en agissant sur les conditions ou troubles impliqués dans la maladie).

Le terme "médicament", tel qu’utilisé ici, englobe des médicaments à usage humain et animal en médecine humaine et vétérinaire et fait référence à toute substance acceptable sur le plan pharmacologique qui procure un effet thérapeutique et/ou bénéfique. Le terme "médicament" utilisé ici n’est pas nécessairement limité aux substances nécessitant une autorisation de mise sur le marché.

Par « transplantation » ou « greffe », on entend une intervention, en particulier une intervention chirurgicale qui consiste à transférer un organe, un tissu ou des cellules d'un individu à l'autre. En particulier, ces termes font référence à une hétérogreffe et/ou à une allogreffe. De préférence, une transplantation consiste à remplacer un organe ou tissu malade par un organe ou tissu sain, appelé « greffon » ou « transplant » et provenant d’un sujet donneur. Dans le contexte de l'invention, le greffon correspond aux îlots pancréatiques prélevés chez le patient donneur et/ou aux cellules d'ilots pancréatiques purifiées destinées à être transplantées chez le patient receveur. Par exemple, le greffon peut correspondre à des îlots pancréatiques qui ont été préparés à partir de cellules souches. Tel qu'utilisé ici, le terme de « cellule souche embryonnaire » se réfère à des cellules dérivées de la masse cellulaire interne du blastocyste et qui ont la capacité de conduire à la formation de tous les tissus de l'organisme (mésoderme, endoderme, ectoderme), y compris aux cellules de la lignée germinale. La pluripotence des cellules souches embryonnaires peut être évaluée par la présence de marqueurs tels que les facteurs de transcription OCT4 et NANOG et des marqueurs de surface comme SSEA3/4, Tra-1-60 et Tra-1-81.

Tel qu'utilisé ici, le terme de « cellule souche pluripotente induite » (CSPi, ou iPS), se réfère à des cellules souches pluripotentes obtenues par reprogrammation génétique de cellules somatiques différenciées, et présentant une morphologie et un potentiel d'autorenouvèlement et de pluripotence en partie similaires à ceux des cellules souches embryonnaires. Ces cellules sont notamment positives pour les marqueurs de pluripotence, notamment la coloration à la phosphatase alcaline et l'expression des protéines NANOG, SOX2, OCT4 et SSEA3/4. Les procédés permettant l'obtention des cellules souches pluripotentes induites sont bien connus de l'homme du métier et sont notamment décrits dans les articles de Yu et al (Science, 2007, 318 (5858): 1917-1920), Takahashi et al (Cell, 2007, 131(5): 861-872) et Nakagawa et al (Nat Biotechnol, 2008, 26(1): 101-106).

Par « adjuvant d'une thérapie » ou « adjuvant d'un traitement », on entend un traitement qui complète un traitement principal (généralement un « traitement de première intention » ou « traitement standard ») afin renforcer l'effet thérapeutique recherché, afin de prévenir ou de retarder la réapparition (récidive) de la maladie, ou afin de diminuer les risques de complications découlant de la maladie ou du traitement.

Par « milieu », « milieu de culture » ou « milieu de conservation », on entend une composition qui permet le maintien et/ou la culture de cellules d'îlots pancréatiques viables et/ou fonctionnels. Ce milieu peut être spécifique à la séparation, l’isolation, la culture et le contrôle des cellules des îlots pancréatiques. En principe, les cellules trouvent dans ce milieu les composants indispensables pour leur survie et/ou leur multiplication tels que des acides aminés, des vitamines, des sels inorganiques, du glucose. En particulier, ce milieu est optimisé pour la culture in vitro d'îlots pancréatiques.

Par « maintien de la viabilité des cellules d'îlots pancréatiques » ou « préservation de la viabilité des cellules d'îlots pancréatiques », on entend le maintien de la survie et/ou de la fonctionnalité des cellules des îlots pancréatiques, et/ou la diminution de l'occurrence et/ou de la fréquence d'apoptose des cellules des îlots pancréatiques.

Dans le cadre de la présente demande on entend par "acide nucléique" un diester de phosphate d’une forme polymérique de ribonucléosides (adénosine, guanosine, uridine ou cytidine; "molécules ARN") ou de désoxyribonucléosides (désoxyadénosine, désoxyguanosine, désoxythymidine, or désoxycytidine; "molécules ADN"), ou un analogue phosphodiester quelconque de ceux-ci, tels que des phosphorothioates et des thioesters, sous forme simple brin ou sous forme double brin. L’acide nucléique peut ainsi être un acide désoxyribonucléique ou un acide ribonucléique. Il peut s'agir de séquences d'origine naturelle ou artificielle, et notamment d'ADN génomique, d'ADNc, d'ARNm, de séquences d'acides aminés hybrides ou de séquences synthétiques ou semi synthétiques, modifiés ou non.

Tels qu’utilisés ici, les termes "construction d’acide nucléique" et "vecteur" sont équivalents et font référence à une molécule d’acide nucléique qui sert à transférer et/ou exprimer une séquence d’acides nucléiques, telle qu’un ADN ou un ARN, dans une cellule hôte. Un vecteur peut comprendre une origine de réplication, un marqueur sélectionnable et éventuellement un site approprié pour l’insertion d’une séquence ou d’un gène. Un vecteur peut être soit un vecteur extra-chromosomal auto-réplicatif, soit un vecteur qui s’intégre dans le génome de la cellule hôte. Il peut également comprendre des éléments d’expression comprenant, par exemple, un promoteur, une séquence d’initiation de la traduction ribosomale, un codon d'initiation, un codon de terminaison et/ou une séquence de terminaison de la transcription. Les vecteurs capables de diriger l’expression de la séquence d’acide nucléique auxquels ils sont liés de manière opérationnelle peuvent également être appelés ici "vecteurs d’expression". La construction d’acide nucléique peut être un vecteur pour l’expression stable ou transitoire d’un gène ou d’une séquence. Tel qu’utilisé ici, le terme "identité de séquence" ou "identité" ou « pourcentage d'identité » se réfère au pourcentage de résidus d’acides aminés identiques entre les deux séquences comparées, ce pourcentage étant obtenu après mise en oeuvre du meilleur alignement (alignement optimum) entre les deux séquences. L’identité de séquence est déterminée en comparant les séquences lorsqu'elles sont alignées de manière à maximiser le chevauchement et l'identité tout en minimisant les interruptions de séquence. Notamment, le pourcentage d'identité par rapport à la séquence de référence sera calculé en divisant (i) le nombre total de résidus identiques alignés entre les deux séquences par (ii) le nombre total de résidus contenus dans la séquence de référence, puis en multipliant par 100 le quotient obtenu. En particulier, l’identité de séquence peut être déterminée en utilisant l’un quelconque des nombreux algorithmes d’alignement global ou local, en fonction de la longueur des deux séquences. Des séquences de longueurs similaires sont de préférence alignées en utilisant des algorithmes d’alignement global (ex. Needleman & Wunsch, J. Mol. Biol 48:443, 1970) qui alignent les séquences de manière optimale sur toute la longueur, tandis que des séquences de longueurs sensiblement différentes sont de préférence alignées en utilisant un algorithme d’alignement local, par exemple l’algorithme de Smith et Waterman (Smith et Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482, 1981) ou l’algorithme d’AltschuI (Altschul et al (1997) Nucleic Acids Res. 25:3389-3402 ; Altschul et al (2005) FEBS J. 272:5101-5109). L’alignement dans le but de déterminer le pourcentage d’identité de séquences d’acides aminés peut être réalisé par toute méthode connue de l'homme du métier, par exemple en utilisant un logiciel disponible sur des sites Internet tels que http: //blast.ncbi.nlm. nih.gov ou http://www.ebi.ac.uk/Tools/emboss/. L’homme de l’art peut aisément déterminer les paramètres appropriés pour mesurer l’alignement. Aux fins de la présente invention, les valeurs de pourcentage d’identité de séquence d’acides aminés désignent des valeurs générées en utilisant le programme EMBOSS Needle d'alignement de séquences par paires qui crée un alignement global optimal de deux séquences en utilisant l'algorithme de Needleman-Wunsch dans lequel les paramètres sont les paramètres par défaut : Scoring matrix = BLOSUM62, Gap open = 10, Gap extend = 0.5, End gap penalty = false, End gap open = 10 and End gap extend = 0.5.

Tel qu'utilisé ici, le terme "comprenant" ou "comprend" est utilisé en référence à des substances, composés ou procédés qui sont essentiels à l'invention, mais qui sont ouverts à l'inclusion d'éléments non spécifiques, essentiels ou non.

Le terme "et/ou" tel qu'il est utilisé ici doit être considéré comme une description spécifique de chacune des deux caractéristiques ou composants spécifiés, avec ou sans l'autre. Par exemple, «A et/ou B» doit être considéré comme une divulgation spécifique de chacun des éléments suivants: (i) A, (ii) B et (iii) A et B, comme si chacun d'eux était présenté individuellement.

Décorine

La décorine selon l'invention est une myokine, en particulier une myokine de mammifère, de préférence une myokine humaine, de manière préférée l'isoforme A de la décorine humaine, de manière encore plus préférée la décorine décrite par la SEQ ID No : 1 ou un fragment ou variant fonctionnel de celle-ci.

Il est entendu que la présente invention concerne également toute protéine présentant des modifications, tels que des mutants, des variants ou des homologues, ayant le même effet ou activité que la décorine selon l'invention. Les termes « homologue », « variant », « équivalent biologique » ou « mutant » sont interchangeables et réfèrent à une protéine ayant une homologie ou une identité de séquence avec la séquence nucléotidique de la décorine selon l'invention, ledit variant fonctionnel conservant l’activité biologique de la protéine dont il est issu. Tel qu’utilisé ici, le terme "mutation" comprend des mutations naturelles ou induites, comprenant au moins des altérations comprenant des délétions, des insertions, des substitutions connues de l’homme de l’art, y compris une modification génétique introduite dans une séquence de nucléotides ou d’acides aminés. Par exemple, un variant présente au moins environ 70%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 98% d'homologie ou d'identité de séquence avec la protéine de référence (encore appelée « séquence parente »), et présente une activité biologique sensiblement équivalente à celle-ci. Par "variant" ou "équivalent", on entend également une séquence polypeptidique ou protéique qui diffère de celle d’une séquence de référence par au moins une modification ou mutation d’acide aminé.

Ainsi, la décorine peut comprendre une séquence présentant un pourcentage d'identité d'au moins 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% avec la séquence de la décorine mature (c'est-à-dire sans le peptide signal et le propeptide), plus spécifiquement pour l'homme avec la séquence entre les positions 31-359 de la SEQ ID NO :1. De manière alternative, la décorine peut comprendre la séquence mature de la décorine (plus spécifiquement pour l'homme avec la séquence entre les positions 31-359 de la SEQ ID NO : 1) et présenter en outre 1 à 20 modifications choisies parmi une substitution, une délétion ou une addition d'un acide aminé. De préférence, les substitutions sont conservatives.

En particulier, la décorine selon l'invention peut comprendre 1 à 20 substitutions conservatives, de préférence 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 substitutions conservatives par rapport à la SEQ ID No.l ou un fragment correspondant aux acides aminés 17-359 ou31-359 de celle-ci. La décorine selon l'invention peut particulièrement comprendre la substitution T268M ou E273Q.

Selon un mode de réalisation, la décorine est un fragment biologiquement actif de la décorine. Par « fragment biologiquement actif » on entend ici un fragment protéique ou polypeptidique qui présente une activité biologique sensiblement équivalente à la décorine. Ainsi, la décorine peut être choisie parmi la décorine avec le peptide signal et le propeptide (notamment la SEQ ID NO : 1 pour l'homme), la décorine sans le peptide signal et avec le propeptide (notamment 17-359 de la SEQ ID NO : 1 pour l'homme), ou la décorine sans le peptide signal et le propeptide (notamment 31-359 de la SEQ ID NO : 1 pour l'homme).

Suivant le sujet traité, la décorine sera de préférence une décorine de la même espèce. Ainsi, si le sujet à traiter est un patient humain, la décorine sera une décorine humaine.

En particulier, l'invention concerne de la décorine ou d'une composition pharmaceutique la comprenant pour son utilisation en tant que médicament dans le traitement du diabète, par exemple du diabète de type 1, de type 2 ou le diabète gestationnel, de préférence dans le traitement du diabète de type 1.

En effet, dans le contexte du traitement du diabète, la décorine permet d'améliorer la synthèse et la sécrétion d'insuline par les cellules des îlots pancréatiques, en particulier en réponse à une stimulation par le glucose, et de diminuer la mortalité des cellules de ces îlots. Notamment, la décorine permet d'augmenter la sécrétion d'insuline par les cellules des îlots pancréatiques en réponse à une stimulation par le glucose, et de diminuer la mortalité des cellules de ces îlots lorsqu'ils sont soumis à l'effet de cytokines pro-inflammatoires comme TNF-alpha, INF-gamma or ILl-beta, d'acides gras comme le palmitate, ou d'une quantité excessive de sucre. Ainsi, la présente invention est également relative à l'utilisation de la décorine pour diminuer chez un patient diabétique les effets de l'inflammation, en particulier de cytokines pro-inflammatoires comme TNF-alpha, INF-gamma or ILl-beta, sur la sécrétion d'insuline en réponse à une stimulation par le glucose, et sur la mortalité des cellules de ces îlots induites par cette inflammation. La présente invention est en outre relative à l'utilisation de la décorine pour diminuer chez un patient diabétique les effets d'une alimentation grasse sur la sécrétion d'insuline en réponse à une stimulation par le glucose, et sur la mortalité des cellules de ces îlots.

Selon un mode de réalisation privilégié, le médicament est destiné à être administré au sujet diabétique avant, pendant et/ou à la suite d’une transplantation de cellules d'îlots pancréatiques. En particulier, la décorine est destinée à être administrée à un patient receveur, notamment dans le but de faciliter la prise de la greffe des cellules d'îlots pancréatiques.

Dans un mode de réalisation le patient traité par la décorine est un patient greffé avec des cellules d'îlots pancréatiques. De préférence, les cellules d'îlots pancréatiques greffées ont été traitées préalablement à la greffe avec de la décorine. En effet, les inventeurs ont clairement démontré un effet extrêmement bénéfique du traitement d'un patient greffé par la décorine, tout particulier lorsque les greffons ont été traités avec la décorine avant la greffe.

Alternativement ou parallèlement, la décorine est destinée à être administrée à un patient donneur, notamment dans le but de préserver la viabilité des îlots pancréatiques qui seront prélevés.

Acides nucléiques et Vecteurs pour l'expression de la décorine

La présente invention concerne également une séquence d'acides nucléiques codant pour de la décorine selon l'invention pour son utilisation dans le traitement du diabète ou d'une complication du diabète. De préférence, la séquence d'acides nucléiques code pour la décorine telle que décrite ci-dessus ou un fragment ou un variant de celle-ci. Par exemple, une séquence codante pour la décorine est décrite dans la SEQ ID NO : 2.

L’invention est également relative à un vecteur recombinant comprenant une séquence d'acides nucléiques codant pour de la décorine selon l'invention telle que décrite ci-dessus pour son utilisation dans le traitement du diabète d'une complication du diabète.

De préférence, il s'agit de vecteurs d'expression comprenant, outre une séquence d'acides nucléiques conforme à l’invention, des séquences régulatrices permettant d’en contrôler la transcription et/ou la traduction. Notamment, le vecteur selon l’invention comprendra notamment des éléments de régulation de l’expression de la séquence codant pour la décorine selon l'invention, tels que des promoteurs et des séquences activatrices ("enhancers") ainsi que des séquences d’initiation et d’arrêt de la transcription appropriées.

En outre, les vecteurs selon l’invention pourront comprendre une ou plusieurs origines de réplication chez les hôtes cellulaires dans lesquels leur amplification et/ou leur expression est recherchée et/ou des marqueurs de sélection.

En particulier, les vecteurs comprenant la séquence d'acides aminés codant pour la décorine peuvent être des vecteurs viraux ou non. Les vecteurs viraux sont bien connus de l'homme du métier et peuvent comprendre par exemple des vecteurs baculoviraux, adénoviraux, parvoviraux, rétroviraux, lentiviraux ou des vecteurs dérivés de virus adéno-associés, par exemple décrits dans Giannoukakis et al., Diabètes 48:2107-2121 (1999); Efrat, Eur. J. ofEndocrinol 138:129-133 (1998); Stone et al., J. Endocinol 164:103- 118 (2000); Castro et al., Baillieres BestPrac. Res. Clin. Endocrinol Metab. 13:431-449 (1999); Becker et al., J Biol. Chem. 59:21234-21238 (1994); Csete et al., Transplantation 59:263-268 (1995); Sigalla et al., Hum. Gen. Ther. 8:1625-1634 (1997); Leibowitz et al., Diabètes 48:745-753 (1999); Guo et al., Cell Transplant 8:661-671 (1999).

Les vecteurs selon l'invention comprennent en particulier des promoteurs eucaryotes ubiquitaires, constitutifs ou inductibles, tels que des promoteurs ubiquitaires (par exemple HPRT, vimentine, a-actine, tubuline), les promoteurs des filaments intermédiaires (par exemple desmine, neurofilaments, kératine, GFAP) les promoteurs spécifiques de tissus (par exemple le promoteur du gène de l'albumine du foie) ou le promoteur précoce du Cytomégalovirus (Boshart et al., 1985, Cell 41 :521-530).

Dans un mode de réalisation particulier, la séquence d'acides nucléiques ou le vecteur comprend en outre un système CRISPR-Cas, de préférence un système CRISPR-Cas9, notamment destiné à être utilisé en thérapie génique dans le traitement du diabète, en particulier pour introduire la séquence d'acide nucléique codant pour la décorine dans le génome d'une cellule cible. De préférence, le système CRISPR contient deux éléments distincts, à savoir i) une endonucléase et ii) un ARN guide.

Cellules

La séquence d'acides nucléiques ou le vecteur la comprenant peuvent être transduits dans une cellule hôte. Ainsi, un aspect de l'invention concerne une cellule comprenant la séquence d'acides nucléiques codant pour de la décorine selon l'invention pour son utilisation dans le traitement du diabète ou d'une complication du diabète.

L’introduction de la séquence d'acides nucléiques ou du vecteur selon l’invention dans une cellule hôte peut être réalisée in vitro, selon les techniques bien connues de l’homme du métier tel que l'électroporation, pour transformer ou transfecter des cellules, soit en culture primaire, soit sous la forme de lignées cellulaires. Alternativement l’introduction de la séquence d'acides nucléiques ou du vecteur selon l’invention peut être réalisée dans des cellules in vivo, en particulier chez un sujet atteint de diabète.

De préférence, la cellule hôte est une cellule eucaryote, de manière préférée une cellule humaine. Toute cellule du corps humain ou toute cellule appropriée pour une transplantation d'ilots pancréatiques peut être utilisée. De préférence, les cellules sont des cellules souches ou des cellules endocrines, en particulier des cellules d'ilots pancréatiques ou des cellules du foie, de manière préférée les cellules sont des cellules bêta et/ou alpha des îlots pancréatiques. De manière préférée, les cellules sont des cellules bêta des îlots pancréatiques. Alternativement, les cellules sont des cellules alpha des îlots pancréatiques.

Selon un aspect particulier, la cellule comprenant une séquence d'acides nucléiques codant pour de la décorine selon l'invention ou un vecteur comprenant celle-ci est une cellule souche. Les cellules souches sont de préférence obtenues par différenciation de cellules souches pluripotentes, en particulier des cellules souches embryonnaires (ES) ou des cellules souches pluripotentes induites (iPS ou hiPSC) par exemple obtenue par dédifférenciation.

Les cellules souches embryonnaires peuvent être obtenues sans destruction de l'embryon dont elles sont issues, par exemple à l'aide de la technique décrite par Chung et al. (Cell Stem Cell, 2008, 2(2): 113-117). Dans un mode de réalisation particulier, et pour des raisons légales ou éthiques, les cellules souches embryonnaires sont des cellules souches embryonnaires non humaines. Dans un autre mode de réalisation particulier, les cellules souches embryonnaires utilisées dans l'invention sont des cellules souches embryonnaires humaines, de préférence obtenues sans destruction de l'embryon dont elles sont issues. Les embryons utilisés sont de préférence des embryons surnuméraires obtenus dans le cadre d'un projet parental après obtention des autorisations réglementaires et éthiques conformes aux lois en vigueur.

Un avantage de l’utilisation de cellules souches par rapport à des cellules d’îlots différenciées est que les cellules souches s'adaptent particulièrement à leur environnement grâce à leur capacité à se différencier in situ.

Alternativement, la cellule comprenant une séquence d'acides nucléiques codant pour de la décorine selon l'invention ou un vecteur comprenant celle-ci est un précurseur de cellules d’îlots pancréatiques, en particulier de cellules bêta d’îlots pancréatiques. Dans un autre mode de réalisation, cette cellule est une cellule du foie.

Dans un autre mode de réalisation, la cellule comprenant une séquence d'acides nucléiques codant pour de la décorine selon l'invention ou un vecteur comprenant celle-ci est une cellule neuroendocrine, telles que celles que l’on trouve dans les glandes pituitaires et adrénales. En effet, ces cellules possèdent la machinerie sécrétoire nécessaire pour une sécrétion régulée d’hormones polypeptidiques.

Compositions pharmaceutiques et médicament

Selon un aspect de l'invention, la décorine, un variant ou un fragment de celle-ci, une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine, un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, ou une cellule comprenant la séquence d'acides nucléiques ou le vecteur, est comprise dans une composition pharmaceutique. Typiquement, la composition pharmaceutique comprend la décorine, une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine, un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, ou une cellule comprenant la séquence d'acides nucléiques ou le vecteur, et un support pharmaceutiquement acceptable.

La composition selon l'invention peut être une composition pharmaceutique destinée à un usage en médecine humaine ou un usage vétérinaire. L'invention concerne également une composition pharmaceutique comprenant de la décorine, d'une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine, d'un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, ou d'une cellule comprenant la séquence d'acides nucléiques ou le vecteur, pour son utilisation dans le traitement du diabète, en particulier dans le traitement du diabète de type 1, du diabète de type 2 ou du diabète gestationnel, ainsi que dans le traitement d'au moins une complication du diabète.

Selon un aspect, l'invention concerne également l'utilisation de la décorine, d'une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine, d'un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, ou d'une cellule comprenant la séquence d'acides nucléiques ou le vecteur, pour la préparation d'une composition pharmaceutique destinée à être utilisée comme médicament, en particulier comme médicament antidiabétique ou comme médicament anti-inflammatoire.

L'invention concerne également une composition pharmaceutique telle que décrite ci-dessus pour son utilisation en tant que médicament dans le traitement du diabète ou d'une complication du diabète. En particulier, l'invention concerne une composition pharmaceutique pour son utilisation en tant que médicament dans le traitement du diabète de type 1 ou d'une complication de celui-ci. Alternativement, l'invention concerne une composition pharmaceutique pour son utilisation en tant que médicament dans le traitement du diabète de type 2 ou d'une complication de celui-ci. Selon un mode de réalisation particulier, le médicament est destiné à être administré avant, pendant et/ou à la suite d’une transplantation de cellules d'îlots pancréatiques. Alternativement, l'invention concerne une composition pharmaceutique comprenant de la décorine pour son utilisation en tant que médicament dans le traitement du diabète gestationnel ou d'une complication de celui-ci.

Selon un aspect, la présente invention concerne une composition pharmaceutique comprenant de la décorine en tant que substance active principale, c'est-à-dire que la décorine est la substance de la composition qui a l'activité et/ou l'effet recherché. Notamment, la décorine est une substance active de la composition pharmaceutique par son activité sur les cellules des îlots pancréatiques, en particulier sur la synthèse et sécrétion d'insuline, sur la survie des cellules et/ou sur l'amélioration de la vascularisation des îlots pancréatiques.

Dans un mode de réalisation, la composition pharmaceutique peut, en outre, contenir au moins un principe actif pharmaceutique supplémentaire ou être destinée à être utilisée en combinaison avec au moins un principe actif supplémentaire. On entend par « principe actif pharmaceutique», tout composé ou substance dont l’administration a un effet thérapeutique ou un effet bénéfique à la santé ou condition générale d’un patient ou d’un sujet auquel il est administré. Des exemples de principes actifs pharmaceutiques qui peuvent être présents dans une composition pharmaceutique de la présente invention ou utilisés en combinaison avec cette composition pharmaceutique incluent, sans limitation, des anti-inflammatoires, des agents immunosuppressifs, des agents antidiabétiques, des antibiotiques, des agents antipyrétiques, des agents antiémétiques, des agents antihistaminiques, des vitamines, des agents antispasmodiques, des agents antiulcéreux ou des combinaisons de ceux-ci. Le médicament selon l'invention peut ainsi être administré en association avec un autre médicament, tel qu’un agent anti inflammatoire, un agent immunosuppressif, un agent antibiotique, un agent antipyrétique, un agent antihistaminique, des vitamines, un agent antispasmodique ou un agent antiulcéreux.

Plus particulièrement, la décorine, une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine, un vecteur comprenant cette molécule d'acides nucléiques, ou une cellule comprenant la séquence d'acides nucléiques ou le vecteur, ou la composition pharmaceutique le/la comprenant peut être utilisée en combinaison avec un ou plusieurs traitements ou médicaments utilisés pour le traitement du diabète, en particulier un principe actif antidiabétique. Ainsi, la composition peut comprendre en outre un principe actif antidiabétique. La présente invention concerne donc une composition pharmaceutique comprenant de la décorine, une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine, un vecteur comprenant cette molécule d'acides nucléiques, ou une cellule comprenant la séquence d'acides nucléiques ou le vecteur, et un principe actif antidiabétique. En particulier, la présente invention concerne donc une composition pharmaceutique comprenant de la décorine et un principe actif antidiabétique.

De manière alternative, la composition peut être destinée à être utilisée pour le traitement du diabète en combinaison avec un tel principe actif. La présente invention concerne donc un kit comprenant la décorine et un principe actif antidiabétique pour une utilisation simultanée, séparée ou séquentielle, notamment dans le traitement du diabète.

Par exemple, le principe actif antidiabétique peut être choisi dans la liste non-exhaustive suivante : insuline, metformine, des sulfonylurées comme le tolbutamide, l'acétohexamide, le tolazamide, le chlorpropamide, le glibenclamide, le glimépiride, le glipizide, le glicazide, le glycopyramide et le gliquidone, des inhibiteurs d'alpha-glucosidase comme l'acarbose, le miglitol et le voglibose, des thiazolidinediones comme le pioglitazone et le rosiglitazone, des méglitinides comme le répaglinide et le natéglinide, un incrétino-mimétique, un analogue du glucagon-like peptide comme l'exénatide ou ses dérivés, le taspoglutide, le liraglutide, le semaglutide, un inhibiteur de la dipeptidyl peptidase-4 comme le vildagliptine, le sitagliptine, le saxagliptine, le linagliptine, l'allogliptine, et le septagliptine, un analogue de l'amyline comme le pamlintide, un inhibiteur du transporteur de sodium glucose comme l'empaglifozine, la dapaglifozine, la canamycine, ou une combinaison de ceux-ci.

En outre, la présente invention concerne également de la décorine ou une composition pharmaceutique pour une utilisation dans le traitement du diabète dans le cadre d'une transplantation de cellules d'ilots pancréatiques. Ainsi, ceci concerne des sujets receveurs, c'est-à-dire greffés ou susceptibles d'être greffés avec des cellules d’îlots pancréatiques. Dans ce mode de réalisation particulier, la décorine ou la composition selon l'invention peut être combinée avec des agents conventionnels utilisés pour favoriser la prise de la greffe des cellules des îlots pancréatiques, notamment des molécules induisant une immunosuppression ou une réduction de l'inflammation.

Ces médicaments ou compositions comprennent notamment des compositions immunosuppressives et/ou des compositions anti-inflammatoires. Ces compositions comprennent en outre de la thymoglobuline pour favoriser l'induction, des anti-TNFa pour contrôler la réaction inflammatoire précoce, de la rapamune en début de greffe pour bénéficier de son rôle anti-macrophagique, des inhibiteurs des calcineurines ou des combinaisons de ceux-ci. Une combinaison particulière comprend une combinaison de thymoglobuline et de rituximab. Ces compositions peuvent également comprendre différents agents dépléteurs de lymphocyte T.

Ainsi, selon un aspect particulier, l'invention concerne de la décorine ou une composition pharmaceutique comprenant de la décorine pour son utilisation comme adjuvant d'une thérapie immunosuppressive ou d'un traitement anti-inflammatoire concomitant ou suivant la transplantation de cellules d'ilots pancréatique chez un patient receveur. L'utilisation de la décorine en tant qu'adjuvant permet d'augmenter la probabilité de la prise de la greffe des cellules d'ilots pancréatiques, de favoriser la vascularisation des cellules d'ilots pancréatiques et/ou de favoriser la sécrétion d'insuline par les cellules d'ilots pancréatiques transplantées.

Ainsi, la composition pharmaceutique selon l'invention est destinée à être administrée à un patient receveur, notamment dans le but de faciliter la prise de la greffe des cellules d'îlots pancréatiques, de favoriser la vascularisation des cellules d'ilots pancréatiques et/ou de favoriser la sécrétion d'insuline par les cellules d'ilots pancréatiques transplantées. En particulier, la décorine est utilisée dans le but de diminuer l'occurrence et/ou la fréquence d'apoptose chez les cellules d'ilots pancréatique qui sont destinées à être transplantées ou ont été transplantées chez le receveur.

La décorine ou la composition pharmaceutique pourra être administrée au sujet susceptible d'être greffé avec des cellules d'îlots pancréatiques avant la greffe et/ou au sujet ayant reçu une greffe de cellules d'îlots pancréatiques de manière concomitante à la greffe et/ou après la greffe.

Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, la présente invention est relative à une méthode de traitement d'un patient ayant reçu une greffe de cellules d'îlots pancréatiques, comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace de décorine, de manière à augmenter la sécrétion d'insuline par les cellules d'ilots pancréatiques transplantées et/ou d'augmenter la viabilité des cellules d'ilots pancréatiques transplantée ou d'en diminuer l'apoptose. Plus précisément, la méthode de traitement d'un sujet diabétique comprend la greffe de cellules d’îlots pancréatiques chez le patient et l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace de décorine, de manière à augmenter la sécrétion d'insuline par les cellules d'ilots pancréatiques transplantées et/ou d'augmenter la viabilité des cellules d'ilots pancréatiques transplantée ou d'en diminuer l'apoptose. Dans un mode de réalisation tout particulier, la méthode de traitement d'un sujet diabétique comprend la mise en contact des cellules d’îlots pancréatiques destinées à être greffées chez le patient avec de la décorine, la greffe des cellules d’îlots pancréatiques traités chez le patient et l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace de décorine, de manière à augmenter la sécrétion d'insuline par les cellules d'ilots pancréatiques transplantées et/ou d'augmenter la viabilité des cellules d'ilots pancréatiques transplantée ou d'en diminuer l'apoptose.

Alternativement ou parallèlement, la composition pharmaceutique est destinée à être administrée à un patient donneur, notamment dans le but de préserver la viabilité des îlots pancréatiques qui sont destinés à être prélevés, c'est-à-dire pour diminuer l'occurrence et/ou la fréquence d'apoptose chez les cellules d'ilots pancréatique qui sont prélevé chez le donneur.

Formulation de la composition pharmaceutique

La formulation d’une composition selon la présente invention peut varier en fonction de la voie d’administration et du dosage pour lesquels la composition est destinée à être utilisée. La composition selon l'invention peut notamment être sous forme solide, semi-solide ou liquide. Après formulation avec au moins un véhicule ou excipient physiologiquement acceptable, une composition selon l’invention peut être sous toute forme appropriée pour l’administration à un mammifère, en particulier l’homme, par exemple sous la forme de tablettes, comprimés, pastilles, dragées, capsules, gélules, pilules, granulats, poudre, suspensions, émulsions, sirops, onguents, ampoule de liquide, flacon muni d’un compte-goutte et autres formes analogues de préparations liquides ou en poudres destinées à être prises en unités mesurées de faible quantité, solutions injectables ou suppositoires.

L’homme de l’art sait sélectionner les véhicules et excipients les plus appropriés à la préparation d’un type donné de formulation. Ainsi, par exemple, les excipients tels que l’eau, le 2,3-butanediol, la solution de Ringer, les solutions isotoniques de chlorure de sodium, les mono ou diglycérides synthétiques, et l’acide oléique sont souvent utilisés pour la formulation de préparations injectables. Des supports appropriés peuvent également être choisis parmi le carbonate de magnésium, le stéarate de magnésium, le talc, le sucre, le lactose, la pectine, la dextrine, l’amidon, la gélatine, la gomme adragante, la méthylcellulose, la carboxyméthylcellulose sodique, une cire à bas point de fusion et le beurre de cacao.

Les compositions solides peuvent être formulées en présence d’un excipient inerte comme le citrate de sodium, et éventuellement d’additifs tels que par exemple des agents liants, des agents humectants, des agents de désintégration, des accélérateurs d’absorption, des agents lubrifiants, etc. D’autres formes appropriées comprennent des préparations sous forme solide qui sont destinées à être transformées peu avant leur utilisation en préparations sous forme liquide.

Le véhicule physiologiquement acceptable peut être un liquide, et la composition selon l'invention est sous la forme d’une solution. Les véhicules liquides sont utilisés dans la préparation de solutions, de solvants, de milieux de dispersion, de suspensions, d'émulsions, de sirops, d'élixirs et de compositions sous pression. Les supports liquides ou à base de gel appropriés comprennent, sans s'y limiter: l'eau et les solutions salines physiologiques; les émulsions ou les suspensions, y compris les solutions salines et les milieux tamponnés, l'urée; des alcools (par exemple, méthanol, éthanol, propanol, butanol); des glycols (par exemple, l’éthylène glycol, le propylène glycol et similaires), des solvants non aqueux comme le propylène glycol, le polyéthylène glycol, des huiles végétales ou de graines telles que l’huile d’olive, et des esters organiques injectables tels que l’oléate d’éthyle. Généralement, les véhicules à base d’eau possèdent un pH neutre (par exemple, pH 7,0 ± 1,0 ou 0,5 unité de pH). Les compositions liquides, y compris par exemple les émulsions, microémulsions, solutions, suspensions, sirops, ou élixirs peuvent être formulés notamment en présence de solvants, d’agents solubilisants, d’émulsifiants, d’huiles, d’acides gras, et/ou d’autres additifs comme par exemple des agents de suspension, des conservateurs, des édulcorants, des arômes naturels ou synthétiques, des agents viscosifiants, des agents stabilisants et/ou épaississants et/ou des agents colorants de qualité alimentaire, qui doivent tous être compatibles avec le maintien de l'activité de la décorine.

Les émulsions peuvent être préparées dans des solutions aqueuses de propylène glycol ou peuvent contenir des agents émulsifiants tels que la lécithine, le monooléate de sorbitan ou l’acacia. Des agents épaississants bien connus peuvent également être ajoutés aux compositions telles que l’amidon de maïs, des gommes naturelles ou synthétiques, des résines, la méthylcellulose, la carboxyméthylcellulose sodique, la gomme de guar, la gomme de xanthane et analogues. Des conservateurs peuvent également être inclus dans la composition, y compris le méthylparabène, le propylparabène, l’alcool benzylique et les sels d’éthylène diamine tétra-acétate. Ces compositions peuvent également comprendre un plastifiant tel que le glycérol ou le polyéthylène glycol (par exemple, dans une gamme de masse moléculaire de MW = 800 à 20 000). La composition de l'excipient peut être modifiée aussi longtemps qu’elle n’interfère pas de manière significative avec l’activité pharmacologique de la décorine.

Sujet et régime d'administration

La décorine ou la composition pharmaceutique selon l’invention peuvent être employées à des fins de médecine humaine ou animale, le sujet considéré pouvant notamment être un mammifère, plus particulièrement tout sujet animal comme un animal de laboratoire (par exemple, primate non humain, rat, souris, hamster, cobaye), un animal de compagnie ou d'élevage (chiens, chats, chevaux, etc..), ou encore un humain. Le sujet peut souffrir du diabète, en particulier du diabète de type 1, du diabète de type 2 du diabète gestationnel ou être susceptible de développer un diabète. De préférence, le sujet a été diagnostiqué comme étant diabétique de type 1 ou de type 2. En particulier, le patient receveur été diagnostiqué comme étant diabétique de type 1 ou de type 2.

Alternativement, le sujet donneur des cellules d'ilots pancréatique n'est pas diabétique. De préférence, le donneur est un individu sain.

Lorsque le sujet donneur est un humain, le donneur remplit les exigences relatives au don d'organes connues de l'homme du métier. Par exemple, les caractéristiques qui permettent la proposition du pancréas pour greffe d'organe ou d'îlots par un donneur humain sont définies par un poids supérieur à 10 kg, un âge inférieur à 65 ans, l'absence d'antécédent de diabète, d'augmentation des transaminases hépatiques supérieure à 3 fois la normale et d'arrêt cardiaque.

Les compositions pharmaceutiques selon la présente invention peuvent être administrées en utilisant toute combinaison de dosage et de voie d’administration efficace pour obtenir l’effet thérapeutique désiré. La quantité exacte à administrer et la fréquence d'administration dépendront notamment du type de sujet, humain ou animal, en fonction de l’âge, du poids, de la condition générale du patient ou de l'animal, de la nature et de la gravité du diabète. La voie d’administration peut être choisie en fonction de la nature et de la gravité du diabète et/ou en fonction de l’âge et/ou de la santé du patient.

La composition selon l'invention peut être administrée de manière systémique, par voie orale, par inhalation ou par injection, par exemple par voie intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée, transdermique, intra-artérielle.

La composition selon l'invention peut être administrée en une ou plusieurs fois, c'est-à-dire sous la forme d'une dose unique ou de doses multiples. En particulier, la composition selon l'invention peut être administrée sous la forme de plusieurs doses.

Dans un mode de réalisation, la composition selon l'invention peut être administrée de manière chronique. De préférence, l’administration de la décorine, du médicament ou de la composition comprenant la décorine est à intervalles réguliers. De préférence, la composition est administrée au sujet à une fréquence comprise entre une dose par jour et une dose par semaine, en particulier une dose tous les 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 jours. Alternativement, la fréquence d'administration peut être de plusieurs doses par jour, par exemple 2, 3, 4 ou 5 doses par jour. Selon l'âge du sujet ou son état physiologique, les doses journalières peuvent être fractionnées pour faciliter l'administration, par exemple avec une administration le matin et une autre le soir. Traitement du diabète

La présente invention est relative à une méthode de traitement du diabète comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace de décorine ou d'une composition pharmaceutique comprenant de la décorine selon la présente invention, une séquence d'acides nucléiques codant pour celle-ci, un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, ou une cellule comprenant ladite séquence d'acides nucléiques ou ledit vecteur, à un sujet diabétique ou susceptible de développer un diabète.

En particulier, la présente invention concerne une méthode de traitement du diabète comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace de décorine ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention et la transplantation de cellules d'ilots de Langerhans à un sujet diabétique. Les cellules de cellules d'ilots de Langerhans sont transplantées en utilisant la procédure habituelle dans le domaine. Notamment, elles sont transplantées dans le foie du patient receveur, où elles vont s'implanter par voie intraportale.

Les méthodes de traitement selon l'invention impliquent généralement l’administration à un individu qui en a besoin d’une quantité efficace de décorine, d’une formulation ou composition pharmaceutique selon l'invention, soit afin de limiter ou retarder le diabète et ses symptômes et/ou de limiter ou retarder l'apparition des complications du diabète, soit pour réduire l'inflammation, soit pour favoriser la prise de la greffe d'ilots pancréatiques.

Les méthodes de traitement du diabète comprennent des méthodes de traitement d’individus chez lesquels on a diagnostiqué un diabète, des méthodes de réduction du risque de complications du diabète chez un individu chez qui on a diagnostiqué du diabète et qui ont été soignés par des traitements conventionnels, en particulier des individus ayant subi ou étant susceptibles de subir une transplantation de cellules d'ilots pancréatiques.

En particulier, la quantité thérapeutiquement efficace ou suffisante de décorine ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention, est une quantité permettant d'obtenir l'effet recherché, à savoir un effet favorisant l'augmentation de la sécrétion d'insuline par des îlots pancréatiques et/ou un effet diminuant l'inflammation et/ou un effet favorisant la viabilité des cellules des îlots pancréatiques, en particulier celle des îlots pancréatiques transplantés et/ou leur vascularisation.

Notamment, la quantité thérapeutiquement efficace ou suffisante de décorine ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention, peut être une quantité permettant d'augmenter la durée d'insulino- indépendance d'un patient diabétique, en particulier celle d'un patient receveur ayant subi une transplantation de cellules d'ilots pancréatiques. De préférence, la quantité thérapeutiquement efficace ou suffisante de décorine ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention, est une quantité permettant de retarder l'apparition de complications du diabète chez un patient diabétique, en particulier celle d'un patient receveur ayant subi une transplantation de cellules d'ilots pancréatiques.

Dans une méthode de traitement du diabète, une "quantité thérapeutiquement efficace" de décorine ou d'une composition selon l'invention est une quantité qui réduit la sévérité d’un symptôme et/ou réduit un paramètre mesurable associé au diabète d’au moins environ 10%, au moins environ 20%, au moins environ 25%, au moins environ 30%, au moins environ 40%, au moins environ 50%, au moins environ 60%, au moins environ 70%, au moins environ 80%, ou au moins environ 90% ou plus, en comparaison avec le symptôme (par exemple, la sévérité du symptôme), ou en comparaison avec le paramètre mesurable associé au diabète, en l’absence de traitement du sujet. De préférence, le paramètre mesurable est la glycémie.

Dans une autre méthode de traitement du diabète, une "quantité thérapeutiquement efficace" de décorine ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention est une quantité qui réduit l'inflammation d’au moins environ 10%, au moins environ 20%, au moins environ 25%, au moins environ 30%, au moins environ 40%, au moins environ 50%, au moins environ 60%, au moins environ 70%, au moins environ 80%, ou au moins environ 90% ou plus, en comparaison avec le symptôme (par exemple, la sévérité du symptôme), ou en comparaison avec la condition inflammatoire d'un patient diabétique n'ayant pas été traité avec de la décorine ou par une composition pharmaceutique la comprenant.

Dans une autre méthode de traitement du diabète, une "quantité thérapeutiquement efficace" de décorine ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention est une quantité qui augmente la viabilité des cellules des îlots pancréatiques d’au moins environ 10%, au moins environ 20%, au moins environ 25%, au moins environ 30%, au moins environ 40%, au moins environ 50%, au moins environ 60%, au moins environ 70%, au moins environ 80%, ou au moins environ 90% ou plus, en comparaison avec la viabilité des cellules des îlots pancréatiques en l’absence de traitement du sujet par de la décorine ou par une composition pharmaceutique selon l'invention.

Dans une autre méthode de traitement du diabète, une "quantité thérapeutiquement efficace" de décorine ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention est une quantité qui augmente la vascularisation des cellules des îlots pancréatiques d’au moins environ 10%, au moins environ 20%, au moins environ 25%, au moins environ 30%, au moins environ 40%, au moins environ 50%, au moins environ 60%, au moins environ 70%, au moins environ 80%, ou au moins environ 90% ou plus, en comparaison avec la vascularisation des cellules des îlots pancréatiques en l'absence de traitement du sujet par de la décorine ou par une composition pharmaceutique selon l'invention. La présente invention peut être utilisée dans des circonstances où l'on souhaite améliorer la viabilité des cellules des îlots pancréatiques indépendamment de la condition diabétique sous-jacente. Un avantage de la présente invention est qu'elle peut être utilisée pour favoriser la viabilité et/ou la vascularisation des cellules d'ilots pancréatique, par administration de la décorine, d’une composition pharmaceutique ou d’un médicament comprenant la décorine, une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine, un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, ou une cellule comprenant ladite séquence d'acides nucléiques ou ledit vecteur, avant, pendant et/ou après la transplantation des cellules d'ilots pancréatique.

Selon un aspect, l'invention concerne une méthode pour augmenter la qualité et/ou la durée de survie de cellules d’îlots pancréatiques, comprenant l’administration à un sujet donneur et/ou receveur d’une composition pharmaceutique selon l'invention, de telle sorte que la qualité et/ou la durée de survie du greffon soit augmentée. De préférence, le greffon correspond aux cellules d'ilots pancréatiques avant et/ou après purification.

Ainsi, l'invention concerne également l'utilisation de la décorine pour favoriser la revascularisation des îlots pancréatiques après transplantation chez un patient receveur.

Particulièrement, la présente invention concerne la décorine, une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine, un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, ou une cellule comprenant ladite séquence d'acides nucléiques ou ledit vecteur, pour la préparation d'un médicament ou d'une composition destinée au traitement du diabète, notamment dans le cadre d'une transplantation de cellules d'ilots pancréatiques chez l'homme. Elle concerne également une méthode permettant de favoriser la prise de la greffe des cellules d'ilots pancréatiques chez un patient, la méthode comprenant l'administration d'une quantité thérapeutiquement efficace de la décorine ou d'une composition pharmaceutique selon l'invention et la transplantation des cellules d'ilots pancréatiques.

Dans un mode de réalisation, le patient donneur est traité par de la décorine, une composition pharmaceutique ou un médicament comprenant la décorine, une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine, un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, avant le prélèvement des îlots pancréatiques.

Dans un mode de réalisation, le patient receveur est traité par de la décorine, une composition pharmaceutique ou un médicament comprenant la décorine, une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine, un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, ou une cellule comprenant ladite séquence d'acides nucléiques ou ledit vecteur, avant, pendant et/ou après la transplantation des îlots pancréatiques. L'administration de décorine ou d'une composition selon l'invention au patient receveur peut ainsi avoir lieu avant, pendant et/ou après que le patient receveur ait subi la transplantation des cellules des îlots pancréatiques. Ainsi, selon un aspect particulier, le patient receveur peut se voir administrer de la décorine ou une composition pharmaceutique selon l'invention en combinaison avec des cellules d'ilots pancréatiques. De préférence, ces cellules d'ilots pancréatiques proviennent d'un individu donneur ayant été traité avec de la décorine, une composition pharmaceutique ou un médicament comprenant la décorine, une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine ou un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, avant le prélèvement des îlots pancréatiques. Alternativement ou additionnement, les cellules d'ilots pancréatiques peuvent avoir été cultivées dans un milieu comprenant de la décorine avant leur transplantation chez le patient receveur.

L'invention concerne également l'administration ou la transplantation de cellules d'ilots pancréatiques ayant été mis en contact avec de la décorine ou avec une composition comprenant de la décorine, une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine ou un vecteur comprenant cette séquence d'acides nucléiques, chez un patient receveur, de préférence un patient souffrant de diabète, en particulier un diabète de type 1.

L’invention concerne également des procédés de thérapie génique destinés au traitement du diabète, permettant l'introduction d'une séquence d’acides nucléiques codant pour de la décorine selon la présente invention, afin d'induire la sécrétion de la décorine dans la circulation sanguine et/ou au niveau d'un tissus ou d'un organe, de préférence le pancréas et/ou le foie.

La thérapie génique consiste à corriger une déficience ou une anomalie (par exemple une mutation, expression aberrante) ou à assurer l’expression d’une protéine d’intérêt par introduction de sa séquence en acides nucléiques dans la cellule ou l’organe affecté. Cette séquence en acides nucléiques peut être introduite soit ex vivo dans une cellule extraite d'un individu, la cellule étant alors introduite dans l'organe ou le tissu cible de l'individu après sa transformation, soit directement in vivo dans les cellules du tissu ou l'organe approprié.

En particulier, des cellules sont issues d’un sujet diabétique ou d'un sujet donneur et soumises à une manipulation génétique pour y transférer une séquence codant pour la décorine ou pour un variant de celle-ci ou un vecteur comprenant cette séquence. De préférence, ces cellules sont des cellules eucaryotes, en particulier des cellules humaines choisies parmi des cellules souches, des cellules endocrines, des cellules d'ilots pancréatiques ou des cellules du foie. De manière préférée, les cellules sont des cellules d'ilots pancréatiques, en particulier des cellules bêta.

Ainsi, selon un aspect particulier, l'invention concerne une thérapie génique de cellules d'ilots pancréatiques ex vivo. Dans ce contexte, le transfert dans les cellules de la séquence nucléique codant pour la décorine ou du vecteur la comprenant, peut être réalisée par électroporation, par biolistique ou par liposomes, ces méthodes pouvant être optimisées pour la transfection de cellules d'ilots pancréatiques (Levine et al., Diabètes Metab. Rev. 13:209-246 (1997)). Dans un mode de réalisation particulier, le système CRISPR /Cas peut être utilisé pour modifier les cellules cibles. Le transfert dans les cellules peut également être réalisé avec des vecteurs viraux, de préférence des vecteurs ayant un tropisme pour les cellules cibles, par exemple celles des îlots pancréatiques ou des cellules hépatiques.

Selon un aspect particulier, l'invention concerne une méthode de traitement du diabète chez un sujet diabétique comprenant les étapes consistant à : a) fournir une ou plusieurs cellules d'ilots pancréatiques, de préférence des cellules d'ilots pancréatiques purifiées, b) l'introduction dans les cellules d'une séquence d’acide nucléique codant pour la décorine ou d'un vecteur comprenant ladite séquence, c) la transplantation des cellules modifiées de l'étape b) chez le sujet diabétique receveur en quantités suffisantes pour favoriser la survie des cellules d'ilots pancréatiques greffés, pour favoriser la production d'insuline par ces cellules et/ou traiter le diabète chez l’individu.

En particulier, les cellules d'ilots pancréatiques peuvent être issues d'un patient donneur ou du patient receveur lui-même. Ainsi, les cellules d'ilots pancréatiques transformées comprenant une séquence d'acides nucléique codant pour la décorine ou un variant de celle-ci peuvent provenir de différents patients ou d'un même patient.

De préférence, l’augmentation de la survie des cellules transformées avec la séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine ou un variant de celle-ci qui sont transplantées chez le receveur est d’au moins 20 %, 50 % ou 75 %, par rapport à des cellules n'ayant pas été transformées avec une séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine. Des comparaisons dans le taux de survie de cellules peuvent être effectuées à tout moment après une transplantation, par exemple, une semaine, un mois, trois mois, six mois, un an, cinq ans, etc.

Dans certains modes de réalisation, les cellules transformées avec la séquence d'acides nucléiques codant pour la décorine ou un variant de celle-ci favorisent la production d’insuline en quantités suffisantes pour traiter le diabète chez le receveur pendant plus d’une semaine, de préférence trois mois, de manière plus souhaitable un an; et idéalement pour la vie entière du sujet receveur de ces cellules.

Les diabètes et les complications ciblées par l'invention

Le diabète se caractérise par un taux de sucre dans le sang à jeun supérieur ou égal à 1,26 g/l, vérifié à deux reprises. Il existe plusieurs tests pour détecter ou surveiller un diabète. Le diagnostic du diabète est basé sur la clinique, la présence d'une hyperglycémie, et l'interrogatoire du patient. L'examen de référence pratiqué en laboratoire d'analyses médicales est une prise de sang mesurant la glycémie ou le taux de sucre sanguin, qui varie selon les apports alimentaires. L'examen de la glycosurie, qui consiste à rechercher l'albumine et le sucre dans les urines, est également utile pour détecter un diabète.

Le diabète de type 1 survient chez des patients jeunes et sans surpoids. La présence d'un autre cas de diabète de type 1 dans la famille (dans 1 cas sur 10) ou d'une autre maladie auto-immune associée (dans 1 cas sur 10) renforce le diagnostic. Le diabète de type 1 est généralement accompagné d'un syndrome cardinal et d'une cétonurie.

Le diabète de type 2 survient chez des patients généralement de plus de 40 ans, en surpoids à prédominance abdominal. La présence d'antécédents familiaux de diabète de type 2, l'existence d'une HTA, d'une hypertriglycéridémie, d'une hypertension artérielle et d'une hypo HDL-cholestérolémie sont fréquemment associés à l'hyperglycémie dans le diabète de type 2 et renforcent le diagnostic.

Le diabète gestationnel survient chez des femmes enceintes. La grossesse est par nature diabétogène car il existe physiologiquement pendant cette période un état d'insulinorésistance qui peut s'aggraver progressivement au cours de la grossesse. Le diabète gestationnel peut être asymptomatique ou présenter des symptômes similaires à ceux des autres types de diabète. Un premier test de glycémie à jeun au premier trimestre de la grosses est recommandé pour détecter un diabète antérieur à la grossesse qui est passé inaperçu. Un second test appelé HGPO (Hyperglycémie provoquée par voir orale) est réalisé entre la 24e et la 28e semaine d'aménorrhée à 75g de glucose. Une valeur de glycémie supérieure aux seuils définis (0,92g/L à jeun ; ou l,80g/L lh après la charge orale en glucose ; ou l,53g/L 2h après) suffit à diagnostiquer un diabète gestationnel. Dans ce cas, le diabète gestationnel doit être surveillé et traité car il comporte un risque pour la mère (accouchement prématuré, risque de développer un diabète de type II post accouchement) comme pour l'enfant (détresse respiratoire, hypoglycémie néonatale, risque de développer un diabète de type II).

L'invention concerne également de la décorine ou une composition pharmaceutique selon l'invention pour une utilisation en vue de prévenir et/ou retarder l’apparition et/ou limiter la progression d’au moins une des complications du diabète. Les complications concernent notamment les complications aigues telles que l'acidocétose diabétique, le coma hyperosmolaire, l'hypoglycémie sévère, la rétinopathie, la néphropathie, l'insuffisance rénale, les maladies cardiovasculaires, en particulier la coronaropathie, l'artériopathie oblitérante des membres inférieurs, les AVC/AIT ou autres atteintes vasculaires artérielles périphériques en lien avec l'athérosclérose, les infections de la bouches, les ulcères du pied, les infections ou le mal perforant plantaire. L'invention concerne également de la décorine ou une composition comprenant de la décorine pour une utilisation en vue d'améliorer les facteurs d'aggravation du diabète ou les comorbidités associées, notamment l'hypertension, la résistance à l'insuline, l'obésité, le surpoids, l'hyperlipidémie ou la dépression.

De préférence, l'invention concerne également de la décorine ou une composition pharmaceutique selon l'invention pour une utilisation dans le traitement d'une complication du diabète choisie dans le groupe constitué par l'acidocétose diabétique, le coma hyperosmolaire, l'hypoglycémie sévère, la néphropathie, l'insuffisance rénale, les maladies cardiovasculaires, en particulier la coronaropathie, l'artériopathie oblitérante des membres inférieurs, les AVC/AIT ou autres atteintes vasculaires artérielles périphériques en lien avec l'athérosclérose, les infections de la bouches, les ulcères du pied, les infections ou le mal perforant plantaire. L'invention concerne également de la décorine ou une composition comprenant de la décorine pour une utilisation en vue d'améliorer les facteurs d'aggravation du diabète ou les comorbidités associées, notamment l'hypertension, la résistance à l'insuline, l'obésité, le surpoids, l'hyperlipidémie ou la dépression.

L'invention concerne également de la décorine ou une composition comprenant de la décorine pour une utilisation en vue d'améliorer l'équilibre glycémique global, notamment la diminution des hypoglycémies et des hyperglycémies, l'amélioration de l'HbAlc et des autres paramètres d'évaluation de l'équilibre glycémique (TIR par exemple).

Préservation des îlots pancréatiques

L'invention concerne également la préparation et l'utilisation d'un milieu de culture, de préservation ou de transformation des cellules d'ilots pancréatiques, le milieu comprenant de la décorine. La décorine est présente dans ce milieu en tant que substance active, c'est-à-dire ayant un effet sur les cellules d'ilots pancréatiques, notamment sur leur survie, qualité et leur capacité à sécréter de l'insuline, et/ou ayant un effet sur la diminution de l'inflammation.

L’isolation et la purification d’îlots pancréatiques humains nécessitent un processus en plusieurs étapes de 5 à 7 h pour extraire et purifier la fraction d’îlots pancréatiques qui sera transplantée au patient receveur. Une digestion enzymatique, un cisaillement mécanique doux, une purification et une culture contrôlés sont l'approche établie pour la préparation d'un produit final enrichi en cellules d'îlots.

La préparation finale des îlots avant leur implantation consiste en leur incubation dans un milieu de culture pendant 24 à 72 heures, afin de permettre le contrôle de la qualité de l’évaluation de la libération du produit, ainsi que le lancement du traitement immunosuppresseur chez le receveur avant la greffe. Cette période de culture d'îlots permet de minimiser le nombre de cellules mortes ou apoptotiques et de leurs sous-produits, qui une fois transplantés pourraient déclencher et/ou augmenter l'inflammation, exposant les îlots nouvellement transplantés à des cytokines nocives.

La capacité de la décorine de préserver la viabilité des cellules d'îlots pancréatiques en culture permet de les expédier vers des centres de transplantation cliniques distants et permet également de concentrer les compétences en matière d'isolation et de purification des îlots dans les installations régionales de traitement des cellules humaines, réduisant ainsi les coûts associés au traitement des pancréas et du repiquage de cellules d'îlots.

Ainsi, selon un aspect particulier, l'invention concerne un milieu de culture, de préservation ou de transformation des cellules d'ilots pancréatiques comprenant ou consistant essentiellement en de la décorine, l'utilisation de la décorine pour préparer des cellules d'ilots pancréatiques destinées à être transplantées chez un patient diabétique, une méthode de préparation de cellules d'ilots pancréatiques destinées à être transplantées chez un patient diabétique ainsi qu'un greffon comprenant des cellules d'ilots pancréatiques préparé par cette méthode ou comprenant de la décorine. En particulier, le milieu de culture, de préservation ou de transformation des cellules d'ilots pancréatiques ne comprend pas de collagène.

La méthode de préparation de cellules d'ilots pancréatiques destinées à être transplantées chez un patient diabétique comprenant la mise en contact ex vivo de cellules d'ilots pancréatiques avec le milieu ou la composition comprenant de la décorine. Ainsi, la méthode comprend les étapes de fournir des cellules des îlots pancréatiques et de mettre en contact lesdites cellules avec de la décorine. Dans un premier aspect, les cellules des îlots pancréatiques ont été obtenues par prélèvement chez le sujet donneur. Les cellules peuvent être mises en contact avec la décorine directement après leur prélèvement du donneur, une fois purifiées, ou à la fois au moment du prélèvement et de la purification des cellules. Dans un autre aspect, les cellules des îlots pancréatiques ont été préparées à partir de cellules souches, notamment en induisant leur différentiation en cellules des îlots pancréatiques.

Selon un aspect, l'invention concerne un procédé pour maintenir ou augmenter la viabilité de cellules d’îlots pancréatiques ex vivo, comprenant une étape consistant à mettre en présence des cellules d’îlots pancréatiques avec de la décorine en tant que substance active.

L'invention concerne également l'utilisation de la décorine pour préserver ou augmenter la viabilité des cellules d’îlots pancréatiques ex vivo.

En particulier, l'invention concerne un procédé ex vivo de préparation de cellules d'ilots pancréatiques destinées à être transplantées chez un patient diabétique, ledit procédé comprenant :

- la fourniture de cellules d'ilots pancréatiques,

- facultativement, la mise en contact des cellules d'ilots pancréatiques avec de la décorine,

- la purification des cellules d'ilots pancréatiques, éventuellement en présence de décorine ; et

- la culture des cellules d'ilots pancréatiques, de préférence dans un milieu comprenant de la décorine, le procédé comprenant au moins une étape qui est réalisée en présence de décorine.

Dans un mode de réalisation particulier, toutes les étapes sont réalisées en présence de décorine. Notamment, la décorine est utilisée en prétraitement chez le sujet donneur, au court du prélèvement d'ilots chez le donneur, en culture d'ilots pancréatiques in vitro avant la transplantation, en prétraitement chez le sujet receveur, en traitement post-greffe chez le receveur et/ou tout a long de la vie de la greffe chez le sujet receveur. Par ailleurs, l'invention concerne une composition ou un greffon comprenant de la décorine et des cellules d'ilots pancréatiques. Les cellules d'ilots pancréatiques peuvent avoir été préparées par la méthode ci- dessus détaillée ou avoir été préparées par la méthode actuellement classiquement mise en oeuvre pour la préparation de greffon de cellules d'ilots pancréatiques. Optionnellement, ces cellules peuvent avoir été transformées avec une séquence d'acides nucléiques codant pour de la décorine selon l'invention ou avec un vecteur comprenant cette séquence, en particulier après leur purification selon la méthode décrite ci-dessus.

Ainsi l'invention concerne également un procédé de traitement du diabète chez un sujet diabétique, ledit procédé comprenant la transplantation d'une composition comprenant des cellules d’îlots pancréatiques purifiées et un milieu comprenant de la décorine chez un sujet receveur, de préférence un sujet receveur diabétique.

En particulier, l'invention concerne également un procédé de traitement du diabète chez un sujet diabétique, ledit procédé comprenant :

- le prélèvement d'ilots pancréatiques chez un patient donneur,

- facultativement, la mise en contact des îlots pancréatiques prélevés avec de la décorine,

- la purification des cellules d'ilots pancréatiques, éventuellement en présence de décorine ;

- facultativement, la transformation des cellules d'ilots pancréatiques avec une séquence d'acides nucléiques codant pour de la décorine selon l'invention ou avec un vecteur comprenant cette séquence,

- la culture des cellules d'ilots pancréatiques, de préférence dans un milieu comprenant de la décorine, et

- la transplantation chez un sujet receveur de la composition comprenant des cellules d’îlots pancréatiques purifiées et facultativement de la décorine,

le procédé comprenant au moins une étape réalisée en présence de décorine.

Dans un mode de réalisation particulier, toutes les étapes sont réalisées en présence de décorine. Notamment, la décorine est utilisée en prétraitement chez le sujet donneur, au court du prélèvement d'ilots chez le donneur, en culture d'ilots pancréatiques in vitro avant la transplantation, en prétraitement chez le sujet receveur, en traitement post-greffe chez le receveur et/ou tout a long de la vie de la greffe chez le sujet receveur.

Selon un autre aspect, l'invention concerne un procédé pour favoriser la production d’insuline chez un sujet diabétique, ledit procédé comprenant la transplantation d'une composition ou un greffon comprenant des cellules d’îlots pancréatiques et de la décorine.

Selon un autre aspect, l'invention concerne une méthode pour augmenter la durée d'insulino- indépendance d'un patient, pour diminuer les risques d'hypoglycémie ou d'hyperglycémie, et/ou pour augmenter la stabilisation de la glycémie, ladite méthode comprenant la transplantation d'une composition ou un greffon comprenant des cellules d'ilots pancréatiques et de la décorine. L'invention concerne de la décorine pour son utilisation pour préserver, augmenter et/ou maintenir la viabilité des cellules des îlots pancréatiques et/ou augmenter la sécrétion d'insuline par les cellules des îlots pancréatiques et/ou diminuer l'inflammation. En particulier, les cellules des îlots pancréatiques sont présentes dans un greffon ou dans une composition destinée à être transplantée. La décorine est en particulier pour agir sur les cellules des îlots pancréatiques entre le moment du prélèvement des îlots chez le patient donneur et leur transplantation chez le patient receveur. Plus spécifiquement, elle peut être utilisée pour agir sur les cellules des îlots pancréatiques entre le moment du prélèvement des îlots chez le patient donneur et le moment de la purification des îlots, et/ou entre le moment de la purification des cellules des îlots pancréatiques et le moment de leur transplantation chez un patient receveur.

EXEMPLES

Les figures et exemples suivants sont présentés de manière à fournir à l’homme du métier une divulgation et une description complètes de la manière de réaliser et d’utiliser la présente invention. Ils et ne sont pas destinés à limiter la portée de ce que les inventeurs considèrent comme leur invention et ne représente pas forcément toutes les expériences effectuées. Bien que la présente invention ait été décrite en se référant à ses modes de réalisation spécifiques, l’homme du métier comprendra que divers changements peuvent être apportés et que des équivalents peuvent être substitués sans s'écarter de l'esprit et de la portée véritables de l'invention. De nombreuses modifications peuvent être apportées pour adapter une situation, une composition, une méthode, une ou plusieurs étapes d'une méthode, à l’objectif, à l’esprit et au cadre de la présente invention. Toutes ces modifications éventuelles entrent dans le cadre des revendications annexées.

Dans le cadre de l'invention, une étude protéomique a permis d'identifier les facteurs/myokines sécrétés par le muscle. Cette étude a permis d'étudier les mécanismes moléculaires précis à l'origine des effets induits par certaines myokines en situation « contrôle » et après induction de l'insulinorésistance voire du diabète chez l'animal. Cette étude protéomique a révélé une myokine qui a attiré toute l'attention des inventeurs : la décorine.

1.1. Effets de la décorine sur l'apoptose et la prolifération des cellules des îlots pancréatiques

Dans un premier temps, les effets de la décorine sur la survie des îlots pancréatiques ont été évalués, en particulier en lien avec l'apoptose. Pour déterminer l'effet de la décorine sur l'apoptose des cellules, la méthode TUNEL a été utilisée. Cette méthode permet de marquer de manière fluorescente les cellules dont l'ADN est fragmenté et qui sont donc en apoptose. Le noyau des cellules a également été marqué avec du DAPI, environ 1000 cellules ont été comptées pour chaque échantillon. Les îlots sont cultivés en absence ou présence de décorine pendant 24 heures, puis des coupes histologiques et un marquage TUNEL sont réalisés. Le taux d'apoptose des cellules non-traitées est de 14,51 ± 4,46% alors que celui des cellules traitées avec la décorine est de seulement 4,51 ± 1,14% (n=6, * p<0,05, figure 1). L'analyse de ce marquage montre que la décorine permet de diminuer significativement l'apoptose. Un traitement avec la décorine pendant 24h permet donc une meilleure survie des îlots pancréatiques.

Dans un second temps, l'effet de la décorine sur la prolifération des cellules des îlots pancréatiques a été évalué. S'intéresser à la prolifération permet de savoir si la décorine entraîne ou non la division incontrôlée des cellules, pouvant notamment mener au développement de tumeurs. Un marquage du KI67 est réalisé sur des coupes histologiques d'îlots. Cette protéine est uniquement synthétisée lors de la division des cellules. Ainsi, si les cellules sont marquées positivement pour cette protéine alors elles sont en division. La décorine n'a pas d'impact sur la prolifération des cellules de l'îlot.

1.2. Effets de la décorine sur la fonctionnalité des îlots pancréatiques

Des îlots pancréatiques de Rat sont cultivés dans des milieux plus ou moins riches en glucose (2,8 ou 16,7 mM glucose). La quantité d'insuline ou de glucagon libérée dans le milieu est ensuite déterminée par la méthode ELISA.

L'impact d'un traitement avec la décorine sur la sécrétion de l'insuline par les îlots pancréatiques a été évalué. L'insuline a pour rôle de favoriser le stockage du glucose dans les organes de réserve du corps lorsque la glycémie est élevée. Les résultats montrent que la quantité d'insuline libérée dans le milieu de culture avec 2,8 mM glucose est bien plus faible que lorsque le milieu est riche en sucre avec 16,7 mM de glucose (n=10, * p<0,05 et *** p<0,001, figure 2 et 3), et ce, pour les deux conditions.

Le test de fonctionnalité montre une amélioration de la sécrétion d'insuline en présence de la décorine par rapport à la condition contrôle (CTL). L'analyse statistique montre que la différence entre 2,8 mM et 16,7 mM glucose est d'une probabilité p<0,05 (*, n=10) pour la condition CTL et d'une probabilité p<0,001 (***, n=10) pour la condition décorine. Cette différence de puissance statistique traduit une meilleure gestion de la sécrétion d'insuline lorsque les îlots sont en présence de la décorine pendant 24h. Parallèlement, la quantité totale d'insuline produite lors du test de fonctionnalité est aussi étudiée (n=10, figure 2 et 3). La quantité d'insuline totale produite par les îlots semble plus importante après traitement avec la décorine.

L'impact d'un traitement avec la décorine sur la sécrétion du glucagon par les îlots pancréatiques a ensuite été évalué.

Le glucagon, à l'inverse de l'insuline, a pour rôle de favoriser la libération du glucose des tissus de stockage vers le sang lorsque la glycémie est faible. Il est donc logique d'avoir une quantité de glucagon libérée dans le milieu de culture avec 2,8 mM de glucose plus élevée que lorsque le milieu est riche en sucre avec 16,7 mM de glucose (n=12, NS : non-significatif et ** p<0,01, figure 2 et 3). Le test de fonctionnalité semble montrer une diminution de la sécrétion de glucagon pour les conditions 2,8 mM glucose et 16,7 mM glucose après traitement pendant 24h avec la décorine.

Parallèlement, la quantité totale de glucagon produite lors du test de fonctionnalité est aussi étudiée (n=12, figure 2). Le test statistique confirme que la décorine ne modifie pas la quantité de glucagon synthétisée par les îlots pancréatiques.

1.3. Effets de la décorine sur les voies de signalisation de la survie et de la fonction des îlots pancréatiques

Une approche mécanistique par Western Blot permet de comprendre les résultats obtenus pour l'étude de l'apoptose et le test de fonctionnalité. Pour cela, l'expression des protéines de la voie de signalisation IGF-1R / 1RS / Akt a été étudiée.

Le récepteur membranaire Insulin-like Growth Factor 1 Receptor (ou IGF-1R) est un des récepteurs sur lesquels l'insuline peut se fixer et provoquer son activation. IGF-1R acquière alors un groupement phosphate et devient phospho-IGF-lR (p-IGF-lR). Il en résulte alors l'activation des voies de signalisation liées à ce récepteur (Hakuno F., Takahashi S-L, 2018).

Après traitement avec ou sans décorine, le contenu total en protéines est récupéré après la lyse des cellules des îlots pancréatiques.

En condition décorine l'expression d'IGF-lR est de 98 ± 13% par rapport au CTL (n=6, figure 4). Parallèlement, l'étude de la forme phosphorylée de cette protéine (p-IGF-lR) montre une modification de son expression protéique : 144 ± 17% par rapport au CTL (n=6, *p<0,05, figure 4). Le rapport de p-IGF- 1R sur IGF-1R montre une augmentation de l'activation d'IGF-lR par la décorine : 156 ± 22% par rapport au CTL (n=6, ** p<0,01, figure 5).

Pour expliquer cette augmentation de l'activation, deux hypothèses se dégagent. La première est que la décorine se fixe directement sur IGF-1R et provoque son activation. La seconde hypothèse est que l'augmentation de la sécrétion de l'insuline par la décorine provoque la fixation de cette hormone sur son récepteur IGF-1R et augmente ainsi son activation. Dans les deux cas, une activation accrue d'IGF-lR est bénéfique pour les cellules des îlots pancréatiques, puisqu'elle permet de déclencher des voies de signalisation de survie cellulaire, de sécrétion d'insuline mais également d'angiogenèse. La première étape de cette voie de signalisation est l'activation des substrats d'IGF-lR : IRS-1 et IRS-2.

Les Insulin Receptor Substrate 1 et 2 (IRS-1 et IRS-2) sont des protéines inactives liées à la partie intra- membranaire du récepteur IGF-1R. Lorsque l'insuline ou la décorine (selon les hypothèses ci-dessus) se fixe sur ce récepteur, le groupement phosphate du récepteur est transmis aux protéines 1RS 1 et 2 (devenant p-IRS-1 et p-IRS2, protéines actives). Elles vont alors déclencher réactions cellulaires, provoquant l'entrée du glucose dans la cellule, la survie et la croissance cellulaire. Après 24h de culture avec la décorine, l'analyse d'IRS-l par Western Blot montre une expression protéique de 109 ± 13% par rapport au CTL (n=6, figure 6). Parallèlement, la forme active d'IRS-l et p-IRS- 1 a été étudiée. La décorine permet d'améliorer l'activation de cette protéine : 144 ± 13% par rapport au CTL (n=7, * p<0,05, figure 6). Le rapport de p-IRS-1 sur IRS-1 montre une amélioration de l'activation d'IRS- 1 par la décorine : 162 ± 29% par rapport au CTL (n=6, * p<0,05, figure 7).

Pour IRS-2, on ne constate pas de différence significative entre les deux conditions, l'expression protéique de IRS-2 après traitement avec la décorine est de 136 ± 34% par rapport au CTL (n=12, figure 8). En revanche, l'expression de la forme active d'IRS-2, p-IRS-2, est augmentée de manière significative grâce à la décorine : 142 ± 12% par rapport au CTL (n=7, ** p<0,01, figure 8). Le rapport de la forme active (p-IRS- 2) sur la forme totale (IRS-2) montre que la décorine semble augmenter l'activation d'IRS-2 : 169 ± 29% par rapport au CTL (n=7, figure 9).

Sur des îlots humains, l'expression et l'activation d'IRS 1 et 2 ont été étudiées avec trois répétitions. De la même manière que chez le Rat, l'expression protéique des formes inactives IRS-1 et IRS-2 n'est pas modifiée. En revanche, l'expression de p-IRS-1 et p-IRS-2 est augmentée grâce à la décorine.

Lorsqu'IRS-l et 2 sont activés, plusieurs voies de signalisation intracellulaires sont enclenchées,

La voie MAPK/ERK : la transcription de gènes de croissance, prolifération et survie cellulaire est activée,

La voie PI3K/AKT : la transcription de gènes de survie cellulaire et de synthèse de protéine.

Les mécanismes de synthèse et de sécrétion d'insuline sont également activés. Cette voie de signalisation est intéressante, puisque la protéine Akt est impliquée dans la régulation d'un grand nombre de protéines de survie comme FoxOl et NF-kB p65. Akt est rendue active lorsqu'elle reçoit un groupement phosphate après l'activation de IRS-1 ou I RS-2, elle devient alors phospho-Akt (p-Akt). p-Akt peut alors à son tour activer différentes voies de signalisation de la survie cellulaire et inhiber les mécanismes de l'apoptose.

Akt est exprimé de manière identique dans les deux conditions : 100 ± 8% par rapport au CTL (n=12, figure 10). La décorine n'a donc pas d'effet sur la synthèse protéique d'Akt. En revanche, l'activation de Akt est modifiée : 181 ± 41% par rapport au CTL (n=12, figure 10). Le rapport p-Akt sur Akt montre une différence significative entre les deux conditions : 209 ± 49% par rapport au CTL (n=12, *** p<0,001, figure 11). On peut donc conclure que la décorine permet une activation plus importante d'Akt.

Lorsqu'Akt est activée, cette protéine peut réguler l'activité d'un grand nombre de protéines, parmi elles, FoxOl. FoxOl est un facteur de transcription qui régule des gènes impliqués dans l'apoptose. Cette protéine est phosphorylée par p-Akt, ce qui va provoquer son exclusion du noyau, bloquant ainsi la transcription des gènes de l'apoptose (Oellerich M. F., Potente M., 2012).

L'analyse de FoxOl a montré une diminution significative de l'expression de cette protéine après 24h de traitement à la décorine : 67 ± 6% par rapport au CTL (n=7, ** p<0,01, figure 12). Parallèlement, la forme inactive de FoxOl (p-FoxOl) a été étudiée. L'expression de la forme inactive est identique dans les deux conditions : 104 ± 5% par rapport au CTL (n=7, figure 12). Le rapport de la forme inactive sur la forme active montre une inactivation significative grâce à la décorine : 163 ± 18% par rapport au CTL (n=7, ** p<0,01, figure 13).

Ces résultats sont donc cohérents avec ceux obtenus pour Akt et sa forme active p-Akt. En effet, Akt rend inactif FoxOl et provoque son ubiquitination et sa dégradation par le protéasome. Dans la littérature, il a été montré qu'une inactivation de FoxOl permet de favoriser la survie cellulaire et les mécanismes de vascularisation (Oellerich M. F., Potente M., 2012). Parallèlement, une étude a montré que l'inactivation de FoxOl joue également un rôle positif dans les mécanismes de synthèse et de sécrétion de l'insuline (Nakae J et al., 2002). Akt régule également l'expression protéique de la sous-unité p65 du complexe NF- KB. N F-KB est un facteur de transcription composé de plusieurs sous-unités (p65, RelB, c-Rel, p50 et p52). En fonction des associations entre les sous-unités, la fixation sur les gènes cibles est différente. Ici, la sous- unité p65 de NF-kB a été étudiée. Si p65 et p50 forment un complexe, alors les gènes ciblés par ce facteur de transcription sont des gènes de la survie cellulaire. Lorsque la sous-unité p65 est phosphorylée (phospho-p65), alors les gènes transcrits sont pro-inflammatoires et donc délétères pour la cellule.

L'analyse de NF-kB p65 par Western Blot montre une augmentation de ce facteur grâce à la décorine : 151 ± 18% par rapport au CTL (n=7, * p<0,05, figure 14). Parallèlement, l'étude de la forme phosphorylée de p65 ne montre pas de modification de l'expression protéique : 146 ± 38% par rapport au CTL (n=8, figure 14). Par ailleurs, le rapport p-p65 sur la forme totale p65 ne montre pas de changement d'expression : 116 ± 37% par rapport au CTL (n=7, figure 15). Il n'y a donc pas d'augmentation de la phosphorylation de la protéine p65 du complexe NF-kB après exposition à la décorine pendant 24h.

Cette molécule ne favorise donc pas la transcription de gènes pro-inflammatoires via la phosphorylation de p65. En revanche, l'expression protéique de p65 grâce à la décorine est intéressante puisque sous cette forme inactive, p65 peut se fixer à une autre sous-unité de ce complexe (p50) et ainsi favoriser la transcription de gènes de la survie cellulaire.

Pour approfondir ces résultats, d'autres mécanismes intracellulaires de survie ont été investigués, notamment avec l'étude de SIRT1. Cette protéine est une déacétylase qui joue un rôle positif dans la régulation du métabolisme, la réparation de l'ADN, les mécanismes de vieillesse et de survie cellulaire (Oellerich M. F., Potente M., 2012). SIRT1 permet ainsi de contrôler de nombreuses voies de signalisation comme celles de NF-kB mais aussi celles de PGCla. Elle permet également d'activer la voie de signalisation de HIF-2a, une des voies de l'angiogenèse permettant le développement de vaisseaux sanguins. L'analyse de SIRT1 montre une augmentation significative de son expression après exposition à la décorine : 167 ± 42% par rapport au CTL (n=4, * p<0,05, figure 16). Il a été montré dans la littérature que l'augmentation de l'expression de SIRT1 permet de protéger les cellules bêta pancréatiques contre l'inflammation (Prud'homme GJ et al. 2014). L'activité de SIRT1 est dépendante de la quantité de nutriments dans la cellule. Plus elle est faible et plus SIRT1 est activée (rapport NAD+/NADH faible) (Oellerich M. F., Potente M., 2012). Or, lors de la transplantation d'îlots pancréatiques, la quantité de nutriments apportée aux cellules est faible puisque le système vasculaire n'est pas encore suffisamment développé. Grâce à la décorine, l'expression de SIRT1 est augmentée, ce qui permettra de décupler ses actions lors de la transplantation d'îlots, favorisant ainsi les mécanismes de survie cellulaire.

SIRT1 régule de manière positive la sous-unité p65 de NF-kB mais régule également l'augmentation de l'expression protéique de PGCla. Cette protéine se lie à un facteur de transcription qui régule les gènes impliqués dans la gestion du métabolisme énergétique. Elle augmente la biogenèse et la fonction des mitochondries, elle joue également un rôle dans les mécanismes de vascularisation.

L'analyse de PGCla montre une surexpression après exposition à la décorine : 168 ± 10% par rapport au CTL (n=7, * p<0,05, figure 16). Une augmentation de l'expression protéique de PGCla grâce à la décorine permet donc de jouer sur plusieurs mécanismes importants après une transplantation d'îlots : efficacité de la cellule (fonction des mitochondries, menant ainsi à une amélioration de la survie) et angiogenèse. Les résultats obtenus pour cette protéine sont cohérents puisqu'il est établi que SIRT1 peut se fixer à PGCla et l'activer (Rodgers JT et al., 2005). Une étude a également montré que PGCla peut réguler positivement la production de VEGF et donc augmenter l'angiogenèse dans un modèle de muscles squelettiques (Arany Z et al., 2008).

1.4. Effets de la décorine sur l'angiogenèse des îlots pancréatiques

Dans un premier temps, l'une des voies majeures de l'angiogenèse : la voie des Hypoxia Inducible Factors (HIF-Ia et 2a) ainsi que des enzymes impliquées dans leurs régulations, les Prolyl Hydroxylase Domain (PHDs) ont été étudiées par Western blot.

HIF-Ia et HIF-2a sont des sous-unités des facteurs de transcription HIF-1 ou HIF-2. Après fixation avec la sous-unité HIF-Ib, ces complexes protéiques peuvent se lier sur les régions promotrices de gènes spécifiques de l'angiogenèse (comme le gène du VEGF par exemple). Elles jouent donc un rôle majeur dans le développement et la croissance des vaisseaux sanguins. L'étude de HIF-Ia ne montre pas de différence significative entre les deux conditions : 117 ± 20% par rapport au CTL (n=12, figure 17). En revanche, l'étude de HIF-2a montre une surexpression de cette protéine grâce à décorine : 163 ± 6% par rapport au CTL (n=ll, *** p<0,0001, figure 17).

Pour compléter ces données l'effet de la décorine sur l'expression de HIF-2a a été étudié, notamment via une action sur les PHDs. Les PHDs sont une famille d'enzymes comprenant trois protéines : PHD 1, 2 et 3, qui, en normoxie (quantité normale d'oxygène dans le sang, permettant une activité normale des cellules), favorisent la dégradation des protéines HIF-Ia et 2a en utilisant l'oxygène comme substrat.

En revanche, en hypoxie, l'oxygène est rare, faute de substrat les PHD ne peuvent plus dégrader HIF-la ou 2a : les mécanismes pro-angiogéniques sont alors enclenchés.

Après 24h de traitement avec la décorine, on ne constate pas de modification de l'expression de ces trois protéines par rapport à la condition contrôle. PHD1 : 125 ± 15%, PHD2 123 ± 16% et PHD3 109 ± 10% (n=12, figure 18). La surexpression de HIF-2a par la décorine ne passe donc pas par une action sur les PHDs.

Une surexpression de HIF-2a sans modification de l'expression des PHDs permet la transcription des gènes de l'angiogenèse. La décorine semble donc avoir un impact sur les mécanismes de développement de vaisseaux sanguins au sein des îlots pancréatiques.

La voie des HIFs n'est pas la seule responsable des mécanismes de vascularisation et d'angiogenèse. Les inventeurs se sont ainsi intéressés à une autre voie majeure de l'angiogenèse : la voie de signalisation du VEGF-A et de son récepteur le VEGF-Receptor 2 (VEGF-R2).

Le VEGF-R2 (Vascular Endothélial Growth Factor Receptor 2) est un récepteur membranaire sur lequel peut se fixer le facteur de croissance VEGF. La fixation de cette protéine sur son récepteur permet de déclencher des réactions cellulaires (survie, prolifération, perméabilité vasculaire, modification du cytosquelette) et donc de stimuler l'angiogenèse. L'étude de VEGF-R2 montre une différence significative grâce à la décorine : 120 ± 9% par rapport au CTL (n=6, * p<0,05, figure 19). Parallèlement, l'étude de la forme phosphorylée (forme active) de VEGF-R2 montre également une différence significative. Après traitement avec la décorine, on constate une augmentation de la quantité de VEGF-R2 et une augmentation significative de l'activation de ce récepteur. Il est intéressant d'augmenter le nombre de récepteur puisque de cette manière, les îlots seront plus réceptifs à l'induction de l'angiogenèse par le VEGF lorsqu'ils seront transplantés.

Enfin, pour compléter l'étude des effets de la décorine sur les mécanismes de l'angiogenèse des îlots pancréatiques, la sécrétion du VEGF-A en fonction du temps de culture a été étudiée. Pour cela, des îlots de Rat ont été traités avec la décorine pendant 2, 4, 8, 12 ou 24h. A ces différents temps, le milieu de culture est prélevé et la quantité de VEGF-A présente dans le milieu est déterminée par la méthode ELISA. Les cellules sont également collectées et la quantité de protéines est déterminée pour chaque échantillon afin de normaliser les résultats.

Les résultats sont présentés sous la forme pourcentage par rapport à la condition CTL au temps 2h (% par rapport au CTL 2h, n=6, figure 20). Sur ce graphique, on peut tout d'abord observer une sécrétion identique pour les deux conditions entre 2h et 12h de traitement. Mais au bout de 24h de traitement avec la décorine, la sécrétion de VEGF-A est augmentée (CTL = 1896 ± 61% et décorine = 1992 ± 152%).

1.5 Effets de la Décorine sur des animaux modèles du diabète

L'efficacité de la greffe d'îlots a été évaluée pendant 56 jours post-transplantation chez des rats en contrôlant le poids corporel (Fig. 21 A et B, n = 3 à 5), la glycémie (Fig. 22 A et B, n = 3 à 5), la c-peptidémie C (Fig. 23 A et B, n = 3 à 5), l'apparition de l'insulino-indépendance (Fig. 24 A et B, n = 3 à 5) et l'évolution des besoins en insuline (Fig. 25 A et B, n = 3 à 5).

Premièrement, le prétraitement des îlots pancréatiques avec la décorine, additionné ou non d'injections de cette myokine, semble augmenter le gain de poids corporel au cours du temps par rapport au groupe contrôle, et ceci à partir de 14 jours post-transplantation (Fig. 21 A, n = 3 à 5). L'effet de la décorine sur le gain de poids est confirmé par la mesure des aires sous la courbe (Fig. 21 B, n = 3 à 5). En effet, les résultats obtenus sur l'ensemble de l'étude, montrent un gain de poids corporel significativement augmenté pour les rats transplantés avec des îlots prétraités avec la décorine (Condition optimale) versus contrôles suboptimale (p < 0.01, n=3 à 5), contrôle optimale (p < 0.01, n=3 à 5) et décorine suboptimale (p < 0.001, n=3 à 5). De plus, aucune différence statistique n'est obtenue entre le contrôle « suboptimale » et le « contrôle optimale ». Par ailleurs, étant donné que cette différence n'est plus statistique entre le groupe décorine optimale et les autres groupes ayant reçu en complément l'injection de décorine, ceci conforte démontre encore que la décorine à un effet positif sur le gain de poids corporel. Néanmoins, il reste à déterminer si ce gain est lié à une amélioration de la fonction du greffon ou bien à une augmentation de la masse musculaire.

Un prétraitement des îlots pancréatiques avec la décorine et/ou une injection quotidienne de décorine améliore le contrôle glycémique des rats transplantés par rapport aux animaux ayant reçu une greffe classique (Fig. 22 A, n = 3 à 5). En effet, dès 14 jours, la glycémie du groupe contrôle est plus importante que les autres groupes transplantés avec un décrochage remarquable après 28 jours. Cet effet bénéfique de la décorine est confirmé par l'analyse des aires sous la courbe (Fig. 22 B, n = 3 à 5). En effet, seules les groupes « décorine optimale » (p < 0.001), contrôle optimale + injection de décorine (p < 0.05) et décorine optimale + injection de décorine (p < 0.001) présentent une glycémie significativement inférieure au groupe contrôle suboptimale. De plus, la plus grande significativité obtenue pour le groupe décorine optimale + injection de décorine (p < 0.001) que le groupe contrôle optimale + injection de décorine (p < 0.05) versus contrôle suboptimale démontre que le prétraitement des îlots avec de la décorine associé à une injection de cette myokine pourrait être encore plus bénéfique pour la fonctionnalité du greffon. Ces résultats sont renforcés par l'étude de la c-peptidémie au cours du temps (Fig. 23 A, n = 3 à 5) et de l'analyse des aires sous la courbe (Fig. 23 B, n = 3 à 5). Enfin, les études de l'obtention de l'insulinoindépendance (Fig. 24, n = 3 à 5) et des besoins en insuline (Fig. 25, n = 3 à 5) durant le déroulement du suivi, prouvent l'impact favorable de la décorine sur la fonction du greffon que ce soit en prétraitement uniquement ou associé à une injection quotidienne de la décorine (effet potentialisateur de l'association prétraitement/injection). En effet, dès 7 jours post greffe, 20% des animaux deviennent insulino-indépendant pour le groupe « décorine optimale + injection de décorine » contre 14 jour pour les groupes recevant une injection de décorine. Par ailleurs, les groupes « décorine optimale » avec ou sans injection présentent un pourcentage d'animaux insulino-indépendant supérieur aux autres groupes, avec un maintien du pourcentage d'animaux insulino-indépendant au minima à 80% à 56 jours post-transplantation. Ainsi, au vu de ces résultats sur le contrôle métabolique, il semble que la prise de poids corporel observée avec le traitement à la décorine pourrait être liée à une amélioration de la survie et de la fonction du greffon.

1.6. Etude in vivo montrant l'intérêt de la décorine sur la survie de la greffe d'ilots après transplantation au niveau hépatique après induction d'un diabète de type 1

En comparant la figure 26A et 26B, on peut constater que les rats receveurs de la transplantation d'ilots ont une greffe d'ilots survivant et fonctionnant beaucoup plus longtemps lorsqu'un prétraitement des îlots a été réalisé et que le récipient de la greffe a reçu une injection de décorine toutes les 24h. On peut néanmoins observer qu'un prétraitement de l'ilot avant transplantation a un fort impact sur la survie, la fonction de la greffe et l'indépendance à l'insuline du receveur.

Ainsi, on peut nettement voir ici qu'un prétraitement à la décorine augmente la fonction et la survie des îlots transplantés in vivo (control vs décorine). De plus, l'injection de décorine chez le receveur toutes les 24h en plus du prétraitement des îlots transplantés augmente de manière importante la fonction de la greffe et l'insulino-indépendance du receveur.

1.7 Etude de l'impact de la décorine lors de conditions diabétogènes

Les îlots humains sont traités soit à la décorine soit exposés à différentes solutions mimant les conditions diabétogènes (inflammation, acide gras et sucre). On peut voir ici qu'un traitement à la décorine potentialise la sécrétion d'insuline et protège l'ilot humain des effets néfastes de l'inflammation, des acides gras et de l'hyperglycémie sur la sécrétion d'insuline mais aussi sur la survie des cellules bêta- pancréatiques.

En particulier, la Figure 27 montre que la décorine potentialise la sécrétion d'insuline en réponse au glucose et protège de l'effet du TNF-alpha sur la sécrétion d'insuline dans les îlots de Langerhans humains. Les 10 préparations indépendantes d'ilots humains ont été traités avec de la décorine en situation contrôle et après un prétraitement au TNF-alpha 20 nM pendant 24h. Les îlots humains ont été traités sous leurs formes natives (pas de dissociation ou isolement cellulaire); N=10. La figure 28 montre que la décorine augmente la survie de la cellule beta pancréatique et la protège de la mort induite par un mix de cytokines pro-inflammatoires connues pour induire la mort cellulaire lors du diabète. Les îlots de Langerhans humains ont été traités et ont ensuite subi un double marquage : un marquage TUNEL marquant les cellules mortes et un marquage insuline marquant les cellules beta- pancréatiques. Les 10 préparations indépendantes d'ilots humains ont été traités avec de la décorine en situation contrôle et après un prétraitement au TNF-alpha +interféron gamma+IL-lbeta (20 nM pendant 24h). N=10

La figure 29 montre que la décorine potentialise la sécrétion d'insuline en réponse au glucose et protège de l'effet d'un excès de gras (palmitate : 500mM finale) sur la sécrétion d'insuline dans les îlots de Langerhans humains. Les 10 préparations indépendantes d'ilots humains ont été traités avec de la décorine en situation contrôle et après un prétraitement au palmitate pendant 48h. Les îlots humains ont été traités sous leurs formes natives (pas de dissociation ou d'isolement cellulaire); N=10.

La figure 30 montre que la décorine augmente la survie des cellules beta pancréatiques et les protège de la mort induite par les acides gras qui miment les conditions circulantes d'un patient diabétique. Les îlots de Langerhans humains ont été traités et ensuite un double marquage a été fait : un marquage dit TUNEL marquant les cellules mortes et un marquage insuline marquant les cellules beta-pancréatiques. Les 10 préparations indépendantes d'ilots humains ont été traités avec de la décorine en situation contrôle et après un prétraitement au palmitate pendant 48h. N=10

La figure 31 montre que la décorine potentialise la sécrétion d'insuline en réponse au glucose et protège de l'effet d'un excès de sucre (glucose : 16,7mM finale) sur la sécrétion d'insuline dans les îlots de Langerhans humains. Les 10 préparations indépendantes d'ilots humains ont été traités avec de la décorine en situation contrôle et après un prétraitement au glucose pendant 48h. Les îlots humains ont été traités sous leurs formes natives (pas de dissociation ou d'isolement cellulaire); N=10.

1.8 Effet de la décorine chez les sujets atteints de diabète de type II.

Des îlots humains ont été isolés chez des patients diabétiques de type 2. Les îlots sont incubés ou non avec de la décorine pendant 24h. On peut voir ici sur les deux préparations qu'un traitement à la décorine restaure une sécrétion à l'insuline en réponse au glucose.

En particulier, la figure 32 montre que la décorine restaure la sécrétion d'insuline dans les îlots humains isolés chez des patients diabétiques de type 2. Les îlots de Langerhans humain ont été traités à la décorine pendant 24h avant la mesure de la sécrétion d'insuline en réponse au glucose. N=2

Conclusion

L'étude de l'apoptose par la méthode TUNEL a montré que la décorine permet de diminuer de manière significative l'apoptose des cellules des îlots pancréatiques. La décorine potentialise la sécrétion de l'insuline en réponse à une stimulation au glucose. Cette augmentation est corrélée à une diminution de la sécrétion du glucagon. Pour expliquer les effets positifs de la décorine sur la survie et la fonctionnalité des îlots pancréatiques, les inventeurs se sont intéressés aux mécanismes intracellulaires par la méthode du Western Blot, en particulier en lien avec la voie de signalisation d'IGF-lR. Les mécanismes de l'angiogenèse ont été étudiés, en particulier l'expression des protéines impliquées dans les deux principales voies de l'angiogenèse : la voie des HIFs et celle du VEGF. L'étude de sécrétion du VEGF-A sur 24h par les îlots montre que la décorine semble améliorer cette sécrétion et pourrait ainsi favoriser le mécanisme de vascularisation.

Ainsi, les résultats obtenus sur les îlots de Rat montrent que l'utilisation de la décorine sur les îlots peut améliorer la survie, la fonction et l'angiogenèse des îlots pancréatiques.

Les résultats obtenus in vivo chez le rat montrent que la décorine est un candidat très intéressant pour optimiser la survie et la fonction du greffon post-transplantation mais également lors de la préparation de celui-ci et participe au maintien de l'insulino-dépendance chez des rats transplantés.

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Animaux

L’étude est réalisée sur des rats Wistar. Les rats sont hébergés selon les normes collectives : par cinq dans des cages, dans une salle à 23 ± 1°C et en cycle lumière/obscurité de 12h. Les Rats sont nourris avec des croquettes standards (SAFE-A04, Villemoisson-sur-Orge, France), la nourriture et l’eau sont disponibles ad libitum (mode d'alimentation libre, généralement jusqu'à satiété). Les expérimentations sur les Rats sont effectuées conformément aux principes et règles de la législation Européenne relative à la protection des animaux. Le protocole a été déposé au ministère et évalué par le Comité Régional d'Ethique en Matière d'Expérimentation Animale de Strasbourg (CREMEAS) de référence de dossier 2015042216149683.

Toutes les expériences in vivo ont été réalisées conformément aux principes et directives de la législation française sur le bien-être des animaux (Décret 2013-118, 02/01/2013). Les expériences proposées ont été évaluées par le comité d’éthique français numéro CEEA-35 et les protocoles ont été approuvés par le gouvernement français en vertu de l'autorisation n°2018040316185500. Les rats Lewis ont été fournis par la société Charles River (Saint-Germain-Nuelles, France). Les rats ont été logés dans des cages collectives standard, dans une salle à température contrôlée (22 ± 1 ° C) avec un cycle de 12 h de lumière / 12 h d’obscurité. Ils ont été nourris avec des granulés standard SAFE-A04 (Villemoisson-sur-Orge, France). La nourriture et l’eau étaient disponibles ad libitum.

Prélèvement des îlots pancréatiques de Rat

L'isolement d'îlots pancréatiques est réalisé sur des Rats Wistar mâles de poids corporel variant de 200 à 220 g, préalablement anesthésiés avec de l'Imalgène ^® (Kétamine, Marial, Lyon, France) complété avec du Rompun ^® (Xylazine 2 %, Bayer, Puteaux, France) par voie intrapéritonéale à raison de 100 mI/100 g de poids corporel.

L'isolement d'îlots pancréatiques est réalisé selon la méthode décrite par Sutton et al. (Sutton R. et al. 1986). Une découpe de la boutonnière ventrale est réalisée, puis le pancréas est dégagé des autres organes. Après avoir ligaturé le canal cholédoque à l'embouchure duodénale, 10 ml de collagénase de type XI (Sigma-Aldrich, St-Louis, USA) à raison de 1 mg/ml, sont injectées dans le pancréas de l'animal via un cathéter dans le canal cholédoque à l'embouchure hépatique. Le pancréas est entièrement prélevé et les îlots pancréatiques sont ensuite séparés du tissu exocrine par centrifugation, à l'aide d'un gradient discontinu de Ficoll. Les îlots purifiés sont cultivés pendant une nuit dans des flasques 25 cm ² dans du milieu M199* (Gibco ^® , Saint Aubin, France) supplémenté avec 10% de SVF (Sigma-Aldrich) et 1% d'ABAM pendant 24h à 37°C, 5% de CO 2 et en atmosphère humide.

Traitements des îlots pancréatiques

Les îlots pancréatiques contenus dans les flasques sont ensuite cultivés dans des plaques 24 puits à une densité de 250 îlots par puit. Pour les îlots de Rat, le milieu de culture est le M199 supplémenté comme décrit précédemment. Le milieu de culture pour les îlots humains est le CMRL-1066 supplémenté comme décrit précédemment. Les milieux de culture contiennent ou non de la décorine (R&D, Systems, Minneapolis, USA) à la concentration finale de 1 pg/ml. La culture se fait pendant 24h à 37°C, 5% de C02 et en atmosphère humide. Après 24h d'incubation, les tests suivants ont été réalisés.

Etude de l'apoptose par immunofluorescence

Les îlots ont été isolés et cultivés en absence ou présence de décorine dans une plaque 24 puits à une concentration de 1250 îlots par puits, à 37°C et 5% C02.

Les îlots sont récupérés et placés dans un composé Optimal Cutting Température (OCT) avant d'être solidifiés dans l'azote liquide. Des sections de 10 pm sont réalisées avec un microtome-cryostat (Leica CM3050 s) et fixées sur des lames pour analyses.

Les ruptures aux extrémités des brins 3-OH de l'ADN, générées lors de l'apoptose, sont détectées en utilisant la technique TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl-transferase-mediated deoxyuridine 5- triphosphate nick-end labeling) selon le protocole du fabricant (In situ cell death détection kit, Roche).

Les cellules ont été co-marquées avec un anticorps monoclonal anti-insuline (Cell Signaling Technology) et le noyau des cellules a été marqué avec du DAPI. Le nombre de cellules TUNEL-positives a été déterminé par comptage après observation au microscope à fluorescence. Pour chaque expérience, environ 1000 cellules ont été comptées avec le logiciel ImageJ. Etude de la prolifération par immunomarquage du KI67

Les lames de coupes histologiques sont réalisées et le marquage du KI67 est réalisé. Cette protéine est synthétisée uniquement lorsque les cellules sont en phase de division. Les cellules ont été marquées avec un anticorps anti-KI67 (Novus Biologicals) utilisé à la dilution 1 :100 dans du tampon phosphate salin (PBS). Le noyau des cellules a été marqué avec du DAPI.

Test de fonctionnalité

Des milieux de culture aux concentrations en glucose de 2,8 et 16,7 mM sont préparés à partir d'une solution de Krebs (115 mM NaCI, 4,7 mM KCI, 3,4 mM CaCI2, 1,2 mM KH2P04, 2,1 mM MgS04, 21,2 mM NaHC03, 13,5 mM Hepes, [pH 7,4]) supplémenté avec 10% de SVF.

10 îlots sont prélevés et synchronisés pendant 30 minutes dans le milieu 2,8 mM glucose, puis cultivés lh dans le milieu 2,8 mM et finalement lh dans le 16,7 mM glucose, à 37°C et 5% C02. Après ces incubations, les îlots sont placés dans une solution d'acide-éthanol pour mesurer le contenu total en insuline et glucagon des îlots qui n'a pas été sécrété lors du test. Le surnageant des milieux de culture et l'acide- éthanol sont conservés à -20°C jusqu'aux dosages. La quantité d'insuline ou de glucagon de chaque échantillon est déterminée par la méthode ELISA selon le protocole du fabricant (Mercodia AB, Uppsala, Sweden). La sécrétion des îlots est exprimée en pourcentage du contenu total en insuline ou glucagon.

Western Blotting

Le contenu total en protéines est extrait des îlots cultivés grâce à du tampon de lyse complété avec un inhibiteur de protéase (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany). Les échantillons ont été centrifugés à 10 000g pendant 10 minutes et la concentration en protéines dans chaque échantillon a été déterminée par un dosage de Bradford, avec la BSA comme étalon.

Pour chaque échantillon, 20 pg de protéines sont déposés dans les puits d'un gel 4-12% SDS- polyacrylamide (SDS-PAGE). Les protéines sont séparées par électrophorèse et transférées sur une membrane PVDF (Milipore). Les sites aspécifiques de la membrane sont bloqués avec une solution Tris- Buffered Saline et 0,1% Tween 20 (TBS-T) contenant 5% de lait, pendant lh et à température ambiante. La membrane est ensuite incubée avec une solution d'anticorps primaires pendant la nuit et à 4°C. Les anticorps primaires sont dilués au 1:1000 dans une solution de TBS-T contenant 5% de BSA.

Les anticorps utilisés sont les suivants : monoclonal anti-phospho-IRSl Tyr628 (Novus Biologicals, Littleton, CO, USA); polyclonal anti-phospho-IRS2 Tyr978 (RayBiotech, Norcross, USA); monoclonal anti- Akt (Cell Signaling Technology, Leiden, NETHERLANDS); monoclonal anti-phospho-Akt Ser473 (Cell Signaling Technology); polyclonal anti-phospho-AS160 Ser/Thr (Cell Signaling Technology); monoclonal anti-NF-kB p65 (Cell Signaling Technology); monoclonal anti-phospho-NF-kB p65 Ser536 (Cell Signaling Technology); monoclonal anti-FoxOl (Cell Signaling Technology); polyclonal anti-phospho-FoxOl Thr24/Fox03a Thr32 (Cell Signaling Technology); polyclonal anti-SIRTl (Cell Signaling Technology); polyclonal anti-PGCla (Abcam, Cambridge, USA); polyclonal anti-PHDl, polyclonal anti-PHD2, et polyclonal anti-PHD3 (Novus Biologicals); monoclonal anti-HIF-la (Novus Biologicals); monoclonal anti- H I F-2ot (Novus Biologicals); polyclonal anti-VEGF Receptor 2 (Abcam); polyclonal anti-phospho-VEGF Receptor 2 Tyrl054/Tyrl059 (Abcam); polyclonal anti-IGF-l Receptor (Novus Biologicals); monoclonal anti-phospho-IGF-l Recepto^/lnsulin Receptor b Tyrll50/1151 (Cell Signaling); polyclonal anti^-actine dilution 1:10000 (Abcam).

Les membranes sont ensuite rincées trois fois cinq minutes avec du TBS-T, puis incubées lh à température ambiante avec les anticorps secondaires dilués au 1 : 10000 dans une solution de TBS-T et 5% de BSA. En fonction de l'espèce qui produit les anticorps primaires, on utilise soit un anticorps immunoglobuline G (IgG) anti-Rabbit couplé avec une enzyme peroxydase de raifort (Horseradish Peroxidase, HRP) (Sigma), soit un anticorps IgG anti-souris couplé avec une HRP (Sigma).

Les membranes sont rincées comme décrit précédemment et l'activité de la HRP est détectée après ajout du substrat Super Signal™ West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher Scientific Inc., Pittsburgh, PA, USA). L'émission lumineuse est ensuite captée par une caméra (Chemidoc, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA) et des images sont prises.

L'énergie lumineuse émise par l'enzyme HRP est analysée de manière semi-quantitative en utilisant le logiciel ImageJ. L'intensité lumineuse relative à chaque protéine est normalisée grâce à la b-actine.

Cinétique de sécrétion de VEGF-A

Les îlots ont été isolés et cultivés en absence ou en présence de décorine dans une plaque 24 puits à une concentration de 500 îlots par puits, à 37°C et 5% C02. Après 2, 4, 8, 12, ou 24h de culture, le surnageant est prélevé et stocké à -20°C jusqu'au dosage du VEGF-A.

La quantité de VEGF-A dans les échantillons é été déterminée par la méthode ELISA selon le protocole du fabricant (RayBiotech). La concentration en protéine de chaque puit a été déterminée et la quantité de VEGF-A a été normalisée par la quantité totale de protéine.

Transplantation d'îlots

La greffe d'îlots a été réalisée chez des rats Lewis mâles (200 g), souche consanguine, afin de se soustraire des réactions immunologiques de rejet. Le diabète a été induit par une injection intrapéritonéale unique de 75 mg / kg de streptozotocine (STZ, Sigma-Aldrich) diluée dans du sérum physiologique stérile. Les animaux ont été considérés comme diabétiques après deux mesures consécutives de la glycémie > 3 g/L à l'aide d'un lecteur de glycémie (Accu-chek Performa, Roche). Les rats ont été ensuite divisés en 9 groupes de 6 animaux par groupe et un suivi métabolique fut réalisé pendant 2 mois. Concernant la transplantation d'îlots pancréatiques, après anesthésie gazeuse à l'isoflurane, les rats diabétiques ont subi une laparotomie suivi d'une injection intraportale soit de milieu CMRL seul (groupe SHAM), soit d'îlots pancréatiques, à raison de 5000 IEQ/kg (condition suboptimale, permet rapidement d'identifier des différences entre les groupes) ou de 10000 IEQ/kg (condition optimale, comparable à ce qui est réalisé en clinique). Ainsi, parmi les rats transplantés, nous trouvons les groupes contrôle (sans pré-traitement des îlots) et décorine (pré-traitement des îlots avec 1 pg/mL de décorine pendant 24h) en quantité suboptimale ou optimale et ayant reçu ou non une injection intrapéritonéale quotidienne de 1 pg/mL de décorine.

Les rats diabétiques ont reçu une injection quotidienne sous-cutanée d’insuline de 6UI (glycémie > 3 g/L) ou de 3UI (2 g/L > glycémie < 3 g/L) diluée dans du sérum physiologique stérile quotidien (Lantus SoloStar ^® avec 100 Ul / mL d’insuline glargine, Sanofi, Paris, France).

Suivi métabolique

Le contrôle métabolique a été surveillé pendant 56 jours après la transplantation. Le gain de poids corporel (gramme par rapport à t=0 post transplantation), la glycémie (g/L) et la c-peptidémie (pmol/L) ont été évalué au cours du temps mais également sur l'ensemble des 56 jours de suivi métabolique par la mesure de l'aire sous la courbe. Pour compléter ces données, une étude comparative entre les groupes a été réalisée concernant, d'une part l'apparition de l'insulinoindépendance et d'autre part les besoins quotidiens en insuline.

Analyse statistique des résultats

Les analyses statistiques ont été réalisées en utilisant le logiciel Statistica (StatSoft, Maisons-Alfort, France). Pour analyser les résultats, un test non-paramétrique de Mann-Whitney est utilisé. Les résultats sont présentés sous la forme moyenne ± SEM et le nombre de répétitions est indiqué pour chaque graphique. Une valeur de p inférieure à 0,05 a été considérée comme significativement statistique. Pour la représentation graphique, la valeur de p est notée comme suit : p<0,05 avec *, p<0,01 avec ** et p<0,001 avec ***.

Les tests statistiques des expériences in vivo ont été réalisés avec le logiciel GraphPad Prism version 7. Les différences entre les groupes ont été évaluées à l’aide d’une analyse de variance (One way ANOVA), suivie du test de comparaisons multiple de Tukey. Les tests post-hoc ne sont exécutés que si F atteint P <0,05 et qu’aucune inhomogénéité de variance significative n'est présente. Les données ont été rapportées en tant que moyenne ± SEM pour le nombre de répétitions indiqué et qu’une valeur p de <0,05 a été considérée comme statistiquement significative.