本发明属于医药技术领域， 地说， 涉及一种 ^藻糖^ ^胺聚糖（dFG ) 及其制备方法， 以及含有该 ^藻糖 ^*唐胺聚糖的药物组^^。 背景技术

岩藥糖化糖胺聚糖 ( Fucosylated Glycosaminoglycan, Fucose-branched Glycosamino- glycan或 fiicose-containing glycosaminoglycan, 简称 FG ),或 ^为岩藻 糖 嫩软骨素 ( Fucosylated chondroitin sulfate, FCS ), 是指一类 皮动物体壁或 内脏中提减得的， 具有类似于石 软骨素主 构， 但具有柳腱 糖取代 的糖胺聚糖衍生物 ( J Biol Chem, 1988, 263 (34)： 18176-83和 J Biol Chem, 1991， 266 (21) : 13530-6 X

天然 FG具有^ 活性（樊绘曾等， 药学学报， 1980, 15: 267 ),此活性使^† 于某些血松 f生疾病具有潜在治疗作用，然而 FG同时具有诱导血小板聚集活性 (Jia- zeng Li等， Thronbosis and Haemostasis, 1988， 54(3): 435-9 )， 而血小板诱导活性严重 影响了 FG潜在治疗作用向实际临床应用的转化。 近年来的研究资料显示， i - 量 FG可^^保留一定强度的^ 活性的同时消除或避免原型多糖的血小板诱导 活性（樊绘曾等，生物化学杂志， 1993, 9(2): 146-151; Toshio Imanari等， T¾rombosis Research, 1997, 129: 27-31 )。

低分子量 FG可以来自 FG的分级处理， 也可以来自 FG解聚。 分级处理所 [氐 Ή FG方法简单（樊绘曾等，生物化学杂志， 1993, 9 (2): 146-151 ), 但由于天然 FG 中所^ ^且 支少， 分^ t理法制 ^i^flFG的得率较低而且资源浪费严重。

常用于糖胺聚糖解聚的酶法解聚、亚硝酸解聚 方法均不适合于解聚 FG，其原因 在于： 岩藻糖 臌的存在使得已知的糖胺聚糖内切酶均不能水 解 FG; FG中的 ^均为乙 唐， 无游离 在， 因而不 ^fclLE肖 聚。

¾0 ₂ 法解聚 FG已见于 ^gJi ( Fan Hui-Zeng等， WO 90/08784; Ken-ichiro Yoshida 等， Tetrahedron Lettere, 1992, 33 (34)4959-62 )。 由于 FG中存在多种不同类型的糖苷 键， 例如存在于主链的葡萄糖醛酸（GlcUA) β(1→3)糖苷键、 乙酰氨基半乳糖 (GalNAc) β(1→4)糖 以及存在于嫩的 α-岩藻糖（Fuc ) 糖截等， 常规 ¾(¾ 解聚方法对这些糖苷键的选择 4生有限。 非选择性裂解主链糖苷键可以形成具有不同 的 '|¾端的低聚 FG产物， 即同时存在较高^ I：的 GlcUA及 GalNAc末端， 因 而影响产物的均一性； 而侧^唐苷键的裂解可以导 ¾ ^藻糖取代侧链的脱落。

^b, 常规 H ₂ 0 ₂ 法解聚？0所需 ^牛相对剧烈， 其^ ί温度要求较高、 反 应时间较长， 而其关键性缺陷在于， 该 的可控性和重复性 。

因此， 开发一种 牛温和、 重现性高、 产物均一性好的制 ^ FG的方 法对 FC的工业化生产具有重大意义。 发明内容

本发明的一个目的在于克 ^W技术的不足， 提^ ""种制备盾量均一可控， 制 备重复性高的低聚岩藻糖化糖胺聚糖 （ Depolymerized fucose-containing glycosaminoglycan, 筒称为 dFG或低聚 FG )的方法。

本发明所述制备 dFG的方法是在 目介质中采用含有第四周期±>度金属离子的 催化剂， 催化 解聚法解聚岩藻糖條胺聚糖（FG)， 包括以下步骤：

1 )在第四周期 i±¾金属离子的催化剂存在下， 在 目介盾中， 加入 i±| ^/以 解 参来源的岩藻糖^ ^唐胺聚糖；

2)中止^ J^, 收集和纯化所需^ 量范围的#¾^藻糖^胺聚糖。

步骤 1 )中，所 参来源的岩藻糖^#胺聚卿 G)是指Λ^皮动物门海参纲所 述动物中提取制备的含有岩藻 4 且分的酸性粘多糖。 其结构特征是： 在其单 且成 中， GlcUA (葡萄糖酸酸）和 GaJNAc ( 2-M2- J^N-乙 -半 ty^嫩酯） 以近于等摩尔比（1:1±0.3)存在， 且 GlcUA与 GaJNAc分别以 β1→3和 β1→4糖 ^^相互连接构成多糖主链， 岩藻糖（Fuc)或其硫酸酯以侧链形式连接于主� �，， 以 摩尔比计， Fuc:GalNAc比值范围可以是约 0.5~2.5。 FG主链结构单元可表示为式 (I):

式（I)中： -OR为 基（-OH)、 硫酸酯基（-OS(V)、 或为如式（Π)所示的 碰酯化岩藻糖基：

式（Π )中： -OR为羟基（-OH)、 酸酯基（-OS0 ₃ - )定义同上式。

来自不同海参种属 /品种的 FG的侧链岩藻糖基 ϋ比例及其连接于主链位置方 式可以存在差异； 海参品种相同但组织来源不同或者提取方法差 异也可能导致 FG 的单糖组成比例、 侧链存在形式以及多糖 跛^ f呈度等方面的不同， 但是这些差异 均不涉及 FG结构特征和糖苦键类型的本盾变化， 不影响本发明所述方法的有效实 应用。 因此， ^^发明中， 所述 FC可来源于世^^地不同品种的海参， 包括但 不限于刺参、 绿刺参、 玉足海参、 黑海参、 黑乳海参、 糙海参等。

步骤 1 )中，解^:在 ^目介质中进行，釆用金属离子作为催化剂催� � 勿 的解 ¾½， 以生成 ^^ FG。

所述¾化物可以在 ^Ji体系中产生自由基， 并通过自由基链 FG 糖苷键，进而形成所述 dFG产物。这些过氧化物包括但不限于过氧乙酸 、过氧化氢、 3-氯 -过苯甲酸、 氢过氧 烯、 过硫酸钠、 过氧化苯甲酰以及它们的盐或酯， 优选 为糊匕氢。

所述 FG在^^体系中的质量分数约为 0.05%"15%， i± ^ 在 体系中的 质量分数约为 0.5%至约 30%。 FG的解聚 过程中， 过氧化 物可以在反应 前一次性^加 T ^^ i体系中， 也可以采用 ^或断续性方式将 ^ ^½物 逐步加入到 体系中。 本发明^ ^将 化物 物按照可 ^ i率的方式持续加 反应体系中。

所述作为催化剂的金属离子为第四周期过渡金 属离子， 包括 Cu+、 Cu ²⁺ 、 Fe ²⁺ 、 Fe ³⁺ 、 Cr ³⁺ 、 Cr ₂ 0 ₇ ² -、 Mn ²⁺ 、 Zn ²⁺ 、 Ni ²⁺ 等， 这些金属离子可以单独^ 1 , 也可以相 互组^ 为复^ ί崔化剂 。 其中， 的催化剂为 Cu+、 Cu ²⁺ Fe ²⁺ 、 Fe ³⁺ 、 Zn ²⁺ , 最^^为 Cu ²⁺ 。 由于金属离子并非独立存在的化学试剂， 实际^的是这些金属离 子的无才^有机盐。 在反应体系中， 所述金属离子的浓度范围可以为约 l nmol/L ~ 0.1mol/L, ^ 的 范围为 10nmol/L ~ 10mmol/L。

所述解聚 过程的常规工艺参数为： 温度范围为 10°C ~ 75°C;反应时间为 20 分钟 ~ 8小时；反应可以在常压或加压条件下进行；� �应可以选择氮气、惰性气体保 护下进行， 也可以在常压条件下与大气环 *N通进行。

反应结束时， 可以向 体系中加入螯^ ^使之与金属离子催化剂螯合而抑制 继而通过^ P、 有 剂^定等技术手段终止 。 ^^是指能 与金属离子形成 ^^的物盾， 其包括但不限于乙二胺四乙酸（EDTA )、 二乙烯三 胺五乙酸（DTPA )、 3-丙二胺四乙酸（PDTA )、 三乙酸基氨（NTA )或它们的盐。 本发明方法优选乙二胺四乙酸二钠或其水合物 。 反应产物沉淀法 -接或在进一步 加 几盐（如乙酸钾）的^ ί牛下加入有才 剂使聚糖类物质 体系中析出的 方法， 所述有枳溶剂包括曱醇、 乙醇、 丙酮等低威醇 /酮， 其中优选为乙醇和丙酮。

反应产物 dFG可以通过本领域已知方法纯化， 例如通过透析法或超滤法去除小 ^"盐，通过^ ^析或 DEAE离子交 ^析进一步纯化等， 所得 dFG产物还可以 通过阳离子交换以制备成单盐形式， 如钠盐、 钾盐或钙盐等。 所 析去杂处理过 程中， 可 4財居目地 dFG 量大小要^^ 宜截留 量的透析膜， 截留分 子量为 3000 Da。透析时间需 ^特定处理条件确定，通常不少于 6小时。 dFG产物 的成盐过程 ύ ^动态离子交城盐法， 其中可选择釆用强酸性阳离子交换树脂。 树 月旨柱预处理、 样品上样与 -^¾均可按常 法进行。 本发明方法中 ύί4的样品上样 质量分^约 2°/ ^ 5%。

本发明方法可以显著改善过氧化凇解聚 FG的反应条件， 即， 釆用相同过氧化 物^ έ物和原型 FG起始物制备相同或近 目等^ ^量的 dFG时， 在温度等 条 件近似的情况下， 相对于直接 i¾化物解聚法（即没有金属离子催化剂存在下 的过 氧化物解聚方法)， 本 明方法可以提高反应速度， 缩短反应时程； 类似地， 在控制 反应时间的条件下， 本发明方法可以显著降低反应所需温度， 以至可以在室温条件 下完成所需^ JS。

在 dFG的重复制备过程中， 在^ ^牛相同或近似的 ^牛下， 与直接氧化 物解聚法相比， 本发明方法所得产物的批次间差异显著 氐。 对于不同目标分子量 的 dFG制备而言， 本发明方法可以便捷地通过改变 条件而实现， 而对于直接过 氧化物解聚法， 则改变 牛后反应产物偏离预计结果的不确定性较为严 重（所 得 dFG 量与目标分子量的差异可达 5%以上)。

本发明方法显著改善 dFG制备的重复性和可控性， 可能与催化剂所致活化能降 而形^目对稳定的 速率有关， 也可能与 温度降^ 时程缩短等温 和 牛及其 ^牛的可控性 ^N定性改善有关。

对于相对纯净、 均一的 ^"制 FG原料而言， 相同反应条件下， 本发明方法所得 产物具有高度的重复性； 但对于含有较多杂质成分的含 FG "粗多糖"而言， 解聚反 应的稳定性与可控性仍有可^^在较大差异。 本发明人现已发现， 反应体系中存在 一定离子强度的 有机盐可以提高解¾½的稳定性。

为此， 本发明 一步提供提高和改善 FG解¾ ^可控性的方法， 即， 向金 属离子催化的 ^ 解^藻糖^ ^唐胺聚糖的 体系中加入一定浓度的^ ^/ 或有机盐。 所 i^bM^/或有机盐包括金属元素（如碱金属、 ¾i金属元素等）与卤 素、 有机酸等形成的盐， 有机酸或无机酸与有机碱形成的盐， 以及它们相互组合的 复合盐， 其中伏逃氯化钠、 氯化钟、 乙酸钠、 三水合乙酸钠、 乙酸钟。 本发明方法 中， 用于改善解聚 和反应可控性的无才 或有机盐的伏 的盐离子浓度为 约 O.l mmol/L至约 1.0mol/L。 盐离子改善^ J^H牛的机制不能完全阐明， 对于本发 明方法而言， 可能与其稳定反应物 FG的构象有关。

本发明所述 FG是来源于棘皮动物海参纲的岩藻糖^ t胺聚糖， 其结构特征是 存在约 1： 1 ± 0.3摩尔比的 GlcUA和 GalNAc (^^_酯）以及不同摩尔比的岩藻糖（硫 酸酯)。 海参品种及其组织来源不同或提取方法的差异 可导致 FG的单糖 比例、 胜存在形式以及多糖硫酸^ ί呈度等方面的不同， 但这些差异均不涉及 FG结构特 糖苷键类型的本质变化， 因此不影响本发明所述解聚方法的实 应用。 本发 明所述 FG的来源动物可选自但不局限于刺参、 绿刺参、 玉足海参、 黑海参、 黑乳 海参、 参等。 显然， 本领域技术人员可以理解， 对于产于世^^地的其它品种 海参， 其来源的符合上述结构特征的岩藻糖化糖胺聚 糖均可以采用本发明所述方法 解聚以获得所需的低聚 FG产物， 因此， 本发明方法不受特定海参品种的限制。

本发明所得 dFG产物的还原' 端可通过 NMR法检测。 NMR检测还可以方便 地用于确认产物中 Fuc/GaJNAc组成比例。

比较直接 i¾化物解聚与催化 化物解聚产物， 本发明发现， Mh 解聚法具有出人意料的糖 ^t i^选棒^其突出表 所得 dFG 上以 GalNAc 为还原 端（以末端数量计" "^在 80%乃至 95%以上）而较少为 GlcUA, 此与直 接 解聚产物存 目对高 ^f:的 性 GlcUA末端有^ ^差别，表明催化过 氧化物解聚法所得 dFG具有更好的末端均一性， 因而具有更好的质量均一性和可控

Fuc GalNAc组成比例没有明显变化； 而直接过氧^勿解聚过程中， 该比例可存在约 5%左右的 氐， 一步证明本发明方法具有 的糖^ 的选择 。

由此，本发明的又一目的是提^ "种低聚 FG(dFG)， 所述 dFG通过本发明方法 制备， 于， 所述 dFG的 ， 端主要为 GalNAc, 通过核磁共振（NMR) 技术 则可确认其组成比例不低于 80%, 相应地， 所述 dFG中， 以 GlcUA作为还 原 'f妹端的聚糖^ "数少于 20%。 的本发明 dFG中， 以 GalNAc为 4妹端 的多糖 数不少于 90%。

dFG产物的 ^^量可采用高效劍交色谱法^ r测。 从保留 FG jk¾学活性以 ½ 免诱导血小板聚集活性考虑， 以重均^^量计， 本发明选 ^ _£ ^0的 ^^量范围为 约 6,000 ~ 20,000Da, 伏逃分子量范围为约 10,000 ~ 15，000Da。

本发明所述 dFG的多^ t指数（PDI,重均分子量与数均分子量之比， Mw/Mn ) ~·*Η· 1.0至 2.0之间； 对于仂 的低聚 FG， 其 PDI介于 1.2至 1.6之间。

本发明所述 dFG可以是其药学上可接受的碱金属、 金属等的盐，例如钠盐、 钾盐和钙盐等； 类^ U也， 本发明所述低聚 FG也可以是其药学上可接受的碱性有机 基团的酯。

本发明所述 dFG具有确切的^ L活性， 因此具有明确的药用潜力。 dFG具有 良好的水溶^， 因此易于制备成溶液型制剂或其冻干制品。 作为多糖类成分， 其口 月！^物利用有限， 因 制备成胃肠夕卜给药剂型， 其制剂制备可以按照本领域内 熟知的技术方法进行。

本发明的又一目的是提供一种药用组合物， 所述药用组合物包括本发明所述 dFG以及药学上可½的辅料。 本发明所述 dFG具有一定强度的^^活性， 因此可 以用于不同程度的 i^f生疾病的预防和治疗， 例如 J I^成性心血管疾病、 脑血管病， 肺静脉 全、 周围静脉 _ώ^、 深静脉 全、 周围性动脉 JW全等。 据此， 本发明可提供所^且^/在治疗 防心血管疾病的药物制备中的应用。 附图说明

图 1为刺参 FG及其降解产物 dFG的 HPGPC图谱；

图 2为显示 FG、 dFG中 Fuc/GalNA摩尔比（曱基信号积分面积比）的 ¹ HNMR 谱图；

图 3A为 dFG-2的 ^- ¹ !! COSY谱图；

图 3B为图 3 A 5.22ppm处的 COSY谱图截面，显示还原 端 GalNAc和 GlcUA 之 α-Η的 NMR信号。

^^实 式

以下实施例用于进一步说明本发明 , 并不构成对 ^发明范围的限制。

实施例 1 金属离子催化的 FG的t ^解聚

1.1材料：

FG: 刺参来源的岩藻 4唐^^唐胺聚糖， 按文! ^法（J Biol Chem, 1991, 266 (21):

13530 ·6)提取制备。 纯度 98%(HPGPC,面积归一化法)， ^"量（Mw)， 69800。

H ₂ 0 ₂ ， CH ₃ COONa-3H ₂ 0, NaCl, NaOH, CuCl ₂ , FeCl ₂ , ZnCl ₂ 等所用试剂： 均 为市售分析纯试剂。

1.2方法：

将四份刺参 FG各 5.0g溶解于圓 尧瓶内的 180ml水中， 45°C水浴保温并持续 均匀餅， 分别加入 10ml纯水或 20mmol/L浓度的氯 同 (Cu ²⁺ )溶液、 氯化亚铁 (Fe ²⁺ )溶:^氯化锌（Zn ²⁺ )溶 ，在 2小时内，以 15 ml/h速率滴加 10%的 ¾(¾, 过程中用 1N的 NaOH溶液控制 pH值范围为 7.2 ~ 7.8， 上述 ^牛下连续 半反 应 2 ~ 8小时。 分别于 开始后 30min、 lh、 2h、 6h、 8h从各^ I»i 5ml， 加 入 15mg EDTA二钠盐并混匀 ,冰 7j ^P,加 3 、的 95%乙醇^定多糖， 5ml 60% 乙醇洗涤两遍， 热空气吹干乙醇， 10ml纯水定容， 高效 交色谱（HPGPC )法检测 产物分子量。

1 结果：

在有无第四周期过渡金属离子催化剂存在下， 过氧化氢对刺参 FG的解聚 « 见表 1和附图 1。 表 1: FG 化解聚产物 测

不同时间点的解聚产物分子量 (Da)

、

Omin 30min 60min 120 min 360 min 480 min

¾(¾+纯水 69,800 60,500 58,700 54,100 48,030 41,010

HiOz + Cu ² " 69,800 33,906 21,952 14,996 12,450 8,805

H ₂ (¾+Fe ²⁺ 69,800 343)0 26,700 19,854 16,906 12,400

H ₂ (¾+Zn ²⁺ 69,800 32,805 27,903 18,031 15,762 11,080 表 1的结^ 明， 金属离子 Cu ²⁺ 、 Fe ²⁺ 、 Zn ²⁺ 对 FG的 ^^解¾½«" 有明显的催化作用， 解聚 速率显著提升。 通过比较这三种催化剂的催化效率可 以看出，金属离子 Cu ²⁺ 的催化作用效率较高，其^^ ^豆的时间内实现 dFG的制备。 实施例 2直接过氧化物解聚法与金属离子催化过氧化� �解聚法所得 dFG产物的 NMR图潘检测

2.1材料：

FG: 刺参来源的岩藻糖^ ^唐胺聚糖， 按文^ "法（J Biol Chem, 1991， 266 (21): 13530-6)提取制备。 纯度 98%(HPGPC，面积归一化法)， 量 (Mw), 69800。

H2O2, CH ₃ COONa-3H ₂ 0, NaCl, NaOH, Cu(CH3COO ¾0等所用试剂： 均为 市售分析纯试剂。

2.2方法：

制备 dFG: 将两份刺参 FG各 5.0g溶解于圓 瓦内的 180ml 7j溶液中， 分别 以 70。C和 35。C水浴保温并持续均匀搅拌，然后分别加入 10ml纯水或 60 mmol/L浓 度的乙酸铜 (Cu ² )溶液，继而在 2小时内以 lOml/h速率滴加 10%的 ¾(¾,反应过程 中用 1N的 NaOH溶液控制 pH值范围为 7.2 ~ 7.8。 上述^ ί牛下连续観半 4小时 后，分别向 液中加入 500 mg EDTA二钠盐并混匀，冰 τ ^Ρ,加 3 只的 95。/。 乙醇^定多糖， 离心得; ; 定， 100ml 60%乙醇洗潦两遍， 离心得 H。 ；^定溶解于 150ml水中， 经 001x7型阳离子树脂交 4械钠盐， 然后以截留^ "量 3500Da的透析 膜透析 ό小时， 截留产物 ， 冷冻干燥， 分别得到 3.23g (dFG-l，直接 ¾(¾解聚 产物）和 3.52 g (dFG-2, Cu ²⁺ 催化的 ¾(¾解聚产物）解聚样品。

理^^ ί则： HPGPC ^i则^ ¹ 量及分布； 电导法检测 -OSC ACOa摩尔比。

NMR^i则：

仪器， AVANCEAV400超导核磁共振 [义（瑞士 Bruker公司 400MHz);

溶剂， I¾099.9Atom%D (Norell公司）；

内标， trimethylsilyl-propionic acid (TSP-D4 ); 温度， 45 °C。

2.3结果 检测结果见下表 2。 NMR谱图见附图 2。

表 2: FG、 （^0-1及^0-2的理^^测与>^1 ^^则

NMR检测

才 口口

Mw n GalNAc(CH ₃ ) Ga Ac/

PDI -OS(¾7-COO- (Da) (Da) /Fuc(CH ₃ ) GlcUA*

FG 68,740 63,468 1.08 3.46 1： 1.02 - dFG-1 18,960 11,760 1.61 3.32 1： 0.93 1:0.45 dFG-2 14,930 10,660 1.40 3.45 1:1.00 1:0.08

Mw: 重均^ ^量； Mn: 数均 量； PDI: 量多 指数（PDI=Mw/Mn)

* ι^ ¾糖 尔比 通过 1^ 矣 化 聚、催化 i± 匕 聚的^ ^糾 (70°C/4h, 35°C/4 h)以及两种反应产物的分子量（约 1.9kDa和约 1.5 kDa)可以看出， 在 Cu ²⁺ 离子存 在下， (¾解聚 FG的反应温度^氏， 效率更高。

从两种产物的理化及波谱分析结果可见， dFG-1和 dFG-2的 PDI值均较 FG有 所升高，此与粘多糖的 4 自由 聚特 目符， 而 dFG-2的練 ^目对较低。

从 -OSC ACOa比^ f， dFG-1的值与 FG 4目比 4%,而 dFG-2 无变 化。

根据 NMR甲基信号积^十算的 GalNAcFuc摩尔比（岩藻糖曱基峰信号出 ί½ 约 1.3 ppm, 而乙¾^半 1唐的曱基峰位于约 2.1 ppm )可见， dFG-1较 FG 氐约 9%, 而 dFG-2 无变化。 该结^ ^明， 在 Cu ²⁺ 离子存在下， Η ₂ (¾解聚 FG的过 考 岩藻糖 乎无影响。 显然， 根据直接±^t^解^斤得 dFG-1的 Fuc比例 变化可以判断， 直接 化解聚可导 ¾ ^藻糖«酯 胜»。

从附图 3A可以判断解聚产物 端的 GalNAc及 GlcUA的摩尔比， 其中 非还原 端以及多糖主链中的 GalNAc及 GlcUA的桥头氢均为 β~构型， 其 NMR 信号出现约 4.4 ~4.6 ppm之间， 而 ' 端 GaJNAc及 GlcUA各存在约半数的 α- 构型桥头氢。 ^l H NMR谱图中 GalNAc及 GlcUA的 α-构型桥头氢均出 ί½约 5.2 ~ 5.3 ppm, 两者难以区分，但与它们相关的 H2#^J化学^ ^多分别出现约 4.2 ~ 4.5 ppm和 3.6 ~3.9 ppm, 因此可以 目关 " 普图中予以区分（原型 FG因^ "量较大， 末端糖 基数较少而难以获得足够强的区分信号 )。

从附图 3B推算可知，在 dGAG-1和 dGAG-2的 ' 端上的 GalNAc与 GlcUA 的摩尔比分别为约 1： 0.45和约 1： 0.08,由此可见， Cu ²⁺ 催化的¾化 聚法对 FG 中的 GalNAc β (1→4)糖 具有^； 的选择i。

本发明的研究结 明， 金属离子催化可以显著提高 it^t^解聚法对糖苦鍵 的选棒 f生。尽管有 ¾iiCu ²⁺ 离子催^ ^ t 的 勿解聚过程中^示出一定的 选择 f生， ^"确切机制不明。 根据解¾½机制判断， 本发明之催化解¾½的选 生应与催化剂对自由基 不同类型糖^ ^的活化能的影响有所差异有关。

本发明的研究结果½i¾， 对于 FG的金属离子催化的过氧化物解聚法， dFG 产物中以 GalNAc为还原 端的聚糖分子数通常可达 80%以上， 而本实施例中， 以 GalNAc为 '1¾端的比例已 95%。 实施例 3直接± 解聚法与金属离子催化 ijA化物解聚法制备的 dFG的重复性 和可控性比较

3.1材料：

同 2.1

3.2方法：

直接 化氢法解聚 F& 五份刺参 FG各 300g溶解于 9L水中， 60°C水浴保 温并持续均匀 半，继而在 2小时内以 0.6L/h速率滴加 15%的 (¾， 过程中用 1 N的 NaOH溶液控制 pH值范围为 7.2 ~ 7.8。 该 ^牛下连续 半^ ^ 6.5小时后， 分别向 液中加入 3.0g EDTA二钠盐并混匀， 冰 加 3 ^、的 95%乙醇 '； 定多糖， 离心得、; J定, 用 0.6L60%乙醇洗涤两遍， 然后溶于 10L水中以截留 量 3000Da的改良纤维素 ¾滤、 6小时，截留产物 ，冷冻干燥，计算产物得率并 检测产物 量及其分布。

Cu ²⁺ 催化的过氧化氢法解聚 FG:五份刺参 FG各 300g溶解于 9L水中， 45。C水 浴保温并持续均匀 4 半， 然后分别加入 0.6L纯水或 20mmol/L浓度的乙酸铜 ( Cu ²⁺ ) 溶液， 继而在 2小时内以 0.6L/h速率滴加 15%的 H ₂ 0 ₂ ， ^^过程中用 1 N的 NaOH 溶液控制 pH值范围为 7.2 ~ 7.8。 该^ (牛下连续 4 半 4小时后， 分别向 液中 加入 3.0g EDTA二钠盐并混匀， 冰 7j Hp， 加 3 ^^P、的 95%乙醇; ¾ί定多糖， 离心 得沉淀， 用 0.6L 60%乙醇洗涤两遍， 然后溶于 10L水中以截留分子量 3000Da的改 良纤维素舰滤 6小时， 截留产物 ， 冷冻干燥， 计算产物得率并检测产物^" 量及其分布。

3.3结果

结果 3。 表 3: 直接过氧化氢解聚 FG及 (^ ²⁺ 催化 化氢解聚 FG的产物

解!^法 产物 Mw (Da) Mn (Da) PDI

1 17,360 10200 1.70

2 19,320 12350 1.56 直接 3 18,690 13,100 1.43

化嬉聚 4 16,780 11,560 1.45

5 16,820 9,980 1.69

RSD(%) 6.47 11.78 8.16

1 10,500 8,040 1.31

2 11,020 8,760 1.26

Cu ²⁺ 催化

3 10,780 7,900 1.36

的 化

娜聚 4 10,660 7,890 1.35

5 11340 8,030 1.41

RSD(%) 3.03 4.46 4.20

Mw: 重均 量， Mn: 数均^ ^量， PDI: 量多^ L指数（PDI = Mw/Mn)

RSD: 相对标准偏差

表 3的结果显示， 直接 化 ¾^斤得 dFG产物^ "量批间差异较大， 其重 均分子量和数均分子量的 RSD值均大于 5%; 而催化 化氢解聚所得产物^ ^量 批间差异较小， 其重均 量和数均^ "量的 RSD值均小于 5 %。 而且， 直接± L 化氢解聚所得产物 Mw、 Mn、 PDI三项检测值的 RSD均明显大于根据本发明的方法 所得的产物， 表明本发明的催化过氧化氢解聚法有更好的稳 定性和可控性。 实施例 4 ^度金属离子催化¾化物法解聚玉 参粗多糖

4.1材料：

玉 ^参： 市售品种

试剂： 同 2.1

4.2方法：

玉 ^参岩藻糖條胺斜綱唐的制备 (参考文 法制备 ):取干燥玉 参 1000g,粉碎， ^ 浴 器中， 加入 10L 浸泡。加入固体氢氧化钟至浓度 为 1N， 60°C恒温籍 100min。 冷却后， ό N盐酸调 pH值为 8.5, 加入 50g胰 蛋白酶， 50°C下保温 3小时。 后， 离心去 ϋ。 取上清液， 用盐酸调 节 pH值为 2.5， 离心去除酸性蛋白^定。 取上清液， 加 2N NaOH溶液中和， 离心 ^冗淀。 取上清液， 加 95 %乙醇使其浓度达 60%， 4。C 过夜。 离心得沉淀， 加 10倍重量的水 ， 离心去除不 ¾4勿。 取上清液， 加醋酸钾» ^溶 4吏其最终浓度 为 2.0mol/L, 加 95 %乙醇至其最终 ^ ^ 为 30% , 静置沉淀。 离心得到的沉淀， 依次用 95 %乙醇、 无水乙醇洗涤， 减压真空干燥， 即得 4：¾参多糖 8.1 g。

Cu ²⁺ 催化的 化氢法解聚 FG:五份玉 参粗多糖各 5.0g溶解于圓;^尧瓶内 的 190ml水中， 35。C水浴 ί显并 ^均匀観半， 然后分别加入 50mmol/L浓度的乙 酸铜 (Cu ²⁺ )溶液 10ml, 继而以 lOml/h速率滴加 10 %的 H ₂ 0 ₂ ，反应过程中用 1 N的 NaOH溶液控制 pH值范围为 7.2 ~ 7.8。 上述 ^牛下连续^ ^半^ 3小时后， 分别向 液中加入 500mg EDTA二钠盐并混匀， 冰 7j p, 加 3 的 95 %乙醇 ϋ 多糖， 离心得^定， 用 100ml 60%乙醇洗涤两遍， 100ml 7J溶后， 加醋酸钟観 溶使其最终浓 2.0mol/L，静置过夜， 离心收集;^定， 100ml水溶， 然后以截留分 子量 3500Da的透析膜透析 8小时，截留产物冷冻干燥，计算产物得率并� �测产物分 子量及分布。

一定离子强度下的 Cu ²⁺ 催化的 i l 匕氢法解聚 F&五份玉 参粗多糖各 5.0g 溶解于圓^ 瓦内含有 12.21g三水合乙酸钠和 6.02g氯 ! ¾的 190ml水中， 35。C水 浴保温并機均匀餅，然后分别加入 50mmol/L浓度的乙酸铜 ( Cu ²⁺ )溶液 10ml, 继而以 lOml/h速率滴力口 10 %的 (¾， 过程中用 1N的 NaOH溶液控制 pH值范 围为 7.2 ~ 7.8。上述^ ί牛下连续4¾！半^ ^ 4小时后，分别向 液中加入 500mg EDTA 二钠盐并混匀，冰 τ ^Ρ,加 3 ^Μ?、的 95 %乙醇^ ^定多糖， 离心得 iKJ定, 100ml 60 %乙醇洗涤两遍， 100ml水溶后，加醋酸钾^^ ^溶使其最终浓度为 2.0mol/L，静置 过夜，离心收集^定， 100ml水溶，然后以截留^ 量 3500Da的透析膜透析 8小时， 截留产物冷冻干燥， 计算产物得率并 '浐物^ "量及分布。

4.3 结果

结果 4。

表 4: 玉 ^参粗多糖的 化氢法解聚

解¾ ^法 产物 4^欠 Mn (Da) PDI

1 13,320 9,560 1.39

2 11,090 8270 1.34

Cu ²⁺ 催化 3 9,790 7,120 1.38

匕氢

解聚 4 12,800 9,430 1.36

5 10,750 8,040 1.34

RSD (%) 12.70 12.01 0.84 1 11,690 8,660 1.35

1.0 M离子 2 11,720 8,450 1.39

强度下的

Cu ²⁺ 催化 ³ 12,030 9,030 1.33

化 10,940 8,140 1.34 聚

5 11,830 ¾530 1.38

RSD(%) 3.60 3.79 1.91

Mw: 重均^ "量， Mn: 数均^ ^量， PDI: ^^量多^ t指数 (PDI = Mw/Mn)

RSD: 相对标准偏差

表 4的结果显示， 对于粗多糖而言， 由于其杂质含量相对较高， 此时采用金属 离子催化的 化 聚， 其所得产物仍然可肯 在较大的批间差异， 其主要表现 在平均分子量存在明显差异（RSD>10% )， 而分散系 差异。

向反应介质中添加一定强度的无才 或有机离子， 可显著改善解聚反应的重复 性， 尽管添加这些离子可能^ J≥速率 ^一定程度的 氐。 ^或有机离子改 善反应重复性的机制尚未完全清楚， 认为可能与维持多糖稳定的构象有关。

本发明的相关研究表明， 不同种属海参来源的非纯净 FG的±| 匕解聚反应中， 对于所 ii LW或有机离子， 适宜的阳离子强度约为 O.lmol/L至 1.0mol/L。 实施例 5低 藻糖^ ^唐胺聚糖 (dFG )的^ k活性

5.1材料

系列玉 ^参 dFG: Mw分别为 25,380、 18，050、 14,350、 11,450、 8,800。按实 施例 4.中 Cu ²⁺ 催化的解聚法制备（解聚时间不同)；

试剂： 兔贫血小^ 浆， 广州蕊特生物科技有限公司；

活化部分凝血活酶时间 （ΑΡΤΓ )测定试剂盒（鞣花酸)： 上海太阳生物技术有 限公司

仪器： BICO双信 it r¾仪， Minivolt公司 （意大利）。

5.2方法

准确雜 ^ 羊品 13.0mg, 溶解定溶至 100ml, 然后稀針倍。 按试剂盒说明书 的方法测各样品的 ΑΡΤΓ时间， 扣除空白血浆的凝血时间， 即是样品延长凝血的时 间 ΔΑΡΤΤ ( Sec )。

5.3结果

实 3^果如表 5所示。 表 5: 玉足海参来源的不同分子量的 dFG对家兔血浆 ΑΡΊΤ时间的影响

dFG 量

25 80 18,050 14^50 11,450 8,800 (Mw )

AAPTT(Sec) 95.1 76.0 64.2 40.9 15.3 表 5中的结^^示， 玉 参来源的 dFG可以 延长 浆 ΑΡΤΓ时间， 表 明其能够抑制内源性¾1。 实施例 6低> ^藻糖化糖胺聚糖 (dFG )的冻干制品

6.1材料

刺参 dFG: Mw 14,350。 按实施例 3中 Cu ²⁺ 催化的解聚法制备。

20mmol/LpH7.0磷酸緩沖液（PBS )

6.2处方

6.3制备工艺

称舉处方量的刺参 dFG 20mmol/L pH 7.0 PBS至全量， 解 完全。 加入 0.6%的药用活性炭， 半 20min; 布氏漏斗及 3.0μπι微孔滤舰炭 虑。 测中间体^ f：。合格后用 0.22μιη的微 lUi膜±虑； 灌装于管制西林瓶中，每 瓶 0.5ml, 灌装过程监测装量， 半压塞， 置冷冻干腐 g内， ^^的冻干曲线进行冻 干， 压塞， 出箱， 轧盖， 目 4佥合格， 得成品。

冻干过程： 将样品进箱， 降隔板温至 > 0。C， 保持 3h; 冷阱降至 -50。C， 开始抽 真空至 300nbar。 开始升华： lh匀速升温至 -30。C, ^ 2h; 2h匀速升温至 -20。C，

8h， 真空^ 200 ~300 bar; 再进行干燥： 2h升温至 -5。C, ^ 2h, 真空

150 ~ 200Mbar; 0.5h升温至 10。C， 2h，真空^ 80 ~ lOOnbar; 0.5h升温至 40。C，

4h， 真空抽至最低。