本发明涉及生物免疫学检测领域，具体涉及一 种用于检测 25-羟基维生素 D的检测剂 及其制备方法和应用。 背景技术

维生素 D是一种脂溶性维生素。 人体中的维生素 D仅有小部分来源于食物（< 10%) , 体内所需的维生素 D的 90%来源亍阳光中紫外线照射皮肤产生。 维生素 D在体内出现的主 要形式是维生素 D2 (麦角钙化醇） 和维生素 D3 (服钙化醇） 。 维生素 D2的营养来源主要 是一些蔬菜、 酵母和真菌类食物， 维生素 D3是由皮下的 7脱氢胆固醇在阳光的作用下转 化而成。

食物源和自身合成的维生素 D2和维生素 D3经血液循环进入肝脏，在 25-羟化鷗作用下 分别转化为 25- OH维生素 D2和 25- OH维生素 D3 , 总称为 25- OH维生素 D。 血清或血浆中 25- OH维生素 D的含量能反映事物摄入和自身合成的维生素 D总量， 因此 25- OH维生素 D是 衡量维生素 D营养状态的最佳指标。

25-羟基维生素 I)是人体内存储维生素 D的主要形式，是人体内代谢活动不可缺少的� � 养物质。除了具有传统意义上的骨骼效应，还 具有影响自身免疫疾病、心血管病、糖尿病、 肿瘤等非骨骼效应。 研究发现， 维生素 D缺乏会直接影响人类基因的表达， 这些基因与风 湿性关节炎和糖尿病等众多疾病有关。

目前，临床上对维生素 D的定量检测巳成为常规检测项目和体检项目� �建立一种快速, 简便， 灵敏， 准确可靠的检测维生素 D水平的方法尤为重要。 25-羟基维生素 D的定量检测 主要有理化检验方法和免疫学方法。理化检验 方法采^液相色谱-质谱联 ^技术 (LC MS ) , 由于存在伩器昂贵、 样本前处理复杂、 过程繁琐费^等缺陷， 该方法的应用受到限制。 免 疫学方法具有灵敏、 快速、 特异和简便等优势， 现在成为维生素 D测定的主流方法。 在目 前的市场上， 用于测定 25-径基维生素 D的主流产品是意大利 Diasorin公司生产的检测试剂 盒， 检测方法是采 ^标记 ABEI (N-(4-氨丁基) 乙基异鲁米诺） 的 25-羟基维生素 D抗原 衍生物和样本中的抗原与包被于磁性微球上的 25-羟基维生素 D抗体竞争结合， 然后加入 激发底物产生发光信号， 从而实现 25-羟基维生素 [)的定量检测， 图 1更形象地展示了其操 作原理 （具体操作步骤及实验条件可参考其 DiaSomi- VD说明书） 。 在检测过程中， 标记 ABEI的 25羟基维生素 D抗原衍生物的稳定性是影响检测稳定性的最� �要的因素， 而 25 羟基维生素 D抗原衍生物是一种稳定性差， 遇光、 遇热等都会导致活性下降的物质， 因此 上述检测试剂盒中的试剂稳定性差， 活性易下降。

因此， 免疫学竞争法测定所采用的 25-羟基维生素 D抗原衍生物的不稳定性导致了 25- 羟基维生素 D免疫学方法测定试剂不能长期稳定地保存， 从而影响其使用和检测结果， 且 保存条件苛刻， 不方便储存和运输， 这成为目前此类方法大规模商品化应用的瓶颈 。 发明内容

针对以上缺陷， 本发明提供一种用于检测 25羟基维生素 D的检测剂， 其是将 25-羟 基维生素 D抗原衍生物偶联至载体蛋白后固定到磁性徵� �上， 通过固定至磁性微球使得 抗原衍生物的稳定性得到显著提高，同^该衍� �物的特定结构使得 25-羟基维生素 D的测 定更加准确。

本发明还提供了上述用于检测 25羟基维生素 D的检测剂的制备方法以及采用上述检 测剂对 25-羟基维生素 D进行免疫学检测的方法， 还提供了包含所述 25-羟基维生素 D检 测剂的试齐 il盒。

根据本发明， 提供了一种用于检测 25-羟基维生素 D的检测剂， 其包括 25-羟基维生 素 D抗原衍生物与蛋白载体形成的偶联物， 以及被所述偶联物包被的磁球。

在现有技术中， 用于检测 25-羟基维生素 D的 25-羟基维生素 D抗原衍生物被发光标 记物标记， 而 25-羟基维生素 D抗体则包被磁球， 其作用原理如图 1所示。 然而， 该产品 存在稳定性较差的缺点。 因为 25-羟基维生素 I)抗原衍生物具有光敏性， 且容易被氧化， 用发光标记物标记 25-羟基维生素 D抗原衍生物的过程中容易造成其部分失活，� �且发光 标记物标记的 25-羟基维生素 D抗原衍生物在溶液中的长期稳定性不好，容� �造成活性下 降。 因此， 用于检测 25-羟基维生素 D的这类检测剂的保存条件较为苛刻， 稳定性较差， 从而造成使用期限较短、 使用效果较差。

本发明将 25-羟基维生素 D抗原衍生物包被在圏相载体磁球上， 一方面减少了 25-羟 基维生素 D抗原衍生物分子的自由度，另一方面磁球的� �色屏蔽了部分光照对 25-羟基维 生素 D抗原衍生物分子的影响， 因此大大增强了 25-羟基维生素 D抗原衍生物在溶液中 的稳定性， 从而可以延长其有效使用期限以及提高测定结 果的准确性。

在本发明中，用于制备所述检测剂的 25-羟基维生素 D抗原衍生物可以是本领域中常 用的，例如在美国专利申请 US20130059825A1中所描述的 25-羟基维生素 D抗原衍生物， 该专利申请的内容通过引用而并入本文中。

在一些具体实施方案中， 25羟基维生素 D抗原衍生物具有如下结构式 （I) ：

（I ) 其中， m为 0、 1、 2或 3 , n为 2、 3、 4、 5或 6。

如式（I)所示的 25 -羟基维生素 D抗原衍生物是^于测定 25-羟基维生素 D的有用的 试剂， 能够同时识别 25-羟基维生素 D2和 25 -羟基维生素 D3。 本发明将具有该所示特定 结构的 25-羟基维生素 D抗原衍生物偶联与蛋白载体上， 并进一步包被磁球， 以此极大改 善了其稳定性。本发明的发明人注意到， 这类 25-羟基维生素 D抗原衍生物具有一定长度 的侧链（即在维生素 D基本结构的 C22位置上引入一段连接臂） ， 针对这类抗原衍生物， 将其偶联至蛋白载体并包被磁球 ^1% 由于维生素 D基本结构和蛋白载体之间通 ϋ一定长 度的链来桥接， 因而可以减小空间效应， 显著地限刺该抗原衍生物分子的活动性， 减少分 子的自由度；再进一步地借助磁球屏蔽部分光 照对该抗原衍生物分子的影响， 即可以大大 提高这类抗原衍生物的稳定性，减少了储存和 运输过程对该抗原衍生物的影响，从而延长 其有效使用期限； 同时'， 由亍该抗原衍生物分子的活动性受到限制， 分子的自由度减少， 更有利于于抗体结合的位点的暴露， 因而有利亍抗原衍生物与抗体的结合，提高了 抗原衍 生物与抗体结合的特异性， 从而提高测定结果的准确性， 使测定结果更加接近真实值。本 发明的发明人还采用 25-羟基维生素 D抗原进行了对比试验， 即将 25-羟基维生素 D抗原 与蛋白载体偶联， 然后包被磁球， 并采用该产品对一系列样品进行检测。将该检 测结果与 采^ LC-MS对同样的样品进行检测的结果进行比较， 发现两种方法的检测结果的线性相 关性并不如本发明采用 25-羟基维生素 D抗原衍生物所提供的检测齐 ij对样品进行检测的结 果与相应的 LC- MS检测结果的线性相关性好。

适合用于本发明的蛋白载体可以是动物源性或 人源性蛋白，包括但不限于牛血清白蛋 白 （BSA) , 阳离子牛血清白蛋白 （cBSA ) 、 血蓝蛋白 （KLH) 、 卵清蛋白 （OVA) 、 血清白蛋白 HAS、牛 γ球蛋白和人 γ球蛋白。蛋白载体可以介导 25-羟基维生素 D抗原衍 生物与抗体之间的结合。 并且， 在本发明中， 蛋白载体起到连接 25-羟基维生素 D抗原衍 生物与磁球的桥梁作用，使得所述抗原衍生物 与蛋白载体偶联之后进一步与磁球结合形成 一个整体的检测剂， 从而提高抗原衍生物的稳定性。

在此所述使用的磁球可以是空心或实心的， 也可以是多孔的， 但不限于这几种形式。 在磁球是多孔磁球的情况下，所述偶联物还存 在于磁球的孔隙中。本发明所使用的磁球优 选为球形，这样能够使所述偶联物更加均匀地 包被磁球，认而能够减少在所获得检测齐 ij的 使用中的非特异性吸附， 进而提供结果的准确性。 在本发明中， 优选粒径为 0.5μπι- 5μίΏ， 并进一步优选为 0.8- 3.0μπι 的磁球。 该粒径范围既能使磁球在溶液中具有良好的分 散性， 又能满足免疫分析对固相载体粒径范围的要求 。

为了使所述偶联物和磁球之间形成较为稳定的 连接关系，本发明所采用的磁球表面带 有功能修饰基团，所述修饰基 用亍直接或间接地与 25-羟基维生素 D与蛋白载体形成的 偶联物连接， 包括但不限于环氧基、 磺酸基、 羧基、 氨基、 醛基、 酷胺基、 巯基和羟基中 的一种或多种。 当磁球表面带有例如羧基、 氨基、 羟基、 巯基等官能团时， 磁球可以直接 与所述偶联物缩合连接； 当磁球表面带有其他官能基团时，通常需要通 过本领域中公知技 术手段将磁球进一步修饰活化， 使其带有能够与所述偶联物化学键合的官能基 团。

本发明还提供了一种如上所述的用于检测 25-羟基维生素 D的检测剂的制备方法，包 括使用 25-羟基维生素 D抗原衍生物和蛋白载体形成的偶联物包被磁� �。应理解， 该包被 过程包括两种情况，一种是首先将 25-羟基维生素 D抗原衍生物和蛋白载体偶联形成偶联 物， 然后再将其包被磁球； 另一种情况是 25-羟基维生素 D抗原衍生物和蛋白载体的偶联 反应与对磁球的包被作用同^进行。

在一些具体实施方案中，上述方法还包括在包 被磁球之前，使用第一活化剂将磁球进 行活化处理， 并将经所述活化处理后的磁球（例如以 1- 100 mg/ _m l的浓度） 分散于缓冲液 中， 并加入 25羟基维生素 D抗原衍生物与蛋白载体形成的偶联物 （例如以 1-20μ _§ 每毫 克磁球的量加入）进行反应， 经固液分离， 清洗固体， 得到所述检测剂； 其中， 所述第一 活化剂为 Ν, Ν-二环己基碳二亚胺（DCC)和 1- (3-二甲基氨基丙基)- 3乙基碳二亚胺 &酸 盐 （EDC) 中的至少一种或其与 N-羟基琥 ¾酸亚胺 （NHS) 和 N-羟基琥珀酰亚胺磺酸钠 盐中的至少一种的混合物。 上述缓冲液包括但不限于碳酸盐缓冲液、磷酸 盐缓冲液、硼酸 盐缓冲液和 Tris缓冲液。

在一些实施方案中，上述方法还包括 25-羟基维生素 D抗原衍生物与蛋白载体形成的 偶联物的制备步骤，所述制备步骤包括使所述 25-羟基维生素 D抗原衍生物和所述蛋白载 体在偶联剂和溶剂的存在下进行偶联反应生成 所述偶联物:其中，所述偶联剂选自戊二醛、 Ν,Ν'-二琥珀 ¾亚胺基碳酸酯中的至少一种； 和 /或所述溶剂选自二甲基甲酷胺、 二甲基亚 ¾¾、 丙酮、 氯仿中的至少一种。

在另一些实施方案中， 25-羟基维生素 D抗原衍生物和蛋白载体的偶联物的制备步 骤包括： m) 使 25-羟基维生素 D抗原衍生物带有羧基， 并使用第二活化剂进行活化； n) 将活化后的 25-羟基维生素 D抗原衍生物与蛋白载体在溶剂的存在下进行� �联，经分离得 到所述偶联物； 其中， 所述第二活化剂可以为 N-羟基琥珀酰亚胺和 N-羟基琥珀酰亚胺磺 酸钠盆中的至少一种和 N， N-二环己基碳二亚胺、 1- (3-二甲基氨基丙基)- 3-乙基碳二亚胺 盆酸盐中的至少一种的混合物； 和 /或所述溶剂可以选自二 ^基甲酰胺 （DMF) 、 二甲基 亚砜、 丙酮、 氯仿中的至少一种。 在一个具体实施方案中， 在歩骤 m) 中使 25-羟基维生 素 D抗原衍生物与环状酸酐反应而引入羧基基团� � 所述环状酸酐可以是任意环状的二元 酸酐， 例如可以选自丁二酸酐、 戊二酸酐和二甘醇酸 S中的至少一种。

在一个具体实施方案中， 所述 25-羟基维生素 D 抗原衍生物与蛋白载体的摩尔比为 10-20:1 , 优选为 15:1。 本发明选择该摩尔比既保证连接到蛋白载体上 的抗原衍生物分子 的数量， 又保证了后续的蛋白载体能有效连接到磁球上 。

本发明还提供了一种用亍检测 25羟基维生素 D的免疫学方法， 包括使结合标记物的 25-羟基维生素 D抗体和如上所述的检测剂与待测样本中的 25-羟基维生素 D竞争结合。 认而测定样本中的 25-羟基维生素 D的含量。其中，所述标记物包括但不限于荧� �标记物、 发光标记物、 生物素标记物、 金标记物和酶标记物。 当采] ¾不同的标记物时， 最后的检测 参数或信号的获取方式和手段相应不同，但均 为本领域技术人员所公知的技术，例如隨联 免疫检测或化学发光检测方法。

本发明还具体地提供了一种用于检测 25-羟基维生素 [)的发光免疫学方法 （例如图 2 所示) , 包括如下歩骤： a) 将待测样本与发光标记物标记的 25-羟基维生素 I)抗体进行 温育，其中温育温度在常规的温育温度不即可 ，例如在 4- 40°C，温育时间可以是 30- 180mm; b) 向歩骤 a) 的混合物中加入本发明提供的如上所述的检测 剂， 使所述发光标记物标记 的 25-羟基维生素 D抗体与所述检测剂和待测样本中的 25羟基维生素 D竞争结合； c) 磁分离， 得到发光标记物标记的 25-羟基维生素 D抗体与所述检测剂的结合物； d) 向步 骤 c)得到的结合物中加入激发底物， 使其产生发光信号； e)根据歩骤 d)测定的发光信 号强度计算待测样本中的 25-羟基维生素 D含量。具体地， 可以将测试样本所产生的发光 信号强度与采用 25维生素 D抗原标准品进行测试所得出的标准曲线进行� �照， 即可获知 样本中 25维生素 D抗原的含量。 其中， 所述待测样本含有待测含量的 25-羟基维生素 D。 所述发光标记物例如可以是 ABEI。

此外， 本发明还提供了一种 25-羟基维生素 [)免疫学检测试剂盒， 该试剂盒包括结合 标记物的 25-羟基维生素 D抗体， 以及如上所述的 25-羟基维生素 D检测剂。 其中， 所述 标记物包括但不限亍荧光标记物、 发光标记物、 生物素标记物、 金标记物和酶标记物。在 一些实施方案中， 所述试剂盒还包括置换剂 （例如 8-苯胺 -！-萘磺酸 CANS) ) 、 洗涤液、 维生素 D标准品、 底物显色液、 反应终止液中的一种或多种。 由于本发明提供的试剂盒 中使用了本发明提供的 25-羟基维生素 D检测剂， 因而其稳定性得以提高， 有效使用期限 延长， 测定结果的准确性得以提高。

本发明首次提出将 25-羟基维生素 [)抗原衍生物与蛋白载体偶联形成偶联物，并� ��偶 联物包覆磁球， 从而形成 25-羟基维生素 I)检测剂。 通过 25-羟基维生素 I)抗原衍生物与 蛋白载体以及固相载体磁球的相互协同作用， 使得 25羟基维生素 D抗原衍生物的稳定性 显著提高， 即获得具有良好的稳定性的检测剂， 并 ϋ所采用的 25-羟基维生素 D抗原衍生 物经过蛋白载体和磁球的修饰之后，其与抗体 结合的特异性也得到提高， 因此本发明所提 供的 25 -羟基维生素 D检测剂改善了现有技术中由于 25-羟基维生素 D抗原衍生物不稳定 而造成相关试剂盒保质期限比较有限或相关检 测过程的不稳定性和结果不准确性等缺陷。 并且， 所述 25 -羟基维生素 D检测剂的制备方法简单易行。 此外， 采用本发明提供的检测 剂能够构成稳定性好、 准确度高、 通用性强的 25-羟基维生素 D检测试剂盒， 可实现 25- 羟基维生素 D的大批量的 ft速检测。 附图说明

图 1是根据意大利 D sorin公司提供的 25-羟基维生素 D检测试剂盒 DiaSorm- VD说 明书的检测原理示意图； 其中， 图中标记的意义如下：

样本中的 25-羟基维生素 D 磁球 样本中的其他成分

25-羟基维生素 D抗体 ₄ ¾,

标记 !的 ₂₅ 福维生 _{¾ D} « ^ 包被 25-»基维生素 D抗体的磁球 图 2是根据本发明的 25-羟基维生素 : D检测原理示意图； 其中， 图中标记的意义如 卜；

^ 样本中的 2 ⁵ -羟基维生素 球.： 样本中

i 25-¾¾ii生素 D抗体 ¾

. ₄ . . 包 羟基逯生素 D抗原衍生¾的感 ¾·■ 图 3是分别采用本发明提供的 25-羟基维生素 D检测剂和 LC- MS对 70个样本的 25 羟基维生素 D含量的测定结果的线性拟合图。

图 4是包含本发明提供的 25-羟基维生素 D检测剂的 25 -羟基维生素 D检测试剂盒 ( 1A、 2A、 3A)、 包含标记物标记的 25羟基维生素 D抗原衍生物的试¾盒（1B、 2B、 3B) 以及市售 25羟基维生素 D检测试剂盒 （1C、 2C、 3C) 的加速稳定性测试结果对比 图。 具体实施方式

下面将通过具体实施例对本发明做进一步说明 ，但应理解，本发明的范围并不限亍此。 实施例 1 25-羟基维生素 I)检测剂 M的制备

1.1 ) 25-羟基维生素 D抗原衍生物与蛋白载体的偶联物的形成

将 mg 25-羟基维生素 D抗原衍生物 M， （在式 （I) 中 m = 0， n = 4) 、 0,262 mg丁 二酸酐和 0.37 μΐ三乙胺（催化剂）溶于无水 DMF中，在氩气保护下， 室温避光反应 4 h; 再加入 0.25 mg NHS和 1.3 mg :DCC, 在氩气保护下， 室温避光静置过夜； 然后将该溶液 缓慢滴加到牛 γ球蛋白 (20 mg牛 γ球蛋白溶于 2 ml 0.1mol/L NaHC0 ₃ ) 溶液中， 室温搅 拌反应 4 h; 离心去沉淀， 上清液用 G25凝胶柱纯化， 收集的蛋白峰 （洗脱液； O.l mol L 磷酸盐缓冲液 （PBS) , pH 7.4) ， 即得到 25-羟基维生素 D抗原衍生物 M'与蛋白载体的 偶联物。

L2) 磁球的活化

取一定量的磁球（Merck公司生产的 Estapor系列羧基化微球 Ml- 180/20)纳米磁球， 按每毫克磁球加入 0,5 mg的 DCC, 然后加入 DMF溶液使磁球的浓度为 20 mg/mi, 置于 在 38Ό水浴锅中并振摇或者机械搅拌 2小时。

1 .3 ) 磁球的包被

将歩骤 .2) 活化好的纳米磁球溶液去除上清液， 然后加入 pH 9.5的碳酸盐缓冲液， 使其浓度达到 20 ffig/ml (以纳米磁球计） ； 再以每毫克磁球 10 μ ₈ 的量添加 25羟基维生 素 D抗原衍生物与蛋白载体形成的偶联物， 然后置于室温震摇反应 2小时。 磁性分离， 用洗液 （0.5% BSA溶液） 清洗固体三遍， 得到包被好 25-羟基维生素 D抗原衍生物和蛋 白载体偶联物的磁球， 即本发明所述检测剂。将该获得的检测剂加入 稀释液（碳酸盐缓冲 液， 也可以是磷酸盐缓冲液、 硼酸盐缓冲液或 Tris 缓冲液） 中， 使其浓度为 l mg/ml， 备 用。 实施例 2 25-羟基维生素 D的检测

采^实施例 1制备的 25-羟基维生素 D检测剂，通过化学发光检测方式检测样本中� � 25-羟基维生素 [)含量。 2.1 ) 25-羟基维生素 D抗体的标记

取 1 mg 25-羟基维生素 D抗体， 用 0, 1 mol/L碳酸盐缓冲液（pH 9.5 )将其体积调至 1 mi, 然后放入透祈袋中， 并置于 pH 9.5碳酸盐缓冲液中透析 1小时。 取 ¾透析好的 25- 羟基维生素 D抗体， 加入 100 fig ABEI-半琥珀酰胺酸 - NHS, 室温震摇 1„5小时。

安装好 G- 25凝胶柱， 用纯化水洗脱千净后， 再用 pH值 7,4的 PBS缓冲液进行平衡 洗脱。 G- 25凝胶柱平衡洗脱完毕后， 将标记好 ABEI的 25-羟基维生素: D抗体过柱纯化， 然后收集出现峰值的蛋白溶液。 将收集好的蛋白溶液， 加入等体积的含 5%的 BSA的保 护液， 加入稀释液稀释至 0.15 μ _§ /η 1。

2.2 ) 化学发光检测

检测方法如下- 利用新产业生物医学工程股份有限公司的 Magiuim系列化学发光测定仪测量。将 100 μΐ样本、 50 μΐ置换剂 （例如 ANS ) 与 100 μΐ ΑΒΕΙ标记的 25 -羟基维生素 D单克隆抗体 混合， 温育 10分钟； 加入 20 μΐ实施例 1中步骤 1„3 ) 制备得到的的 25-羟基维生素 D抗 原衍生物标记的磁性徵球 （即本发明制备的检测剂） 备用溶液， 温育 10 miii。 使^磁板 使反应液中的磁球被分离， 去除上清液， 加入 400 μ1清洗液 （Tri^HCl溶液） 清洗：三次。 加入化学发光激发物， 监测 3秒钟内发出的相对光强度（RLU) 。 参照在相同条件下测定 不同浓度的 25-羟基维生素 D标准品溶液的发光信号强度所建立的 25-羟基维生素 D浓度 和发光信号强度的标准曲线来计算所测样本中 的 25-羟基维生素 D的含量。

采用该方法检测 70个不同样本中的 25-羟基维生素 I)的量。

采用 LC-MS检测与实施例 2的 2.2中相同的 70个样本中的 25-羟基维生素 D的量， 并将实施例 2的检测结果和本对比例的检测结果进行线性� �归， 如图 3所示。

由图 3可见，采用本发明提供羟基维生素 D检测别及相应的检测方法对 70个不同样 本进行测定的结果与采用 LC- MS 的测定结果的线性回归相关系数为 0.924， 说明了通过 本发明提供的检测方法获得的测定结果与通过 采用 LC-MS设备获得的测定结果很接近， 进而说明了本发明提供的检测方法的准确性很 高， 特异性好。

1.1 ) 25-羟基维生素 D ₃ 与蛋白载体的偶联物的形成

将 1 mg 25-羟基维生素 1¾溶于 0.1 ml无水吡啶中， 加入 12.5 mg丁二酸酐， 在氩气 保护下， 室温避光反应 4天，将反应混合物加入到 10 ml乙酸乙酯中，依次用水、稀盐酸、 水洗涤, 无水硫酸钠千燥， 过滤， 滤液 （有机相） 经真空千燥得到 25-羟基维生素 D ₃ -3- 半琥 ¾酸酯； 将 1 mg25-羟基维生素 D ₃ - 3-半琥珀酸酯溶于 0,5 mi无水二氯甲垸中， 加入 (K28 mg NHS禾 t! 0.37 mg EDC, 室温搅拌过夜， 用水洗涤有机相， 无水硫酸钠干燥， 过滤， 滤液 （有机相） 经真空千燥得到 25-羟基维生素 D ₃ - 3-半琥珀酸酯的活化酯， 然后将 Img 该活化酯溶于 100 μί DMF, 该其缓慢滴加到牛 γ球蛋白 （20 mg牛 γ球蛋白溶于 2 ml 0.1 _mO l/L Na:HCO ₃ )溶液中， 室温搅拌反应 4 h; 离心去沉淀， 上清液用 G25凝胶柱纯化， 收集的蛋白錄 （洗脱液： 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液 （PBS ) , pH 7.4) , 即得到 25-羟基维 生素 与蛋白载体的偶联物。

1.2 ) 磁球的活化

取一定量的磁球（Merck公司生产的 Estapor系列羧基化微球 Ml- 80/20)纳米磁球， 按每毫克磁球加入 0„5 mg的 DCC, 然后加入 DMF溶液使磁球的浓度为 20 mg/ml, 置于 在 38Ό水浴锅中并振摇或者机械搅拌 2小时。

13 ) 磁球的包被

将歩骤 1.2 ) 活化好的纳米磁球溶液去除上清液， 然后加入 pH 9.5的碳酸盐缓冲液， 使其浓度达到 20 mg/ml (以纳米磁球计） ； 再以每毫克磁球 10 μ ₈ 的量添加 25-羟基维生 素 D ₃ 和蛋白载体形成的偶联物，然后置于室温 震摇反应 2小时。磁性分离，用洗液（0.5% BSA溶液） 清洗固体:三遍， 得到包被好 25-羟基维生素 1) ₃ 和蛋白载体偶联物的磁球。 将 该获得的检测剂加入稀释液 （碳酸盐缓冲液， 也可以是磷酸盐缓冲液、 硼酸盐缓冲液或 Tris 缓冲液） 中， 使其浓度为 1 mg/ml, 备用。

1.4) 化学发光检测

同实施例 2中的检测方法， 对 70个相同样本进行检测， 并与 LC-MS的结果进行线 性回归， 线性回归相关系数为 0.47, 表明采用天然抗原 25-羟基维生素 D ₃ 作为抗原与蛋 白载体偶联并包被磁球得到的检测别对 25-羟基维生素进行检测的准确度比本发明采用 抗 原衍生物形成的检测剂的准确度低很多。 实施例 3 25-羟基维生素 D免疫学检测试剂盒的加速稳定性测试

本 25-羟基维生素 D免疫学检测试剂盒包括实施例 1所制备的 25-羟基维生素 D检测 齐 ίΚ ΑΒΕΙ标记的 25-羟基维生素 D单克隆抗体、 置换剂、 25-羟基维生素 D高点校准品和 低点校准品。

选取：三个不同浓度的 25-羟基维生素 I)样本溶液 （】， 2, 3 ) , 采用上述试剂盒， 在 37°C条件下， 通过新产业生物医学工程股份有限公司的 Maglumi系列化学发光测定伩分 别测定这三个样本溶液的发光强度， 每天测一次， 连续测定 30天； 其中， 在整个测试过 程中， 用于测试的：三个 25-羟基维生素 D样本溶液在冻存环境下保存， 而所使^的试齐 ij盒 一直保存在 37Ό下。 结果见图 4 ( 1A, 2Α, 3Α) 。

由图 4可见， 采用本发明提供的保存在 37Ό下的 25-羟基维生素 D测定试剂盒对不 同的 25-羟基维生素 D浓度的≡个样品进行测定， 在 30天的连续测定中， ―三个样品分别 的测定结果基本恒定，这充分表明了本发明所 提供的试剂盒具有良好的稳定性， 能够确保 在一定的使用期限内测量结果的准确性。 对比例 3

本 25-羟基维生素 D免疫学检测试剂盒包括本对比例所制备的 ΑΒΕΙ标记的 25-羟基 维生素 D抗原衍生物、 包被 25-羟基维生素 D单克隆抗体的磁球、 置换 ¾、 25 -羟基维生 素 D高点校准品和低点校准品。

( 1 ) 25-羟基维生素 D抗原衍生物的标记

将 1 mg 25-羟基维生素 D抗原衍生物 M' (在式（I )中 m = 0, n = 4)溶于 ΙΟΟμΙ DMF， 然后加入 2„5 mg ABEI-半琥珀酰胺酸 - NHS和 10 μΐ三:乙胺， 室温避光搅拌反应过夜， 产 物用 HPLC纯化， 加入等体积的含 5%的 BSA的保护液， 加入稀释液稀释至 0,15 μ _§ Λιι1。

(2) 25-羟基维生素 D抗体包被磁球

同实施例 1中 1.2)和 .3 ) 的方法， 只是将用于包被磁球的 25-羟基维生素 D抗原衍 生物和蛋白载体的偶联物替换为 25-羟基维生素 [)单克隆抗体， 得到 25-羟基维生素 D单 克隆抗体和磁球的结合物， 稀释到 1 mg /ml备用。

(3 ) 化学发光检测

利用新产 生物医学工程股份有限公司的 Maghimi系列化学发光测定仪测量。将 100 ^样本、 50 ^置换剂 （例如 ANS) 与 100 μΐ 歩骤 (2) 制备得到的 25-羟基维生素 D单 克隆抗体和磁球的结合物备用溶液混合， 温育 10分钟， 去除上清液， 加入 400 μΐ清洗液 (Tris»HCl溶液） 清洗三次， 然后加入 ΙΟΟμί本对比例步骤 （1 ) 中制备得到的 ΑΒΕΙ标 记的抗原衍生物的备用溶液， 温育 10分钟， 去除上清液， 加入 400 μΐ清洗液 （Tris»HCl 溶液）清洗三.次， 加入化学发光激发物， 监测 3秒钟内发出的相对光强度（RLU) 。 参照 在相同条件下测定不同浓度的 25-羟基维生素 D标准品溶液的发光信号强度所建立的 25- 羟基维生素 D浓度和发光信号强度的标准曲线来计算所测� �本中的 25-羟基维生素 D的 3里。 通过本对比例中的检测方法对 70个不同样本 （与实施例 2相同） 进行测定， 与采用 LC-MS的测定结果的线性回归相关系数为 0.858 (数据未列出） 。 与实施例 2的结果比较 可见，使用相同的抗原衍生物，本发明通过对 抗原衍生物修饰从而提供的检测剂能够提高 抗原衍生物和抗体结合的特异性， 从而检测结果准确性更高。

对本对比例中的试剂盒进行与实施 ί到 3相同条件下的加速稳定性测试，：三个样本� �信 号强度下降幅度均显著高于实施例 3 (图 4中 IB, 2B, 3B) 。 可见， 在使用相同的抗原 衍生物的情况下，本发明通过对所使用的抗原 衍生物修饰、即与蛋白载体偶联之后包被磁 球从而提供的检测剂能够显著地提高相关检测 试剂盒的稳定性。 对比例 4

采用 Diasorin公司 25-羟基维生素 D化学发光免疫分析试剂盒（产品代码： 310600) , 在与实施例 3相同的环境下对相同的三个样本进行 30天的连续测定 （在测定过程中， 该 试剂盒同样保存在 37°C的温度下） ， 结果见图 4 (1C， 2C, 3C) 。

由图 4可见， Diasorin公司 25 -羟基维生素 D化学发光免疫分析试剂盒测定的结果在 30天内有显著的变化，这表明 Diasorin公司 25-羟基维生素 D化学发光免疫分析试剂盒的 稳定性不佳， 本发明实施例 3的稳定性显著优于对比例 4。

容易理解，使用稳定性差的检测剂进行检测得 到的结果，很可能由于该检测齐 il潜在的 变质而变得不准确， 不能够表现真实值。 实施例 4 25-羟基维生素 D检测剂 Ν的制备和性能表征

1.1) 25-羟基维生素 D抗原衍生物与蛋白载体的偶联物的形成

将 mg 25-羟基维生素 D抗原衍生物 N' (在式（I)中 m = 2, n = 2)溶于 0.1 ml DMF 中， 加入到牛 γ球蛋白 （20 mg牛 γ球蛋白溶于 2 ml O.lffioi/L碳酸盐缓冲液） 溶液中， 再加入 25%的戊二醛溶液使戊二醛的最终重量浓度为 0.5%, 室温搅拌反应 2 h; 离心去沉 淀， 上清液用 G25凝胶柱纯化， 收集的蛋白峰（洗脱液； 0,1 mol/L磷酸盐缓冲液（PBS) , pH7,4) ， 即得到 25-羟基维生素 D抗原衍生物 N'与蛋白载体的偶联物。

12) 磁球的包被

取一定量的磁球（Merck公司生产的 Estapor系列羧基化微球 Ml- 180/20)纳米磁球， 分散于 pH 7.0的磷酸盐缓冲液中 （20 mg/ml) , 以每毫克磁球 10 μ¾的量添加本实施例 步骤 1J)制备得到的 25-羟基维生素 D抗原衍生物 N'和蛋白载体的偶联物， 再加入 EDC 使其终浓度为 10 mg/ml， 然后置于 40°C震摇反应 2小时。 磁性分离， 用洗液 （0.5% BSA 溶液） 清洗圏体三遍， 得到包被好 25 -羟基维生素 D抗原衍生物 N'和蛋白载体偶联物的 磁球， 即本发明所述检测剂。将该获得的检测剂加入 稀释液（碳酸盐缓冲液， 也可以是磷 酸盐缓冲液、 硼酸盐缓冲液或 Tris 缓冲液） 中' 使其浓度为 l mg/ml， 备用。

1.3 ) 对 25-羟基维生素 D进行化学发光检测

采用本实施例步骤 1 ,2 ) 得到的检测剂， 参照实施例 2的方法对 70个不同样本中的 25-羟基维生素 D的量进行检测， 并将检测结果与采用 LC- MS对该 70个样品进行检测的 结果进行比较， 两者的线性回归相关系数为 0.917, 说明采用本实施例提供的检测剂与采 用 LC- MS对同样的样本的测定结果很接近， 进而说明了本实施例提供的检测方法的准确 性高。

1.4 ) 试剂盒的加速稳定性测试

本 25-羟基维生素 D免疫学检测试剂盒包括本实施例步骤 1.2 )所制备的 25羟基维生 素 D检测剂、 ABEI标记的 25-羟基维生素 D单克隆抗体、 置换剂、 25-羟基维生素 D高 点校准品和低点校准品。

参照实施例 3的加速稳定性测试实验步骤，测定本 25羟基维生素 D免疫学检测试剂 盒在 37°C下在 30天中的加速稳定性性能， 结果与实施例 3类似， 即本 25-羟基维生素 D 免疫学检测试剂盒分别对三：个不同浓度的样 品进行测定， 每个样品在连续的 30天的测定 结果分别基本保持恒定，说明了本 25-羟基维生素 D免疫学检测试剂盒具有良好的稳定性„ 实施例 5 25-羟基维生素 D检测剂 0的制备和性能表征

1 .1 ) 25-羟基维生素 D抗原衍生物与蛋白载体的偶联物的形成

将 1 mg 25-羟基维生素 D抗原衍生物 0' (在式（ί) 中 m === 1 , n === 6 )溶于 0,】 ml 无 水甲醇中， 加入 1 .5 mg N,N'-二琥珀酰亚胺基碳酸酯， 室温搅拌反应 2 h; 产物用薄层色谱 ( TLC )纯化，得到活化的衍生物，取 Iffig该衍生物溶于 DMF,加入到牛 γ球蛋白（20 mg 牛 γ球蛋白溶于 2 m imd/:L 碳酸盐缓冲液） 溶液中， 室温搅拌反应 2 h， 离心去沉淀， 上清液 J¾ G25凝胶柱纯化， 收集的蛋白峰 （洗脱液： 0.1 mol/L磷酸盐缓冲液 （PBS ) , pH 7,4 ) ， 即得到 25-羟基维生素 D抗原衍生物 0'与蛋白载体的偶联物。

12 ) 磁球的包被

同实施例 4, 只是将偶联物替换为本实施例步骤 1 .1 ) 制备得到的 25-羟基维生素 D 抗原衍生物 0'与蛋白载体的偶联物， 得到本实施例的检测齐 ij。

1.3 ) 对 25-羟基维生素 D进行化学发光检测

采用本实施例步骤 1.2 ) 得到的检测剂， 参照实施例 2的方法对 70个不同样本中的 25-羟基维生素 D的量进行检测， 并将检测结果与采用 LC-MS对该 70个样品进行检测的 结果进行比较， 两者的线性回归相关系数为 0.921 , 说明采^本实施例提供的检测剂与采 用 LC- MS对同样的样本的测定结果很接近， 进而说明了本实施例提供的检测方法的准确 性高。

L4) 试剂盒的加速稳定性测试

本 25-羟基维生素 D免疫学检测试剂盒包括本实施例歩骤 1.2 )所刺备的 25-羟基维生 素 D检测剂、 ABE】标记的 25-羟基维生素 D单克隆抗体、 置换剂、 25-羟基维生素: D高 点校准品和低点校准品。

参照实施例 3的加速稳定性测试实验步骤，测定本 25-羟基维生素 D免疫学检测试剂 盒在 37"C下在 30天中的加速稳定性性能， 结果与实施例 3类似， 即本 25羟基维生素 D 免疫学检测试剂盒分别对三个不同浓度的样品 进行测定， 每个样品在连续的 30天的测定 结果分别基本保持恒定，说明了本 25-羟基维生素 D免疫学检测试剂盒具有良好的稳定性。 虽然本发明已作了详细描述，但对本领域技术 人员来说，在本发明精神和范围内的修 改将是显而易见的。此外， 应当理解的是， 本发明记载的各方面、 不同具体实施方式的各 部分、和列举的各种特征可被组合或全部或部 分互换。在上述的各个具体实施方式中， 那 些参考另一个具体实施方式的实施方式可适当 地与其它实施方式组合,这是将由本领域技 术人员所能理解的。此外， 本领域技术人员将会理解， 前面的描述仅是示例的方式， 并不 旨在限制本发明。