Die Erfindung betrifft eine Detektionseinrichtung für ein Laserscanning-Mikroskop, wobei die Detektionseinrichtung einen Lichteingang, wenigstens ein Filtermodul und wenigstens einen ortsauflösenden Detektor aufweist und eingerichtet ist, Licht von dem Lichteingang zu dem Filtermodul und von dort zu dem ortsauflösenden Detektor zu leiten.

Laserscanning-Mikroskope sind aus dem Stand der Technik bekannt. Eine beson dere Form der Laserscanning-Mikroskope wird beispielsweise für die sogenannte „Image Scanning Microscopy“ verwendet. Dabei handelt es sich um ein Verfahren der Fluoreszenz-Mikroskopie, bei dem Fluorophore, die beispielsweise in einer biolo gischen Probe angeordnet sind, mittels einer fokussierten Anregungsstrahlung, ins besondere durch einen Laserstrahl, zum Leuchten angeregt werden. Der fokussierte Anregungsstrahl wird dabei rasternd über die Probe geführt und regt folglich jeweils nur in einem räumlich eng begrenzten Bereich die vorhandenen Fluorophore zum Leuchten an. Zu jedem Rasterpunkt wird die Fluoreszenzemission mit einem konfo- kal angeordneten Detektor erfasst, der im Unterschied zu in der herkömmlichen La- serscanning-Mikroskopie verwendeten Detektoren ortsauflösend ist. Es wird folglich zu jedem Rasterpunkt ein Teilbild der Probe durch das entsprechende Mikroskop er fasst, wobei aus der Gesamtheit dieser Teilbilder das Gesamtbild errechnet werden kann. Die erzielbare Auflösung des Gesamtbildes hängt insbesondere von der Güte der Abbildung der einzelnen Teilbilder auf den ortsauflösenden Detektor ab und ist höher als die Auflösung eines herkömmlichen konfokal aufgenommenen Bildes. Un ter Image Scanning Microscopy wird hier in der Folge jede Form der Laserscanning- Mikroskopie mit ortsauflösender Detektion der Fluoreszenzemission zu jedem Ras terpunkt verstanden, beispielsweise auch STED-Mikroskopie (STED: stimulated emission depletion) unter Verwendung eines ortsauf lösenden Detektors.

In Laserscanning-Mikroskopen wird bei der Erfassung der Fluoreszenzemission durch verschiedene Filteranordnungen vermieden, Anregungslicht oder Anregungs strahlung zu detektieren, die beispielsweise als Streulicht den Weg in den Detektor des Mikroskops finden könnte. Daher sind seit jeher Filteranordnungen in den La- serscanning-Mikroskopen verbaut, die Strahlung der Anregungswellenlänge heraus filtern. Ein Laserscanning-Mikroskop ist vorzugsweise jedoch in der Lage, die Fluo reszenzstrahlung unterschiedlicher Fluorophore zu detektieren, damit nicht für jedes verwendete Fluorophor ein separates Mikroskop verwendet werden muss. Unter schiedliche Fluorophore weisen jedoch Fluoreszenzstrahlung unterschiedliche Wel lenlängen auf, sodass es von Vorteil ist, unterschiedliche Filter in den Mikroskopen zu verwenden, um auf die geänderten Anforderungen, die durch unterschiedliche in Proben verwendete Fluorophore hervorgerufen werden, reagieren zu können.

Die DE 102 13 187 A1 beschreibt eine Ausführungsform, bei der mehrere spektrale Bänder oder Kanäle gleichzeitig erfasst und detektiert werden können, indem Licht, das an der ersten verschiebbaren Blende reflektiert wird, einerweiteren verschiebba ren Blende zugeführt wird. Dabei tritt jeweils ein Teil des Lichtes durch die Blende hindurch und wird einem Detektor zugeführt, der jedoch kein ortsauflösender Detek tor ist. Eine ähnliche Vorrichtung ist der DE 102014 116782 A1 zu entnehmen, bei der ebenfalls das durch eine Lochblende geführte Licht durch ein Prisma spektral aufgespalten und durch verschiebbare Blenden und Linsen gefiltert wird. Die ver schiebbaren Blenden, Linsen und zusätzliche Prismen, um das Licht bestimmter Wellenlängenbereiche wieder zu bündeln, bilden ebenfalls ein kontinuierliches Filter modul im Sinne der vorliegenden Erfindung. Die beschriebenen Detektoren sind je doch nicht ortsauflösend. In der DE 19835070 B4 wird statt eines Prismas ein variabler Bandpassfilter ver wendet, der einen variablen Kurzpassfilter und einen variablen Langpassfilter bein haltet. Während ein Kurzpassfilter für Wellenlängen durchlässig ist, die kürzer als eine Grenzwellenlänge sind, ist ein Langpassfilter durchlässig für Wellenlängen, die länger als eine Grenzwellenlänge sind. Durch geschickte Kombinationen der Grenz wellenlängen von Kurz- und Langpassfilter können so die gewünschten Wellenlän genbereiche herausgefiltert werden. Die unterschiedlichen Kurzpassfilter und/oder Langpassfilter können als einzelne Filter, beispielsweise in einem Filterrad, wobei das Rad gedreht werden kann, um einen anderen Filter in den Strahlengang zu be wegen, oder als kontinuierliche Farbverlaufsfilter ausgebildet sein, die entlang einer Längsrichtung verschoben werden können. Auch bei dieser Ausgestaltung wird je doch das zu detektierende Licht konfokal mittels eines Punktdetektors detektiert, das, bevor es den Filter erreicht, noch durch eine Lochblende geführt wird. Eine ortsauflö- sende Detektion der Fluoreszenzemission zu einem Rasterpunkt ist auch in dieser Ausgestaltung nicht möglich. Ähnliche Einrichtungen sind der DE 102006034908 A1 , der DE 102009012874 B4 und der DE 102018 126232 B3 bekannt. In allen diesen Dokumenten werden Farbverlaufsfilter als Filterelemente verwendet, um Licht, das zuvor durch eine Lochblende geführt wurde, spektral zu filtern, das dann einem Detektor zugeführt wird, der nicht ortsauflösend ist.

Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, eine Detektionseinrichtung so wei terzuentwickeln, dass eine kontinuierlich einstellbare spektrale Filterung bei gleich zeitiger ortsauflösende Detektion möglich wird.

Die Erfindung löst die gestellte Aufgabe durch eine Detektionseinrichtung gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 , die sich dadurch auszeichnet, dass wenigstens ein Filtermodul als kontinuierliches Filtermodul mit zwei kontinuierlich durchstimmba ren Filterelementen ausgebildet ist und optisch hinter dem kontinuierlichen Filtermo dul wenigstens ein Kompensatorelement angeordnet ist, mittels dessen eine Fokus lage von Licht auf dem ortsauflösenden Detektor einstellbar ist. Im Stand der Technik mit konfokaler, nicht ortsauflösender Detektion definiert die Größe und die Genauigkeit der Positionierung der konfokalen Lochblende die Ortsauflösung, mit der ein Bild einer Probe aufgenommen werden kann. Der Loch blende nachgeordnete und dem Detektor vorgeordnete Elemente wirken sich nicht auf die erzielbare Auflösung aus. Die Verwendung eines ortsauflösenden Detektors beispielsweise zur Erhöhung der erzielbaren Auflösung des Gesamtbildes der Probe anstelle eines über die gesamte Detektorfläche integrierenden Detektors verändert die Randbedingungen und Anforderungen an die Position und die Art und Weise der verwendeten optischen Elemente, die im Strahlengang des Lichtes angeordnet wer den dürfen, fundamental. Eine Störung der räumlichen Verteilung und damit der Ortsauflösung des Lichtes verbietet sich, wenn der ortsauflösende Detektor mit Vor teil genutzt werden soll.

Deshalb ist man im Stand der Technik davon ausgegangen, dass die oben genann ten Anordnungen, bei denen bei konfokaler, nicht ortsauflösender Detektion die spektrale Trennung erst nach der Lochblende erfolgt, nicht in der Image Scanning Microscopy genutzt werden können. In der herkömmlichen Laserscanning-Mikrosko- pie werden die laterale und axiale Ortsauflösung der konfokalen Detektion im We sentlichen durch die Lochblende bestimmt. Im Strahlengang nachgeordnete Ele mente beeinflussen die Ortsauflösung bei dieser Art der Mikroskopie grundsätzlich nicht. Dies ist jedoch bei der Image Scanning Microscopy mit einer ortsaufgelösten Detektion der Fluoreszenzemission zu jedem Rasterpunkt anders, da sich bei dieser alle optischen Elemente vor dem ortsauflösenden Detektor auf die Ortsauflösung des Gesamtbildes auswirken. Zudem ist man davon ausgegangen, dass insbesondere die als kontinuierlich durchstimmbare Filterelemente bekannten Farbverlaufsfilter ei nen Einfluss auf die Ortsauflösung haben, da sie eine räumliche Inhomogenität be züglich der Wellenlänge in dem durch den Filter hindurchgetretenen Licht hervorru- fen. Außerdem führen mechanische Verschiebungen einzelner optischer Bauteile in nerhalb des Strahlenganges, wie sie beispielsweise bei der Verwendung von Farb- verlaufsfiltern oder Prismenanordnungen zur Erstellung der Detektions-Wellenlän genbänder notwendig sind, bei ortsauflösenden Detektoren und einer gewünschten ortsauflösenden Detektion im Bereich des Beugungslimits zu Veränderungen des op tischen Pfades und damit der Abbildungseigenschaften der Detektionseinrichtung. Insbesondere kommt es zu lateralen Verschiebungen der Fokuslage auf dem orts auflösenden Detektor.

Der Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, dass die Anordnung einer Filterkaskade im Strahlengang von Licht auf dem Weg zu einem ortsauflösenden Detektor einen al lenfalls sehr kleinen Einfluss auf die Ortsauflösung hat. Dadurch ist die Verwendung eines Farbverlaufsfilters möglich. Die Auswirkungen der mechanischen Verschiebun gen einzelner Bauteile im Strahlengang des Lichtes können durch das Kompensator element ausgeglichen werden, durch das eine Auftreffposition von Licht auf dem ortsauflösenden Detektor einstellbar ist.

Erfindungsgemäß weist die Detektionseinrichtung wenigstens ein Filtermodul auf, das als kontinuierliches Filtermodul ausgebildet ist. Es verfügt über zwei kontinuier lich durchstimmbare Filterelemente. Diese sind vorzugsweise unabhängig voneinan der durchstimmbar. Der Anteil des einfallenden Lichtes, der dem wenigstens einen ortsauflösenden Detektor zugeleitet wird, ist also ein spektraler Anteil des einfallen den Lichtes, der eine obere und eine untere Grenzwellenlänge aufweist. Die obere Grenzwellenlänge wird bevorzugt durch eines der Filterelemente und die untere Grenzwellenlänge durch das andere der Filterelemente bestimmt. Lassen sich die beiden Filterelemente unabhängig voneinander durchstimmen, ist auch die Differenz zwischen oberer und unterer Grenzwellenlänge und damit die spektrale Breite des auf den ortsauflösenden Detektor geleiteten Lichtanteils einstellbar. Können die bei den Filterelemente nur gemeinsam durchgestimmt werden, etwa bei einer Loch blende im Strahlengang eines durch ein Prisma spektral aufgespaltenen Lichtstrahls, ist die spektrale Breite des Lichtes, das auf den Detektor gelang nicht einstellbar. Auch eine solche Ausführungsform ist durch die gewählte Formulierung abgedeckt.

Wenigstens eines der Filtermodule ist aus zwei kontinuierlich durchstimmbaren Fil terelementen gebildet. Unter einem kontinuierlich durchstimmbaren Filterelement wird ein Filterelement verstanden, das als Kurzpassfilter oder als Langpassfilter ver wendet werden kann und dessen Grenzwellenlänge kontinuierlich, also stufenlos, einstellbar ist. Ein kontinuierlich durchstimmbarer Kurzpassfilter lässt folglich Licht hindurch, das eine Wellenlänge aufweist, die kürzer als die Grenzwellenlänge ist. Da bei ist die Grenzwellenlänge frei einstellbar. Analog dazu lässt ein kontinuierlich durchstimmbarer Langpassfilter Licht hindurch, dessen Wellenlänge größer als die Grenzwellenlänge ist, wobei die Grenzwellenlänge ebenfalls frei einstellbar ist. Durch Kombination eines Kurzpassfilters und eines Langpassfilters lässt sich Licht eines bestimmten Wellenlängenbereichs aus einem größeren Spektralbereich herausfil tern. Dieses wird dann einem Detektor, vorzugsweise dem wenigstens einen ortsauf- lösenden Detektor, zugeleitet.

Ein kontinuierliches Filtermodul mit zwei kontinuierlich durchstimmbaren Filterele menten kann als Transmissionsfilter oder als Reflexionsfilter verwendet werden. Bei einem Transmissionsfilter wird der Teil des Lichtes dem Detektor zugeleitet, der die beiden kontinuierlich durchstimmbaren Filterelemente in Transmission durchläuft, während bei einem Reflexionsfilter der Teil des Lichtes dem Detektor zugeleitet wird, der an den Filterelementen reflektiert wird. Eine Verwendung eines Transmissionsfil ters ist von Vorteil.

Beim Verschieben wenigstens eines der beiden kontinuierlich durchstimmbaren Fil terelemente ist es in der Regel nötig, das jeweilige Filterelement mechanisch zu be wegen. Dies kann motorgetrieben, beispielsweise durch einen Elektromotor gesche hen oder, um höhere Genauigkeit zu erreichen, durch Piezo-Elemente erreicht wer den. Unabhängig davon, wie die Bewegung des Filterelementes hervorgerufen wird, muss das Filterelement beweglich gelagert sein, was aufgrund von Fertigungstole ranzen, Fertigungsungenauigkeiten und Spiel dazu führt, dass sich die Ausrichtung des Filterelementes relativ zum optischen Pfad verändern kann, was bereits zu einer Verschiebung des gefilterten Lichtes, das heißt der Fokuslage des gefilterten Lichtes auf dem ortsauflösenden Detektor führen kann. Dies kann durch das Kompensator element ausgeglichen werden. Erfindungsgemäß ist das wenigstens eine Kompensatorelement optisch hinter dem kontinuierlichen Filtermodul angeordnet. Das bedeutet, dass das Kompensatorele ment das Licht auf dem Weg bis zu dem Filtermodul nicht beeinflusst. Es wird durch das Kompensatorelement folglich nur ein Bauteil bewegt oder auf sonstige Weise be einflusst, das im Strahlengang hinter dem Filtermodul angeordnet ist. Alternativ oder zusätzlich dazu kann das Kompensatorelement auch verwendet werden, um das Licht zu beeinflussen, das das Filtermodul verlassen hat.

Vorzugsweise ist das wenigstens eine Filtermodul Teil einer Filterkaskade mit we nigstens zwei Filtermodulen. Dadurch wird es möglich, mehrere spektrale Kanäle, also Wellenlängenbereiche, des in die Detektionseinrichtung durch den Lichteingang einfallenden Lichtes zu detektieren, ohne Einstellungen an der Filterkaskade oder der Detektionseinrichtung zu verändern. Die Anzahl der Kanäle, die auf diese Weise detektiert werden können, entspricht der Anzahl der Filtermodule in der Filterkaskade oder der Anzahl der Filtermodule in der Filterkaskade plus Eins. Mit einem einzigen Filtermodul können zwei Kanäle detektiert werden.

In einer bevorzugten Ausgestaltung ist das wenigstens eine Kompensatorelement eingerichtet, den wenigstens einen ortsauflösenden Detektor zu bewegen. Das bein haltet bevorzugt eine Bewegung in einer Ebene senkrecht zur optischen Achse, also eine laterale Bewegung. Alternativ oder zusätzlich dazu beinhaltet die Bewegung eine Verschiebung des Detektors entlang der optischen Achse, also eine axiale Be wegung.

Bevorzugt ist wenigstens ein Kompensatorelement zwischen dem kontinuierlichen Filtermodul und dem ortsauflösenden Detektor angeordnet. Dabei bedeutet „zwi schen“ nicht zwangsläufig örtlich oder geometrisch dazwischen, auch wenn dies be vorzugte Ausgestaltungen sind. Wichtig ist lediglich, dass das wenigstens eine Kom pensatorelement optisch zwischen dem Filtermodul und dem Detektor angeordnet ist, also eingerichtet ist, das Licht auf dem Weg von dem Filtermodul zu dem Detek tor zu beeinflussen. Vorzugsweise ist wenigstens ein Kompensatorelement, besonders bevorzugt jedes Kompensatorelement, als bewegbarer, insbesondere kippbarer Spiegel ausgebildet, der weiter bevorzugt um zwei Kippachsen kippbar gelagert ist. Besonders bevorzugt stehen die beiden Kippachsen senkrecht aufeinander. In der Regel ist es ausrei chend, die Fokuslage von Licht, das heißt die Lage des Punktes, der zum Zentrums des Beleuchtungsfokus in der Probe konjugiert ist, auf dem ortsauflösenden Detektor in zwei Richtungen einzustellen, die entlang der Detektorebene, also senkrecht zur optischen Achse und dem optischen Pfad, verlaufen. Diese beiden als X-Richtung und Y-Rechnung bezeichneten Richtungen, die bevorzugt senkrecht aufeinander ste hen, verlaufen folglich parallel zur Detektorebene. In einer bevorzugten Ausgestal tung ist es durch das wenigstens eine Kompensatorelement zudem möglich, auch die Fokussierung des auftreffenden Lichtes auf den ortsauflösenden Detektor zu ver ändern, also eine Verschiebung der Fokuslage in der dritten senkrecht stehenden Richtung, der Z-Richtung, zu erreichen. Dies kann bevorzugt dadurch erreicht wer den, eine Linse im Strahlengang zu verschieben. Eine derartige Linse ist beispiels weise vorhanden, um das von der Filterkaskade zu dem ortsauflösenden Detektor geleitete Licht auf der Detektorfläche zu fokussieren. Diese Linse, die auch eine Lin senanordnung mit mehreren optischen Bauteilen, insbesondere mehrere Linsen, sein kann, ist in einer bevorzugten Ausführungsform entlang der optischen Achse, die be vorzugt dem Lichtpfad entspricht, verschiebbar angeordnet. In diesem Fall ist die Linse auch ein Kompensatorelement oder gehört auch sie zum Kompensatorele ment, da durch sie die Fokuslage von Licht auf dem ortsauflösenden Detektor ein stellbar ist. Durch die mechanische Verschiebung einzelner optischer Bauteile selbst wird zwar keine oder allenfalls eine sehr geringe Verschiebung der Fokuslage in Z- Richtung verursacht, aber die Fokuslage in Z-Richtung hängt auf Grund chromati scher Abweichungen der Abbildungseigenschaften mit der Auswahl eines Detekti ons-Wellenlängenbandes zusammen. Bei einem gewöhnlichen Laserscanning-Mikro- skop, wie es aus dem Stand der Technik bekannt ist, wird in aller Regel die dabei verwendete Lochblende so justiert, dass sie in einem Mittel für alle zu verwendenden Detektions-Wellenlängenbänder gut ist, aber zumindest nicht für alle perfekt. Die Verwendung eines ortsauflösenden Detektors ermöglicht den Verzicht auf eine Loch blende. In Verbindung mit einem Kompensatorelement zur Einstellung der Fokuslage von Licht auf dem ortsauflösenden Detektor in Z-Richtung wird somit eine zusätzliche Einstellmöglichkeit, die die Abbildungsgüte verbessert, bereitgestellt. Das Kompen satorelement kann mehrere unterschiedliche Elemente, beispielsweise einen kippba ren Spiegel und eine verschiebbare Linse aufweisen, die bevorzugt aber nicht zwangsläufig verwendet werden, um die Fokuslage des Lichtes auf dem Detektor in unterschiedlichen Richtungen einzustellen. Mehrere Kompensatorelemente, die auf Licht aus dem gleichen Filtermodul wirken, werden als Kompensationseinrichtung bezeichnet. Die verschiedenen Kompensatorelemente einer Kompensationseinrich tung können die Fokuslage in unterschiedlichen Richtungen beeinflussen. Dabei ist es von Vorteil, wenn jedes Kompensatorelement die Fokuslage in nur einer Raum richtung beeinflusst. Es ist jedoch auch möglich, dass einzelne oder alle Kompensa torelemente einer Kompensationseinrichtung die Fokuslage in mehrerer Raumrich tungen beeinflussen.

Für einige Anwendungen ist von Vorteil, dass das Kompensatorelement zwischen dem Filtermodul und dem ortsauflösenden Detektor angeordnet ist, wobei die Anord nung zwischen den beiden Bauteilen bedeutet, dass sich das Kompensatorelement im Strahlengang des Lichtes befindet, das vom Filtermodul zum ortsauflösenden De tektor geleitet wird. Es ist nicht notwendig, dass sich das Kompensatorelement bau lich zwischen dem Filtermodul und dem Detektor befindet, sofern es sich im Strahlen gang zwischen diesen beiden Elementen befindet.

Vorzugsweise sind die kontinuierlich durchstimmbaren Filterelemente Farbverlaufsfil- ter, die in einer Längsrichtung verschiebbar angeordnet sind. Sie wirken als Kurz passfilter und als Langpassfilter, wobei unterschiedliche Farbverlaufsfilterfür die un terschiedlichen Filter-Arten verwendet werden. Beide Farbverlaufsfilter sind entlang einer Längsrichtung verschiebbar. Die Längsrichtung entspricht dabei der Richtung, in der auch der Gradient des Filters verläuft. Die Grenzwellenlänge eines derartigen Farbverlaufsfilter hängt von der Position ab, an der das Licht auf den Farbverlaufsfil ter trifft. Die Grenzwellenlänge verändert sich folglich und bildet so einen Gradienten. Entlang dieser Richtung ist der Farbverlaufsfilter verschieblich angeordnet. In einer bevorzugten Ausgestaltung verfügt die Detektionseinrichtung über mehrere Detektoren. Die Anzahl der vorhandenen Detektoren entspricht dabei vorteilhafter weise der Anzahl der Filtermodule, die die Anzahl der ohne Änderungen im Mikro skopaufbau detektierbaren spektrale Kanäle begrenzt. Daher ist es von Vorteil, wenn die Anzahl der Detektoren identisch ist zu Anteil der Filtermodule. Vorzugsweise sind mehrere der Detektoren als ortsauflösende Detektoren ausgebildet. Besonders be vorzugt sind alle verwendeten Detektoren ortsauflösende Detektoren.

Vor jedem ortsauflösenden Detektor befindet sich vorteilhafterweise ein Kompensa torelement, mittels dessen eine Auftreffposition von Licht auf dem jeweiligen ortsauf lösenden Detektor einstellbar ist. Die Kompensatorelemente für die unterschiedlichen ortsauflösende Detektoren können identisch zueinander oder unterschiedlich ausge bildet sein. Vorzugsweise sind sie unabhängig voneinander steuerbar, sodass die Auftreffposition von Licht auf den unterschiedlichen ortsauflösenden Detektoren ge trennt und unabhängig voneinander einstellbar ist. Bei einer Filterkaskade durchläuft das den jeweiligen Detektoren zugeleitete Licht eine unterschiedliche Anzahl von Fil terelementen. So wird ein Teil des Lichtes dem ersten Detektor zugeleitet, nachdem es ausschließlich das erste Filtermodul durchlaufen hat. Ein weiterer Teil des Lichtes wird einem zweiten Detektor zugeleitet und hat bereits zwei Filtermodule durchlau fen. Je mehr mechanisch verstellbare Filterelemente in diesen unterschiedlichen Fil termodulen enthalten sind und gegebenenfalls verstellt werden, desto größer ist ge gebenenfalls auch die Korrektur der Auftreffposition des Lichtes auf dem ortsauflö senden Detektor, die notwendig ist, um die gewünschte Ortsauflösung und Qualität der Abbildungen zu erreichen und aufrechtzuerhalten. Daher sind die Kompensator elemente bevorzugt separat, unabhängig und/oder einzeln voneinander ansteuerbar und einstellbar.

Vorzugsweise verfügt jedes Filtermodul über einen Detektorausgang, durch den Licht auf wenigstens einen Detektor geleitet wird. Zudem verfügt zumindest jedes bis auf das letzte Filtermodul über einen Filterausgang, durch den Licht auf ein weiteres Fil termodul geleitet wird. Auch das letzte Filtermodul kann über einen Filterausgang verfügen, hinter dem ein weiteres Filtermodul angeordnet werden kann. Dieser Filter ausgang des letzten Filtermoduls kann als weiterer Detektorausgang verwendet wer den oder er kann in eine Strahlfalle führen. Es hat sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn hinter jedem Detektorausgang ein Detektor angeordnet wird, um das Licht, dass das jeweilige Filtermodul durch den Detektorausgang verlässt, aufzufangen, zu detektieren und der Auswertung zuzuführen.

In einer Ausführungsform verfügt die Detektionseinrichtung über wenigstens ein Um schaltelement, durch das das Licht von wenigstens einem Filtermodul zu unter schiedlichen Detektoren leitbar ist. Das Umschaltelement ist beispielsweise als Kipp spiegel ausgebildet. Das Umschaltelement ist eingerichtet, Licht von einem Filtermo dul, das das Filtermodul bevorzugt durch einen Detektorausgang verlässt und auf das Umschaltelement geleitet wird, auf unterschiedliche Detektoren zu leiten. Das Umschaltelement ist dazu in unterschiedliche Stellungen oder Zustände bringbar, in denen das Licht auf verschiedenen Detektoren geleitet wird, wenn es von dem Filter modul kommend auf das Umschaltelement trifft.

Alternativ oder zusätzlich dazu ist durch das Umschaltelement das Licht von mehre ren Filtermodulen auf einen Detektor, vorzugsweise einen ortsauflösenden Detektor leitbar. Dadurch kann die Anzahl der benötigten Detektoren, insbesondere der orts auflösenden Detektoren, reduziert werden. Dadurch werden Kosten gespart. Das Umschaltelement kann auch in dieser Ausgestaltung als Kippspiegel ausgebildet sein. Je nach Stellung des Umschaltelementes, also insbesondere des Kippspiegels, wird Licht aus unterschiedlichen Filtermodulen auf den gewünschten Detektor gelei tet. Durch ein einziges Umschaltelement wird vorzugsweise jeweils nur Licht aus ei nem einzigen Filtermodul auf den Detektor geleitet. Mit modernen Umschaltelemen ten, insbesondere Kippspiegeln ist ein schnelles Umschalten möglich.

Vorzugsweise verfügt die Detektoranordnung über mehrere Umschaltelemente, vor zugsweise so viele Umschaltelemente wie Filtermodule. Jedes Umschaltelement ist dann eingerichtet, Licht von wenigstens einem Filtermodul auf unterschiedliche De- tektoren zu leiten. Ist für jedes der Filtermodule ein separates Umschaltelement vor handen, kann das Licht, dass die Filtermodule verlässt, auf den jeweils gewünschten Detektor geleitet werden, wobei dies unabhängig von dem gewählten Detektor für das Licht eines anderen Filtermoduls gewählt werden kann.

Alternativ oder zusätzlich dazu ist wenigstens ein Umschaltelement eingerichtet, das Licht aus mehreren Filtermodulen umzuleiten. Dazu wird das Licht der jeweiligen Fil termodule durch optische Elemente, beispielsweise Spiegel, auf das Umschaltele ment geleitet und von dort dem jeweiligen Detektor zugeordnet. Dadurch wird die An zahl der benötigen Umschaltelemente reduziert. Die Wahl der zu verwendenden De tektoren für das Licht aus mehreren Filtermodulen ist in dieser Ausgestaltung nicht unabhängig voneinander.

Die Umschaltelemente oder das Umschaltelement ermöglichen es, in schneller Ab folge hochaufgelöste Bildaufnahmen der Probe in verschiedenen Farbkanälen, bei spielsweise unter Nutzung verschiedener Fluorophore, zu gewinnen, wobei für jeden Farbkanal ein ortsauflösender Detektor verwendet wird, obwohl nicht für jeden ver wendeten Farbkanal beziehungsweise jedes verwendete Filtermodul ein nur diesem Modul zugeordneter ortsaufösender Detektor vorhanden ist. Die Anzahl der benötig ten ortsauflösenden Detektoren wird dadurch reduziert. Dies ist insbesondere für die Ausgestaltung des Umschaltelementes möglich, die es erlaubt, Licht aus unter schiedlichen Filtermodulen auf einen einzigen ortsauflösenden Detektor zu leiten. Dadurch ist es vorzugsweise ausreichend, wenn die Detektionseinrichtung nur einen einzigen ortsauflösenden Detektor aufweist.

Die Bildaufnahme kann dann beispielsweise zeilenweise erfolgen, wobei bei einer ersten Stellung des Umschaltelements entlang einer Zeile ein erster Farbkanal unter Nutzung eines ersten Filtermoduls aufgenommen wird, wobei während eines Zurück laufens der Scan-Einheit an den Anfang einer Zeile das Umschaltelement umge schaltet wird und wobei entlang einer Zeile ein zweiter Farbkanal unter Nutzung ei nes zweiten Filtermoduls aufgenommen wird. Dieses Schema kann fortgesetzt wer- den, bis zu allen gewünschten Farbkanälen, maximal aber bis zu jedem vorhande nen Filtermodul eine Bildzeile aufgenommen wurde. Alternativ ist es auch möglich, jeweils am Zeilenende das Umschaltelement umzuschalten und eine Folgezeile je weils mit umgekehrter Abtastrichtung aufzunehmen. Anschließend wird das Schema beispielsweise in derselben Reihenfolge, alternativ auch in einer anderen Reihen folge der verwendeten Farbkanäle für eine folgende Bildzeile wiederholt. Es ist auch möglich, ein Aufnahmeschema zu anzuwenden, bei dem die Scan-Einheit bei jedem einzelnen Durchlauf eine neue Zeile abtastet, sodass die einzelnen Farbkanäle ver schachtelt aufgenommen werden. Ein solches Aufnahmeschema ist in der La- serscanning-Mikroskopie üblich, wobei der Zeilenabstand so gewählt wird, dass der Abstand der Zeilen eines einzigen Farbkanals an die angestrebte Auflösung des Ge samtbildes angepasst ist. Umschaltelemente, beispielsweise Kippspiegel mit vorab festgelegten Kippstellungen, können mit so hoher Reproduzierbarkeit in ihre festge legten Schaltstellungen geschaltet werden, dass Einstellungen der den Filtermodulen zugeordneten Kompensatorelemente nur jeweils einmalig nach Einstellung der Filter- module zur Auswahl der Detektions-Wellenlängenbänder zu Beginn einer Aufnahme zu mehreren Farbkanälen erfolgen muss.

Vorzugsweise ist das Umschaltelement als Kompensatorelement ausgebildet. In die sem Fall werden jeweils nach dem Einstellen der Filtermodule hinsichtlich der Detek tions-Wellenlängenbänder für jeden Farbkanal die Schaltstellungen des integrierten Umschalt- und Kompensatorelements derart festgelegt, dass nach jedem Schalten in eine der festgelegten Schaltstellungen ein dem jeweils genutzten Filtermodul zuge ordneter Fehler kompensiert ist.

Bevorzugt verfügt die Detektionseinrichtung über eine optische Einrichtung, die der art eingerichtet ist, dass eine Taille eines einfallenden Gaußschen Bündels zwischen zwei benachbarten Filtermodulen oder innerhalb eines Filtermoduls liegt. Vorzugs weise wird eine Strahldivergenz verringert. Die benachbarten Filtermodule sind be vorzugt in der Mitte oder zumindest im mittleren Bereich der Filterkaskade angeord net. Verfügt die Filterkaskade beispielsweise über vier Filtermodule, ist die Taille be- vorzugt zwischen dem zweiten und dritten Filtermodul angeordnet. Verfügt die Filter kaskade über fünf Filtermodule, liegt die Taille bevorzugt innerhalb des dritten Filter moduls oder zwischen dem dritten und dem vierten der Filtermodule. Auf diese Weise wird erreicht, dass die bei einem Gaußschen Bündel mit kleiner Taille zwangs läufig vorhandene Divergenz einen möglichst kleinen Einfluss auf die Filterung des einfallenden Lichtes durch die Filterkaskade hat. Je kleiner die Taille des Gaußschen Bündels ist, desto größer ist die Divergenz. Bei der Verwendung von kontinuierlich durchstimmbaren Filterelementen, insbesondere von Farbverlaufsfiltern, ist es wich tig, dass der jeweilige Lichtfleck, den das einfallende Licht auf dem jeweiligen Fil terelement bildet, möglichst klein ist, um die räumliche Abhängigkeit der Grenzwel lenlänge, die der Farbverlaufsfilter zwangsläufig aufweist, innerhalb des Lichtfleckes möglichst klein zu halten. Ein zu großer Durchmesser des Lichtstrahls kann auch dazu führen, dass Spiegel, die den Strahl innerhalb der Kaskade weiterleiten, nicht mehr den ganzen Strahl weiterleiten können und somit der Strahl beschnitten wird. Würde die Taille des Gaußschen Bündels beispielsweise vor das erste Filtermodul gelegt, weitet sich das Gaußsche Bündel beim Durchlaufen der Filterkaskade immer weiter auf, sodass der Lichtfleck insbesondere auf dem letzten Filtermodul und des sen Filterelementen sehr groß wird. Diese Anordnung wird daher vermieden. Der beste Wert für den Durchmesser der Strahltaille hängt ab von der genauen Bauart der einzelnen Filtermodule sowie der Anzahl der Module. In einer konkreten Anord nung der Anmelderin wird die Detektionseinrichtung mit einem Gaußschen Bündel betrieben, dessen Taille einen Durchmesser von kleiner als 1,5 mm, bevorzugt klei ner als 1 mm aufweist.

Durch die Positionierung der Taille in dem mittleren Bereich der Filterkaskade wird erreicht, dass sich der Lichtfleck auf den ersten Filtermodulen und deren Filterele menten mit Fortschreiten entlang des Lichtpfades zunächst verkleinert, bis die Taille erreicht wird. Nach der Taille hingegen erfolgt die Aufweitung und der Lichtfleck wird größer. Insgesamt jedoch bleibt die Größe des Lichtfleckes auf allen kontinuierlich durchstimmbaren Filterelementen in einem vertretbaren Rahmen. Vorzugsweise verfügt die Detektionseinrichtung über eine elektrische oder elektroni sche Steuerung, die eingerichtet ist, das Kompensatorelement derart zu steuern, dass ein Maximum der von dem ortsauflösenden Detektor detektierten Strahlung in der Mitte des ortsauflösenden Detektors liegt. Die elektronische Steuerung kann bei spielsweise Teil einer elektronischen Datenverarbeitungseinrichtung sein, die Teil des Mikroskops oder Teil der Detektoreinrichtung sein kann. Da der ortsauflösende Detektor ohnehin die Verteilung der einfallenden Lichtintensität misst, kann aus dem detektierten Signal eine Stellgröße bestimmt werden, um das Kompensatorelement zu steuern.

In einer bevorzugten Ausgestaltung handelt es sich bei einem, besonders bevorzugt jedoch bei allen ortsauflösende Detektoren um segmentierte Flächendektoren. Dazu gehören beispielsweise pixelierte Detektoren, die mehrere voneinander räumlich ge trennte Einzeldetektoren aufweisen, beispielsweise SPAD-Arrays (SPAD: Single Photon Avalanche Diode) .Ihnen vorgelagert ist vorzugsweise wenigstens eine Linse oder Linsenanordnung, die eingerichtet ist, das einfallende Licht auf den Detektor ab zubilden. Dabei ist die Linse oder Linsenanordnung vorzugsweise so eingerichtet, dass das erste Maximum, das erste Minimum und das zweite Maximum der Beu gungsscheibe ortsaufgelöst detektiert werden. Alternativ kann auch das erste Maxi mum und das erste Minimum detektiert werden.

Das wenigstens eine erfindungsgemäß vorhandene Kompensatorelement wird im Betrieb der Detektionseinrichtung als Teil eines Laserscanning-Mikroskopes verwen det, um die durch das Verschieben wenigstens eines der Filterelemente verursachte Verschiebung des gefilterten Lichtes, das heißt der Fokuslage des gefilterten Lichts auf dem ortsauflösenden Detektor, zu kompensieren. Dies soll natürlich möglichst schnell geschehen, um insbesondere die Messung nicht unnötig zu verzögern. Ein Laserscanning-Mikroskop verfügt über wenigstens eine Lichtquelle und eine Optik, die das Licht der Lichtquelle in einen Fokusbereich der Probe fokussiert. Bei diesem Beleuchtungslicht handelt es sich um das Anregungslicht, mit dem Fluorophore an geregt werden, die sich in oder auf der Probe befinden. Das Beleuchtungslicht wird durch eine Scan-Einheit über die Probe gescannt oder gerastert. Die Fluorophore senden dann Emissionslicht aus, das detektiert werden soll. Das Emissionslicht wird über die Scan-Einheit der Detektionseinrichtung zugeführt und dort durch das we nigstens eine Filtermodul gefiltert und dem wenigstens einen ortsauflösenden Detek tor zugeleitet. Dabei ist der Detektor, genauer eine Detektionsapertur des Detektors konfokal zu dem Fokusbereich auf oder in der Probe angeordnet. Diese Konfokalität kann durch das Verschieben wenigstens eines Filterelementes gestört werden und wird dann durch das Kompensatorelement wieder hergestellt.

Dazu muss bestimmt werden, wie das Kompensatorelement zur Kompensierung der Störung einzustellen ist. Eine Vorrichtung und ein Verfahren, mit dem dies leicht er mittelt werden kann, sind beschrieben in der noch nicht veröffentlichen internationa len Patentanmeldungen mit dem Aktenzeichen PCT/EP2020/066589. Der gesamte Inhalt dieser Anmeldung wird hiermit durch Bezugnahme in die vorliegende Anmel dung aufgenommen.

Das Bestimmen kann mittels einer Einrichtung zur Überprüfung der Konfokalität bei spielsweise in mehreren Schritten erfolgen. Das von der Lichtquelle ausgesandte Licht wird über die Scan-Einheit nicht der Probe, sondern einem Hilfsdetektor zuge leitet. Dieser, genauer seine Hilfsdetektorapertur, ist in einer Fokusebene angeordnet und wird durch Verstellen der Scan-Einheit mit dem Beleuchtungslicht abgetastet. Dabei wird eine erste Intensitätsverteilung des vom Hilfsdetektor detektierten Be leuchtungslichtes erfasst.

In einem anderen Schritt wird mittels einer Hilfslichtquelle, die vorzugsweise eben falls in derselben Fokusebene wie der Hilfsdetektor und auf einer zur Hilfsdetek torapertur zugehörigen optischen Achse angeordnet ist, Hilfslicht in die Scan-Einheit eingeleitet, das mittels der Scan-Einheit der Detektionseinrichtung zugeleitet wird. Hierbei können Hilfsdetektorapertur und Hilfslichtquelle aus demselben Element ge bildet sein, beispielsweise einer Diode, die sowohl als Emitter als auch als Empfän ger betrieben werden kann, oder dem Ende einer Lichtleitfaser, die über einen Faser koppler sowohl an einen Detektor als auch an ein Leuchtmittel, beispielsweise einen Laser, angeschlossen ist. Auch hier wird durch Verstellen der Scan-Einheit die De tektionseinrichtung, genauer ihre Detektionsapertur, abgetastet und so eine zweite Intensitätsverteilung erfasst. Dann wird mindestens ein Unterschied zwischen der ersten Intensitätsverteilung und der zweiten Intensitätsverteilung über die verschie denen Stellungen der Scan-Einheit hinweg als Maß für einen Fehler der Konfokalität erfasst. Dieser Fehler wird bestimmt und aus ihm wird eine Stellgröße für das Kom pensatorelement abgeleitet und das Kompensatorelement wird so eingestellt, dass der Fehler kompensiert wird. Eine Kombination aus Hilfslichtquelle und Hilfsdetek torapertur wird im Folgenden Hilfseinrichtung genannt. Dies gilt auch dann, wenn Hilfsdetektorapertur und Hilfslichtquelle durch das gleiche Bauteil, beispielsweise eine Diode, gebildet werden.

Durch die beiden Schritte ist es möglich, besonders einfach und schnell eine Abwei chung in der Konfokalität zu ermitteln und das Kompensatorelement geeignet einzu stellen. Da die Detektionseinrichtung gemäß den Ausführungsbeispielen der vorlie genden Erfindung eingerichtet sein kann, unterschiedliche spektrale Bereiche, also unterschiedliche Farben, zu detektieren, ist es von Vorteil, wenn das Laserscanning- Mikroskop mehrere Hilfseinrichtungen mit jeweils einer Hilfslichtquelle aufweist. Die verschiedenen Hilfslichtquellen senden jeweils Hilfslicht mit zueinander unterschiedli chen Wellenlängen aus oder können es zumindest aussenden. Jede Hilfseinrichtung verfügt zudem über jeweils eine Hilfsdetektorapertur, die eingerichtet sind, das Licht der Hilfslichtquelle der jeweiligen Hilfseinrichtung zu detektieren. Die Hilfsdetek toraperturen der verschiedenen Hilfseinrichtungen können daher Licht mit zueinan der unterschiedlichen Wellenlängen detektieren. Eine Anordnung mehrerer solcher Hilfseinrichtungen ist deshalb auf einfache Weise möglich, weil es nicht darauf an kommt, an welchem Ort innerhalb einer Fokalebene ein solches Paar angeordnet ist, sondern nur darauf, dass es in einer Fokalebene innerhalb des Abtastbereichs der Scan-Einheit angeordnet ist. Sind mehrere Hilfseinrichtungen vorhanden, kann das oben skizzierte Verfahren auch für mehrere spektrale Anteile, also mehrere Detekti onskanäle gleichzeitig durchgeführt werden. Jede Hilfseinrichtung mit einer Hilfslicht quelle, die Hilfslicht aussenden kann, und einer Hilfsdetektorapertur, die dieses von der Hilfslichtquelle ausgesandte Licht detektieren kann, funktioniert vorzugsweise bei einer vorbestimmten Wellenlänge und Hilfslichtquelle und Hilfsdetektorapertur sind bezüglich dieser Wellenlänge, die auch als Arbeitswellenlänge der Hilfseinrichtung bezeichnet werden kann, aufeinander abgestimmt. Werden mehrere Hilfseinrichtun gen verwendet, weisen diese vorzugsweise unterschiedliche Arbeitswellenlängen auf

Die Erfindung löst die gestellte Aufgabe zudem durch ein Laserscanning-Mikroskop mit einer hier beschriebenen Detektionseinrichtung.

Mithilfe der beiliegenden Zeichnungen werden nachfolgend einige Ausführungsbei spiele der vorliegenden Erfindung näher erläutert. Es zeigt

Figur 1 eine schematische Darstellung einer Detektionseinrichtung ge mäß einem ersten Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfin dung,

Figur 2 - einen Ausschnitt einer Detektionseinrichtung gemäß einem wei teren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung,

Figur 3 den Ausschnitt aus Figur 2 in einer anderen Einstellung,

Figur 4 einen Ausschnitt einer Detektionseinrichtung gemäß einem wei teren Ausführungsbeispiel der vorliegenden Erfindung und

Figuren 5 und 6- eine schematische Darstellung von gemessenen Intensitäten

Figur 1 zeigt schematisch Detektionseinrichtung 2 gemäß einem ersten Ausführungs beispiel der vorliegenden Erfindung. Sie verfügt über einen Lichteingang 4, durch den Licht, das zuvor durch andere optische Einrichtungen 6, von denen lediglich bei spielhaft eine optische Einrichtung 6 dargestellt ist, geführt wurde, in die Detektions einrichtung 2 eindringt. Schematisch ist ein Teleskop 8 dargestellt. Durch das Tele skop verschiebt sich die Taille des eintretenden Gaußschen Bündels im gezeigten Ausführungsbeispiel nach rechts zwischen die ersten beiden Filtermodule 14. Die Detektionseinrichtung 2 verfügt über eine Filterkaskade 12, die im gezeigten Ausfüh rungsbeispiel drei Filtermodule 14 aufweist. Jedes der Filtermodule 14 verfügt über zwei Filterelemente 16, die kontinuierlich durchstimmbar sind und beispielsweise als Farbverlaufsfilter ausgebildet sein können. Die ersten beiden gezeigten Filtermodule 14 verfügen über jeweils einen Detektorausgang 18 und einen Filterausgang 20. Der Teil des Lichtstrahls 10, der im ersten Filtermodul 14 die beiden Filterelemente 16 durchdringt, wird aus dem Detektorausgang 18 zu einem ortsauflösenden Detektor 22 geleitet. Der Teil des Lichtstrahls 10, der im ersten Filtermodul 14 an dem ersten der Filterelemente 16 reflektiert wird, wird aus dem Filterausgang 20 zum nächsten Filtermodul 14 geführt. Das letzte Filtermodul 14, das in Figur 1 ganz rechts darge stellt ist, verfügt über zwei Detektorausgänge 18, da das jeweils austretende Licht nicht einem weiteren Filtermodul 14 zugeführt wird, sondern einem als ortsauflö- sende Detektoren 22 ausgebildeten Detektor und einer Strahlfalle 25. Optisch hinter den Filterelementen 16 eines Filtermoduls 14 befinden sich in Figur 1 nicht darge stellte Kompensatorelemente 26, die den jeweiligen Detektoren 22, 24 zugeordnet sein können und die verwendet werden können, um eine Fokuslage des Lichtes auf einem Detektor 22, 24 zu verändern. Ein Kompensatorelement 26 kann beispiels weise verwendet werden, um eine Abbildungslinse 32 senkrecht zur Strahlrichtung zu verschieben, wobei die Verschiebung, in der Figur durch Verschiebungspfeile 27' dargestellt, die Fokuslage in Z-Richtung einstellt. Andere Kompensatorelemente be wirken eine Verschiebung, in der Figur durch Verschiebungspfeile 27 dargestellt, in X-Richtung und in Y-Richtung. Der besseren Übersichtlichkeit wegen sind in der Fi gur 1 nur zwei der drei Filtermodule 14 Verschiebungspfeile 27, 27' zugeordnet.

Auch dem dritten Filtermodul sind entsprechende, nicht dargestellte Kompensator elemente 26 zugeordnet. Dadurch kann eine ausreichende Kompensation erreicht werden.

Figur 2 zeigt einen schematischen Ausschnitt aus einer Detektionseinrichtung 2 und stellt drei Filtermodule 14 mit je zwei Filterelementen 16 dar. Durch die in Figur 2 nach unten zeigenden Detektorausgänge 18 verlässt ein Teil des Lichtes das jewei- lige Filtermodul 14 und wird auf einen Spiegel 28 geführt. Dieser Spiegel 28 reflek tiert den Teil des Lichtes auf das Kompensatorelement 26, das im gezeigten Ausfüh rungsbeispiel als beweglicher Spiegel ausgebildet ist. Es ist gleichzeitig ein Um schaltelement 36.

Das Umschaltelement 36 lenkt in der dargestellten Einstellung das Licht, das das erste Filtermodul 14 durch seinen Detektorausgang 18 verlassen hat, auf den orts- auflösenden Detektor 22 und das Licht, das die Detektorausgänge 18 des zweiten und des dritten Filtermoduls 14 verlassen hat, auf nicht ortsauflösende Sammelde tektoren 24.

In einer Einstellung, die in Figur 3 dargestellt ist, leitet das Umschaltelement 36 Licht, das das zweite Filtermodul 14 durch dessen Detektorausgang 18 verlassen hat, auf den ortsauflösenden Detektor 22 und Licht, das das erste Filtermodul 14 durch des sen Detektorausgang 18 verlassen hat, in eine Strahlfalle 25, während es Licht, das das dritte Filtermodul 14 durch dessen Detektorausgang 18 verlassen hat, auf den Sammeldetektor 24, der dem ortsauflösenden Detektor 22 benachbart ist, leitet.

In einer dritten Einstellung, die nicht dargestellt ist, leitet es Licht, welches das dritte Filtermodul 14 durch dessen Detektorausgang 18 verlassen hat, auf den ortsauflö senden Detektor 22, während es übriges Licht jeweils in eine Strahlfalle 25 leitet. Da bei dient das Umschaltelement 36 gleichzeitig als Kompensatorelement 26. Das be deutet, dass die festgelegte Einstellung des Umschaltelements 36 bei einer Ände rung des ausgewählten Detektions-Wellenlängenbandes, das heißt, bei einer Ände rung des Einstellung des dem ortsauflösenden Detektor 24 jeweils zugeordneten Fil termoduls 14 derart ist, dass ein Fehler der Fokuslage des Lichts auf dem ortsauflö senden Detektor 22 kompensiert ist. Eine Anpassung hinsichtlich der Lagen des Lichts auf den Sammeldetektoren ist nicht möglich, aber auch nicht nötig, da deren Detektionsaperturen ausreichend groß gewählt sind. In der gezeigten Einstellung des Ausführungsbeispiels ist das Kompensatorelement 26 also so angeordnet, dass das aus dem Detektorausgang 18 des zweiten und dritten Filtermoduls austretende Licht auf die beiden Sammeldetektoren 24 geleitet wird, während das aus dem Detektor ausgang 18 des ersten Filtermoduls 14 austretende Licht auf den ortsauflösenden Detektor 22 trifft. Das als beweglicher Spiegel ausgebildete Kompensatorelement 26 dient auch als Umschaltelement 36, mit dem jeweils das aus einem Detektorausgang eines der Filtermodule 14 austretende Licht auf den ortsauflösenden Detektor 22 ge leitet wird. In einer alternativen Ausgestaltung können auch die Spiegel 28 jeweils Teil einer Kompensationseinrichtung sein, die zwei Kompensatorelemente 26, die als zwei Spiegel ausgebildet sind, aufweist. Der jeweilige Spiegel 28 kann dann bei spielsweise verwendet werden, um eine Kompensation in einer ersten Richtung zu erreichen. Der zweite Spiegel, also bevorzugt das Umschaltelement 36, wird in die sem Fall verwendet, um eine Kompensation in einer zweiten Richtung, die bevorzugt senkrecht auf der ersten Richtung steht, zu erreichen.

Figur 3 zeigt den aus Figur 2 bekannten Aufbau mit den Filtermodulen 14 und deren Detektorausgängen 18. Das austretende Licht wird auf die Spiegel 28 geführt, von denen es auf das Kompensatorelement 26 geleitet wird. Dies ist in Figur 3 in einer anderen Position dargestellt als in Figur 2. Das Licht des ersten Filtermoduls wird in eine Strahlfalle 25 geleitet und steht der Auswertung nicht zur Verfügung. In der Strahlfalle 25 wird das Licht absorbiert und kann somit nicht als Streulicht auf einen der Detektoren 22, 24 fallen. Das Licht des mittleren Filtermoduls 14 wird auf den ortsauflösenden Detektor 22 und das Licht des rechten Filtermoduls 14 auf den Sam meldetektor 24 geleitet. Da die Auftreffposition des Lichtes auf dem jeweiligen Detek tor 22, 24 nur für den ortsauflösenden Detektor 22 relevant ist, ist in der gezeigten Ausführungsform, die nur über einen einzigen ortsauflösenden Detektor 22 verfügt ein einziges Kompensatorelement 26 ausreichend.

Figur 4 zeigt eine andere Ausgestaltung. Auch diese verfügt über drei Filtermodule 14 mit jeweils zwei Filterelementen 16, die jeweils kontinuierlich durchstimmbaren ausgebildet sind. Auch diese Filtermodule 14 verfügen über jeweils einen Detektor ausgang 18, durch den Licht in Figur 4 nach unten das jeweilige Filtermodul 14 in Richtung auf jeweils einen ortsauflösenden Detektor 22 verlässt. Das durch einen Detektorausgang 18 austretende Licht trifft jeweils auf ein Kompensatorelement 26 und wird von dort durch jeweils eine Abbildungslinse 32 auf den jeweiligen ortsauflö- senden Detektor 22 geleitet. Ein Umschaltelement 36 ist nicht nötig. Die Figuren 5 und 6 zeigen exemplarische Messwerte. Jedes Feld 34 entspricht einem Pixel eines ortsauflösenden Detektors 22. Beim Rastern über eine Probe wird eine Vielzahl von Teilbildern mit dem ortsauflösenden Detektor 22 aufgenommen, wobei jeder Pixel, also jedes Feld 34 die auftreffenden Photonen, also insbesondere die auftreffende Lichtintensität, detektiert. Die in den Figuren 5 und 6 gezeigten Werte, die den einzel nen Feldern 34 zugeordnet sind, entsprechen den aufsummierten Intensitäten über eine Mehrzahl von aufgenommenen Teilbildern. Es sind also Maße für eine über die Mehrzahl von Bildern integrierten Intensitäten, die von den jeweiligen Feldern 34 de tektiert wurden. Dabei wurden die Werte normiert, so dass der Maximalwert bei 1 ,00 liegt. Bei einer optimal justierten Einrichtung ergibt sich, wenn sehr viele Photonen detektiert werden und ein hinreichender Bereich der Probe abgetastet wird, im Mittel eine rotationssymmetrische Verteilung. Eine solche ist in Figur 5, bei der der Maxi malwert nach links unten verschoben ist, nicht gegeben. In Figur 6 ist der Maximal wert zwar im mittleren Feld 34, die darum herum liegende Verteilung der Werte ist annähernd rotationssymmetrisch. Abweichungen von der Rotationssymmetrie kön nen sich unter anderem ergeben durch Photonenrauschen, durch einen nicht hinrei chenden abgetasteten Bereich einer inhomogenen Probe, sowie durch eine nicht vollständige Kompensation. Grundsätzlich lassen sich aber auf Grundlage solcher aufsummierten Intensitäten die Kompensationseinrichtungen und deren Kompensa torelemente 26 so einstellen, dass Fehler der Fokuslagen kompensiert sind. Die Be stimmung der Kompensation kann erleichtert werden, wenn bei der Abtastung die Probe nicht nur mit Anregungslicht beaufschlagt wird, sondern auch mit STED-Licht, welches die Emission von Fluoreszenz in äußeren Bereichen des Anregungsfokus jeweils unterdrückt. Dies hat den Effekt, dass Fluoreszenz jeweils nur aus dem ach sennahen Bereich des Anregungsfokus emittiert wird, sodass schon jede einzelne detektierte Intensitätsverteilung in besserer Näherung rotationssymmetrisch ist. Inho mogenitäten der Probe kommen weniger zum Tragen. Auf diese Weise lässt sich die Anlage, insbesondere das Mikroskop, justieren und einstellen, ohne dass eine Refe renzprobe oder eine besondere Einrichtung zur Einstellung der Konfokalität nötig ist. Bezugszeichenliste

2 Detektionseinrichtung

4 Lichteingang

6 optische Einrichtung

8 Teleskop

10 Lichtstrahl

12 Filterkaskade

14 Filtermodul

16 Filterelement

18 Detektorausgang

20 Filterausgang

22 ortsauflösender Detektor

24 Sammeldetektor

25 Strahlfalle

26 Kompensatorelement

27, 27' Verschiebungspfeil 28 Spiegel

30 Absorptionselement

32 Abbildungslinse

34 Feld

36 Umschaltelement