Nachweisverfahren für Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis Die vorliegende Anmeldung betrifft ein Verfahren zum spezifischen Nachweis und ggf. zur Quantifizierung von Mycobacterium avium ssp. paratuberculosis (MAP) in einer Probe eines Individuums. Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren wird hierzu der Nachweis des Vorhandenseins der IS900-Region in einer Probe mit Hilfe einer Nukleinsäureamplifikation und spezifischen Oligo- nukleotiden durchgeführt. In einem weiteren Aspekt wird vorliegend ein Test-Kit zum spezifischen Nachweis von MAP in einer Probe mittels Amplikationsver- fahren bereitgestellt. Schließlich werden spezifische Oligonukleotide offenbart, die zum spezifischen Nachweis von MAP geeignet sind. Stand der Technik

Mycobacterium avium ist eine Mykobakterienart, die verschiedenste Wirte hat. Mycobacterium avium kann einerseits die Geflügeltuberkulose verursachen, andererseits auch bei Menschen und anderen Säugetieren als Krankheitserreger auftreten. Eine Spezies hiervon ist Mycobacterium avium ssp. pa- ratuberculosis (MAP), ein obligat pathogenes Bakterium der Gattung Mycobacterium. MAP gilt aus Auslöser der Paratuberkulose (Johne'sche Krankheit), einer Erkrankung die insbesondere bei Wiederkäuern auftritt. Auch die Subspezies MAP konnte neben den Wiederkäuern und dem Menschen in weiteren Tierarten, insbesondere in Wildtieren detektiert werden, u.a. in Hasen, Vögeln, Wildkatzen, Waschbären und Ratten. Es wird weiterhin eine mögliche Beteiligung dieses Erregers bei dem Krankheitsbild „Morbus Crohn" des Menschen diskutiert.

Der Erreger MAP ist seit Anfang des 1 9. Jahrhunderts bekannt als Verursacher der Paratuberkulose. Bei der Paratuberkulose handelt es sich um ei- ne chronische Darmerkrankung, die über Wochen hinweg zu einer ständigen Abmagerung führt. Im Endstadium verläuft diese Erkrankung tödlich. Überwiegend werden adulte Hauswiederkäuer, wie Rinder, Schafe und Ziegen, aber auch Wildwiederkäuer und Zootiere befallen. Üblicherweise erfolgt die Übertragung des Erregers vor allem auf neugeborene Kälber und Kälber bis zum Alter von 6 Monaten. Die Infektion findet dabei meist schleichend und unerkannt auf fäkal-oralem Wege statt und auch die Kolostralmilch erkrankter Kühe kann den Erreger enthalten. Nach einer mehrjährigen Latenzzeit mit unregelmäßiger und nicht kontrollierbarer Erregerausscheidung tritt die Krankheit typischerweise erst bei älteren Kühen auf. Derzeit gibt es keine Therapie. I mpfstoffe zeigten in der Vergangenheit zweifelhafte Erfolge, so dass ein Einsatz in Deutschland zurzeit nicht erfolgt. Häufig ist der Zukauf von subklinischen bzw. persistent infizierten Tieren für die Neuinfektionen innerhalb einer Herde verantwortlich. Gerade die klinisch unauffälligen Träger sowie unerkannte Ausscheider sind die wichtigste Ursache für dauerhaft fortbestehende Bestandsinfektionen. Ge- rade durch die weite Verbreitung der Paratuberkulose sowie wirtschaftliche Schäden sind verbesserte Diagnostikmethoden und die Entwicklung von Bekämpfungsprogrammen aktuell gefragt. Die Paratuberkulose ist in Deutschland nach §78a Abs. 2 Tierseuchengesetz meldepflichtig.

Die Diagnostik von Paratuberkulose stellt einen wesentlichen Baustein bei der Bekämpfung und bei der Früherkennung der Paratuberkulose dar. Es gibt bereits verschiedene Testverfahren und Diagnoseverfahren, die z.B. auf Antikörper-basierten Tests beruhen. Ein Problem der kommerziell erhältlichen Tests ist allerdings die mangelnde Sensitivität und die mangelnde Spezifität. Antikörper-basierte Tests sind weiterhin ungeeignet, da serologisch negative Ausscheider aufgrund der mangelnden Sensitivität dieser Tests in den Herden verbleiben und so die Krankheit weiterhin verbreiten können.

Um zukünftig ein wirksames Eradikationsprogramm durchführen zu können, sind verlässliche Erregernachweise notwendig. Molekularbiologische Verfahren, insbesondere Verfahren auf Basis einer Nukleinsäureamplifikation sind vielfach diskutiert worden. Insbesondere molekularbiologische Verfahren auf Basis der Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) werden gro ße Chancen zugerechnet. Die PCR stellt eine schnelle und zuverlässige Methode dar, um MAPDNA in Verdachtsproben zu bestätigen. Als besonders geeignete Bereiche des MAP-Genoms wurden hierbei die Insertionssequenz IS900, aber auch Bereiche von ISMav2, hspX und F57 identifiziert. Es kristallisiert sich insbesondere das Insertionselement IS900 als ein geeigneter Bereich zur molekularen Diagnostik, insbesondere mit Hilfe von PCR-Verfahren heraus.

IS900 ist ein 1 451 bp gro ßes Fragment, das 1 7 Kopien innerhalb des

Genoms des Referenzstammes MAP-K1 0 aufweist. Aufgrund dieser hohen Kopienzahl kann eine höhere Sensitivität des Nachweisverfahrens erreicht werden und macht die IS900 zu einer geeigneten Targetregion. Konventionelle und Echtzeit-PCR (real-time PCR) zum Nachweis von MAP basierend auf die Ziel- sequenz IS900 sind beschrieben.

So enthält die DE1 0200701 5775A1 zum spezifischen Nachweis von MAP geeignete Oligonukleotide. Weiterhin offenbart dieses Dokument entsprechende Verfahren und Test-Kits zum Nachweis von MAP. Aus der EP 2 009 1 1 8 A2 ist ebenfalls ein Verfahren zum Nachweis und zur Quantifizierung von MAP auf Basis von IS900 und F57 spezifischen Primern bekannt.

Allerdings leiden die dort beschriebenen Verfahren nach wie vor an einer mangelnden Sensitivität bei hoher Spezifität.

Bull et al. , 2007, PlosOne, 1 1 , e1 229, beschreibt einen real-time PCR Assay zum Nachweis von MAP. Münster P., et al., 201 1 , Vet Microbiol, 1 54(1 -2), 1 97- 201 , offenbart eine semi-rested PCR (snPCR) zum Nachweis von MAP. Eine hohe Sensitivität ist beschrieben. Allerdings erfordert eine sn PCR die Durchführung von 2 PCR-Durchgängen. sn PCR ist bekannt als ein Verfahren, bei dem eine hohe Kontaminationsgefahr besteht und daher für den Routineeinsatz mit einem hohen Durchsatz an Proben nicht geeignet ist.

Erforderlich ist aber, infizierte Individuen mit hoher Sensitivität und großer Spezifität nachzuweisen, um ein entsprechendes Eradikationsprogramm durchzuführen. Dieses Verfahren soll insbesondere auch in biologischen Proben, wie Kot, Organ, Milch und Gewebeproben durchführbar sein ohne vorherige umfangreiche Anzucht, welche bis zu 1 6 Wochen benötigt, oder Aufberei- tungsschritte durchführen zu müssen.

Au ßerdem soll dieses Verfahren geeignet sein, eine entsprechende Automatisierung zu erlauben. Die im Stand der Technik beschrieben Verfahren erlauben dieses nicht. Beschreibung der Erfindung

In einem ersten Aspekt richtet sich die vorliegende Anmeldung auf ein Verfahren zum spezifischen Nachweis ggf. zur Quantifizierung von Mycobacte- rium avium ssp. paratuberculosis (MAP) in einer Probe eines Individuums. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst dabei den Schritt des Nachweises der IS900-Region eines MAP-Genoms in einer Probe mit Hilfe einer Nukleinsäu- reamplifikation, wobei diese Amplifikation mit den spezifischen Oligonukleoti- den bestehend aus jeweils mindestens 1 5 aufeinanderfolgende Nukleotiden der Sequenzen gemäß Seq. I D Nr. 1 und Seq. I D Nr. 2 durchgeführt werden und ein Nachweis der IS900-Region mindestens eines MAP-Genoms das Vorhandensein von MAP in der Probe aufzeigen.

Es wurde vorliegend herausgefunden, dass die spezifischen Oligo- nukleotide, wie sie hier eingesetzt werden, nämlich die Oligonukleotide, die mindestens 1 5 aufeinanderfolgende Nukleotiden der Sequenzen gemäß Seq. I D Nr. 1 und Seq. I D Nr. 2 aufweisen, eine hervorragende Spezifität und Sensi- tivität gegenüber MAP in diagnostischen Verfahren auf Basis einer Nukleinsäu- reamplifikation erlauben.

Es ist dabei bevorzugt, dass die Oligonukleotide gemäß Seq. I D Nr. 1 und/oder Seq. I D Nr. 2 unabhängig voneinander mindestens 1 6, wie 1 7, 1 8 aufeinanderfolgende und insbesondere mindestens 1 9 Nukleotide dieser beiden Sequenzen aufweisen. Bevorzugter ist, dass zumindest eines der spezifischen Oligonukleotide gemäß Seq. I D Nr. 1 und/oder Seq. I D Nr. 2 mindestens 1 1 , 1 2, 1 3, 14, 1 5, insbesondere mindestens 1 6, 1 7, 1 8, 1 9 oder sämtliche Nukleotide der genannten Sequenzen aufweist. Es ist klar, dass auch Ausführungsformen enthalten sind, bei denen ein Oligonukleotid z. B. mindestens 1 8 Nukleotide der Sequenz gemäß Seq. I D Nr. 1 und mindestens 1 9 Nukleotide der Sequenz gemäß Seq. I D Nr. 2 aufweist. I m Umfang dieser Erfindung ist jede Variation enthalten.

Das Verfahren zur Nukleinsäureamplifikation ist bevorzugt eine Polyme- rase-Ketten-Reaktion (PCR). Bei dieser kann es sich insbesondere um eine Echtzeit-PCR (real-time PCR)- handeln. Die PCR, z. B. in Form einer Echtzeit- PCR ist insbesondere eine quantitative PCR. Im Gegensatz zu bekannten Verfahren, die ebenfalls auf Basis einer PCR beruhen, ist es vorliegend mit den erfindungsgemäßen Oligonukleotiden als Primerpaar möglich, in einer Amplifikationsrunde aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten. Bisher bekannte Verfahren beruhen häufig auf den sogenann- ten„nested"- oder„semi-nested-PCR"-Verfahren. Hierbei erfolgt die Amplifika- tion in zwei Schritten, d. h. das Verfahren dauert länger und ist teurer als ein Einschrittverfahren. Weitere Vorteile der Echtzeit-PCR sind die Möglichkeit einer Quantifizierung der MAP-DNA, eine schnelle Durchführung mit geringer Kontaminationsgefahr sowie die Gewährleistung einer hohen Sensitivität und Spezifität.

Es ist insbesondere bevorzugt, dass bei der Nukleinsäureamplifikation, wie der PCR insbesondere der Echtzeit-PCR und besonders bevorzugt bei der quantitativen PCR, der Nachweis der IS900-Region mit Hilfe einer Nukleinsäu- resonde erfolgt. Diese Nukleinsäuresonde ist ein üblicherweise mit einem Label oder Marker markiertes Oligonukleotid, die an die IS900-Region des MAP- Genoms und/oder an einer Nukleinsäure komplementär zu der IS900-Region des MAP-Genoms, hybridisiert.

Unter Hybridisierung wird vorliegend verstanden, dass ein Nukleinsäu- remolekül, wie die Nukleinsäuresonde, sich an mindestens einem anderen Nukleinsäuremolekül, hier einem amplifizierten Genabschnitt, anlagert, wobei im Anlagerungsbereich die beiden einzelnen Stränge der Nukleinsäuren im Wesentlich vollständig komplementär sind. Es können sich auch triple Helices zwischen der Nukleinsäuresonde und vorliegender doppelsträngiger DNA ausbilden. Dem Fachmann sind bekannte Hybridisierungsverfahren bekannt. Ins- besondere sind die hybridisierenden Bereiche wenigstens zu 70 % komplementär, wie mindestens 75 %, insbesondere mindestens 80 %, bevorzugt mindestens 90 %, wie mindestens 95 %, insbesondere mindestens 99 %, wie vollständig komplementär.

In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Nukleinsäure ein Oligo- nukleotide mit mindestens 1 5 aufeinanderfolgende Nukleotiden gemäß Seq. I D Nr. 3. Es ist bevorzugt, dass die Sonde eine ist mit mindestens 1 6, 1 7, 1 8 aufeinanderfolgenden Nukleotiden gemäß Seq. I D Nr. 3, bevorzugt 1 9 Nukleotide, wie die Sequenz Seq. I D Nr. 3 selbst mit 20 Nukleotiden. Die Sonde ist dabei in üblicher Art und Weise mit einem Label oder Marker markiert, die eine einfache Detektion mit bekannten Verfahren erlaubt. Dem Fachmann sind übliche Label oder Marker bekannt, wie Fluoreszenzfarbstoffe, z.B. FAM (5 oder 6 Carboxyfluorescein), VIC, N I D, Fluorescein, Fluoresceini- sothiocyanat (FITC), 6-carboxy-2', 4', 7', 4, 7-Hexachlorofluorescein (HEX), Cyaninfarbstoffe, wie Cy3, Cy5 usw. , Rhodamin-Farbstoffe, Phenanthriden- farbstoffe und weitere dem Fachmann wohlbekannte Farbstoffe. Besonders geeignet für die Sonden-Detektion sind FAM und der Black-Hole-Quencher-1 (BHQ1 ).

Dem Fachmann sind für das jeweilige Protokoll der Nukleinsäureamplifi- kation, wie der PCR, der Echtzeit-PCR und insbesondere für quantitative PCR, die geeigneten Farbstoffe in Verbindung mit den geeigneten Amplifikations- systemen bekannt.

Bei der Echtzeit-PCR werden alternativ inaktive, z. B. gequenchte, Fluo- reszenzfarbstoffe beigemischt, die durch die DNA-Produktion aktiviert werden. Übliche Farbstoffe, die mit der synthetisierten doppelsträngigen DNA interkalie- ren können, sind z. B. Ethidiumbromid oder SYBR Green. Bei der Nutzung des TaqMan Systems zur Nukleinsäureamplifikation sind die Nukleinsäuresonden solche, die durch Hydrolyse nachweisbar sind, zum Beispiel durch Bestimmung der entsprechenden Fluoreszenz. Dem Fachmann sind weitere geeignete Systeme auf Basis und z.B. LightCycler-Sonden, FRET-Sonden, Molecular Bea- cons oder Skorpion Primer bekannt. Das Nukleinsäureamplifikationverfahren ist insbesondere bevorzugt eine quantitative Echtzeit-PCR mit Primern gemäß Seq. I D Nr. 1 und Seq. I D Nr. 2 und einer Nukleinsäuresonde gemäß Seq. I D Nr. 3.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren und auch in den erfindungsgemäßen Test-Kits können weiterhin entsprechende Kontrollen vorliegen. Diese Kontrollen beinhalten Kontrollen für die Amplifikation und/oder Kontrollen für die Aufreinigung. Diese Kontrollen können z. B. in der Probe selbst vorliegen oder in einen parallelen Ansatz durchgeführt werden. So kann beispielhaft die Sonde bei der Echtzeit-PCR mit einem gequenchten Farbstoff, wie FAM, ausgestattet sein. Gleichzeitig ist die Sonde mit einem zweiten Marker, der in einem anderen Bereich, z. B. in einem anderem Bereich Licht emittiert, nachge- wiesen werden kann als der gequenchte Farbstoff und der nicht gequencht ist, ausgestattet. Dadurch ist eine Kontrolle der PCR möglich. Weiterhin kann in der Probe oder parallel dazu eine Positivkontrolle amplifiziert werden, wie ß- Aktin. Der Nachweis hiervon erfolgt mit einem Marker, der zu den ersten und zweiten Marker unterschiedlich ist, z. B. ein Cy5 Farbstoff. Dadurch ist eine Kontrolle der Reaktion möglich und erlaubt eine Verbesserung der Aussagekraft des Verfahrens. Zur Amplifikationskontrolle, welche den inhibitorischen Effekt einer klinischen Probe ausschließt, kann eine zweite Fluoreszenzfarbe (z.B. H EX, gemessen bei 533-580 nm) für die Sonde integriert werden.

Zur Quantifizierung können in Parallelansätzen weiterhin entsprechende

Positivkontrollen für MAP in vorbestimmten Konzentrationen eingesetzt werden. Dem Fachmann sind die entsprechenden Versuchsansätze bekannt.

Die Nukleinsäureamplifikation erfolgt bevorzugt aus einer Probe eines Individuums. Die der Nukleinsäureamplifikation unterworfene Probe kann dabei eine Probe sein, die aus einer Vielzahl von gepoolten Proben besteht, um so ein effektives Testen auf MAP zu ermöglichen. Üblicherweise kann eine ge- poolte Probe eine Mischung aus z.B. 1 0 bis 20 einzelnen Proben unterschiedlicher Individuen sein. Alternativ handelt es sich bei der Probe um die Probe eines einzelnen Individuums.

Unter dem Ausdruck Individuum, wird vorliegend insbesondere verstanden, ein Individuum ausgewählt aus Wiederkäuern, insbesondere Rinder, Schafe und Ziegen aber auch wilde Wiederkäuer, wie Zebra usw. Hierbei kann es sich z.B. um Zootiere handeln. Unter dem Ausdruck Individuum fallen weiterhin Menschen. So kann das Verfahren z.B. eingesetzt werden, um bei einem Menschen eine Infektion mit MAP zu testen, z.B. im Zusammenhang mit der Diagnose von Morbus Crohn.

Bei der Probe selbst kann es sich um eine ausgewählte Kot-, Milch-, Blut-, Sperma-, Gewebe- oder Organ-Probe handeln. Alternativ kann es sich auch um Umweltproben handeln, z.B. Proben auf pflanzlicher Basis oder Pro- ben aus Bio-gasanlagen und Gewässern.

Bevorzugt handelt es sich bei der Probe um eine Kotprobe oder eine Milchprobe eines Wiederkäuers, insbesondere eines Rindes.

Die Probe kann dabei erfindungsgemäß mit geeigneten Verfahren auf- gearbeitet werden. Übliche Verfahren schließen eine Aufarbeitung der Probe ein. Dem Fachmann sind geeignete Verfahren bekannt. Insbesondere kann die Aufarbeitung mit Hilfe bekannter DNA-Extraktionsverfahren erfolgen. Diese schließen die Verwendung bekannter Kits auf Basis von Tensiden und Salzen ein. Weiterhin sind mechanische DNA-Extraktionsverfahren möglich, einschließlich einer Aufarbeitung mittels Homogenisatoren etc. Insbesondere sind Verfahren geeignet, die den Einsatz von Tensiden zur Extraktion einschließen.

In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf Test- Kits zum spezifischen Nachweis von MAP in einer Probe mittels Amplifikation- verfahren, insbesondere mittels PCR. Diese Test-Kits umfassen Oligonukleoti- de zur Amplifizierung der MAP IS900-Region mit jeweils mindestens 1 5 aufeinanderfolgende Nukleotiden gemäß Seq. I D Nr. 1 und 2. Bevorzugt ist dieses Test-Kit eines für die PCR-Nukleinsäureamplifikation insbesondere eines für die Echtzeit-PCR. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem Test-Kit um eines geeignet für die quantitative PCR, wie die quantitative Echtzeit-PCR. In einer Ausführungsform umfasst das Test-Kit weiterhin ein Oligonukleotid mit mindestens 1 5 aufeinanderfolgenden Nukleotiden der Nukleinsäuresonde gemäß Seq. I D Nr. 3. Dieses Test-Kit ist insbesondere geeignet zur quantitativen Analyse auf Basis von z. B. der TaqMan PCR. Das er- findungsgemäße Test-Kit kann weiterhin weitere Bestandteile zur Durchführung der Nukleinsäureamplifikation, insbesondere die notwendigen Enzyme, Nukleotide und Puffer aufweisen. Weiterhin bevorzugt kann eine Positivkontrolle mit beigefügt sein und/oder Anweisungen zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Schließlich kann das Test-Kit entsprechende Reagenzien und Mittel enthalten, die zur Gewinnung der genomischen DNA aus Proben insbesondere Kot-, Milch-, Blut-, Sperma-, Organ-, Gewebe- und Umweltproben geeignet sind, und/oder Mittel zur Durchführung der PCR, insbesondere Echtzeit-PCR.

Dem Fachmann sind geeignete Reagenzien und Mittel bekannt.

Die Anmeldung richtet sich schließlich auf Oligonukleotide zum spezifischen Nachweis und, optional, zur Quantifizierung von MAP in einer Probe eines Individuums, wobei mindestens 1 5 aufeinanderfolgende Nukleotide der Sequenz Seq. I D Nr. 1 und mindestens 1 5 aufeinanderfolgende Nukleotide der Sequenz I D Nr. 2 vorhanden sind und, ggf. , mindestens 1 5 aufeinanderfolgende Nukleotide der Seq. I D Nr. 3.

Diese Oligonukleotide sind insbesondere in der Verwendung zum spezifischen Nachweis und optional zur Quantifizierung von MAP insbesondere mit- tels quantitativer Echtzeit-PCR geeignet. Die erfindungsgemäßen Oligonukleotide sind solche, wie oben ausgeführt.

Die Erfindung wird im Folgenden mit Hilfe von Beispielen näher erläutert, ohne auf sie beschränkt zu sein. Ausführungsbeispiel :

Für die Überprüfung der Spezifität der erfindungsgemäßen Primer (MAP ₅ 23-542f/MAP ₆ 6i -642r) und die TaqMan Sonde (MAP ₆ 1 7-636 _P ) gemäß Tabelle 1 wurden 1 4 Mykobakterien Arten sowie 14 nicht-Mykobakterien Arten, die häufig in der Landwirtschaft und der Umwelt vorkommen, sowohl in der klassischen als auch in der Echtzeit-PCR getestet und die Spezifität bestätigt (Tabelle 2). Figur 1 zeigt die Position der erfindungsgemäßen Primer zu den Primern aus dem Stand der Technik.

Tabelle 1 : Nukleinsäuresequenzen der Primer und TaqMan Sonde zur Detekti- on von MAP-DNA in der Echtzeit-PCR.

Primer/Sonde Sequenz (5'-3') Lokalisation/Seq.ID.No. ^*

MAP ₅₂ 3-542f TACCGCGGCGAAGGCAAGAC 523-542/ 1 MAP ₆₆ l-642r CGGAACGTCGGCTGGTCAGG 661 -642/ 2 MAP ₆₁₇ -636p ATGACATCGCAGTCGAGCTG 617-636/ 3

^* Nach der publizierten IS900 Sequenz MAP K- lÖ (GenBank: ÄF416985), Seq. ID No. 4.

Tabelle 2: Verwendete Referenzstämme zum Spezifitäts-Nachweis der TaqMan Echtzeit-PCR.

Bakterien-Spezies Name/Quelle

Mykobakterien-Arten M. avium ssp. paratuberculosis ATCC 1 9698

M. avium ssp. avium ATCC 1 5769

M. avium ssp. avium ATCC 1 9421

M. avium ssp. avium ATCC 25291

M. avium ssp. silvaticum ATCC 49884

M. bovis ATCC 27289

M. fortuitum ATCC 6841

M. gordonae ATCC 14470

M. intracellulare ATCC 1 3950

M. kansasii ATCC 1 2478

M. marinum ATCC 927

M. phlei ATCC 354

M. scrofulaceum ATCC 1 9981

M. smegmatis ATCC 1 9420

Andere Bakterien-Arten

Campylobacter jejuni ATCC 33560

Clostridium perfringens Cattle

Clostridium sordelli Cattle

Escherichia coli 0101 :K28 Cattle

Escherichia coli 0149:K91 Swine

Escherichia coli 0157:1-17 ATCC 700927

Enterococcus faecalis ATCC 1 9433

Enterococcus hirae ATCC 1 0541

Rhodococcus equi ATCC 25694

Salmonella cholerasuis Cattle

Salmonella thyphimurium Cattle

Staphylococcus aureus Cattle

Streptococcus dysgalactiae Cattle

Streptococcus uberis Cattle

Die verwendete DNA der Referenzstämme wurde aus Kulturen mit Hilfe des QIAamp Blood Kit (Quiagen, Hilden , Germany) extrahiert und mittels Nano- Drop® (N D-1 000 Spectrophotometer, peQLab Biotechnologie GmbH, Erlangen) gemessen. Die DNA wurde auf 1 ng/μΙ eingestellt. Durch den Einsatz publizier- ter PCR-Verfahren wurde die speziesspezifische DNA der Referenzstämme bestätigt. Als Negativkontrolle diente steriles, destilliertes Wasser.

In allen Fällen waren auf dem Agarosegel die zu erwartenden PCR- Produkte der jeweiligen Genus-spezifischen PCR deutlich zu erkennen.

Zur Abklärung der Spezifität wurden die beiden Primer (MAP ₅₂ 3- ₅₄ 2f/MAP ₆ 6i -642r) auf Kreuzreakti vität mit anderen Bakterienspezies in der klassischen PCR getestet (Figur 2). Für den Ansatz der PCR wurden „Ready-To- Go™" PCR„Beads" (Amersham Pharmacia Biotech Europe, Freiburg) verwendet. Reaktionsansatz und -bedingungen der PCR waren wie folgt:

Ready-To-GoTM PCR Beads 1 Bead

Aqua dest. 21 μΙ

Primer MAP-for (1 0 pmol/μΙ) 1 μΙ

Primer MAP-rev (1 0 pmol/μΙ) 1 μΙ

Template 2 μΙ

Der PCR ist ein Denaturierungsschritt bei 95 ^Q C für 4 min vorgeschaltet.

Denaturierung : 95 ^Q C, 30 sec

Annealing : 58-70 ^Q C, 30 sec

Elongation : 72 ^Q C, 60 sec

Den Abschluss der PCR bildet die Verlängerung der Elongation bei 72 ^Q C für 7 min.

Die zu erwartenden 1 39 bp großen PCR-Produkte waren auf dem Agarosegel deutlich und ausschließlich bei der MAP-DNA-Probe (ATCC 1 9698) zu erkennen. Amplifikate im 1 39 bp Bereich wurden bei anderen Bakterienspezies (n = 14) nicht beobachtet. Daher können die eingesetzten Primer (MAP ₅₂ 3- 5 ₄ 2f/MAP _{66 -642} r) als MAP-spezifisch angesehen werden.

Zusätzlich wurde die Spezifität mittels Sequenzierung des 1 39 bp langen Produktes bestätigt. Dazu wurden die PCR-Produkte in den Plasmidvektor pCR ^® 2.1 -TOPO ^® (Invitrogen, Groningen, Niederlande) kloniert, in E. coli Bakterien vermehrt und mit dem Wizard ^® Plus SV Minipreps Purification System (Promega, Mannheim) aufgereinigt. Die Nukleotidsequenzen wurden mit Hilfe von MegAlign mit der Sequenz des MAP K-1 0 Referenzstammes (Accession No. AE1 6958) verglichen. Insgesamt wurden 1 5 Klone in beiden Richtungen sequenziert und ausgewertet. Die IS900-Sequenzen der Amplifikate stimmten mit der publizierten bovinen MAP K-1 0 Sequenz zu 1 00% überein.

Nachdem die Spezifität der Primer (MAP ₅ 23-542f/MAP ₆ 6i -642r) in der klassi- sehen PCR anhand von Referenzstämmen (n = 14) überprüft wurde, sollte die Spezifität der Sonde (MAP ₆ 17-636 _P ) in Kombination mit den Primern in der Echt- zeit-PCR bestätigt werden. Als Negativkontrolle diente steriles, destilliertes Wasser. Reaktionsansatz sowie Reaktionsbedingungen der Echtzeit-PCR mit TaqMan Sonde auf dem LightCycler™ 480 (Roche Diagnostics, Mannheim) wa- ren wie folgt:

Light Cycler " ^vl DNA 480 Master 1 0 μΙ

Primer MAP-for (1 0 pmol/μΙ) 0,5 μΙ

Primer MAP-rev (1 0 pmol/μΙ) 0,5 μΙ

Sonde (1 0 pmol/μΙ) 1 μΙ

Aqua dest. 3 μΙ

Template 5 μΙ

95 °C 1 0 min

95 °C 1 5 sec

60 °C 30 sec 45 Zyklen

72 °C 35 sec Figur 3 zeigt die Detektion von MAP mittels TaqMan Sonde (MAP ₆ i ₇ -636 _P ) -

Die MAP-Spezifität der Primer (MAP ₅ 23-542f/MAP _{661 -64} 2 _r ) und der TaqMan Sonde (MAP ₆ 17-636 _P ) konnte hinreichend belegt werden. Ein Signal war nur beim Referenzstamm MAP (ATCC 1 9698) sichtbar. Die Reaktion der anderen Bakterienspezies war vergleichbar mit der Negativkontrolle.

Zur weiteren Abklärung der Spezifität wurden die Primer (MAP ₅₂ 3-

₅₄ 2f/MAP ₆ 6i -642r) sowie die TaqMan Sonde (MAP ₆ 17-636 _P ) auf Kreuzreaktivität mit anderen Mykobakterien-Spezies (n = 1 3) getestet.

Die verwendete DNA der Mykobakterien-Referenzstämme wurde aus Kulturen wie oben beschrieben aufgereinigt und mittels Nano-Drop ^® gemessen. Die DNA wurde auf eine Konzentration von 1 ng/μΙ eingestellt. Durch den Einsatz eines publizierten „multiplex"-PCR-Verfahrens (Shin et al., 201 0, Journal of Clinical Microbiology 48 (1 1 ), 4057-4062) wurde die speziesspezifische DNA der Referenzstämme bestätigt. Als Negativkontrolle diente steriles, destilliertes Wasser. Reaktionsansatz und Reaktionsbedingungen waren wie in der Literatur angegeben.

Die zu erwartenden PCR-Produkte der jeweiligen Mykobakterien-Arten waren auf dem Agarosegel deutlich zu erkennen. Zur weiteren Spezifitäts- Abklärung der Primer (MAP ₅ 23-542f/MAP _{66 -64} 2 _r ) wurden diese auf Kreuzreaktivi- tät mit anderen Mykobakterien-Arten in der klassischen PCR getestet (Figur 4).

Die zu erwartenden 1 39 bp großen PCR-Produkte waren auf dem Agarosegel deutlich ausschließlich bei MAP-DNA (ATCC 1 9698) zu erkennen. Ampli- fikate im 1 39 bp Bereich traten bei anderen Mykobakterien-Spezies (n = 1 3) nicht auf. Daher können die eingesetzten Primer (MAP ₅ 23-542f/MAP ₆ 6i -642r) ge- genüber anderen Mykobakterien-Arten als MAP-spezifisch angesehen werden.

Nachdem die Spezifität der Primer (MAP ₅ 23-542f/MAP ₆ 6i -642r) in der klassi ^¬ schen PCR anhand von Mykobakterien-Referenzstämmen (n = 1 3) überprüft wurde, sollte die Spezifität der Sonde (MAP ₆ 17-636 _P ) in Kombination mit den Primern in der Echtzeit-PCR bestätigt werden. Als Negativkontrolle diente steri- les, destilliertes Wasser. Reaktionsansatz sowie Reaktionsbedingungen der Echtzeit-PCR mit TaqMan Sonde auf dem LightCycler™ 480 waren wie bereits oben definiert.

Die MAP-Spezifität der Primer (MAP ₅ 23-542f/MAP _{661 -64} 2 _r ) und der TaqMan Sonde (MAP ₆ 17-636 _P ) konnte auch gegenüber Mykobakterien-Spezies hinrei- chend belegt werden. Ein Signal war nur bei dem Referenzstamm MAP (ATCC 1 9698) sichtbar. Die Reaktion der anderen Mykobakterienstämme war vergleichbar mit der Negativkontrolle.

Die Nachweisgrenze bzw. Sensitivität der entwickelten TaqMan Echtzeit- PCR wurde mittels Titrationsreihen von 1 ng/μΙ bis 1 fg/μΙ Plasmid-DNA und MAP-DNA (ATCC 1 9698) aus Kultur ermittelt (Figur 5).

Für die Herstellung von Plasmid-DNA wurden PCR-Produkte (1 39 bp) wie oben beschrieben kloniert und aufgereinigt. Anschließend wurde der Nuk- leinsäuregehalt von Plasmid-DNA mittels NanoDrop ^® ermittelt und Verdün- nungsreihen von 1 ng/μΙ bis 1 fg/μΙ hergestellt.

Beim Einsatz von kulturell gewonnener MAP-DNA wurde eine Nachweisgrenze von 1 0 fg/μΙ erreicht. Das Genom von MAP besitzt eine Länge von 4,7 1 0 ⁶ bp (Cocito et al., 1 994, Clinical Microbiology Reviews 7 (3), 328-345). Un- ter Verwendung der Avogadro'schen Konstante 6,022 1 0 mol ^" und dem Molgewicht eines Basenpaares von 660 g ^χ mol ^"1 ließ sich berechnen, dass 5, 1 5 fg einer Genomeinheit entsprechen (Münster et al., 201 1 , Veterinary Microbiology 1 54, 1 97-201 ; Münster et al., 201 2). Nach dieser Berechnung lag die Nachweisgrenze mit 1 0 fg/μΙ bei ca. 2 Genomeinheiten.

Nach Überprüfung der Spezifität und Sensitivität wurde die Echtzeit-PCR auf ihre Effizienz getestet. Die Effizienz stellt ein Qualitätsmerkmal einer quantitativen Echtzeit-PCR dar. Durch Gegenüberstellung der erzielten Cp-Werte und der MAP-DNA Konzentration wurde eine Standardkurve erstellt. Eine Standardkurve gibt die logarithmische Konzentration der isolierten DNA des Erre- gers in den jeweiligen Verdünnungsstufen an. Die Steigung der Geraden betrug -3,42 ± 0,23, der Fehler 0,04 ± 0,02 und die Effizienz lag bei 1 ,97 ± 0,08 (Auswertung mittels„2nd Derivative Maximum" Methode). Damit erwies sich die lineare Standardkurve für eine quantitative Anwendung der TaqMan Echtzeit- PCR als geeignet.

Die Reproduzierbarkeit der Echtzeit-PCR wurde anhand von 9 Wiederholungen auf dem LightCycler™ 480 ermittelt (3x3 Läufe) und mittels„2nd Derivative Maximum" sowie der„Fit Point" Methode ausgewertet. Zur Visualisierung wurden der jeweilige Mittelwert sowie die Standardabweichung der„Crossing points" (Cp), d.h. die Zyklenzahl, an denen die Fluoreszenz erstmalig signifi- kant über die Hintergrund-Fluoreszenz ansteigt, berechnet und als Säulendiagramm dargestellt (Figur 6 und 7).

Es konnte gezeigt werden, dass die Echtzeit-PCR reproduzierbare Ergebnisse lieferte. Alle neun Wiederholungen ergaben ähnliche Mittelwerte der Cp-Werte, wobei die Standardabweichung statistisch niedrig war (maximal ± 0,73).

Auch eine Auswertung mittels„Fit Poinf'-Methode erzielte reproduzierbare Ergebnisse mit gleichbleibender Sensitivität von 1 0 fg/μΙ.

Zur Prüfung der Quantifizierbarkeit der TaqMan Echtzeit-PCR bzw. Ver- anschaulichung der Übereinstimmung der kalkulierten mit den bekannten MAPDNA Konzentration wurden diese berechnet und in Tabelle 3 gegenübergestellt. DNA-Konzentrationen wurden sowohl mit der„2nd Derivative Maximum"- als auch mit der„Fit Poinf'-Methode berechnet. Bei letztem wurden manuell die „Noise Band" auf 6,00 und der„Treshold" auf 3,00 gesetzt.

Tabelle 3: Quantifizierung von MAP-DNA aus Kultur in log-m Verdünnungsstufen mittels TaqMan Echtzeit-PCR anhand von 9 Wiederholungen (3x3 Läufe). Die Auswertung erfolgte mittels „2nd Derivative Maximum"- und „Fit Point"- Methode.

2nd Derivative Maximum Fit Point

BekannBerechnete Berechnete

Probe te Konz. Konz. Cp-Wert Konz. Cp-Wert

1 ng/μΙ 10 ^"9 9,17 x 10 ^"10 22,79 ± 0,65 1,10 x 10 ^"9 21,00 ± 0,62

100 pg/μΙ 10 ^"10 1,25 x 10 ^"10 25,76 ± 0,07 1,33 x 10 ^"10 23,94 ± 0,34

10 pg/μΙ io- ¹¹ 9,12 x 10 ^"12 29,61 ± 0,38 7,62 x 10 ^"12 27,88 ± 0,52

1 pg/μΙ io- ¹² 8,19 x 10 ^"13 32,82 ± 0,39 7,46 x 10 ^"13 31,11 ±0,54

100 fg/μΙ IO ^"13 1,29 x 10 ^"13 35,18 ± 0,36 1,14 x 10 ^"13 33,73 ± 0,35

10 fg/μΙ IO ^"14 1,05 x 10 ^"14 37,61 ± 0,73 1,26 x 10 ^"14 36,80 ± 0,94

1 fg/μΐ IO ^"15 -- -- --

NTC

Ähnliche Werte der bekannten und berechneten DNA-Konzentrationen zeigten eine grundsätzliche Quantifizierbarkeit von MAP-DNA mittels TaqMan Echtzeit-PCR. Auch als die Reaktionsansätze der Verdünnungsreihe von MAP- DNA mittels „Fit Poinf'-Methode („Noise Band" 6,00; „Treshold" 3,00) ausgewertet wurden, wurden bei gleich bleibender Sensitivität die Ergebnisse der berechneten DNA-Konzentrationen nicht verfälscht.

Die Stabilität bzw. Sensitivität einer PCR kann unter Feldbedingungen beeinflusst werden, wenn DNA aus Kot oder Gewebe extrahiert wird. Die mög- liehe inhibierende Wirkung wurde mit Hilfe von Plasmid-DNA Verdünnungsreihen (1 ng/μΙ bis 1 fg/μΙ), welche mit DNA aus negativem Kot versetzt wurden, ausgeschlossen (Figur 8).

Auch als die Reaktionsansätze der Verdünnungsreihe von Plasmid-DNA mit DNA aus MAP-negativem Kot hinterlegt wurden, wurde bei gleich bleibender Sensitivität das Ergebnis nicht verfälscht. Für die Veranschaulichung der Übereinstimmung der kalkulierten mit den bekannten MAP-DNA Konzentrationen wurde diese berechnet und in Tabelle 4 gegenübergestellt.

Tabelle 4: Berechnete Konzentrationen und ermittelte Cp-Werte von Plasmid- DNA in log-io Verdünnungsstufen (1 ng/μΙ bis 1 fg/μΙ) mittels TaqMan Echtzeit- PCR.

H ₂ 0 Kot-DNA

Bekannte Berechnete Crossing Berechnete Crossing

Probe Konz. Konz. Point Konz. Point

1 ng/μΙ 10 ^"9 9,63 x 10 ^"10 11,61 ± 0,07 9,97 x 10 ^"10 13,53 ± 0,12

100

pg/μΐ KT ¹⁰ 1,08 x 10 ^"10 15,27 ± 0,22 1,05 x 10 ^"10 16,88 ± 0,02

10 pg/μΙ io- ¹¹ 9,67 x 10 ^"12 19,22 ± 0,11 9,42 x 10 ^"12 20,47 ± 0,14

1 pg/μΙ io- ¹² 7,51 x 10 ^"13 23,33 ± 0,24 9,89 x 10 ^"13 23,83 ± 0,03

100 fg/μΙ IO ^"13 9,00 x 10 ^"14 26,63 ± 0,15 1,03 x 10 ^"13 27,20 ± 0,07

10 fg/μΙ IO ^"14 1,14 x 10 ^"14 29,75 ± 0,06 9,83 x 10 ^"15 30,13 ± 0,17

1 fg/μΐ IO ^"15 9,85 x 10 ^"16 33,33 ± 0,07 1,01 x 10 ^"15 32,34 ± 0,03

NTC

Trotz der Hinterlegung mit DNA aus MAP-negativem Kot sind keine gravierenden Verschiebungen der Werte erkennbar. Ähnliche Werte der bekannten und berechneten DNA-Konzentrationen zeigen eine grundsätzliche Ein- setzbarkeit der TaqMan Echtzeit-PCR zur Quantifizierung von MAP-DNA unabhängig von der Matrix Kot.

Für die vielseitige Anwendbarkeit der Echtzeit-PCR in der Routinediagnostik sowie in der Forschung muss der Nachweis von MAP-DNA in unterschiedlichen Matrices gewährleistet sein. Um den universellen Einsatz zu bele- gen, wurden aus dem Archiv der Routinediagnostik entnommen und bereits in der „semi-nested"-PCR positiv getestete Proben zweimal auf dem LightCyc- ler™ 480 geprüft. Kot-, Milch-, Sperma-, Blut-, Gewebe- und Umweltproben wurden ausgewählt (Figur 9).

MAP-DNA konnte in allen Matrices sicher in den beiden Läufen nachge- wiesen werden. In Tabelle 5 sind die Cp-Werte der beiden Läufe sowie Mittelwert und Standardabweichung dargestellt.

Tabelle 5: Ermittelte Cp-Werte der verschiedenen Matrices auf dem LightCyc- ler™ 480 mit TaqMan Sonde.

Kot Milch Sperma Blut Gewebe Umwelt

Lauf 1 25,07 33,53 27,83 30,00 33,26 29,33 Lauf 2 26,28 33,34 27,85 29,97 31 ,88 29,30

MW 25,68 ± 33,44 ± 27,84 ± 29,99 ± 32,57 ± 29,32 ± STBW 0,86 0, 1 3 0,01 0,02 0,98 0,02

Die getesteten Kot-, Milch-, Sperma-, Blut-, Gewebe- und Umweltproben gaben ein eindeutiges fluoreszierendes Signal mit Cp-Werten zwischen 25,07 und 33,53. Das Ergebnis war reproduzierbar mit Standardabweichungen von 0,02 bis 0,98.

Für den Einsatz der Echtzeit-PCR zum Nachweis von Paratuberkulose bei Wiederkäuern können auch Kontrollsysteme für die Amplifikation (z. B. H EX-Kanal) bzw. Extraktion (z. B. Cy5-Kanal) eingesetzt werden, die über andere Label oder Marker unabhängig detektiert werden können. Dabei kann der Nachweis einer erfolgreichen Nukleinsäure-Extraktion z.B. über eine Amplifika- tion des Zielgens ß-Aktin erfolgen. Dem Fachmann sind weitere Kontrollsysteme für die Amplifikation bzw. Extraktion bekannt.

Das endgültige Protokoll der MAP TaqMan Echtzeit-PCR lautet wie folgt:

95 °C 1 0 min

95 °C 1 5 sec

60 °C 30 sec 40 Zyklen

72 °C 35 sec Die dem Archiv entnommenen Proben gaben auch bei der Analyse mit einem Kontrollsystem für die Amplifikation und Extraktion im FAM-Kanal (465- 51 0 nm) ein reproduzierbares eindeutiges fluoreszierendes Signal mit durchschnittlichen Cp-Werten zwischen 23,58 und 33,29 sowie Standardabweichun- gen von 0,02 bis 0,98.

Der beschriebene Test wurde mit 1 3 Rindern, die als positiv auf MAP getestet waren, evaluiert. Dazu wurde DNA aus den Kotproben extrahiert und mit der beschriebenen Echtzeit-PCR auf MAP getestet. Hier zeigte sich, dass der Test MAP in Kotproben nachweisen konnte.

Schließlich wurden zur Bestätigung der Robustheit des Testes Organproben aus verschiedenen Darmbereichen zwei Kühe getestet. Wie aus den Tabellen unten zu erkennen, ist der erfindungsgemäße Test zum Nachweis der MAP geeignet. Tabelle 7: Quantitative Anwendung der IS900 TaqMan Echtzeit-PCR zum

Nachweis von MAP in Gewebeproben von zwei an Paratuberkulose erkrankten Kühen. Darstellung der Cp-Werte dreimal gemessen im FAM-Kanal (465-51 0 nm).

FAM-Kanal

Tier Probe (465-510 nm)

Tier A Duodenum 32,68 ± 0,21

Jejunum 28,00 ± 0, 1 2

lleum 27,09 ± 0,08

Caecum 25,06 ± 0,04

Ln caecalis 33,00 ± 0,23

Tier B Duodenum 33,79 ± 0,69

Jejunum 34,33 ± 0,61

lleum 25,52 ± 0,03

Caecum 24,53 ± 0,03

Ln caecalis 28,86 ± 0, 1 1 Alle Proben zeigten eine Amplifikationskurve im FAM-Kanal mit Cp- Werten von 24,53 bis 34,33 und Standardabweichungen von 0,03 bis 0,69.

Für eine quantitative Auswertung wurden, wie bereits oben beschrieben, DNA-Konzentration sowie MAP-Genomeinheiten pro Gramm Gewebe berechnet (Tabelle 8) und graphisch dargestellt (Figur 10).

Tabelle 8: Quantitative Anwendung der IS900 TaqMan Echtzeit-PCR zum Nachweis von MAP in Gewebeproben zweier an Paratuberkulose erkrankter Kühen. Zur Quantifizierung von MAP in Gewebe wurden die DNA- Konzentration sowie die Zahl der Genomeinheiten pro Gramm Gewebe berechnet.

DNA-

Tier Probe Konzentration MAP / g Gewebe

Tier A Duodenum 7,99 x 10 ^"14 6,21 x 10 ³

Jejunum 4,04 10 ^"12 3,14 10 ⁵ lleum 8,13 x 10 ^"12 6,32 10 ⁵

Caecum 3,57 10 ^"11 2,77 x 10 ⁶

Ln caecalis 5,96 x 10 ^'14 4,63 x 10 ³

Tier B Duodenum 3,27 10 ^'14 2,54 x 10 ³

Jejunum 1 ,91 x 10- ¹ 1 ,48 x 10 ³ lleum 2,57 x 10 ^'11 2,00 10 ⁶

Caecum 5,17 x 10 ^"11 4,02 x 10 ⁶

Ln caecalis 2,05 x 10 ^~12 1 ,59 10 ⁵

In einer Validierungsstudie wurden die kommerziell erhältlichen MAP-PCR-Kits Adiavet (Adiavet ParaTB Realtime), AB-TaqMan (Applied Biosystems Taq- ManMAP) und Vetmax (Applied Biosystems VetMax MAP Real Time PCR Screening Kit), sowie ein publizierter PCR-Assay in Bull et al. (Tim J. Bull et al., 2007, PloS One 2007(11), e1229) vergleichend zur hier beschriebenen Echtzeit-PCR getestet. Die Durchführung erfolgte bei den kommerziell erhältlichen Kits nach Herstellerangaben. Als Referenz wurde eine semi-nested-PCR (snPCR) eingesetzt (Münster P. et al, Vet Microbiol. 2011 : 154(1 -2): 197-201 ). Sie besitzt mit dem Nachweis von 1 Genomeinheit die höchste Sensitivität und ist allen „real-time"-Verfahren hinsichtlich der Sensitivität überlegen. Allerdings ist es allgemeiner Stand der Technik, dass solche snPCRs für Routineanwendungen wegen der extrem hohen Kontaminationsgefahr bei Massendurchsatz ungeeignet sind.

Die PCR-Läufe fanden auf einem Roche LightCycler 480 statt. Die snPCR lief klassisch auf einem konventionellen Thermocycler (Biometra„Trio").

Als Testproben standen 14 mittels semi-nested-PCR (sn-PCR) negativ geteste- te und 35 positiv getestete Kotproben aus der Routinedignostik zur Verfügung (N=49).

Die Ergebnisse der Untersuchung sind in Tabelle 9 für die positiv getesteten Kotproben zusammengefasst. Die Cp-Werte von zwei Untersuchungen wurden gemittelt. Standen die Ergebnisse nur von einer Untersuchung zur Verfügung, wurden diese für die weiteren Analysen verwendet. Die Validierung in Tabelle 9 stellt die Subtraktion der Cp-Werte dar. Zunächst wurde die TaqMan Echtzeit- PCR gegen alle kommerziell erhältlichen Vergleichs-PCRs geprüft. Hierzu wurde jeweils vom entsprechenden „TaqMan-PCR-Proben-CP- ert" der korres- pondierende„Vergleichs-PCR-Proben-CP-Wert" subtrahiert. Ein positiver Wert in der entsprechenden Spalte sagt aus, dass der TaqMan-PCR-Proben-CP- Wert höher war, als der subtrahierte Vergleichswert. Die PCR wäre demnach in der Sensitivität schlechter als die Vergleichs-PCR, da definitionsgemäß die Sensitivität umso höher ist je niedriger der CP-Wert ist. In gleicher Weise fand ein Vergleich zwischen der TaqMan-PCR und der publizierten PCR von Bull et al. statt, bei der das Endvolumen in der TaqMan Echtzeit-PCR auf die von Bull et al. beschriebenen PCR angepasst wurde (jeweils 50 ί statt 20 [iL).

Die Vergleichsstudie kommt zu dem Ergebnis, dass die neu entwickelte Echtzeit-PCR allen Vergleichs-PCRs überlegen war. [Die TaqMan Echtzeit- PCR Plus schlug in der klassischen Variante (5 μΙ Template) alle Vergleichs- PCRs. Sie war auch ihrer eigenen Variante mit 8 ί Template knapp überlegen.] Tabelle 9:

Ergebnisse der Validierungsstudie

Lfd. snPCR Taq- TaqMan TaqTaqNR. Man Man Man

Adiavet ABTaq- Vetmax Bull et man al.

1 + -7,55 -2,92 -2,06 -5,31

2 + -7,44 -2,91 -2,00 -5,59

3 + -2,73 -1,54 -1,02 -4,62

4 + -2,67 -1,23 -0,79 -4,30

5 + -6,95 -2,42 -1,23 -4,57

6 + -3,65 -1,61 -0,47 -3,37

7 + -10,07 -1,39 0,74 -2,32

8 + -6,49 -2,31 -1,37 -4,44

9 + -7,95 -8,10 -10,97 -4,89

10 + -2,19 -1,82 -6,31 -0,27

11 + -4,85 -10,82 -13,86 -8,96

12 + -2,56 -7,86 -13,82 -7,72

13 + -9,21 -9,43 -12,34 -3,61

14 ++ 0,41 2,75 1,73 -2,59

15 ++ -3,85 -0,28 -1,40 -4,75

16 + -11,20 -11,20 -11,20 -4,39

17 + -11,95 -11,95 -11,95 -4,36

18 + 3,59 9,85 8,76 5,59

19 + -10,11 -10,11 -10,11 -2,92

20 + -12,24 -12,24 -12,24 -5,77

21 + -12,34 -13,03 -13,03 -3,17

22 + -6,48 -6,48 -6,48 -6,48

23 + 0,00 8,07 6,93 4,29

24 + 2,94 2,81 0,00 0,73

25 + -8,91 -9,15 -11,62 -9,78 26 + 0,00 0,00 0,00 5,98

27 + 3,05 2,88 0,00 5,21

28 + -1 2,30 -1 2,30 -1 2,30 -4,65

29 + 0,00 0,00 0,00 1 ,63

30 + 0,00 0,00 0,00 1 ,91

31 + -1 3,52 -1 3,52 -1 3,52 /

32 + -1 1 ,59 -1 1 ,59 -1 1 ,59 /

33 + -1 0,40 -1 0,40 -1 0,40 -1 0,40

34 + 0,00 0,00 0,00 0,00

35 + 0,00 0,00 0,00 0,00 besser 25/35 25/35 24/35 24/33

gleich 6/35 5/35 7/35 2/33

schlech 4/35 5/35 4/35 7/33

ter

Der obige Vergleich zeigt deutlich, dass das erfindungsgemäße Verfahren mit den erfindungsgemäßen Primern den im Stand der Technik beschriebenen Verfahren und den kommerziell erhältlichen Testkits in der Sensitivität überlegen ist.

Kurze Beschreibung der Figuren

Figur 1 : Graphische Darstellung der verwendeten Primer (MAP ₅₂ 3- 542f/MAP _{661 -642} r) sowie Patente der IS900.

Figur 2: Spezifitäts-Abklärung der Primer (MAP ₅₂ 3-542f/l 1AP _{66 -64} 2r) mit nicht- Mykobakterienspezies. Dazu wurden amplifizierte PCR-Produkte mittels Gelektrophorese (1 ,5% Agarosegel) aufgetrennt.

Figur 3: Spezifitätsnachweis der TaqMan Echtzeit-PCR auf dem Light Cyc- ler™ 480 anhand von Referenzstämmen (n = 14).

Figur 4: Spezifitäts-Abklärung der Primer (MAP ₅ 23-542f/MAP ₆ 6i -642r) mit anderen Mykobakterien-Arten. Dazu wurden amplifizierte PCR- Produkte mittels Gelektrophorese (1 ,5% Agarosegel) aufgetrennt. Figur 5: Sensitivitätsnachweis der Echtzeit-PCR anhand von ATCC 1 9698

MAP-DNA. A: 1 ng/μΙ, B: 1 00 pg/μΙ, C: 1 0 pg/μΙ, D: 1 pg/μΙ, E: 1 00 fg/μΙ, F: 1 0 fg/μΙ, G : 1 fg/μΙ, NTC: Steriles Wasser.

Figur 6: Reproduzierbarkeit der TaqMan Echtzeit-PCR anhand von 9 (3 x 3

Läufe) Wiederholungen (Effizienz = 1 ,97 ± 0,08; Fehler = 0,04 ± 0,02). Die Auswertung erfolgte mittels „2nd Derivative Maximum" Methode.

Figur 7: Reproduzierbarkeit der TaqMan Echtzeit-PCR anhand von 9 Wie- derholungen (3 x 3 Läufe) (Effizienz = 2,07 ± 0,09; Fehler = 0, 1 8 ±

0,03). Die Auswertung erfolgte mittels„Fit Poinf'-Methode.

Figur 8: Graphische Darstellung der Amplifikationskurven der Plasmid-DNA

Verdünnungsreihen (1 ng/μΙ bis 1 fg/μΙ) hinterlegt mit H ₂ 0 (A) und Kot- DNA (B) auf dem LightCycler™ 480 mit TaqMan Sonde. Kurven v.l.n.r. : 1 ng/μΙ, 100 pg/μΙ, 10 pg/μΙ, 1 pg/μΙ, 100 fg/μΙ, 10 fg/μΙ, 1 fg/μΙ,

Steriles Wasser (NTC).

Figur 9: Graphische Darstellung der Amplifikationskurven zum Nachweis von MAP-DNA aus verschiedenen Matrices auf dem LightCycler™ 480 mit TaqMan Sonde.

Figur 10: Quantitative Anwendung der IS900 TaqMan Echtzeit-PCR zum

Nachweis von MAP in Gewebeproben. Gegenüberstellung von Tier A und Tier B. Die Balken stellen den Mittelwert sowie die Standardabweichung (3 Wiederholungen) der berechneten MAP- Konzentration in verschiedenen Geweben dar.