INFECCIOSA EN PECES Campo del Invento

El presente invento se refiere a ún método para determinar la virulencia en el virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) serotipo Sp y los partidores relacionados.

Estado del Arte:

El virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV), es el agente etiológico de una enfermedad de distribución mundial que provoca severas pérdidas económicas en el cultivo de salmonídeos, principalmente en individuos juveniles. La proteína VP2, es la proteína principal y más externa que conforma la cápside del virus IPN. Estudios moleculares sugieren que las variaciones, específicamente, en las posiciones aminoacídicas 217 y 221 de la proteína VP2, estarían directamente relacionadas con la virulencia en aislados del serotipo Sp. Aquellos virus que codifican para el residuo treonina en la posición 217 y alanina en 221 , se caracterizan por ser muy virulentos. Aquellos aislados que poseen una composición de residuos aminoacídicos prolina en 217 y alanina en 221 , son de mediana virulencia, mientras que los aislados con treonina en la posición 221 y un residuo aminoacídico indistintos en la posición 217, resultan de baja virulencia.

Existe la necesidad de un método para determinar la virulencia en el virus IPNV serotipo Sp y así como también de partidores necesarios para llevar a cabo dicho método.

Un objetivo de la presente invención es proveer un método para determinar la virulencia del virus IPN en muestras provenientes de peces de campo que portan el virus. De esta forma, se puede hacer una extrapolación del comportamiento del virus en la población, que se direccionará con la estrategia de control que deberá tomar la empresa dueña de los peces.

Otro objetivo de la presente invención de la presente es caracterizar las cepas de virus IPN que han sido utilizadas en la preparación de vacunas comerciales, y de aquellas cepas de campo, para evaluar su concordancia.

Además la presente invención provee un sistema de partidores para ser usado en la determinación de virulencia del virus IPN. Breve Descripción de las Figuras

La figura 1 , muestra los alineamientos de las secuencias y la correlación de la naturaleza de los residuos aminoacídicos en las posiciones 217 y 221 de la proteína VP2, principalmente sobre la mortalidad de peces inoculados experimentalmente con una vacuna comercial. Deducción de la secuencia aminoacídica a partir de una secuencia nucleotídica obtenida por secuenciamiento de una región parcial del gen que codifica para la proteína VP2. En la Figura 1 se muestra la siguiente región del gen del virus IPN que se utiliza para la determinación de la virulencia de IPNV:

CGTCCGCCTAGAGGACGAGACACCCCAGGGTCTCCAGTCAATGAACGGGGCCAA GATGAGGTGCACAGCTGCAATTGCACCGCGGAGGTACGAGATCGACCTCCCATCC CAACGCCTACCCCCCGTTCCTGCGACAGGAACCCTCACCACTCTCTACGAAGGGA ACGCCGACATCGTCAACTCTACAACAGTGACGGGAGACATAAACTTCAGTCTGGC AGAACAACCCGCAGAAGAGACCAAGTTCGACTTCCAGCTGGACTTCATGGGCCTT GACAATGACGTCCC

En la Figura 2: Alineamiento múltiple de secuencias aminoacídicas de casos clínicos de 6 piscicultura (Pise 1 , Pise 2, Pise 3, Pise 4, Pise 5 y Pise 6) y una virina comercial (Com vac).

Descripción de la Invención

La presente invención se refiere a un método para determinar la virulencia en el virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) serotipo Sp en una muestra de peces, que comprende:

a) determinar la presencia del IPNV en una población de peces tomando una muestra de tejido desde los mismos y seleccionar aquellas muestras con mayor carga viral;

b) extraer el RNA de las muestras seleccionadas de la etapa a);

c) amplificar la región discreta de la proteína VP2 que contiene los residuos 271 y 221 a partir de un eluído del ARN extraído en la etapa b) usando los siguientes partidores IPNal : GGGACGTCATTGTCAAGGCC e IPNs7:

CGTCCGCCTAGAGGACGAGAC;

d) purificar los productos de amplificación obtenidos en la etapa c); e) secuenciar el producto de amplificación purificado de la etapa d), traduciendo la secuencia nucleotídica obtenida a una secuencia aminoacídica; e

f) identificar la presencia de los residuos treonina o prolina en la posición 217 y el residuo alanina en la posición 221 en la secuencia aminoacídica obtenida de la etapa e) para establecer virulencia muy alta o mediana del IPNV, respectivamente.

La presente invención también se refiere a una mezcla de partidores para determinar la virulencia en el virus de la necrosis pancreática infecciosa (IPNV) serotipo Sp en una muestra de peces, que comprende la secuencia sintética IPNal : GGGACGTCATTGTCAAGGCC y la secuencia sintética IPNs7: CGTCCGCCTAGAGGACGAGAC.

Descripción Detallada de la Invención

A partir de muestras tomadas desde el riñon anterior (RA) de peces que están cursando un cuadro clínico agudo, severo o subclínico, producido por IPNV. Se determina inicialmente la presencia del IPNV en un grupo de peces de 10 a 20 peces aproximadamente, para establecer una prevalencia. De las muestras analizadas, se escoge la que presenta una mayor carga viral para realizar la caracterización genética. La extracción de material genético del tipo de ARN desde el RA se efectúa utilizando brevemente el siguiente procedimiento; la muestra de riñon anterior se coloca al interior de una bolsa y se macera con un martillo de goma. Posteriormente, se adiciona tampón PBS hasta alcanzar una turbidez adecuada (Equivalente a un N°5 de la escala McFarland). Se toman 200 ul y se agrega a un tubo eppendorf que contiene 500 ul de Trizol (Invitrogen) o RNA solvent (Omega Biotek). Se homogeniza y posteriormente se agrega 100 ul de Cloroformo y se vuelve a homogenizar hasta obtener una solución con apariencia lechosa. Se centrifuga a 13.000 rpm por 3 minutos y se toman 200 ul de la fase superior (transparente), y se transfiere a un tubo que contenga 400 ul de tampón de lisis TRK (Perteneciente al kit Total RNA kit). Se adicionan a esta mezcla 600 ul de etanol al 75% y se homogeniza. Finalmente, se traspasa todo a una columna de sílica con un tubo de recolección y se centrifuga a 13.000 rpm por 1 min, descartando la solución eluída y reutilizando el tubo de recolección. Luego, se agregan 700 ul de tampón I y se centrifuga a 13.000 rpm por 1 min, se descarta la solución eluida y se centrifuga nuevamente la columna a 13.000 rpm por 1 min para secarla. Finalmente, se transfiere la columna a un tubo eppendorf previamente rotulado y se agregan 50 ul de agua libre de nucleasa a la columna y se centrifuga a 13.000 rpm por 1 min, se guarda el tubo con el eluído y se desecha la columna.

El ARN eluído de la etapa de extracción de ARN, se utiliza para realizar la amplificación de la región discreta de VP2 que contiene los residuos 217 y 221. La amplificación se realiza por ejemplo con un kit comercial, en este caso se utiliza el kit SuperScript® III One-Step RT-PCR System with Platinum® Taq DNA Polymerase (Invitrogen), al cual se le agregan los siguientes partidores IPNal = GGGACGTCATTGTCAAGGCC y IPNs7 CGTCCGCCTAGAGGACGAGAC.

Brevemente, se prepara un número de reacciones en base al número de muestra a analizar. Por ejemplo, para preparar 10 reacciones de amplificación, se preparan las microplacas correspondientes a este número de reacciones y se prepara la mezcla maestra de acuerdo a lo descrito en el kit, la tabla siguiente muestra los volúmenes de cada componente para preparar la mezcla maestra:

Posteriormente, se disponen 23 ul de la muestra maestra en cada uno de los

microtubos y se agrega a cada uno 2 ul de la muestra de ARN extraída previamente. Posteriormente, se colocan los tubos en un termociclador de tiempo real con el siguiente perfil o programa térmico:

1 ciclo: 50°C 15 minutos

1 ciclo: 95°C, 20 segundos

40 ciclos: 95°C, 10 segundos

55°C, 5 seg*, lectura de fluorescencia

1 ciclo: 25°C, 30 segundos

Al finalizar el programa de amplificación, se realiza una corrida electroforética. Esto se realiza en un soporte de agarosa al 2% (2 gramos de agarosa en 100 mi de tampón TE), el cual permite realizar una migración diferencial de los productos de PCR amplificados. Las muestras son cargadas en un soporte que a su vez se encuentra inmerso en una cámara que contiene tampón TE, medio salino, a la cual se le aplica un potencial eléctrico generando la migración de los productos de amplificación. Los productos migran al polo positivo porque el material genético tiene carga negativa y el tampón TE genera el medio salino para que se genere el diferencial de potencial y se genere la migración. Los productos se dejan correr cerca de 15 minutos aproximadamente. Posterior a esto, se saca la agarosa de la cámara de electroforesis y se coloca sobre una tabla de UV. Cuando se prepara el gel de agarosa se coloca un elemento intercalante que al estar intercalado en el ADN en presencia de UV se genera una señal fluorescente que puede ser registrada visualmente. Cuando se observa una única señal fluorescente en forma de banda a la altura aproximadamente de 250 pb, corresponde a la amplificación específica generada por los partidores IPNal y IPNs7 (IPNal = GGGACGTCATTGTCAAGGCC y IPNs7 CGTCCGCCTAGAGGACG AGAC). La banda es cortada con ayuda de un bisturí y se purifica el ADN contenido en el fragmento escindido con un kit comercial. En este caso, por ejemplo se utiliza el kit Minielute gel extraction (Quiagen). Brevemente, las bandas cortadas (Aproximadamente, 30 mg), se colocan en un tubo eppendorf y se adicionan 300 ul de Tampón QG y se incuba a 50°C durante 15 minutos. Luego de la incubación, se adicionan 100 ul de isopropanol y se homogeniza. La disolución se transfiere a la columna de sílica y se centrifuga a 13.000 rpm por 1 minuto. Se descarta el eluído y se adiciona a la columna 300 ul de Tampón QG y se centrifuga nuevamente a 13000 rpm por 1 minuto. Posteriormente, se realiza un lavado con 600 ul de tampón PE y se centrifuga a 13000 rpm por 1 minuto. Se descarta el eluído y se seca la columna por centrifugación a 13000 rpm por 2 minutos. Se traslada la columna a un tubo de eppendorf de 1 ,5 mi y se adiciona a la columna 15 ul de Tampón Elution BE y centrifugar a 13000 rpm por 1 minuto. Se desecha la columna y en el tubo eppendorf queda el purificado de los productos de amplificación.

Una vez purificado el producto de amplificación es enviado a secuenciar a una empresa que preste este servicio, tal como Macogen de Korea o Biogenetics de Chile. Dichas empresas generan archivos electrónicos de secuenciación que pueden ser analizados con software comerciales. En este caso, se utilizó el software Vector NTI 10 el cual permite leer estos archivos y editarlos. El software presenta varias herramientas bioinformáticas, dentro de las cuales se encuentra el traducir una secuencia nucleotídica a una secuencia aminoacídica. Esto se realiza sólo transformando los tripletes de ADN a su aminoácido correspondiente, el código genético; Figura . Posteriormente, se identifican los residuos relacionados con la virulencia, buscando la secuencia aminoacídicas específica y conservada LLP para posicionarse y se relaciona la identidad de las posiciones 217 y 221 con lo descrito en los experimentos realizados en Shivappa RB, H Song, K Yao, A Aas-Eng, O Evensen, V Vakharia. 2004. Molecular characterization of Sp serotype strain of infectious pancreatic necrosis virus exhibiting difference in virulence. Dis Aquat Org 61 , 23-32, que como se mencionó en la introducción se puede asociar una combinación de aminoácidos en estas posiciones con un grado de virulencia.

El objetivo del análisis es ver la virulencia del virus y como se relaciona con el cuadro que se esté cursando. Por ejemplo, si se caracteriza un virus con residuos de baja virulencia y el cuadro es baja mortalidad, para un futuro evento de virus con los mismos residuos se podría generar una aproximación del comportamiento del cuadro en base a la información generada previamente.

A modo de ejemplo, en la figura 2 se observa un alineamiento múltiple de secuencias aminoacídicas, donde se encuentran marcadas las posiciones 217 y 221. En la secuencias que se encuentran con la abreviatura como Pise 1 , 2, 3, 4, 5 y 6 corresponden a casos clínicos de 6 pisciculturas que registraron altas mortalidades (fluctuaron entre 30-50%), lo que se correlaciona con la naturaleza de los residuos aminoácidicos en las posiciones 217 y 221. De esta forma, para un futuro evento al encontrar al inicio de eventos clínicos estos aminoácidos en una caracterización genética del patógeno se podrá proyectar la mortalidad esperada en base a la información histórica y genética.

Bibliografía

Santi N, V Vakharia, O Evensen. 2004. Identification of putative motifs involved in the virulence of infectious pancreatic necrosis virus. Virology 322, 31-40.

Shivappa RB, H Song, K Yao, A Aas-Eng, O Evensen, V Vakharia. 2004. Molecular characterization of Sp serotype strain of infectious pancreatic necrosis virus exhibiting difference in virulence. Dis Aquat Org 61 , 23-32.

Song H, N Santi, O Evensen, V Vakharia. 2005. Molecular determinants of infectious pancreatic necrosis virus virulence and cell cultura adaption. J Virol 79, 0289-10299. Roberts RJ, MD Pearson. 2005. Infectious pancreatic necrosis in Atlantic salmón, Salmo salar L. J Fish Dis 28, 383-390.