Deuterierung von Markierstoffen

Beschreibung:

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Markierstoffen in Flüssigkeiten unter Verwendung von Deuterierungsmitteln. Die Erfindung betrifft weiterhin Verfahren zur Markierung von Flüssigkeiten und die Verwendung von Deuterierungsmitteln zur Verbesserung der Nachweisbarkeit von Markierungsstoffen in Flüssigkeiten.

Weitere Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind den Ansprüchen, der Beschreibung und den Beispielen zu entnehmen. Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale des erfindungsgemäßen Gegenstandes nicht nur in der jeweils konkret angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen verwendbar sind, ohne den Rahmen der Erfindung zu verlassen. Bevorzugt beziehungsweise ganz bevorzugt sind insbesondere auch diejenigen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, in denen alle Merkmale des erfindungsgemäßen Gegenstandes die bevorzugten beziehungsweise ganz bevorzugten Bedeutungen haben.

Der Einfluß der Deuterierung auf die Lebensdauer im angeregten Zustand und die Quantenausbeute fluoreszierender Verbindungen ist bekannt (vgl. z.B. Dissertationsschrift „Strahlungslose Desaktivierung in Xanthen-, Oxazin- und Carbazinfarbstoffen", Rüdiger Sens, Universität Siegen, 1984).

Beispielsweise haben auch A.L. Burin und M.A. Ratner in J. Chem. Phys, 1998, 109, 6092 beschrieben, dass die schwächere vibronische Kopplung in den deuterierten Systemen höhere Fluoreszenzquantenausbeuten bedingt.

EP 0 818 674 beschreibt Verfahren zur Identifikation eines Analyten in einer Probe durch Behandlung einer Probe mit einem Deuterierungsreagenz unter Verwendung des nach Bestrahlung emittierten Raman-Signals.

In der Praxis werden Markierstoffe in Flüssigkeiten häufig in sehr geringen Konzentra- tionen im ppm oder ppb-Bereich verwendet. Geringe Konzentrationen der Markierstoffe sind hierbei einerseits von Vorteil, wenn die Flüssigkeiten unsichtbar oder weitgehend unbemerkt markiert werden sollen. Andererseits besteht auf Grund dieser Anforderungen ein ständiger Bedarf an immer empfindlicheren Verfahren, die den Nachweis von Markierstoffen in Flüssigkeiten auch in extrem geringen Konzentrationen zuverlässig ermöglichen. Weiterhin sind die Flüssigkeiten oft durch Substanzen verunreinigt, die den zuverlässigen Nachweis der Markierungsstoffe in den oft verwendeten geringen Konzentrationen erschweren oder gar unmöglich machen.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es Verfahren zur Verfügung zu stellen, die den Nachweis von Markierstoffen in Flüssigkeiten auch in extrem geringen Konzentrationen zuverlässig ermöglichen. Eine Teilaufgabe der vorliegenden Erfindung war es den Nachweis von Markierstoffen in geringen Konzentrationen auch in verunreinigten Flüssigkeiten zu ermöglichen.

Dementsprechend wurde ein Verfahren zum Nachweis von Markierstoffen in Flüssig- keiten gefunden, wobei

(a) ein oder mehrere, gleiche oder verschiedene, Markierstoffe in der Flüssigkeit vorliegen,

(b) ein Deuterierungssmittel mit der Flüssigkeit in Kontakt gebracht wird und

(c) der Markierstoff in der Flüssigkeit fluoreszenzspektroskopisch nachgewie- sen wird.

Die zu markierenden Flüssigkeiten sind grundsätzlich beliebiger Natur und können reine Flüssigkeiten oder Gemische von Flüssigkeiten sein. Bevorzugt werden im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens unpolare Flüssigkeiten eingesetzt. Unter un- polaren Flüssigkeiten werden im Rahmen dieser Erfindung Flüssigkeiten oder Mischungen von Flüssigkeiten mit einer Dielektrizitätskonstante (18°C, 50Hz) kleiner als 4 verstanden. Die Flüssigkeiten sind im Allgemeinen käuflich erhältlich. Bevorzugt enthalten die unpolaren Flüssigkeiten öle, besonders bevorzugt Mineralöle, insbesondere Dieselkraftstoffe. Ganz besonders bevorzugt handelt es sich bei der unpolaren Flüssigkeit um ein Mineralöl, insbesondere einen Dieselkraftstoff.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens enthält die Flüssigkeit Verunreinigungen. Unter Verunreinigungen der Flüssigkeit sind im Rahmen dieser Erfindung solche Stoffe zu verstehen, die den Nachweis der Markierstoffe in Schritt (c) des oben angegebenen Verfahrens stören oder unmöglich machen.

Ausdrücke der Form C ₃ -Cb bezeichnen im Rahmen dieser Erfindung chemische Verbindungen oder Substituenten mit einer bestimmten Anzahl von Kohlenstoffatomen. Die Anzahl an Kohlenstoffatomen kann aus dem gesamten Bereich von a bis b, einschließlich a und b gewählt werden, a ist mindestens 1 und b immer größer als a. Eine weitere Spezifizierung der chemischen Verbindungen oder der Substituenten erfolgt durch Ausdrücke der Form C ₃ -Cb-V. V steht hierbei für eine chemische Verbindungsklasse oder Substituentenklasse, beispielsweise für Alkylverbindungen oder Alkyl- substituenten.

Halogen steht für Fluor, Chlor, Brom, oder lod, vorzugsweise für Fluor, Chlor oder Brom, besonders bevorzugt für Fluor oder Chlor.

Heteroatome sind bevorzugt Sauerstoff, Stickstoff, Schwefel oder Phosphor.

Im einzelnen haben die für die verschiedenen Substituenten angegebenen Sammelbegriffe folgende Bedeutung:

Ci-C2o-Alkyl: geradkettige oder verzweigte Kohlenwasserstoffreste mit bis zu 20 Koh- lenstoffatomen, beispielsweise Ci-Cio-Alkyl oder Cn-C2o-Alkyl, bevorzugt Ci-Cio-Alkyl beispielsweise Ci-C3-Alkyl, wie Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, oder C4-C6-Alkyl, n- Butyl, sec-Butyl, tert.-Butyl, 1 ,1-Dimethylethyl, Pentyl, 2-Methylbutyl, 1 ,1- Dimethylpropyl, 1 ,2-Dimethylpropyl, 2,2-Dimethylpropyl, 1-Ethylpropyl, Hexyl, 2- Methylpentyl, 3-Methyl-pentyl, 1 ,1-Dimethylbutyl, 1 ,2-Dimethylbutyl, 1 ,3-Dimethylbutyl, 2,2-Dimethylbutyl, 2,3-Dimethylbutyl, 3,3-Dimethylbutyl, 2-Ethylbutyl, 1 ,1 ,2-

Trimethylpropyl, 1 ,2,2-Tri-methylpropyl, 1-Ethyl-1-methylpropyl, 1-Ethyl-2-methylpropyl, oder C ₇ -C-I ₀ -AIkVl, wie Heptyl, Octyl, 2-Ethyl-hexyl, 2,4,4-Trimethylpentyl, 1 ,1 ,3,3- Tetramethylbutyl, Nonyl oder Decyl sowie deren Isomere.

Ci-C2o-Alkoxy bedeutet eine geradkettige oder verzweigte Alkylgruppe mit 1 bis 20

Kohlenstoffatomen (wie vorstehend genannt), welche über ein Sauerstoffatom (-O-) angebunden sind, beispielsweise Ci-Cio-Alkoxy oder Cn-C2o-Alkoxy, bevorzugt C1-C10- Alkyloxy, insbesondere bevorzugt Ci-C3-Alkoxy, wie beispielweise Methoxy, Ethoxy, Propoxy.

C3-Ci5-Cycloalkyl: monocyclische, gesättigte Kohlenwasserstoffgruppen mit 3 bis zu 15 Kohlenstoffringgliedern, bevorzugt Cs-Cs-Cycloalkyl wie Cyclopropyl, Cyclobutyl, Cyclopentyl, Cyclohexyl, Cycloheptyl oder Cyclooctyl sowie ein gesättigtes oder ungesättigtes cyclisches System wie z. B. Norbornyl oder Norbenyl.

Aryl: ein ein- bis dreikerniges aromatisches Ringsystem enthaltend 6 bis 14 Kohlenstoffringglieder, z. B. Phenyl, Naphthyl oder Anthracenyl, bevorzugt ein ein- bis zweikerniges, besonders bevorzugt ein einkerniges aromatisches Ringsystem.

Aryloxy: ist ein ein- bis dreikerniges aromatisches Ringsystem (wie vorstehend genannt), welches über ein Sauerstoffatom (-O-) angebunden ist, bevorzugt ein ein- bis zweikerniges, besonders bevorzugt ein einkerniges aromatisches Ringsystem.

Heterocyclen: fünf- bis zwölfgliedrige, bevorzugt fünf- bis neungliedrige, besonders bevorzugt fünf- bis sechsgliedrige, Sauerstoff-, Stickstoff- und/oder Schwefelatome, gegebenenfalls mehrere Ringe aufweisende Ringsysteme wie Furyl, Thiophenyl, Pyr- ryl, Pyridyl, Indolyl, Benzoxazolyl, Dioxolyl, Dioxyl, Benzimidazolyl, Benzthiazolyl, Di-

methylpyridyl, Methylchinolyl, Dimethylpyrryl, Methoxyfuryl, Dimethoxypyridyl, Difluor- pyridyl, Methylthiophenyl, Isopropylthiophenyl oder teil. -Butylthiophenyl. Die Hetero- cyclen können in beliebiger Weise chemisch an die Verbindungen der allgemeinen Formel (I) angebunden sein, beispielsweise über eine Bindung zu einem Kohlenstoff- atom des Heterocyclus oder eine Bindung zu einem der Heteroatome. Weiterhin, insbesondere, fünf- oder sechsgliedrige gesättigte stickstoffhaltige Ringsysteme, die über ein Ringstickstoffatom angebunden sind und die noch ein oder zwei weitere Stickstoffatome oder ein weiteres Sauerstoff- oder Schwefelatom enthalten können.

Ci-C2o-Alkylamino bedeutet eine mit einer, geradkettigen oder verzweigten Alkylgrup- pen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen (wie vorstehend genannt), substituierte Amingrup- pe, beispielsweise Ci-C2-Dialkylamino oder C3-C4-Dialkylamino, bevorzugt C1-C2- Dialkylamino, die über den Stickstoff angebunden ist.

Ci-C2o-Dialkylamino bedeutet eine mit zwei, gleichen oder verschiedenen, geradkettigen oder verzweigten Alkylgruppen mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen (wie vorstehend genannt), substituierte Amingruppe, beispielsweise Ci-C2-Dialkylamino oder C3-C4- Dialkylamino, bevorzugt Ci-C2-Dialkylamino, die über den Stickstoff angebunden ist.

Als Markierstoffe sind grundsätzlich alle Stoffe geeignet, die sich in Flüssigkeiten mit Hilfe fluoreszenzspektroskopischer Verfahren nachweisen lassen. Bevorzugt sind Markierstoffe, die sich in geringen Konzentrationen im ppb- oder ppm-Bereich nachweisen lassen. Die Konzentrationseinheiten ppm und ppb beziehen sich im Rahmen dieser Erfindung auf das Verhältnis von Gewichtseinheiten, falls nicht anders angegeben.

Bevorzugt werden weiterhin Markierstoffe, die eine für das menschliche Auge unsichtbare Markierung der Flüssigkeiten erlauben. Häufig weisen solche Markierstoffe keine oder nur eine sehr geringe Absorption im sichtbaren Bereich des elektromagnetischen Spektrums (Wellenlänge von 380 bis 750 nm) auf oder sind auf Grund der geringen Konzentration im ppb- oder ppm-Bereich für das menschliche Auge nicht sichtbar. Daher bedeutet Markierung im Rahmen dieser Erfindung nicht die Einfärbung der Flüssigkeiten mit Hilfe von Farbstoffen.

Als Markierstoffe, können im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens sowohl ein- zelne chemische Verbindungen oder Gemische von chemischen Verbindungen eingesetzt werden, die Wasserstoffatome aufweisen. Bevorzugt lassen sich die Wasserstoffatome der Markierstoffe einfach gegen Deuterium austauschen. Diese Wasserstoffatome werden im Rahmen dieser Erfindung als H/D-labile Wasserstoffatome bezeichnet. Bevorzugt treten H/D-labile Wasserstoffatome (X-H) chemisch gebunden an Sauerstoff- oder Stickstoffatome auf (X = N oder O).

Beispielsweise weisen die Markierstoffe Substituenten auf, die H/D-labile Wasserstoffe enthalten (deuterierbare Substituenten). Insbesondere enthalten diese Substituenten N-H oder O-H Gruppen. Bevorzugte deuterierbare Substituenten sind substituierte oder unsubstituierte Amino-, Hydroxy-, Carboxyl-, oder Amidgruppen. Besonders bevorzugt sind die deuterierbaren Substituenten chemisch am Chromophor der Markierstoffe angebunden.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Markierungsstoffe chemische Verbindungen aus den Verbindungsklassen der Phthalo- cyanine, Naphthalocyanine, Nickel-Dithiolen-Komplexe, Aminiumverbindungen von aromatischen Aminen, Methinfarbstoffe, Azulenquadratsäurefarbstoffe, Anthrachinone, Rylene (z.B. Quaterrylen-, Terrylen-, Perylenfarbstoffe), Naphthalintetracarbonsäure- diimide, Dibenzanthrone, Isodibenzanthrone oder elektroneutralen Merocyaninfarbstof- fe. Besonders bevorzugt haben diese Verbindungen ihr Absorptionsmaximum im Be- reich von 600 bis 1200 nm. Ganz besonders bevorzugt weisen diese Markierstoffe H/D-labile Wasserstoffe auf.

Beispielsweise sind Vertreter der oben genannten Verbindungsklassen in den Schriften WO 94/02570, WO 2005/063942 A1 , der europäischen Anmeldung 06126725.8, WO 98/52950, WO 2005/066179 A1 , WO 2005/070935 A1 , der PCT Anmeldung

PCT/EP2007/052122, der europäischen Anmeldung 07105776.4, der PCT Anmeldung PCT/EP2007/051745 und WO 2006/097434 A2 offenbart.

Auf die Offenbarung der WO 94/02570 wird bezüglich der Beispiele für Phthalocyanine (Seite (S.) 1 , Zeile (Z.) 37 - S. 3, Z.9), Naphthalocyanine (S.3, Z.11 - S.4, Z.20), Nickel-Dithiolen-Komplexe (S.4, Z. 22 - S. 4, Z. 46), Aminiumverbindungen von aromatischen Aminen (S. 5, Z. 1 - Z. 31), Methinfarbstoffe (S. 5, Z. 33 - S. 6, Z. 29), Azulenquadratsäurefarbstoffe (S. 6, Z. 31 - S. 7, Z. 16) explizit Bezug genommen. Auf die Offenbarung der WO 2005/063942 A1 wird bezüglich der Beispiele für Anthrachinone (S. 2, Z. 20 - S. 4, Z. 13, S. 8, Z. 9 - S. 13, Z. 27) explizit Bezug genommen. Auf die Offenbarung der WO 98/52950 wird bezüglich der Beispiele für Phthalocyanine (S. 1 , Z. 43) explizit Bezug genommen. Auf die Offenbarung der WO 2005/070935 A1 wird bezüglich der Beispiele für Phthalocyanine (S. 1 , Z. 6 - S. 4, Z. 18) explizit Bezug genommen. Auf die Offenbarung der PCT Anmeldung PCT/EP2007/051745 wird bezüg- lieh der Beispiele für Perylenfarbstoffe (S. 2, Z. 24 - S. 6, Z. 18) explizit Bezug genommen. Auf die Offenbarung der WO 2006/097434 A2 wird bezüglich der Beispiele für Dibenzanthrone und Isodibenzanthrone (S. 1 , Z. 7 - S. 2, Z. 33) explizit Bezug genommen.

Die Markierstoffe können nach dem Fachmann bekannten oder an sich bekannten Verfahren hergestellt werden.

Ganz besonders bevorzugt sind die Markierstoffe gegeben durch Anthrachinone der allgemeinen Formeln (I) bis

("I)

Hierbei bedeuten in den Formeln (I) bis (III) die Variablen R, R ¹ und R ² unabhängig voneinander Ci-C2o-Alkyl, bevorzugt Ci-Cis-Alkyl, das gegebenenfalls durch 1 bis 4 Sauerstoffatome in Etherfunktion unterbrochen ist, oder Aryl, das gegebenenfalls mit einem oder mehreren Ci-C2o-Alkyl, das gegebenenfalls durch 1 bis 4 Sauerstoffatome in Etherfunktion unterbrochen ist, substituiert ist.

X nimmt in den Formeln (I) bis (III) entweder die Bedeutung von zwei Wasserstoffatomen, zwei Cyanogruppen in 2,3- oder 6,7-Stellung oder zwei gleichen Gruppen CH(R ⁹ )(R ¹⁰ ) in 2,3- oder 6,7-Stellung des Anthrachinongerüstes an. Bei den letzteren beiden Gruppen CH(R ⁹ )(R ¹⁰ ) handelt es sich entweder um zwei Gruppen CH(COOR')2, CH(CN)COOR' oder CH(CN)2 , wobei die Reste R' vorzugsweise Ci-C ₂ o-Alkyl, das gegebenenfalls durch 1 bis 4 Sauerstoffatome in Etherfunktion unterbrochen ist, oder Aryl, das gegebenenfalls mit einem oder mehreren Ci-C2o-Alkyl, das gegebenenfalls durch 1 bis 4 Sauerstoffatome in Etherfunktion unterbrochen ist, substituiert ist, bedeuten.

In der Bedeutung eines Ci-Cis-Alkyl, das gegebenenfalls durch 1 bis 4 Sauerstoffatome in Etherfunktion unterbrochen ist, erfolgt die Auswahl der Variablen R, R ¹ und R ² vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, Isopentyl, Neopentyl, tert-Pentyl, Hexyl, 2-Methyl- pentyl, Heptyl, Hept-3-yl, Octyl, 2-Ethylhexyl, Isooctyl, Nonyl, Isononyl, Decyl, Isodecyl,

Undecyl, Dodecyl, Tridecyl, 3,5,5,7-Tetramethyl-nonyl, Isotridecyl, Tetradecyl, Penta- decyl, Methoxymethyl, 2-Ethylhexoxymethyl, 2-Methoxyethyl, 2-Ethoxyethyl, 2-Pro- poxyethyl, 2-lsopropoxyethyl, 2-Butoxyethyl, 2- und 3-Methoxypropyl, 2- und 3-Ethoxy- propyl, 2- und 3-Propoxypropyl, 2- und 3-Butoxypropyl, 2- und 4-Methoxybutyl, 2- und 4-Ethoxybutyl, 2- und 4-Propoxybutyl, 2- und 4-Butoxybutyl, 3,6-Dioxaheptyl, 3,6-Dio- xaoctyl, 4,8-Dioxanonyl, 3,7-Dioxaoctyl, 3,7-Dioxanonyl, 4,7-Dioxaoctyl, 4,7-Dioxa- nonyl, 4,8-Dioxadecyl, 3,6,8-Trioxadecyl, 3,6,9-Trioxaundecyl, 3,6,9, 12-Tetraoxatri- decyl und 3,6,9, 12-Tetraoxatetradecyl.

In der Bedeutung eines Aryl, das gegebenenfalls mit einem oder mehreren C1-C20- Alkyl, das gegebenenfalls durch 1 bis 4 Sauerstoffatome in Etherfunktion unterbrochen ist, erfolgt die Auswahl der Variablen R, R ¹ und R ² vorzugsweise aus der Gruppe bestehend aus unsubstituiertem Phenyl, den einfach in 2-, 3- und 4-Stellung, den zweifach in 2,3-, 2,4- und 3,4-Stellung und den dreifach in 2,3,4-, 2,3,5-, 2,3,6-, 2,4,5-, 2,4,6- und 3,4,5-Stellung substituierten Phenylresten, welche substituiert sind mit den zuvor exemplarisch aufgezählten, gegebenenfalls mit Sauerstoff in Etherfunktion unterbrochenen Ci-C2o-Alkylresten.

Besonders bevorzugt sind Verbindungen der Formeln (I) bis (III), in welchen beide Variablen R, R ¹ und R ² bzw. R, R ¹ und R ² bzw. R ¹ und R ² untereinander gleich sind, d.h. als entsprechende Verbindungen sind zu nennen:

und

10ϊ

sowie die entsprechenden mit Cyanogruppen oder Gruppen CH(R ⁹ )(R ¹⁰ ) in 6,7- Stellung substituierten Verbindungen, wobei die Variablen R der zuvor aufgeführten Auswahl entsprechen.

Als erfindungsgemäß zu verwendende Markierstoffe sind ebenfalls insbesondere Anthrachinonderivate der nachfolgend gezeigten Verbindungen der Formeln IV bis VII zu nennen:

worin bedeuten

R ³ R" oder NHR",

R ⁸ NHR"

W Wasserstoff oder NHR", p 1 , 2, 3 oder 4, wobei für p größer als 1 die Reste gleich sind, und

R" Ci-C2o-Alkyl, das gegebenenfalls durch 1 bis 4 Sauerstoffatome in Etherfunktion unterbrochen ist; Cyclohexyl, das gegebenenfalls mit einer oder mehreren Ci-C2o-Alkylgruppen, die gegebenenfalls durch 1 bis 4 Sauerstoffatome in Etherfunkti-

on unterbrochen sind, substituiert ist; Heterocyclus, der gegebenenfalls mit einer oder mehreren Ci-C2o-Alkylgruppen, die gegebenenfalls durch 1 bis 4 Sauerstoffatome in Etherfunktion unterbrochen sind, substituiert ist; Aryl, das gegebenenfalls mit einem oder mehreren Ci-C2o-Alkyl, das gegebenenfalls durch 1 bis 4 Sauerstoffatome in E- therfunktion unterbrochen ist, Ci-C2o-Alkoxy, Ci-C2o-Alkylamino oder Ci-C2o-Di- alkylamino substituiert ist; Phenyl-Ci-C4-alkyl, das im Phenylrest gegebenenfalls mit einem oder mehreren Ci-C2o-Alkyl, das gegebenenfalls durch 1 bis 4 Sauerstoffatome in Etherfunktion unterbrochen ist, Ci-C2o-Alkoxy, Ci-C2o-Alkylamino oder C1-C20- Dialkylamino substituiert ist.

R" in den Formeln IV bis VII bedeutet besonders bevorzugt Ci-C2o-Alkyl, das gegebenenfalls durch 1 bis 4 Sauerstoffatome in Etherfunktion unterbrochen ist, oder Aryl, das gegebenenfalls mit einem oder mehreren Ci-C2o-Alkyl, das gegebenenfalls durch 1 bis 4 Sauerstoffatome in Etherfunktion unterbrochen ist.

Insbesondere ist R" in den Formeln IV bis VII ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, Iso- pentyl, Neopentyl, tert-Pentyl, Hexyl, 2-Methylpentyl, Heptyl, Hept-3-yl, Octyl, 2-Ethyl- hexyl, Isooctyl, Nonyl, Isononyl, Decyl, Isodecyl, Undecyl, Dodecyl, Tridecyl, 3,5,5,7-Tetramethyl-nonyl, Isotridecyl, Tetradecyl, Pentadecyl, Methoxymethyl, 2-Ethyl- hexoxymethyl, 2-Methoxyethyl, 2-Ethoxyethyl, 2-Propoxyethyl, 2-lsopropoxyethyl, 2-Butoxyethyl, 2- und 3-Methoxypropyl, 2- und 3-Ethoxypropyl, 2- und 3-Propoxy- propyl, 2- und 3-Butoxypropyl, 2- und 4-Methoxybutyl, 2- und 4-Ethoxybutyl, 2- und 4- Propoxybutyl, 2- und 4-Butoxybutyl, 3,6-Dioxaheptyl, 3,6-Dioxaoctyl, 4,8-Dioxanonyl, 3,7-Dioxaoctyl, 3,7-Dioxanonyl, 4,7-Dioxaoctyl, 4,7-Dioxanonyl, 4,8-Dioxadecyl, 3,6,8- Trioxadecyl, 3,6,9-Trioxaundecyl, 3,6,9, 12-Tetraoxatridecyl, 3,6,9, 12-Tetraoxatetra- decyl, unsubstituiertem Phenyl, den einfach in 2-, 3- und 4-Stellung substituierten, den zweifach in 2,3-, 2,4- und 3,4-Stellung substituierten und den dreifach in 2,3,4-, 2,3,5-, 2,3,6-, 2,4,5-, 2,4,6- und 3,4,5-Stellung substituierten Phenylresten, welche substituiert sind mit den zuvor exemplarisch aufgezählten, gegebenenfalls mit Sauerstoff in Etherfunktion unterbrochenen Ci-C2o-Alkylresten, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, sec-Butyl, tert-Butyl, Pentyl, Iso- pentyl, Neopentyl, tert-Pentyl, Hexyl, 2-Methylpentyl, Heptyl, Hept-3-yl, Octyl, 2-Ethyl- hexyl, Isooctyl, Nonyl, Isononyl, Decyl, Isodecyl, Undecyl, Dodecyl, Tridecyl, 3,5,5,7-Tetramethyl-nonyl, Isotridecyl, Tetradecyl, Pentadecyl, Methoxymethyl, 2-Ethyl- hexoxymethyl, 2-Methoxyethyl, 2-Ethoxyethyl, 2-Propoxyethyl, 2-lsopropoxyethyl, 2-Butoxyethyl, 2- und 3-Methoxypropyl, 2- und 3-Ethoxypropyl, 2- und 3-Propoxy- propyl, 2- und 3-Butoxypropyl, 2- und 4-Methoxybutyl, 2- und 4-Ethoxybutyl, 2- und 4-Propoxybutyl, 2- und 4-Butoxybutyl, 3,6-Dioxaheptyl, 3,6-Dioxaoctyl, 4,8-Di- oxanonyl, 3,7-Dioxaoctyl, 3,7-Dioxanonyl, 4,7-Dioxaoctyl, 4,7-Dioxanonyl, 4,8-Di- oxadecyl, 3,6,8-Trioxadecyl, 3,6,9-Trioxaundecyl, 3,6,9,12-Tetraoxatridecyl und 3,6,9, 12-Tetraoxatetradecyl.

Die Synthese der Anthrachinone erfolgt beispielsweise nach den in der EP 0 323 184 A1 beschriebenen Methoden.

In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Markierstoffe ganz besonders bevorzugt gegeben durch Anthrachinondicarbonsäureimide der allgemeinen Formeln (VIII):

wobei

R ¹¹ , R ¹² , R ¹³ , R ¹⁴ unabhängig voneinander, gleich oder verschieden H, Ci-C ₂ o-Alkyl, Aryl, Heterocyclen

R15 Ci-C ₂ O-AIkVl, C ₃ -Ci5-Cycloalkyl, Aryl,

R ¹⁶ , R ¹⁷ , R ¹⁸ , R ¹⁹ unabhängig voneinander, gleich oder verschieden H, Ci-C ₂₀ -Alkyl, Ci-C ₂₀ -Alkoxy, Aryl, Aryloxy, NR ¹¹ R ¹² , Halogen, CN, NO ₂ ,

wobei die Substituenten R ¹¹ bis R ¹⁹ jeweils an beliebiger Position durch ein oder mehrere Heteroatome unterbrochen sein können, wobei die Anzahl dieser Heteroatome nicht mehr als 10, bevorzugt nicht mehr als 8, ganz besonders bevorzugt nicht mehr als 5 und insbesondere nicht mehr als 3 beträgt, und/oder jeweils an beliebiger Position, allerdings nicht mehr als fünfmal, bevorzugt nicht mehr als viermal und besonders bevorzugt nicht mehr als dreimal, durch NR ¹¹ R ¹² , CONR ¹¹ R ¹² , COOR ¹¹ , SO ₃ R ¹¹ , CN, NO ₂ , Ci-C ₂ o-Alkyl, Ci-C ₂ o-Alkoxy, Aryl, Aryloxy, Heterocyclen oder Halogen substituiert sein können, wobei diese ebenfalls maximal zweimal, bevorzugt maximal einmal mit den genannten Gruppen substituiert sein können.

Die Synthese der Anthrachinondicarbonsäureimide erfolgt beispielsweise nach den in der europäischen Anmeldung 06126725.8 beschriebenen Methoden.

Ganz besonders bevorzugt sind im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens die Markierstoffe gegeben durch Phthalocyanine der allgemeinen Formeln (IX) und (X):

in denen die Reste R ²¹ , R ²² , R ²³ und R ²⁴ sowie R ²⁶ , R ²⁷ , R ²⁸ und R ²⁹ jeweils einen hete- rocyclischen Rest oder ein Aryloxy bedeuten. Die Aryloxy Substituenten können selbst noch mit bis zu vier, bevorzugt mit zwei, Ci-C4-Alkylgruppen substituiert sein.

M bedeutet zweimal Wasserstoff, zweimal Lithium, Magnesium, Zink, Kupfer, Nickel, VO, TiO, AICI, AIOH, AIOCOCH ₃ , AIOCOCF3, oder SiR ²⁹ R ³⁰ . Wobei R ²⁹ und R ³⁰ unabhängig voneinander, gleich oder verschieden, H, OH, Cl, Ci-C2o-Alkyl, Aryl, C1-C20- Alkoxy oder Aryloxy sind.

Die oben genannten Phthalocyanine sind an sich bekannt und können nach an sich bekannten Methoden, wie sie bei der Herstellung von Phthalocyaninen oder Naphtha- locyaninen zur Anwendung kommen und wie sie beispielsweise in F. H. Moser, A.L. Thomas "The Phthalocyanines", CRC Press, Boca Rota, Florida, 1983, oder J. Am.

Chem. Soc. Band 106, Seiten 7404 bis 7410, 1984, beschrieben sind, erhalten werden.

Die Synthese der Phthalocyanine erfolgt beispielsweise auch nach den in der WO 2005/070935 beschriebenen Methoden.

Die Formeln (IX) und (X) umfassen selbstverständlich auch die Stellungsisomere dieser Verbindungen bezüglich der Substituenten R ²¹ bis R ²⁸ .

Von besonderem Interesse sind Phthalocyanine der Formeln (IX) oder (X), in der alle R ²¹ bis R ²⁸ heterocyclische Reste sind und jeweils Pyrrolidin-1-yl, Piperidin-1-yl, Pipe- razin-1-yl oder Morpholin-4-yl bedeuten, wobei diese Reste ein- bis dreifach, vorzugsweise einfach, durch Ci-C4-Alkyl,Benzyl, Phenylethyl oder Phenyl substituiert sein können.

In einer anderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens sind die Markierstoffe bevorzugt gegeben durch Naphthalocyanine der allgemeinen Formel (Xl):

wobei

Y ¹ bis Y ⁸ unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff , Hydroxy , Ci-C2o-Alkyl oder Ci- C2o-Alkoxy, wobei die Alkylgruppen jeweils durch 1 bis 4 Sauerstoffatome in Etherfunk- tion unterbrochen sein können und gegebenenfalls durch Phenyl substituiert sind, und

Y ⁹ bis Y ¹² unabhängig voneinander jeweils Wasserstoff, Ci-C2o-Alkyl oder C1-C20- Alkoxy, wobei die Alkylgruppen jeweils durch 1 bis 4 Sauerstoffatome in Etherfunktion unterbrochen sein können, Halogen, Hydroxysulfonyl oder Ci-C4-Dialkylsulfamoyl bedeuten.

M' bedeutet zweimal Wasserstoff, zweimal Lithium, Magnesium, Zink, Kupfer, Nickel, VO, TiO, AICI, AIOH, AIOCOCH ₃ , AIOCOCF3, oder SiR ²⁹ R ³⁰ . Wobei R ²⁹ und R ³⁰ un- abhängig voneinander, gleich oder verschieden, H, OH, Cl, Ci-C2o-Alkyl, Aryl, C1-C20- Alkoxy oder Aryloxy sind.

Von besonderem Interesse sind dabei Naphthalocyanine der Formel (Xl), in der mindestens einer der Reste Y ¹ bis Y ⁸ von Wasserstoff verschieden ist.

Die oben genannten Naphthalocyanine sind an sich bekannt und können gemäß den Methoden des oben genannten Standes der Technik (Moser, J. Am. Chem.Soc.) erhalten werden.

Ganz besonders bevorzugt sind im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens die Markierstoffe gegeben durch Rylenfarbstoffe der allgemeinen Formel (XII):

(XII) wobei

RSI ₁ R∞ R ₃ S ₁ R ₃₄ unabhängig voneinander, gleich oder verschieden H, Ci-C ₂₀ -Alkyl, Aryl, Heterocyclen, NR ³⁵ R ³⁶ ,

R ₃ S ₁ R ₃₆ unabhängig voneinander, gleich oder verschieden H, Ci-C2o-Alkyl, Aryl, Heterocyclen sind,

wobei die Substituenten R ³¹ bis R ³⁶ jeweils an beliebiger Position durch ein oder mehrere Heteroatome unterbrochen sein können, wobei die Anzahl dieser Heteroatome nicht mehr als 10, bevorzugt nicht mehr als 8, ganz besonders bevorzugt nicht mehr als 5 und insbesondere nicht mehr als 3 beträgt, und/oder jeweils an beliebiger Position, allerdings nicht mehr als fünfmal, bevorzugt nicht mehr als viermal und besonders bevorzugt nicht mehr als dreimal, durch Ci-C2o-Alkyl, Ci-C2o-Alkoxy, Aryl, Aryloxy oder Heterocyclen substituiert sein können, wobei diese ebenfalls maximal zweimal, bevor- zugt maximal einmal mit den genannten Gruppen substituiert sein können.

Die Herstellung der Rylene erfolgt nach bekannten dem Fachmann geläufigen Methoden, wie sie beispielsweise in Houben Weyl, Methoden der organischen Chemie, Thieme Verlag, Stuttgart, und den folgenden Schriften beschrieben sind: EP-A 0 596 292, EP-A 0 648 817, EP-A 0 657 436, WO 94/02570, WO 96/22331 , WO 96/22332, WO 97/22607, WO 97/22608, WO 01/16109, WO 02/068538, WO 02/076988, DE-A 101 48 172 und den deutschen Patentanmeldungen 10 2004 057 585.1 und 10 2005 032 583.1.

Das Bereitstellen der Flüssigkeiten, die Markierstoffe enthalten, entsprechend Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann auf beliebige Art und Weise erfolgen. Häufig werden die Markierstoffe in Form von Lösungen angewandt, können jedoch auch als Feststoffe den zu markierenden Flüssigkeiten zugesetzt worden sein. Als Lösungsmittel eignen sich vorzugsweise aromatische Kohlenwasserstoffe wie Toluol oder XyIoI. Um eine zu hohe Viskosität der resultierenden Lösungen zu vermeiden, wählt man im allgemeinen eine Konzentration an Markierstoffen von 2 bis 50 Gew.-%, bezogen auf die Lösung.

Die in Schritt (a) des erfindungsgemäßen Verfahrens bereitgestellten Flüssigkeiten werden als markierte Flüssigkeiten bezeichnet.

In Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Flüssigkeit mit einem Deute- rierungsmittel in Kontakt gebracht.

Als Deuterierungsmittel sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung grundsätzlich alle Stoffe geeignet die Deuteriumatome in einen Markierstoff einführen können. Bevorzugt werden Deuterierungsmittel eingesetzt, die einen H/D-Austausch von H/D-labilen Wasserstoffatomen bewirken. Während die Deuterierung im Allgemeinen bevorzugt ist, lässt sich das erfindungsgemäße Verfahren auch mit höheren Wasserstoffisotopen wie beispielsweise Tritium durchführen.

Beispielsweise lassen sich im Rahmen des Erfindungsgemäßen Deuterierungsmittel einsetzen, die Flüssigkeiten sind. Bevorzugt werden deuterierte Alkohole als Deuterierungsmittel eingesetzt, wie monodeuteriertes Methanol (MeOD) oder monodeuteriertes Ethanol (EtOD). Ganz bevorzugt ist EtOD.

In einer weiteren bevorzugten Form des erfindungsgemäßen Verfahrens wird D2O als Deuterierungsmittel eingesetzt. In einer weiteren bevorzugten Form des erfindungsgemäßen Verfahrens wird Lithiumaluminiumdeuterid als Deuterierungsmittel eingesetzt.

In einer weiteren bevorzugten Form des erfindungsgemäßen Verfahrens wird D3PO4 BF3 als Deuterierungsmittel eingesetzt. DsPO ₄ BFs IaSSt sich gemäß dem in der US 3,475,507 beschriebenen Verfahren herstellen.

Entsprechend Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die markierten Flüssigkeiten mit dem Deuterierungsmittel in Kontakt gebracht. Das in Kontakt bringen kann durch beliebige Verfahren erfolgen. Beispielsweise können beide als Flüssigkeiten, gegebenenfalls nach der Lösung des Deuterierungsmittels in einer Flüssigkeit, miteinander gemischt werden. Ob hierbei das Deuterierungsmittel zur Flüssigkeit hinzugegeben wird oder umgekehrt ist im Allgemeinen unerheblich. Häufig wird das Deuterierungsmittel der Flüssigkeit zugesetzt und das Mischen erfolgt durch beispielsweise Schütteln oder Rühren. Bevorzugt löst sich das Deuterierungsmittel entweder als Festsubstanz, als Flüssigkeit oder in einem Lösungsmittel in der markierten Flüssigkeit.

Die Dauer des Kontakts zwischen markierter Flüssigkeit und Deuterierungsmittel in Schritt (b) des erfindungsgemäßen Verfahrens kann beispielsweise abhängig vom jeweiligen Markierstoff über einen weiten Bereich variieren. Bevorzugt liegt die Dauer des Kontakts im Bereich von 10 Sekunden bis 24 Stunden. Besonders bevorzugt ist die Dauer des Kontakts weniger als 1 Stunde. Ganz bevorzugt ist die Dauer des Kontakts weniger als 10 Minuten.

Die im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzte Menge an Deuterie- rungsmittel bezogen auf die markierte Flüssigkeit kann, anhängig von der chemischen Natur der Deuterierungsmittel und der Markierstoffe, in einem weiten Bereich variieren. Bevorzugt wird das Gewichtsverhältnis von Deuterierungsmittel zu markierter Flüssig- keit aus dem Bereich von 20:1 bis 1 :20 gewählt. Bevorzugt beträgt der gewählte Bereich von 10:1 bis 1 :10, insbesondere von 4:1 bis 1 :4.

Die Mengen an Deuterierungsmitteln und markierten Flüssigkeiten die im erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte werden, können über einen weiten Bereich variieren. Meist reichen, beispielsweise bei einem spektroskopischen Nachweis in Schritt (c) wenige Milligramm oder Milliliter der Stoffe aus. Bevorzugt werden weniger als 10 mg o- der 10 ml eingesetzt.

Der Nachweis der Markierstoffe in Schritt (c) wird grundsätzlich mit Hilfe der allgemein bekannten Verfahren der Fluoreszenzspektroskopie, wie beispielsweise in WO

94/02570 beschrieben, durchgeführt. Der Nachweis kann qualitativ oder auch quantitativ erfolgen. Eine wichtige Kenngröße für den Nachweis der Markierstoffe ist das Signal/Rauschverhältnis des jeweiligen Verfahrens. Um einen Markierstoff zuverlässig nachzuweisen sollte das Signal/Rauschverhältnis im Allgemeinen besser sein als 10/1. Für einen quantitativen Nachweis wird ein Signal/Rauschverhältnis von besser als 30/1 bevorzugt.

Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht es durch den Einsatz des Deuterie- rungsmittels in Schritt (b), in Schritt (c) durch fluoreszenspektroskopischen Nachweis selbst extrem geringe Konzentrationen von Markierstoffen zuverlässig nachzuweisen.

Vermutlich erfolgt in Schritt (b) ein H/D-Austauch labiler Wasserstoffe des Markierstoffes, der zu einer erhöhten Quantenausbeute der Fluoreszenz führt. In der Regel werden die Intensitäten der Fluoreszenzsignale nach dem in Kontakt bringen mit Deuterie- rungsmittel um ein Vielfaches erhöht. Als Referenz für die Intensität des Fluoreszenzsignals dient hierbei das Signal der Probe ohne die Behandlung mit Deuterierungsmittel, aber gegebenenfalls unter entsprechender Verdünnung.

Bevorzugt wird die Intensität des Fluoreszenzsignals durch das erfindungsgemäße Verfahren mindestens um den Faktor zwei erhöht. Besonders bevorzugt ist ein Faktor von mindestens vier. Ganz besonders bevorzugt erhöht sich die Intensität des Fluoreszenzsignals um mindestens den Faktor fünf.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens lässt sich durch den Einsatz des Deuterierungsmittels in Schritt (b), bei einer vergleichbaren Zuverlässigkeit des Nachweises in Schritt (c) die benötigte Konzentration an Markierstoff um ein Vielfaches reduzieren. Bevorzugt lässt sich die Konzentration um einen Faktor

von mindestens zwei, besonders bevorzugt mindestens 4 und insbesondere mindestens fünf verringern.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsfom des erfindungsgemäßen Verfahrens wird durch den Einsatz des Deuterierungsmittels in Schritt (b), die bei der Durchführung des fluoreszenzspektroskopischen Nachweises (c) auftretende Hintergrundfluoreszenz nicht in dem gleichen Maße verstärkt wie die Intensität des Floureszenzsignals des Markierstoffs und somit das Signal/Rauschverhältnis verbessert. Bevorzugt verbessert sich das Signal/Rauschverhältnis um einen Faktor von mindestens zwei, be- sonders bevorzugt mindestens 4 und insbesondere mindestens um 5.

Häufig wird durch das in Kontakt bringen mit dem Deuterierungsmittel in Schritt (b) auch in einer verunreinigten Flüssigkeit das Signal/Rauschverhältnis für den Nachweis in Schritt (c) verbessert. Daher wird in einer bevorzugten Ausführungsform des erfin- dungsgemäßen Verfahrens der Nachweis in Schritt (c) an einer verunreinigten Flüssigkeit durchgeführt. Vermutlich findet im Fall der verunreinigten Flüssigkeiten der H/D- Austausch vornehmlich im Markierstoff und nur untergeordnet in den Substanzen statt, die die Verunreinigung bewirken.

In einer weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird der Nachweis der Markierstoffe (Schritt (c)) zeitabhängig durchgeführt. Es wird also zu verschiedenen Zeitpunkten die Fluoreszenzintensität der Markierstoffe bestimmt. Der zeitliche Verlauf der Fluoreszenzintensität ist ein charakteristisches Merkmal für die verwendeten Markierstoffe und kann zum Nachweis und zur Identifizierung der Mar- kierstoffe herangezogen werden.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Markierung von Flüssigkeiten, wobei der Nachweis der Markierstoffe entsprechend einer der Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgt.

Ein anderer Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung von Deuterierungsmitteln zur Verbesserung der Nachweisbarkeit von Markierungsstoffen in Flüssigkeiten.

Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens lassen sich Markierungsstoffe in Flüssig- keiten, auch in extrem geringer Konzentration, zuverlässig auch ohne eine Abtrennung und Aufbereitung nachweisen.

Die Erfindung wird durch die Beispiele näher erläutert ohne dass die Beispiele den Gegenstand der Erfindung einschränken.

Beispiele:

Alle %-Angaben sind, falls nicht anders angegeben, Gew.-%.

Alle ppm-Angaben sind, falls nicht anders angegeben, bezogen auf Gewicht zu verste- hen.

Anteile in Mischungen sind als Gewichtsanteile zu verstehen.

Alle Langpassfilter weisen eine Blocking-OD (OD: optische Dichte) von 3 auf, falls nichts anderes angegeben ist.

Alle Fluoreszenzmessungen erfolgen in 1 cm Küvetten, falls nicht abweichend angegeben.

Beispiel 1

Markierstoff 1 (MS1 ):

Zu einer Lösung von MS1 mit einer Konzentration von 50 ppb in kommerziellem Diesel (Fa. Aral®) wurden 15 Gew.-% monodeuteriertes Ethanol (EtOD) zugegeben. Mit Hilfe eines Messgeräts zur Detektion von Fluoreszenz in Mineralölen (Dieseltester), wie in WO 94/02570 (z.B. Beschreibung S. 20, Abb. 1 und Beispiele) beschrieben, wurde die Zunahme der Fluoreszenzintensität mit der Zeit registriert. Nach einer Stunde hat sich die Fluoreszenzintensität um den Faktor 3,9 erhöht. Der zeitliche Verlauf der Fluoreszenzintensität ist ein charakteristisches Wiedererkennungsmerkmal für den verwendeten Markierstoff.

Zeitlicher Verlauf der Signalintensität (Intensität). Konzentration des Farbstoffs: 50 ppb; Zeit in Minuten; Signalintänsität: willkürliche Einheiten. (Zugabe EtOD erfolgte zum Zeitpunkt t=0. Der Wert 1 ,0 der Intensität ist der Referenzwert vor der Zugabe von E- tOD.)

Anregungswellenlänge Dieseltester: Laser: 640nm

Langpassfilter: 780nm und 776nm

Beispiel 2

Markierstoff 2 (MS2):

Eine Menge von 4,35 mg des Markierstoffs MS2 wurde in 50 ml Toluol gelöst (100 ppm) und die Lösung 15 Minuten zur Dispergierung im Ultraschallbbad behandelt. Die Ausgangslösung wurde bis auf 100 ppb mit Toluol verdünnt und im Fluoreszenz- Detektionsgerät (Dieseltester) gemessen (vgl. Beispiel 1 ). Zu Proben entnommen aus der 100 ppb Lösung, wurden jeweils 5 Gew.-%, 10 Gew.-%, 20 Gew.-%, 40 Gew.-%, 50 Gew.-%, 60 Gew.-% und 80 Gew.-% monodeuteriertes Ethanol (Ethanol D1 , EtOD) zugegeben und im Fluoreszensz-Detektionsgerät (Dieseltester) gemessen. Zum Vergleich wurde die 100 ppb Lösung mit gleichen Teilen Toluol verdünnt und gemessen.

Einstellungen des Fluoreszenz-Detektionsgerät: - Anregungswellenlänge: 760 nm Langpassfilter 776 nm

Beispiel 3

Markierstoff 3 (MS3):

Eine Menge von 4,35 mg des Farbstoffs MS3 wurde in 50 ml Toluol gelöst (100ppm) und 15 Minuten zur Dispergierung im Ultraschallbad behandelt. Die Ausgangslösung wurde bis auf 100 ppb mit Toluol verdünnt und im Fluoreszenz-Detektionsgerät (Dieseltester) gemessen (vgl. Beispiel 1 ). Zu Proben entnommen aus der 100 ppb Lösung, wurden jeweils 5 Gew.-%, 10 Gew.-%, 20 Gew.-%, 40 Gew.-%, 50 Gew.-%, 60 Gew.- % und 80 Gew.-%, Ethanol D1 (EtOD) zugegeben und im Fluoreszensz- Detektionsgerät (Dieseltester) gemessen. Zum Vergleich wurde die 100 ppb Lösung mit gleichen Teilen Toluol verdünnt und gemessen.

Einstellungen des Fluoreszenz-Detektionsgerät:

Anregungswellenlänge: 670 nm - Langpassfilter: zwei mal 695 nm

Beispiel 4

Eine Menge von 8,7 mg Marker MS2 wurde in 100 ml Toluol gelöst (Konzentration 100 ppm). Anschließend wurde die Probe 15 Minuten im Ultraschallbad dispergiert. Die Gesamtlösezeit betrug 30 Minuten. Die Probe wurde mit Toluol so weit verdünnt, bis eine Konzentration von 100 ppb erreicht wurde. Diese Probe wurde im Fluoreszenz- Detektionsgerät (Dieseltester) gemessen (vgl. Beispiel 1 ). Die Anregungswellenlänge

des Lasers betrug 760 nm (Langpassfilter: 776 nm). Ein Teil der 100 ppb Lösung wurde mit 2 Teilen (Gewicht) Toluol weiter verdünnt (33 ppb) und ebenfalls im Fluores- zenz-Detektionsgerät (Dieseltester) gemessen. Anschließend wurde ein anderer Teil der 100 ppb Lösung mit 2 Teilen Ethanol D1 verdünnt und gemessen. Man beobachtete einen deutlichen Signalanstieg auf der Anzeige des Messgerätes. über einen Zeitraum von 20 Minuten wurden an der 33 ppb Probe, die mit Ethanol D1 versetzt worden war, weitere Messungen durchgeführt um die Stabilität des Signals zu überprüfen.

Konzentration Anzeige Messgerät [Skalenteile]

100 ppb (Ansatz in Toluol) 4,5

33 ppb (mit Toluol verdünnt) 1 ,5

33 ppb (mit Ethanol D1 verdünnt] 7,5

Zeit Anazeige Messgerät [Minuten] [Skalenteile]

0 7,5

1 7,5

3 7,3

5 6,9

7 7,1

10 6,8

15 6,9

20 6,9

Vergleichsversuch 1

Kommerzieller Diesel (Fa. Aral®) wurde im Fluoreszenz-Detektionsgerät gemessen.

Anschließend wurde der Diesel mit Ethanol 1 :2 (Gewicht) verdünnt und gemessen. In einem weiteren Versuch wurde Diesel mit Ethanol D1 (EtOD) verdünnt und gemessen.

Die Vergleichsversuche mit Diesel wurde mit zwei verschiedenen Lasern (u. Filtern) durchgeführt: a: Anregungswellenlänge 660 nm, Langpassfilter: 695 nm b: Anregungswellenlänge 760 nm, Langpassfilter: 776 nm a: Anregungswellenlänge 660, Langpass 695 nm

b: Anre un swellenlän e 760, Lan ass 776 nm

Beispiel 5

Folgende Markierstoffe wurden in Toluol gelöst: MS4, MS5, MS6, MS7, MS8. Es wurden jeweils gleiche Teile Ethanol bzw. Ethanol D1 (EtOD) zugegeben und die Zunahme der Fluoreszenzintensität im Fluoreszenz-Maximum (FL-Maximum) mit Hilfe eines kommerziellen Fluoreszenzspektrometers der Marke Cary Eclipse ermittelt.

MS5

MS7

Versuchsdurchführung der Messungen mit Cary Eclipse:

Die Farbstoffe wurden in Toluol gelöst und auf eine Extinktion von 1 ,0 im Absorptionsmaximum eingestellt. Anschließend wurde zu zwei Teilen (immer Gewichtsteile) der so hergestellten Lösungen je ein Teil Ethanol (EtOH) bzw. Ethanol D1 (EtOD) zugegeben. Diese Lösungen wurden bei einer Wellenlänge nahe ihrer Absorptionsmaxima angeregt (Lambda ex), bei der die zu vergleichenden mit Ethanol bzw. Ethanol D1 verdünnten Toluollösungen gleiche Absorptionen hatten. Es wurden folgende Fluoreszenzintensitäten (Skalenteile) im jeweiligen Fluoreszenzmaximum (FL) erhalten:

Messungen mit dem Dieseltester (vgl. Beispiel 1 ): bestehend aus einem Laser der Wellenlänge 640 nm mit zwei Blocking-Filtern (Kan- tenwellenlängen: 776 nm und 780 nm , Blocking OD jeweils 6) im Strahlengang der Detektionseinrichtung für Fluoreszenz.

Versuchsdurchführung:

Es wurden Lösungen der Farbstoffe in Toluol (ppm-Bereich) hergestellt, die gleiche Absorptionen bei 640 nm hatten. Zu zwei Teilen dieser Lösungen wurden wie oben je ein Teil Ethanol bzw. Ethanol D1 zugegeben. Die so ermittelten Fluoreszenzintensitäten (Skalenteile) wurden wie oben ausgewertet. Auch hier beobachtet man einen beträchtlichen Zuwachs der Fluoreszenzintensität durch Deuterierung:

Beispiel 6

MS2 wurde in Toluol auf eine Extinktion von 0,5 im Absorptionsmaximum von 750 nm eingestellt und mit Ethanol D1 (EtOD) 1 :1 (Gewicht) verdünnt. Anschließend wurde die Kinetik der Fluoreszenz von MS2 mit dem Fluorezenzspektrometer Cary Eclipse bei 820 nm gemessen. Nach 20 Minuten Wartezeit ist das Intensitätsmaximum erreicht.

Solvent Violett 59 (CAS Nr. 6408-72-6) wurde in Toluol auf eine Extinktion von 0.16 im Absorptionsmaximum von 542 nm eingestellt und mit Ethanol D1 1 :1 (Gewicht) verdünnt. Anschließend wurde die Kinetik der Fluoreszenz mit dem Fluoreszenzspektro- meter Cary Eclipse im Fluoreszenzmaximum bei 607 nm (Toluol) bzw. 616 nm (1 :1- Verdünnung mit Ethanol D1 ) gemessen. Nach 20 Minuten Wartezeit ist das Intensitätsmaximum erreicht.

Nullwert ist in diesem Fall die Intensität für Solvent Violett 59 in Toluol vor der Ethanol D1 Zugabe.

Beispiel 7

MS9

MS9 wurde in Ethanol bzw. Ethanol D1 bei 658 nm auf eine Extinktion von 0,2 eingestellt. Anregung bei dieser Wellenlänge lieferte folgende Fluoreszenzintensitäten bei 725 nm:

Zunahme der Fluoreszenzintensität [Skalenteile]:

Beispiel 8

Marker MS2 wurde in Ethanol und monodeuteriertem Ethanol (EtOD) auf eine Extinktion von jeweils 0.2 bei 746 nm eingestellt. Das in deuteriertem Ethanol beobachtete Fluoreszenzsignal ist etwa um den Faktor 3 höher als in nichtdeuteriertem Ethanol.

Beispiel 9 Markierstoff 10 (MS10):

Eine Menge von 8,7 mg MS10 wurde in 100 ml Toluol gelöst (Konzentration 100 ppm). Anschließend wurde die Probe 15 Minuten im Ultraschallbad dispergiert. Die Gesamt- lösezeit betrug 30 Minuten. Die Probe wurde mit Toluol so weit verdünnt, bis eine Konzentration von 10 ppb erreicht wurde. Diese Probe wurde im Fluoreszenz- Detektionsgerät (Dieseltester) gemessen (vgl. Beispiel 1 ). Die Anregungswellenlänge des Lasers betrug 660 nm (Langpassfilter: 695 nm). Ein Teil der Marker Lösung wurde mit 2 Teilen Toluol weiter verdünnt (3 ppb) und ebenfalls im Fluoreszenz- Detektionsgerät (Dieseltester) gemessen. Ein weiterer Teil wurde mit 2,3 Teilen Etha- nol D1 (EtOD) verdünnt (<3ppb) und gemessen. Ein anderer Teil wurde mit 2 Teilen Ethanol D1 verdünnt (3 ppb) und gemessen.