| JP3662238 | COOLING DEVICE AND THERMOSTATIC DEVICE |
| JP3871846 | METHOD AND APPARATUS FOR DETECTING HYBRIDIZATION REACTION |
| WO/2009/107065 | REACTOR SYSTEM |
SCHUBERT, Axel (Sommerstraße 25, München, 81543, DE)
VOLKERT, Fritz (Bündtenweg 40, Oberwil, CH-4104, CH)
HOEFERLIN, Daniel (Allmendweg 11, Waldkirch, 79183, DE)
NURNUS, Joachim (Kleegärtle 7, Neuenburg, 79395, DE)
SCHUBERT, Axel (Sommerstraße 25, München, 81543, DE)
VOLKERT, Fritz (Bündtenweg 40, Oberwil, CH-4104, CH)
HOEFERLIN, Daniel (Allmendweg 11, Waldkirch, 79183, DE)
| Patentansprüche 1 . Vorrichtung zur Durchführung der PCR, mit - einer Probenaufnahme (2) zur Aufnahme von Probengefäßen, wobei die Proben- aufnähme (2) eine Mehrzahl von Aufnahmeöffnungen (21 ) aufweist, in denen jeweils ein Probengefäß oder ein Einsatz (3) zur Aufnahme eines Probengefäßes angeordnet werden kann; - einer Mehrzahl von Peltierelementen (5), wobei jeder Aufnahmeöffnung (21 ) mindestens eines der Peltierelemente (5) zugeordnet ist, so dass in den Aufnahmeöff- nungen (21 ) angeordnete Probengefäße oder Einsätze (3) individuell temperiert werden können; - einer Mehrzahl von Temperatursensoren (4) zum Bestimmen der Temperatur einer in einem Probengefäß vorgelegten Probe, wobei jeder der Aufnahmeöffnungen (21 ) mindestens einer der Temperatursensoren (4) zugeordnet ist; und - einer Mehrzahl von Rückstellkrafterzeugungsmitteln, wobei jeder der Aufnahmeöffnungen (21 ) jeweils mindestens ein Rückstellkrafterzeugungsmittel zugeordnet ist, das mit dem der Aufnahmeöffnung (21 ) zugeordneten Temperatursensor (4) so zusammenwirkt, dass es den Temperatursensor (4) in thermischem Kontakt mit einem in der Aufnahmeöffnung (21 ) angeordneten Probengefäß oder mit einem Ein- satz (3) zur Aufnahme eines Probengefäßes hält, wobei - zumindest eines der Rückstellkrafterzeugungsmittel ein elastisches Element (6) aufweist, an dem der Temperatursensor (4) angeordnet ist, wobei das elastische Element (6) über einen Rand der Aufnahmeöffnung (21 ) hinausragt oder in die Aufnahmeöffnung (21 ) hineinragt, so dass es nach einem Anordnen eines Probenge- fäßes oder eines Einsatzes (3) in der zugeordneten Aufnahmeöffnung (21 ) abgebogen und der Temperatursensor (4) auf diese Weise gegen das Probengefäß oder den Einsatz (3) vorgespannt wird. 2. Vorrichtung zur Durchführung der PCR, insbesondere gemäß Anspruch 1 , mit - einer Probenaufnahme (2) zur Aufnahme von Probengefäßen, wobei die Probenaufnahme (2) eine Mehrzahl von Aufnahmeöffnungen (21 ) aufweist, in denen jeweils ein Probengefäß oder ein Einsatz (3) zur Aufnahme eines Probengefäßes angeordnet werden kann; - einer Mehrzahl von Peltierelementen (5), wobei jeder Aufnahmeöffnung (21 ) min- destens eines der Peltierelemente (5) zugeordnet ist, so dass in den Aufnahmeöffnungen (21 ) angeordnete Probengefäße oder Einsätze (3) individuell temperiert werden können; - einer Mehrzahl von Temperatursensoren (4) zum Bestimmen der Temperatur einer in einem Probengefäß vorgelegten Probe, wobei jeder der Aufnahmeöffnungen (21 ) mindestens einer der Temperatursensoren (4) zugeordnet ist; und - einer Mehrzahl von Rückstellkrafterzeugungsmitteln, wobei jeder der Aufnahmeöffnungen (21 ) jeweils mindestens ein Rückstellkrafterzeugungsmittel zugeordnet ist, das mit dem der Aufnahmeöffnung (21 ) zugeordneten Temperatursensor (4) so zusammenwirkt, dass es den Temperatursensor (4) in thermischem Kontakt mit einem in der Aufnahmeöffnung (21 ) angeordneten Probengefäß oder mit einem Einsatz (3) zur Aufnahme eines Probengefäßes hält, wobei - zumindest eines der Rückstellkrafterzeugungsmittel in Form eines elastisch ausgeformten Abschnitts einer Seitenwand einer der Aufnahmeöffnungen (21 ) ausgebildet ist, der den Temperatursensor (4) gegen ein in der Aufnahmeöffnung angeordnetes Probengefäß oder gegen einen in der Aufnahmeöffnung angeordneten Einsatz (3) zur Aufnahme eines Probengefäßes drückt. Vorrichtung zur Durchführung der PCR, insbesondere gemäß Anspruch 1 oder 2, mit - einer Probenaufnahme (2) zur Aufnahme von Probengefäßen, wobei die Probenaufnahme (2) eine Mehrzahl von Aufnahmeöffnungen (21 ) aufweist, in denen jeweils ein Probengefäß oder ein Einsatz (3) zur Aufnahme eines Probengefäßes angeordnet werden kann; - einer Mehrzahl von Peltierelementen (5), wobei jeder Aufnahmeöffnung (21 ) mindestens eines der Peltierelemente (5) zugeordnet ist, so dass in den Aufnahmeöffnungen (21 ) angeordnete Probengefäße oder Einsätze (3) individuell temperiert werden können; - einer Mehrzahl von Temperatursensoren (4) zum Bestimmen der Temperatur einer in einem Probengefäß vorgelegten Probe, wobei jeder der Aufnahmeöffnungen (21 ) mindestens einer der Temperatursensoren (4) zugeordnet ist; - einer Mehrzahl von Rückstellkrafterzeugungsmitteln, wobei jeder der Aufnahmeöffnungen (21 ) jeweils mindestens ein Rückstellkrafterzeugungsmittel zugeordnet ist, das mit dem der Aufnahmeöffnung (21 ) zugeordneten Temperatursensor (4) so zusammenwirkt, dass es den Temperatursensor (4) in thermischem Kontakt mit einem in der Aufnahmeöffnung (21 ) angeordneten Probengefäß oder mit einem Einsatz (3) zur Aufnahme eines Probengefäßes hält; und - einem zu der Probenaufnahme (2) separaten Träger (7), an dem die Peltierelemente (5) angeordnet sind. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenaufnahme (2) aus einem thermisch isolierenden Material gebildet ist. 5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche soweit rückbezogen auf Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass sich die Aufnahmeöffnung (21 ) in Einführrichtung, entlang derer ein Probengefäße oder während der Montage der Vorrichtung ein Einsatz (3) zur Aufnahme eines Probengefäßes in die Aufnahmeöffnung (21 ) einzuführen ist, verjüngt und der elastische Abschnitt an einen unteren Rand (213) der Aufnahmeöffnung (21 ) oder einen Bodenbereich der Aufnahmeöffnung angrenzt. 6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche soweit rückbezogen auf An- spruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das elastische Element (6) mit einem ersten Abschnitt (61 ) an der Probenaufnahme (21 ) angeordnet ist und mit einem zweiten Abschnitt (62), an dem sich der Temperatursensor (4) befindet, über den Rand der Aufnahmeöffnung (21 ) hinausragt oder in die Aufnahmeöffnung (21 ) hineinragt, so dass der Temperatursensor (4) nach dem Anordnen des Probengefäßes oder des Einsatzes (3) in der zugeordneten Aufnahmeöffnung (21 ) an einer Seitenwand (32) des Probengefäßes oder des Einsatzes (3) zur Anlage kommt. 7. Vorrichtung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das elastische Element (6) mit dem ersten Abschnitt (61 ) an einer Oberseite (22) der Probenaufnahme (21 ) angeordnet ist. 8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das elastische Element (6) in Form eines flächigen Elementes ausgebildet ist, wobei der erste Abschnitt des elastischen Elementes (6) durch einen ersten Abschnitt des flächigen Elementes ausgebildet ist, der an der Oberseite (22) der Probenaufnahme (2) angeordnet ist, und der zweite Abschnitt des elastischen Elementes (6) durch einen zweiten Abschnitt des flächigen Elementes, an dem der Temperatursensor (4) angeordnet ist, wobei der zweite Abschnitt des flächigen Elementes vor dem Anordnen des Probengefäßes oder des Einsatzes (3) mit der Aufnahmeöffnung (21 ) überlappt. 9. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatursensoren (4) mit einer an einer Oberseite (22) der Probenaufnahme (2) angeordneten Leiterbahn (80) elektrisch kontaktiert sind. 10. Vorrichtung nach Anspruch 9 soweit rückbezogen auf Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Peltierelemente (5) mit einer auf einer der Probenaufnahme (2) zugewandten Seite (71 ) des Trägers (7) angeordneten Leiterbahn (8) elektrisch kontaktiert sind. 1 1 . Verfahren zum Herstellen einer Vorrichtung zur Durchführung der PCR, mit den Schritten: - Bereitstellen einer Probenaufnahme (2), die eine Mehrzahl von Aufnahmeöffnun- gen (21 ) aufweist; - Bereitstellen mindestens eines Temperatursensors (4) sowie mindestens eines Rückstellkrafterzeugungsmittels in Form eines elastischen Elementes (6), an dem der Temperatursensor angeordnet ist; - Anordnen des elastischen Elementes (6) an der Probenaufnahme (2) derart, dass es über einen Rand einer der Aufnahmeöffnungen (21 ) hinausragt oder in eine der Aufnahmeöffnungen (21 ) hineinragt; - Anordnen eines Einsatzes (3) zur Aufnahme von Probengefäßen in der Aufnahmeöffnung (21 ), so dass das elastische Element (6) abgebogen und der Temperatursensor (4) gegen den Einsatz (3) vorgespannt wird. 12. Verfahren nach Anspruch 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das elastische Element (6) und/oder der Temperatursensor (4) mit dem Einsatz (3) stoffschlüssig verbunden werden. 13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass das elastische Element (6), der Temperatursensor (4) und/oder der Einsatz (3) vor dem Anordnen des Einsatzes (3) in der Aufnahmeöffnung (21 ) mit einem Klebstoff versehen werden. 14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1 bis 13, gekennzeichnet durch - Bereitstellen eines Trägers (7), auf dem eine Mehrzahl von Peltierelementen (5) angeordnet ist, und - Verbinden der Probeaufnahme (2) mit dem Träger (7), so dass jeder der Aufnahmeöffnungen (21 ) mindestens ein Peltierelement zugeordnet ist. 15. Verfahren nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass vor dem Anordnen des Einsatzes (3) in der Aufnahmeöffnung (21 ) ein Ausgleichsmaterial auf den Träger (7) und/oder das der Aufnahmeöffnung zugeordnete Peltierelement (5) aufgebracht wird. PCR-Verfahren, insbesondere unter Verwendung einer Vorrichtung gemäß der vorhergehenden Ansprüche, mit den Schritten: - Anordnen mindestens einer ersten und einer zweiten DNA-Probe in einer gemeinsamen Probenaufnahme (2), wobei jeder DNA-Probe ein Temperatursensor (4) zugeordnet ist; - zyklisches Temperieren der ersten DNA-Probe gemäß einem ersten Temperatur- profil sowie zyklisches Temperieren der zweiten DNA-Probe gemäß einem zweiten Temperaturprofil, wobei - das erste Temperaturprofil gemäß einer ersten Anzahl von Zyklen und das zweite Temperaturprofil gemäß einer zweiten Anzahl von Zyklen, die verschieden ist von der ersten Anzahl von Zyklen, wiederholt durchlaufen wird. 17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die erste und/oder die zweite DNA-Probe mit einem Farbstoff markiert und während des Durchführens der PCR jeweils die Fluoreszenzintensität des Farbstoffs als Maß für die Menge des durch die PCR erzeugten Materials über die Zeit bestimmt wird. 18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, dass die erste und/oder die zweite Anzahl von Zyklen in Abhängigkeit davon gewählt werden, ob ein vorgebbarer Grenzwert der Fluoreszenzintensität erreicht ist. 19. Verfahren nach einem der Ansprüche 16 bis 18, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Temperaturprofil verschieden ist von dem zweiten Temperaturprofil. 20. PCR- Verfahren, insbesondere gemäß einem der Ansprüche 16 bis 19, mit den Schritten: - Anordnen mindestens einer ersten und einer zweiten DNA-Probe in einer gemeinsamen Probenaufnahme (2), wobei jeder DNA-Probe ein Temperatursensor (4) zugeordnet ist; - zyklisches Temperieren der ersten DNA-Probe gemäß einem ersten Temperaturprofil sowie zyklisches Temperieren der zweiten DNA-Probe gemäß einem zwei- ten Temperaturprofil; - im Anschluss an das zyklische Temperieren Erhöhen der Temperatur der ersten DNA-Probe gemäß einer ersten Temperaturrampe und gleichzeitig Erhöhen der Temperatur der zweiten DNA-Probe gemäß einer zweiten Temperaturrampe, um den Schmelzpunkt der ersten und der zweiten DNA-Probe zu bestimmen. 21 . Verfahren nach Anspruch 21 , dadurch gekennzeichnet, dass die erste und die zweite DNA-Probe mit einem Farbstoff markiert sind und zur Bestimmung des Schmelzpunktes jeweils die Änderung der Fluoreszenzintensität mit der Temperatur des Farbstoffs in Abhängigkeit von der Temperatur ermittelt wird. |
Beschreibung Die Erfindung betrifft Vorrichtungen zum Durchführen der PCR gemäß den Ansprüchen 1 bis 3, ein Verfahren zum Herstellen einer Vorrichtung zur Durchführung der PCR gemäß Anspruch 1 1 sowie PCR-Verfahren gemäß den Ansprüchen 16 und 20.
Aus dem Stand der Technik sind Vorrichtungen und Verfahren zur Durchführung der PCR, d.h. der Polymerase-Kettenreaktion zur Vervielfältigung von DNA-Material (Polymerase Chain Reaction), bekannt. Bekannte PCR-Vorrichtungen weisen insbesondere eine Heizeinheit (Thermocycler) zum zyklischen Temperieren des zu vervielfältigenden DNA- Materials auf. Das der Erfindung zugrunde liegende Problem besteht darin, eine möglichst einfach herstellbare Vorrichtung und ein Verfahren anzugeben, mit denen mehrere DNA-Proben auf möglichst effiziente Weise gleichzeitig und individuell vervielfältigt und/oder analysiert werden können. Des Weiteren soll ein möglichst einfaches Verfahren zum Herstellen einer Vorrichtung zur Durchführung der PCR angegeben werden.
Diese Probleme werden durch die Vorrichtungen mit den Merkmalen gemäß den Ansprü- chen 1 bis 3, durch das Verfahren mit den Merkmalen nach Anspruch 1 1 bzw. durch die Verfahren mit den Merkmalen gemäß den Ansprüchen 16 und 20 gelöst. Weiterbildungen der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen angegeben.
Danach wird eine Vorrichtung zur Durchführung der PCR bereitgestellt, mit
- einer Probenaufnahme zur Aufnahme von Probengefäßen, wobei die Probenaufnahme eine Mehrzahl von Aufnahmeöffnungen aufweist, in denen jeweils ein Probengefäß oder ein Einsatz zur Aufnahme eines Probengefäßes angeordnet werden kann;
- einer Mehrzahl von Peltierelementen, wobei jeder Aufnahmeöffnung mindestens eines der Peltierelemente zugeordnet ist, so dass die in den Aufnahmeöffnungen angeord- neten Probengefäße oder Einsätze (d.h. die in den Probengefäßen angeordneten DNA-Proben) individuell temperiert werden können;
- einer Mehrzahl von Temperatursensoren zum Bestimmen der Temperatur einer in dem Probengefäß vorgelegten Probe, wobei jeder der Aufnahmeöffnungen mindestens einer der Temperatursensoren zugeordnet ist; und
- einer Mehrzahl von Rückstellkrafterzeugungsmitteln, wobei jeder der Aufnahmeöffnungen jeweils mindestens ein Rückstellkrafterzeugungsmittel zugeordnet ist, das mit dem der Aufnahmeöffnung zugeordneten Temperatursensor so zusammenwirkt (insbesondere vorspannt), dass es den Temperatursensor in thermischem Kontakt mit einem in der Aufnahmeöffnung angeordneten Probengefäß oder mit einem Einsatz zur Aufnahme eines Probengefäßes hält, wobei
- zumindest eines der Rückstellkrafterzeugungsmittel ein elastisches Element aufweist, an dem der Temperatursensor angeordnet ist, wobei das elastische Element über einen Rand der Aufnahmeöffnung hinausragt oder in die Aufnahmeöffnung hineinragt, so dass es nach einem Anordnen eines Probengefäßes oder eines Einsatzes in der zugeordneten Aufnahmeöffnung abgebogen und der Temperatursensor auf diese Weise gegen das Probengefäß oder den Einsatz vorgespannt wird.
Gemäß einer Ausgestaltung der Erfindung ist das elastische Element mit einem ersten Abschnitt an der Probenaufnahme angeordnet und ragt mit einem zweiten Abschnitt, an dem sich einer der Temperatursensoren befindet, so in die Aufnahmeöffnung hinein, dass der zweite Abschnitt beim Einführen eines Probengefäßes oder eines Einsatzes zur Aufnahme eines Probengefäßes in die Aufnahmeöffnung abgebogen und gegen das Probengefäß oder den Einsatz vorgespannt wird, so dass der Temperatursensor an einer Seitenwand des Probengefäßes oder des Einsatzes zur Anlage kommt. Beispielsweise ist der erste Abschnitt des elastischen Elementes an einer Seitenwand einer Aufnahmeöffnung festgelegt, während der zweite Abschnitt von der Seitenwand abstehend in die Aufnahmeöffnung hineinragt.
Gemäß einer anderen Variante ist das elastische Element mit dem ersten Abschnitt an einer Oberseite der Probenaufnahme angeordnet (insbesondere festgelegt) und ragt vor dem Anordnen eines Probengefäßes bzw. eines Einsatzes zur Aufnahme eines Proben- gefäßes in der Aufnahmeöffnung mit dem zweiten Abschnitt, an dem der Temperatursensor angeordnet ist, über einen Rand der Aufnahmeöffnung, der in der Oberseite der Probeaufnahme verläuft, hinaus, wobei der zweite Abschnitt beim Einführen eines Probengefäßes (bzw. des Einsatzes) in die Aufnahmeöffnung abgebogen und gegen das Probengefäß (bzw. gegen den Einsatz) vorgespannt wird, so dass der Temperatursensor an einer Seitenwand des Probengefäßes (bzw. des Einsatzes) zur Anlage kommt.
Insbesondere ist der Temperatursensor an einer Seite des elastischen Elementes angeordnet, die vor dem Einführen des Probengefäßes (bzw. des Einsatzes) von der Aufnahmeöffnung weg weist. Die„Oberseite" der Probenaufnahme ist eine Seite der (z.B. plat- tenartig ausgebildeten) Probenaufnahme, über die das Probengefäß (bzw. der Einsatz) in die Aufnahmeöffnung eingeführt wird, und die insbesondere dem der Aufnahmeöffnung zugeordneten Peltierelement abgewandt ist, wie oben bereits erläutert.
Darüber hinaus kann auch das Peltierelement über die Rückstellkrafterzeugungsmittel gegen eine Seitenwand eines in die Aufnahmeöffnung eingesetzten Probengefäßes oder eines Einsatzes zur Aufnahme eines Probengefäßes gedrückt werden. Insbesondere ist das Peltierelement zusammen mit dem Temperatursensor an den Rückstellkrafterzeu- gungsmitteln festgelegt. Beispielsweise sind die Rückstellkrafterzeugungsmittel jeweils in Form eines elastischen Elementes ausgebildet, wobei sowohl ein Temperatursensor als auch ein Peltierelement mit dem elastischen Element verbunden sein können. Natürlich können auch separate elastische Elemente für den Temperatursensor und das Peltierelement verwendet werden.
Es wird darauf hingewiesen, dass die Formulierung, wonach der erste Abschnitt des elas- tischen Elementes„an der Oberseite der Probenaufnahme" angeordnet ist, nicht zwingend bedeutet, dass sich der erste Abschnitt unmittelbar in Kontakt mit der Oberseite der Probenaufnahme befinden muss, sondern es ist auch denkbar, dass sich zwischen der Oberseite der Probenaufnahme und dem ersten Abschnitt des elastischen Elementes eine oder mehrere Materialschichten oder Materialbahnen (z.B. eine Leiterbahn) befinden.
Beispielsweise ist das elastische Element in Form eines elastischen flächigen Elementes ausgebildet (z.B. aus einem Metall oder einem Kunststoff), wobei ein erster Abschnitt des flächigen Elementes an der Oberseite der Probenaufnahme festgelegt ist und ein anderer Abschnitt des flächigen Elementes, an dem der Temperatursensor angeordnet ist, vor dem Anordnen eines Probengefäßes mit der Aufnahmeöffnung überlappt. Insbesondere ist das flächige Element in Form eines Streifens (z. B. eines Metallstreifens) ausgebildet, dessen eines Ende an der Oberseite der Probenaufnahme festgelegt ist und dessen anderes Ende, an dem der Temperatursensor angeordnet ist, vor dem Anordnen eines Probengefäßes (bzw. eines Einsatzes zur Aufnahme eines Probengefäßes während der Montage der Vorrichtung) in der Aufnahmeöffnung mit der Aufnahmeöffnung überlappt, d. h., das Ende mit dem Temperatursensor befindet sich vor dem Einführen des Probengefäßes (bzw. des Einsatzes) (z. B. mittig) über der Aufnahmeöffnung und wird beim Einführen des Probengefäßes (bzw. des Einsatzes) durch das Probengefäß (bzw. durch den Einsatz) insbesondere durch dessen Boden zur Seite gedrückt, so dass es mit einer Sei- te an einer Seitenwand der Aufnahmeöffnung und der Temperatursensor an einer Außenseite des Probengefäßes (bzw. des Einsatzes) anliegt.
Es wird darauf hingewiesen, dass ein„Streifen" insbesondere eine Form bezeichnet, die eine im Wesentlichen flächige Ausdehnung besitzt, obwohl auch eine gewisse Ausdeh- nung (Dicke) senkrecht zur Fläche vorhanden sein kann, die jedoch deutlich geringer ist als die Flächenausdehnung. Darüber hinaus erstreckt sich ein Streifen insbesondere entlang einer Haupterstreckungsrichtung, in der er seine größte Abmessung (Länge) aufweist, wobei die Länge z.B. größer ist seine Abmessung (Breite) in einer Richtung senkrecht zur Längsrichtung (z. B. 3 bis 10 mal größer). Beispielsweise weist ein Streifen eine im Wesentlichen rechteckige Form auf. Allerdings kann das elastische flächige Element auch eine andere Geometrie aufweisen, z.B. oval ausgestaltet sein.
Das elastische Element kann auch ein Bestandteil des Temperatursensors sein; z.B. realisiert eine Anschlussleitung (oder mehrere Anschlussleitungen), über die der Tempera- tursensor elektrisch kontaktiert ist, das elastische Element. Des Weiteren ist denkbar, dass der Temperatursensor auf einer gedruckten Leiterplatte (z.B. in Form einer flexiblen Leiterplatte, z.B. eine„FlexPCB") angeordnet ist, wobei ein Teilabschnitt der Leiterplatte, auf dem der Temperatursensor angeordnet ist, das elastische Element ausbildet. Möglichkeiten der Verwendung einer Leiterplatte zur Kontaktierung des Temperatursensors sind weiter unten beschrieben. Denkbar ist auch, dass der Temperatursensor (bzw. die mehreren Temperatursensoren) über eine starre Leiterplatte kontaktiert wird, die Leiterplatte jedoch einen flexiblen Bereich aufweist, an dem der Temperatursensor angeordnet ist.
Es ist auch denkbar, dass einer Aufnahmeöffnung mehrere Temperatursensoren zuge- ordnet sind, die z.B. an verschiedenen elastischen Elementen, d.h. an unterschiedlichen Positionen in Bezug zu der Aufnahmeöffnung (und damit an unterschiedlichen Positionen in Bezug zu einem in der Aufnahmeöffnung angeordneten Probengefäß), angeordnet sind. Somit kann die Temperatur an unterschiedlichen Positionen des Probengefäßes bestimmt werden, was z.B. zur Steuerung der Temperaturregelung genutzt werden kann. Beispielsweise sind den Aufnahmeöffnungen jeweils mehrere, räumlich verteilte Peltiere- lemente zugeordnet, die in Abhängigkeit von den mittels der mehreren Temperatursensoren gemessenen Temperaturen gesteuert werden, z.B. um eine möglichst homogene Temperaturverteilung oder ein sonstiges vorbestimmbares räumliches Temperaturprofil zu erzeugen.
In einem zweiten Aspekt betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung der PCR, mit
- einer Probenaufnahme zur Aufnahme von Probengefäßen, wobei die Probenaufnahme eine Mehrzahl von Aufnahmeöffnungen aufweist, in denen jeweils ein Probenge- fäß oder ein Einsatz zur Aufnahme eines Probengefäßes angeordnet werden kann;
- einer Mehrzahl von Peltierelementen, wobei jeder Aufnahmeöffnung mindestens eines der Peltierelemente zugeordnet ist, so dass in den Aufnahmeöffnungen angeordnete Probengefäße oder Einsätze individuell temperiert werden können;
- einer Mehrzahl von Temperatursensoren zum Bestimmen der Temperatur einer in einem Probengefäß vorgelegten Probe, wobei jeder der Aufnahmeöffnungen mindestens einer der Temperatursensoren zugeordnet ist; und
- einer Mehrzahl von Rückstellkrafterzeugungsmitteln, wobei jeder der Aufnahmeöffnungen jeweils mindestens ein Rückstellkrafterzeugungsmittel zugeordnet ist, das mit dem der Aufnahmeöffnung zugeordneten Temperatursensor so zusammenwirkt, dass es den Temperatursensor in thermischem Kontakt mit einem in der Aufnahmeöffnung angeordneten Probengefäß oder mit einem Einsatz zur Aufnahme eines Probengefäßes hält, wobei - zumindest eines der Rückstellkrafterzeugungsmittel in Form eines elastisch ausgeformten Abschnitts einer Seitenwand einer der Aufnahmeöffnungen ausgebildet ist, der den Temperatursensor gegen ein in der Aufnahmeöffnung angeordnetes Probengefäß oder gegen einen in der Aufnahmeöffnung angeordneten Einsatz zur Aufnahme eines Probengefäßes drückt.
Hier ist somit kein separates Rückstellkrafterzeugungsmittel vorhanden, sondern ein Abschnitt der Probenaufnahme in einem zur Aufnahmeöffnung benachbarten Bereich weist selber elastische Eigenschaften auf, um den Temperatursensor gegen das Probengefäß (bzw. den Einsatz) zu drücken. Insbesondere ist der Temperatursensor an dem elastischen Abschnitt festgelegt, z.B. festgeklebt.
Beispielsweise ist der elastische Abschnitt der Seitenwand (d.h. insbesondere eine Wand, die im Wesentlichen parallel zur Längsachse der Aufnahmeöffnung, d.h. zur Ein- führrichtung des Probengefäßes verläuft) in Form eines Vorsprungs ausgeformt, der von der Seitenwand absteht. Es ist auch möglich, dass der elastische Abschnitt als Erhebung ausgeformt ist, die die Aufnahmeöffnung umläuft, so dass die Aufnahmeöffnung im Bereich der umlaufenden Erhebung einen kleineren Durchmesser aufweist als außerhalb der Erhebung. Beispielsweise ist der Durchmesser im Bereich der umlaufenden Erhe- bung etwas kleiner als der maximale Au ßendurchmesser des Probengefäßes (bzw. des Einsatzes).
Als elastisches Material für den elastischen Abschnitt der Seitenwand kommt zum Beispiel ein Kunststoff, ein Gummi oder ein gummiartiges Material infrage. Insbesondere ist es möglich, dass das Material des elastischen Wandabschnitts verschieden ist von dem übrigen Material der Probenaufnahme. So kann beispielsweise ein Gummimaterial oder ein elastischer Kunststoff in einer Ausnehmung der (z.B. sonst einstückig geformten) Probenaufnahme eingesetzt werden, um den elastischen Wandabschnitt zu bilden. Es ist insbesondere auch denkbar, dass eine solche Probenaufnahme mittels eines Zweikom- ponenten-Spritzgussverfahrens erzeugt wird. Es ist natürlich auch möglich, dass der elastische Abschnitt einstückig mit der übrigen Probeaufnahme ausgeformt ist.
Beispielsweise kann sich die Aufnahmeöffnung auch zu einem Bodenbereich bzw. zu einem unteren Rand der Aufnahmeöffnung hin verjüngen, wobei der elastische Abschnitt, an dem der Temperatursensor angeordnet ist, in dem Bodenbereich bzw. im Bereich des unteren Randes (der von einer unteren Seite der Probenaufnahme ausgebildet wird, die z.B. dem zugeordneten Peltierelement zugewandt ist) vorgesehen ist. Somit weist der untere, an den Bodenbereich bzw. an den unteren Rand angrenzende Bereich der Aufnahmeöffnung einen geringeren Durchmesser auf als ein an den oberen Rand der Aufnahmeöffnung angrenzenden Bereich. Somit kann ein Probengefäß (bzw. ein Einsatz zur Aufnahme eines Probengefäßes) durch den größeren oberen Durchmesser der Aufnahmeöffnung auf einfache Weise in die Aufnahmeöffnung eingeführt werden, wobei der Temperatursensor dennoch bei vollständig in die Aufnahmeöffnung eingesetztem Probengefäß (bzw. Einsatz) gegen die Außenseite des Probengefäßes (bzw. des Einsatzes) gedrückt wird.
In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung der PCR, mit
- einer Probenaufnahme zur Aufnahme von Probengefäßen, wobei die Probenaufnahme eine Mehrzahl von Aufnahmeöffnungen aufweist, in denen jeweils ein Probenge- fäß oder ein Einsatz zur Aufnahme eines Probengefäßes angeordnet werden kann;
- einer Mehrzahl von Peltierelementen, wobei jeder Aufnahmeöffnung mindestens eines der Peltierelemente zugeordnet ist, so dass in den Aufnahmeöffnungen angeordnete Probengefäße oder Einsätze individuell temperiert werden können;
- einer Mehrzahl von Temperatursensoren zum Bestimmen der Temperatur einer in einem Probengefäß vorgelegten Probe, wobei jeder der Aufnahmeöffnungen mindestens einer der Temperatursensoren zugeordnet ist;
- einer Mehrzahl von Rückstellkrafterzeugungsmitteln, wobei jeder der Aufnahmeöffnungen jeweils mindestens ein Rückstellkrafterzeugungsmittel zugeordnet ist, das mit dem der Aufnahmeöffnung zugeordneten Temperatursensor so zusammenwirkt, dass es den Temperatursensor in thermischem Kontakt mit einem in der Aufnahmeöffnung angeordneten Probengefäß oder mit einem Einsatz zur Aufnahme eines Probengefäßes hält; und
- einem zu der Probenaufnahme separaten Träger, an dem die Peltierelemente angeordnet sind.
Der Träger ist insbesondere stoffschlüssig und/oder über Befestigungsmittel kraft- oder formschlüssig mit der Probenaufnahme verbunden.
Darüber hinaus kann der Träger als Wärmesenke ausgebildet sein und eine„Kaltseite" der Peltierelemente definieren. Insbesondere ist der Träger aus einem gut wärmeleitenden Material wie z. B. einem Metall (insbesondere Aluminium oder Kupfer ausgebildet). Darüber hinaus kann der Träger (insbesondere an seiner den Peltierelementen abgewandten Seite) Strukturen zur Erhöhung der Wärmeabfuhr aufweisen, z. B. Rippen oder sonstige Strukturen, die die Oberfläche des Trägers vergrößern. Es ist auch möglich, dass der Träger (insbesondere über seine den Peltierelementen abgewandte Unterseite) ein Heatpipe (Wärmeabführrohr) ausbildet oder mit einem Heatpipe verbunden ist, insbesondere, um eine homogenere Wärmeverteilung in der Unterseite zu erzeugen.
Gemäß einer anderen Ausgestaltung der Erfindung (gemäß dem ersten, zweiten und/oder dritten Aspekt) ist die Probenaufnahme einstückig ausgeformt, wobei die Aufnahmeöffnungen insbesondere rasterförmig angeordnet sind. Die Aufnahmeöffnungen (zumindest einige der Aufnahmeöffnungen) sind etwa in Form eines Durchgangslochs ausgebildet oder in Form eines Sacklochs, das sich von einer Seite der Probenaufnahme in das Material der Probenaufnahme hinein erstreckt, jedoch eine Tiefe aufweist, die geringer ist als die Dicke der Probenaufnahme.
Die Abmessungen der Aufnahmeöffnungen sind insbesondere auf die aufzunehmenden Probengefäße abgestellt, wobei die Aufnahmeöffnungen insbesondere einen zumindest näherungsweise kreisförmigen Querschnitt aufweisen. Selbstverständlich können zumindest einige der Aufnahmeöffnungen auch anders ausgestaltet sein, z.B. mit einem recheckigen oder einem sonstigen Querschnitt. Bei den in die Aufnahmeöffnungen einzusetzenden Probengefäßen, in denen die PCR-Ausgangsmaterialen eingefüllt werden, han- delt es sich z.B. um Kunststoffgefäße, insbesondere um sogenannte„Eppendorf-Tubes".
Beispielsweise können auch mehrere miteinander verbundene Probengefäße verwendet werden, z.B. in Form marktüblicher Mikrotiterplatten. Es ist jedoch auch denkbar, dass andere Arten von Probengefäßen verwendet werden, zum Beispiel Probengefäße, die im Wesentlichen hohlzylindrisch und/oder (z.B. einstückig) aus einem gut wärmeleitenden Material (insbesondere einem Metall, wie z.B. Aluminium) ausgebildet sind, um einen möglichst guten Wärmekontakt der in dem Probengefäß vorhandenen Probe mit dem jeweiligen Temperatursensor und dem jeweiligen Pel- tierelement herzustellen.
Gemäß einer Erfindungsvariante werden in den Aufnahmeöffnungen jeweils Einsätze (insbesondere dauerhaft) angeordnet, in die jeweils ein Probengefäß eingesetzt werden kann. Die Probengefäße (Reaktionsgefäße) werden also nicht unmittelbar in die Aufnah- meöffnungen der Probenaufnahme eingesetzt, sondern in die Einsätze, die sich in den Aufnahmeöffnungen befinden. Insbesondere sind die in den Aufnahmeöffnungen anzuordnenden Einsätze aus einem thermisch gut leitenden Material (insbesondere einem Metall wie etwa Aluminium) ausgebildet und so beschaffen, dass sie von den Peltierelementen erzeugte Wärme vertei- len, um jeweils ein möglichst gleichmäßiges Temperieren einer in einem Probengefäß, das in dem Einsatz angeordnet ist, vorgelegten Probe zu ermöglichen.
Die jeweiligen Rückstellkrafterzeugungsmittel dienen gemäß dieser Erfindungsvariante in erster Linie dazu, eine möglichst einfache Montage der Einsätze in den Aufnahmeöffnun- gen zu ermöglichen und dennoch einen möglichst guten thermischen Kontakt zwischen den Temperatursensoren und Einsätzen zu realisieren.
Darüber hinaus kann die Probenaufnahme aus einem thermisch gut isolierenden Material (insbesondere einem Kunststoff) ausgebildet sein, wodurch ein „Übersprechen" beim Temperieren benachbarter Proben möglichst vermieden wird, so dass das Temperieren der Proben (die jeweils in einem Probengefäß vorgelegt werden, das in einer der Aufnahmeöffnungen der Probenaufnahme angeordnet ist) mittels der Peltierelemente und das Ermitteln der aktuellen Temperatur der Proben mittels der Temperatursensoren im Wesentlichen unabhängig von der Temperatur der anderen, insbesondere jeweils be- nachbarten Proben erfolgen kann. Hierdurch kann die Temperatur der einzelnen Proben individuell und sehr genau geregelt werden. Den unterschiedlichen (an der gemeinsamen Probenaufnahme angeordneten) Proben können daher unterschiedliche PCR- Temperaturprofile (Temperaturzyklen) vorgegeben werden, die jeweils über die den Proben individuell zugeordneten Peltierelemente und die Rückkopplung über die ebenfalls den einzelnen Proben individuell zugeordneten Temperatursensoren exakt erzeugt werden können.
Somit können selbst bei Verwendung von Probengefäßen in Form einer konventionellen Mikrotiterplatte verschiedene Probengefäße (d.h. verschiedene„wells") der Mikrotiterplat- te mit unterschiedlichen Heizraten und Temperaturprofilen auch für komplexe Analysen bearbeitet werden. Insbesondere können viele unterschiedliche Proben (z.B. unter Verwendung einer Mikrotiterplatte im Standardformat„96er" oder„384er") individuell in einem Analysedurchgang identifiziert werden. Es wird darauf hingewiesen, dass die Probenaufnahme nicht unbedingt einstückig aus einem thermisch isolierenden Material ausgeformt sein muss. Es sind als Probenauf- nähme im Prinzip beliebige Konstruktionen denkbar, die eine Mehrzahl von Aufnahmeöffnungen aufweisen, wobei die Bereiche der Aufnahmeöffnungen insbesondere thermisch gegeneinander isoliert sind. Beispielsweise könnte als Probenaufnahme auch eine Struktur aus einem Draht verwendet werden, die die Aufnahmeöffnungen aufweist und die zumindest abschnittsweise mit einem thermisch isolierenden Material versehen ist (das z.B. den Draht umgibt).
Als Temperatursensoren kommen insbesondere Widerstandselemente, Thermoelemente und/oder Halbleiter-Sensoren infrage, obwohl die Erfindung natürlich nicht auf einen be- stimmten Temperatursensortyp festgelegt ist.
Die zur Temperierung (d.h. insbesondere zum Erwärmen, aber ggf. auch zum Abkühlen) in den Probengefäßen angeordneter DNA-Proben vorgesehenen Peltierelemente sind insbesondere in Form mikrotechnologisch hergestellter Peltierelemente ausgebildet, d.h. in Form von Peltierelementen, die jeweils Abmessungen (insbesondere Dicken) im Millimeter- oder Mikrometerbereich besitzen. Ein derartiges Peltierelement ist z. B. in der deutschen Patenanmeldung DE 198 45 104.0 beschrieben, auf die insofern ausdrücklich Bezug genommen wird. Die Peltierelemente sind insbesondere so angeordnet, dass sie jeweils unmittelbar mit einer Außenseite einer Seitenwand oder eines Bodens eines in eine Aufnahmeöffnung eingesetzten Probengefäßes in mechanischen und damit thermischen Kontakt kommen. Beispielsweise ragen die Peltierelemente (d.h. zumindest einige der Peltierelemente) jeweils in einen unteren Bereich einer der Aufnahmeöffnungen hinein. Der„untere Be- reich" einer Aufnahmeöffnung mündet in eine untere Seite der Probenaufnahme, die einer oberen Seite der Aufnahmeöffnung abgewandt ist, wobei in die„obere Seite" (Substratoberfläche) ein oberer Bereich der Aufnahmeöffnung mündet, über den das Probengefäß in die Aufnahmeöffnung eingeführt wird. Es ist auch möglich, wenn die Aufnahmeöffnung in Form eines Sacklochs ausgebildet ist, dass das zugeordnete Peltierelement an einer Innenseite des Bodens der Aufnahmeöffnung angeordnet ist, so dass der Boden des Probengefäßes auf dem Peltierelement aufliegt, wenn das Probengefäß vollständig in die Aufnahmeöffnung eingesetzt ist. Es ist allerdings auch denkbar, dass das Peltierelement nicht in einem Bodenbereich des Pro- bengefäßes angeordnet ist, sondern so, dass es mit einer Seitenwand des Probengefäßes in Kontakt kommt. Eine Anordnung des Peltierelementes seitlich zu dem Probenge- faß bzw. dem Einsatz (d.h. insbesondere zwischen einer Seitenwand der Probenaufnahme und einer Au ßenseite des Probengefäßes bzw. des Einsatzes) ermöglicht insbesondere die Durchführung einer optischen Messung (insbesondere der Durchlicht-PCR) der in dem Probengefäß befindlichen Probe durch den Boden des Probengefäßes hindurch.
Natürlich ist auch denkbar, dass jeweils einer Aufnahmeöffnung mehrere Peltierelemente zugeordnet sind, von denen z.B. ein erstes am Bodenbereich und ein zweites an einer Seitenwand eines in die Aufnahmeöffnung eingesetzten Probengefäßes anliegt. Bei Verwendung von Einsätzen zur Aufnahme von Probengefäßen sind die Peltierelemente insbesondere so angeordnet, dass sie jeweils mit ihrer Warmseite an dem Einsatz anliegen. Beispielsweise sind die Einsätze jeweils becherartig ausgebildet, wobei die Peltierelemente insbesondere so angeordnet sind, dass sie jeweils an einer Au ßenseite eines Bodenabschnitts und/oder seitlich an einer Seitenwand des Einsatzes anliegen.
Es ist auch denkbar, dass zwischen den Einsätzen und den Peltierelementen jeweils ein Ausgleichsmaterial, etwa ein TIM (Thermal Interface Material - thermisches Grenzflächenmaterial), vorhanden ist, z.B. Graphit, Indium und/oder Silikon. Es ist zusätzlich oder alternativ auch möglich, dass die Peltierelemente jeweils mit den Einsätzen über einen Kleber verbunden sind.
Darüber hinaus können die Einsätze auch über einen Rastmechanismus in den Aufnahmeöffnungen der Probenaufnahme verrastet sein. Beispielsweise weisen die Einsätze hierzu Raststrukturen (z.B. Haken oder Nuten) auf, die jeweils in korrespondierende Raststrukturen der Aufnahmeöffnungen, die z.B. an Seitenwänden der Aufnahmeöffnungen ausgebildet sind, eingreifen.
Gemäß einer anderen Weiterbildung dieser Erfindungsvariante (d.h. die Verwendung von „Einsätzen") sind zudem Mittel vorgesehen, die die Einsätze gegen die Peltierelemente drücken. Beispielsweise weisen diese Mittel einen Aufsatz (z.B. in Form einer Platte) auf, der auf die Probenaufnahme aufgelegt wird und der so ausgebildet ist, dass er die Einsätze gegen die Peltierelemente drückt. Beispielsweise drückt der Aufsatz jeweils derart gegen einen Rand (z.B. in Form einer Auskragung) eines becherförmigen Einsatzes, dass ein Bodenbereich des Einsatzes gegen das Peltierelement gedrückt wird. Insbe- sondere kann hier zwischen dem Einsatz (insbesondere dessen Bodenbereich) und dem Peltierelement ein elastisches Material (z.B. in Form eines elastischen TIM) vorgesehen sein.
Gemäß insbesondere dem ersten und dem zweiten Aspekt der Erfindung sind zumindest einige der Temperatursensoren jeweils zwischen einer Seitenwand der Aufnahmeöffnung und einem in der Aufnahmeöffnung angeordneten Probengefäß (bzw. einem Einsatz zur Aufnahme eines Probengefäßes) positioniert, so dass jeweils insbesondere ein temperatursensibler Bereich der Temperatursensoren an der Außenwand des Probengefäßes (bzw. des Einsatzes) anliegt. Beispielsweise erstreckt sich der Temperatursensor zumin- dest näherungsweise parallel zu einer Seitenwand (die unter einem Winkel, insbesondere senkrecht, zu der Substratoberfläche verläuft) der Aufnahmeöffnung und/oder der Außenwand des in die Aufnahmeöffnung eingesetzten Probengefäßes (bzw. des Einsatzes). Es ist natürlich auch denkbar, dass der Temperatursensor zwischen einem Bodenbereich der Aufnahmeöffnung und einem Boden des Probengefäßes (bzw. des Einsat- zes) verläuft, oder dass mehrere Temperatursensoren vorhanden sind, von denen z.B. eines an einer Seitenwand und ein anderes an einem Boden des Probengefäßes (bzw. des Einsatzes) anliegt.
Der Temperatursensor wird mittels des Rückstellkrafterzeugungsmittels gegen das Pro- bengefäß (bzw. des Einsatzes) vorgespannt, so dass der temperatursensitive Bereich des Temperatursensors in direktem mechanischen Kontakt mit der Au ßenseite des Probengefäßes (bzw. des Einsatzes) steht, um die Temperatur des in dem Probengefäß befindlichen Materials möglichst genau ermitteln zu können. Insbesondere ist der Temperatursensor an dem elastischen Element (z.B. stoffschlüssig) festgelegt. Es ist auch denk- bar, dass ein zusätzlicher Temperatursensor an einem Boden des Probengefäßes (bzw. des Einsatzes) anliegt.
Bei Verwendung von Einsätzen zur Aufnahme von Probengefäßen ist es auch möglich, dass die Temperatursensoren jeweils mit einer Au ßenseite der Einsätze über einen (ins- besondere gut wärmeleitenden) Kleber verbunden sind, um eine besonders stabile, dauerhafte Verbindung zwischen den Temperatursensoren und den (insbesondere metallenen) Einsätzen herzustellen und z.B. auch um etwaige Unebenheiten des Einsatzes auszugleichen. Beispielsweise ist das elastische Element in Form einer Feder (etwa einer Schraubenfeder) ausgebildet, die insbesondere mit einem Ende an einem Abschnitt der Probenauf- nähme, der an die Aufnahmeöffnung angrenzt, anliegt (z.B. dort festgelegt ist) und deren anderes Ende mit dem Temperatursensor gekoppelt ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der Erfindung sind die Temperatursensoren mit einer an einer Oberseite der Probenaufnahme angeordneten Leiterbahn, z.B. in Form einer gedruckten Leiterplatte (Printed Circuit Board - PCB), elektrisch verbunden sind. Die Leitplatte könnte gleichzeitig auch dazu dienen, die Einsätze zur Aufnahme eines Probengefäßes gegen die jeweiligen Peltierelemente zu drücken. Die Peltierelemente sind beispielsweise ebenfalls mit einer Leiterbahn elektrisch verbunden, wobei die Leiterbahn insbesondere auf einer der Probenaufnahme zugewandten Seite des Trägers angeordnet ist, insbesondere ist die Leiterbahn zur Kontaktierung der Peltierelement in Form eines Printed Circuit Boards ausgestaltet. Die Erfindung umfasst auch ein Verfahren zum Herstellen einer Vorrichtung zur Durchführung der PCR, mit den Schritten:
- Bereitstellen einer Probenaufnahme, die eine Mehrzahl von Aufnahmeöffnungen aufweist;
- Bereitstellen mindestens eines Temperatursensors sowie mindestens eines Rückstell- krafterzeugungsmittels in Form eines elastischen Elementes, an dem der Temperatursensor angeordnet ist;
- Anordnen des elastischen Elementes an der Probenaufnahme derart, dass es über einen Rand einer der Aufnahmeöffnungen hinausragt oder in eine der Aufnahmeöffnungen hineinragt;
- Anordnen eines Einsatzes zur Aufnahme von Probengefäßen in der Aufnahmeöffnung, so dass das elastische Element abgebogen und der Temperatursensor gegen den Einsatz vorgespannt wird.
Gemäß einer Variante dieses Verfahrens wird das elastische Element und/oder der Tem- peratursensor mit dem Einsatz stoffschlüssig verbunden. Beispielsweise werden das elastische Element, der Temperatursensor und/oder der Einsatz vor dem Anordnen des Einsatzes in der Aufnahmeöffnung mit einem Klebstoff versehen, um nach der Montage einen dauerhaft guten thermischen Kontakt sicherzustellen. Die Erfindung betrifft entsprechend auch eine Vorrichtung, die zunächst wie die oben beschriebene Vorrichtung gemäß dem ersten Erfindungsaspekt ausgebildet wurde und in die dann nach dem oben angegebenen Verfahren mindestens ein Einsatz eingesetzt wurde, so dass das elastische Element mit einem Abschnitt abgebogen zwischen einer Seitenwand der Aufnahmeöffnung und einer Seitenwand des Einsatzes verläuft, wobei z.B. der Temperatursensor stoffschlüssig mit der Seitenwand des Einsatzes verbunden werden kann.
Die Erfindung betrifft des Weiteren ein PCR-Verfahren, insbesondere unter Verwendung einer wie oben beschriebenen Vorrichtung, wobei das Verfahren die Schritte aufweist:
- Anordnen mindestens einer ersten und einer zweiten DNA-Probe in einer gemeinsamen Probenaufnahme;
- zyklisches Temperieren der ersten DNA-Probe gemäß einem ersten Temperaturprofil sowie zyklisches Temperieren der zweiten DNA-Probe gemäß einem zweiten Temperaturprofil, wobei
- das erste Temperaturprofil gemäß einer ersten Anzahl von Zyklen und das zweite Temperaturprofil gemäß einer zweiten Anzahl von Zyklen, die verschieden ist von der ersten Anzahl von Zyklen, wiederholt durchlaufen wird.
Insbesondere weist die Probenaufnahme zur Durchführung des Verfahrens, wie z.B. oben beschrieben, Peltierelemente und Temperatursensoren auf, die jeweils einer Aufnahmeöffnung, in die jeweils ein Probengefäß mit der DNA-Probe eingesetzt wird, der Probenaufnahme zugeordnet sind. Beispielsweise wird zur Durchführung des Verfahrens eine wie oben beschriebene Vorrichtung verwendet. Somit ist es möglich, die erste und die zweite DNA-Probe individuell, d.h. insbesondere gemäß unterschiedlicher Temperaturprofile, zu temperieren. Selbstverständlich kann das Verfahren mit mehr als zwei DNA- Proben durchgeführt werden, wobei sich die Proben z.B. in der Art des DNA-Materials und/oder der Menge des DNA-Materials unterscheiden.
Darüber hinaus ist es möglich, die erste und die zweite DNA-Probe mit unterschiedlichen Temperaturprofilen zu temperieren, so dass eine PCR mit unterschiedlichen Proben, die z.B. unterschiedliche Primer-DNA-Material-Kombinationen aufweisen, gleichzeitig durch- geführt werden kann, obwohl die die Proben in derselben Probenaufnahme angeordnet sind.
Insbesondere ermöglicht die Erfindung, dass die Zahl der Temperaturzyklen in Abhängigkeit von der Menge des DNA-Materials durchgeführt wird, so dass z.B. nicht die Probe mit der geringsten Menge an DNA-Material die Gesamtzyklenzahl für sämtliche Proben bestimmt, sondern die Zyklenzahl individuell für jede Probe gewählt werden kann. Hier- durch lässt sich die Dauer der PCR insbesondere für Proben, die eine größere Menge DNA-Material aufweisen, reduzieren. Insbesondere können auch unterschiedliche auf der PCR basierende Diagnostiktests (z.B. HIV, HCV, etc.), die unterschiedliche Zyklenanzahlen und Temperaturprofile erfordern, gemeinsam, d. h. in ein und derselben Probenauf- nähme, durchgeführt werden.
In einer Weiterbildung des erfindungsgemäßen Verfahrens werden die erste und/oder die zweite DNA-Probe mit einem Farbstoff markiert und während des Durchführens der PCR jeweils das Zeitverhalten der Fluoreszenz des Farbstoffs als Maß für die Menge des durch die PCR erzeugten Materials bestimmt. Insbesondere wird die erste und/oder die zweite Anzahl von Zyklen in Abhängigkeit davon gewählt, ob ein vorgebbarer Grenzwert der Fluoreszenzintensität erreicht ist. Somit kann anhand des Fluoreszenzsignals die PCR z. B. bei nur einer der beiden Proben beendet werden, wenn aus dem Fluoreszenzsignal hervorgeht, dass eine ausreichende Menge vervielfältigen DNA-Materials vorliegt.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung auch ein PCR-Verfahren mit den Schritten:
- Anordnen mindestens einer ersten und einer zweiten DNA-Probe in einer gemeinsamen Probenaufnahme, wobei jeder DNA-Probe ein Temperatursensor zugeordnet ist; - zyklisches Temperieren der ersten DNA-Probe gemäß einem ersten Temperaturprofil sowie zyklisches Temperieren der zweiten DNA-Probe gemäß einem zweiten Temperaturprofil;
- im Anschluss an das zyklische Temperieren Erhöhen der Temperatur der ersten DNA- Probe gemäß einer ersten Temperaturrampe und gleichzeitig Erhöhen der Temperatur der zweiten DNA-Probe gemäß einer zweiten Temperaturrampe (die verschieden von der ersten Temperaturrampe sein kann), um den Schmelzpunkt der ersten und der zweiten DNA-Probe zu bestimmen.
Insbesondere können die erste und die zweite DNA-Probe mit verschiedenen Farbstoffen (z.B. „SYBR green" oder Ethidiumbromid) markiert sein, wobei zur Bestimmung des Schmelzpunktes der jeweiligen DNA-Probe jeweils die Änderung der Fluoreszenzintensität des entsprechenden Farbstoffs mit der Temperatur in Abhängigkeit von der Temperatur ermittelt wird, d.h. es wird die Ableitung d(RFU)/dT eines normierten Fluoreszenzsignals RFU nach der Temperatur T ermittelt. Charakteristisch für das Erreichen des Schmelzpunktes ist, dass die Änderung des Fluoreszenzsignals mit der Temperatur, d. h. die Ableitung des Fluoreszenzsignals nach der Temperatur, ein Maximum erreicht. Insofern können unterschiedliche Schmelzkurven parallel analysiert werden. Insbesondere ist es mit der Schmelzpunktbestimmung möglich, Einzelnukleotid- Polymorphismen (englisch„Single Nucleotide Polymorphism" - SNP) des vervielfältigen DNA-Materials zu identifizieren oder Genotyping-Experimente durchzuführen. Darüber hinaus ermöglicht die Bestimmung des Schmelzpunktes auch das Erkennen von „Mispriming" oder „Primer-Dimer"-Artefakten. Beispielsweise führt ein Primer-Dimer- Artefakt, der auf das ungewollte Vervielfältigen von Primerverbindungen zurückgeht, zu einem niedrigeren Schmelzpunkt im Vergleich zum Schmelzpunkt der zu vervielfältigenden DNA-Sequenz.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren, das insbesondere unter Verwendung einer wie oben beschriebenen Vorrichtung durchgeführt wird, ist es z.B. möglich, auf die Proben unterschiedliche Temperaturrampen anzuwenden, die sich z.B. hinsichtlich der Start- und/oder der Endtemperatur und/oder des Zeitverlaufs unterscheiden. Beispielsweise werden die Temperaturrampen im Hinblick auf unterschiedliche Allele einer DNA- Sequenz, die unterschiedliche Schmelztemperaturen aufweisen, ausgewählt.
Beispielsweise weisen die folgenden ß-Globin-Allele unterschiedliche Schmelzpunkte T, auf, an die die jeweils anzuwendende Temperaturrampe angepasst werden könnte:
Locus Allele Pairing T m (°C)
Hb C/Hb S Wild type T-T mismatch 55,6
Hb C G-T & T-T mismatch 50,1
Hb S T-A matsch 62,7
Die Erfindung wird im Folgenden anhand von Ausführungsbeispielen unter Bezugnahme auf die Figuren näher erläutert. Es zeigen: Fig.l A eine Vorrichtung zur Durchführung der PCR gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung;
Fig. 1 B eine Vorrichtung zur Durchführung der PCR gemäß einem Ausführungsbeispiel der Erfindung;
Fig. 2A - 2C Beispiele zum Betreiben einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;
Fig. 3 ein Beispiel eines Fluoreszenzsignals einer mit einem Farbstoff markierten
DNA-Probe in Abhängigkeit von der Zyklenanzahl; und Fig. 4 die Änderung eines Fluoreszenzsignals einer mit einem Farbstoff markierten DNA-Probe in Abhängigkeit von der Temperatur der DNA-Probe. In Figur 1 A ist eine erfindungsgemäße Vorrichtung 1 zur Durchführung der PCR während ihrer Montage dargestellt. Die Vorrichtung 1 weist eine Probenaufnahme 2 zur Aufnahme von Probengefäßen (nicht dargestellt) auf. Die in der Probenaufnahme 2 anzuordnenden Probengefäße sind insbesondere Kunststoff-Reaktionsgefäße, in denen insbesondere mindestens eine DNA-Probe angeordnet ist, die mittels der PCR vervielfältigt werden soll.
In die Probenaufnahme 2, die zum Beispiel aus einem einstückigen Materialstück aus einem thermisch isolierenden Material besteht, ist eine Mehrzahl von Aufnahmeöffnungen 21 in Form von Durchgangsöffnungen eingebracht. Die Aufnahmeöffnungen 21 sind zum Beispiel in einem Raster (z.B. gemäß den Figuren 2A bis 2C gezeigt) angeordnet und weisen jeweils einen kreisförmigen Querschnitt auf. In die Aufnahmeöffnungen werden jeweils becherartige Einsätze 3 eingefügt, die jeweils zur Aufnahme eines PCR- Probengefäßes dienen. Insbesondere ist der Innendurchmesser der Einsätze 3 an den Außendurchmesser der PCR-Probengefäße angepasst. Den Aufnahmeöffnungen 21 ist jeweils ein Temperatursensor 4 zugeordnet, der zum Bestimmen der Temperatur der in dem in den jeweiligen Einsatz 3 eingesetzten Probengefäß vorhandenen Probe dient.
Des Weiteren weist die Vorrichtung eine Mehrzahl von Peltierelementen 5 auf, wobei jeweils eines der Peltierelemente 5 einer der Aufnahmeöffnungen 21 zugeordnet ist. Die Peltierelemente dienen zur Temperierung der Probengefäße, d.h. der in den Probengefäßen jeweils angeordneten Probe. Insbesondere umfasst die Vorrichtung 1 auch eine Steuerung, über die die Peltierelemente in Abhängigkeit von einem Signal des zugehörigen Temperatursensors gesteuert werden.
Des Weiteren umfasst die Vorrichtung 1 eine Mehrzahl von Rückstellkrafterzeugungsmit- teln, die jeweils in Form eines elastischen Materialstreifens 6 (der zum Beispiel aus einem Metall gebildet ist) gestaltet sind. Der Materialstreifen 6 ist mit einem ersten Ende 61 an einer Oberseite der Probenaufnahme 2 festgelegt, wobei die„Oberseite" durch eine Seite der Probenaufnahme 2 ausgebildet wird, die den Peltierelementen 5 abgewandt ist. Das andere Ende 62 der Materialstreifen 6 ragt hingegen über einen oberen Rand 21 1 der Aufnahmeöffnung 21 , der in der Oberseite 22 der Probenaufnahme 2 ausgebildet ist, hinaus, so dass das Ende 62 und der an diesem Ende 62 angeordnete Temperatursensor 4 mit der Aufnahmeöffnung 21 überlappen, d.h. der Temperatursensor 4 fluchtet mit der Aufnahmeöffnung 21 . Insbesondere befindet sich das Ende 62 so über der Aufnahmeöffnung 21 , dass ein Einsatz 3, der während der Montage der erfindungsgemäßen Vorrichtung in einer der Aufnahmeöffnung 21 eingesetzt wird, gegen das Ende 62 drückt, so dass es von dem übrigen Materialstreifen 6 abgebogen wird und bei vollständig eingesetztem Einsatz 3 parallel zu einer Seitenwand 212 der Aufnahmeöffnung 21 verläuft, wie dies in Fig.1 für den rechten der beiden dargestellten Einsätze 3 gezeigt ist. Der in die linke der beiden dargestellten Aufnahmeöffnungen 21 einzufügende Einsatz ist noch nicht montiert, so dass der der linken der beiden Aufnahmeöffnungen zugeordnete Materialstreifen 6 gerade über den Rand der linken Aufnahmeöffnungen 21 hinausragt. Der auf dies Weise gebogene Materialstreifen 6 spannt somit den Temperatursensor 4 gegen den Einsatz 3 vor, so dass ein temperaturempfindlicher Bereich des Temperatursensors 4 an einer Außenseite einer Seitenwand 32 des Einsatzes 3, die sich vorliegend parallel zur Seitenwand 212 der Aufnahmeöffnung 21 erstreckt, anliegt. Durch die Vorspannung des Temperatursensors 4 über den biegbaren Materialstreifen 6 wird ein dau- erhafter guter thermischer Kontakt zwischen dem Temperatursensor 4 und dem Probengefäß 3 und damit zu dem in dem Einsatz 3 angeordneten Probengefäß hergestellt. Zusätzlich kann ein Klebstoff verwendet werden, um die Temperatursensoren dauerhaft mit den Einsätzen 3 zu verbinden. Es wird darauf hingewiesen, dass die Erfindung auch eine Vorrichtung abdeckt, die keine Einsätze 3 aufweist, sondern die PCR-Probengefäße unmittelbar in die Aufnahmeöffnungen 21 eingesetzt werden können. Gemäß dieser Erfindungsvariante werden die Materialstreifen 6 jeweils beim Einsetzen der Probengefäße in die Aufnahmeöffnungen abgebogen, so dass die Temperatursensoren jeweils gegen eine Außenwand des Probenge- fäßes gedrückt werden.
Die Peltierelemente 5 sind auf einer der Probenaufnahme 2 zugewandten Seite eines als Wärmesenke 7 ausgebildeten Trägers angeordnet, wobei jeweils ein Peltierelement 5 einer der Aufnahmeöffnungen 21 zugeordnet ist. Die Probenaufnahme 2 und die Wärme- senke 7 sind separat ausgebildete Teile (wie in Fig. 1 dargestellt), die jedoch miteinander verbunden werden, zum Beispiel verklebt oder kraft- oder formschlüssig (z.B. ver- schraubt) gekoppelt werden. Nach dem Verbinden der Probenaufnahme 2 mit der Wärmesenke 7 ragen die Peltierelemente 5 jeweils von unten, d.h. durch einen Bereich der Aufnahmeöffnung 21 , der durch einen in einer Unterseite 214 der Probenaufnahme 2 gebildeten unteren Rand 213 begrenzt wird, zumindest abschnittsweise in die Aufnah- meöffnung 21 hinein, so dass ein vollständig in ein Aufnahmeöffnung 21 eingefügter Einsatz 3 über seinen Bodenabschnitt 31 in thermischem Kontakt zu dem Peltierelement 5 steht, d.h. insbesondere mit dem Bodenabschnitt 31 an der Warmseite des Peltierele- mentes 5 anliegt. Darüber hinaus können die Einsätze 3 auch Rastelemente (nicht dargestellt) aufweisen, über die sie mit den Aufnahmeöffnungen 21 so verrasten, dass sie in Kontakt mit den Peltierelementen gehalten werden. Des Weiteren kann zur Herstellung einer möglichst stabilen thermischen Ankopplung der Einsätze 3 mit den jeweiligen Peltierelementen 5 ein TIM und/oder ein Klebstoff zwischen den Einsätzen 3 und den Peltierelementen 5 angeordnet sein.
Insbesondere wird vor dem Anordnen der Einsätze 3 auf der Wärmesenke 7 und/oder auf dem jeweiligen Peltierelement ein Ausgleichsmaterial in Form eines TIM angeordnet, das als Füllmaterial dient, um Höhenunterschiede insbesondere zwischen den Peltierelemen- ten und der Oberseite der Wärmesenke 7 auszugleichen. Als TIM kommt hier insbesondere ein elastisches Material in Frage; z.B. ein Silikon basiertes Material, das eine vergleichsweise hohe Elastizität bei akzeptabler Wärmeleitfähigkeit aufweist. Nach dem Einsetzen der Einsätze 3 in die Aufnahmeöffnungen 21 wird das (insbesondere knetartige) TIM verformt und haftet an einem Bodenbereich der Einsätze einerseits und an der Wär- mesenke 7 und/oder den Peltierelementen andererseits.
Die Peltierelemente 5 sind über eine gedruckte Leiterplatte 8, die auf einer Oberseite 71 , der Wärmesenke 7 angeordnet ist, elektrisch kontaktiert. Ähnlich ist auf der Oberseite 22 der Probenaufnahme 2 eine gedruckte Leiterplatte 80 vorgesehen, über die die Tempera- tursensoren 4 elektrisch kontaktiert sind.
Es wird darauf hingewiesen, dass die Anordnung der Peltierelemente in einem unteren Bereich der Aufnahmeöffnungen nicht zwingend ist, sondern zumindest einige der Peltierelement auch an einer Seitenwand der Aufnahmeöffnungen angeordnet werden können, so dass sie jeweils über eine Seitenwand und nicht über einen Boden der Probengefäße in thermischem Kontakt mit der Probe stehen. Dies ermöglicht, wie oben bereits erwähnt, z.B. eine Durchlicht-PCR und insbesondere die Messung der Fluoreszenz eines Markierfarbstoffs durch den Boden des Probengefäßes hindurch.
Gemäß dem Ausführungsbeispiel der Figur 1 B (die die erfindungsgemäße Vorrichtung in fertig montiertem Zustand zeigt) sind die Peltierelemente 5 nicht so an der Wärmesenke 7 angeordnet, dass sie jeweils mit einem Bodenbereich der Einsätze 3 in Kontakt kommen, sondern mit der Außenseite einer Seitenwand 32 der Einsätze 3.
Die insbesondere einstückig aus einem thermisch isolierendem Material ausgeformte Probenaufnahme 2 weist im Bereich ihrer Aufnahmeöffnungen 21 einen zumindest näherungsweise L-förmigen Querschnitt auf, so dass sie jeweils einen Bodenabschnitt 21 1 1 und eine senkrecht zum Bodenabschnitt 21 1 1 verlaufende Seitenwand 21 12 aufweisen. An den Seitenwänden 21 12 ist jeweils ein Rückstellkrafterzeugungsmittel in Form eines elastischen Materialstreifens 6 angeordnet, wobei der Materialstreifen 6 jeweils mit einem Ende an der Seitenwand 21 12 der Probenaufnahme festgelegt ist und das andere („freie") Ende des Materialstreifens 6 vor Anordnung der Einsätze 3 von der Seitenwand absteht und in die Aufnahmeöffnung 21 hineinragt. Analog zu Figur 1 A wird der Materialstreifen 6 jeweils beim Einfügen der Einsätze 3 in die Aufnahmeöffnungen 21 in Richtung auf die Seitenwand 21 12 abgebogen, so dass das Ende mit dem Temperatursensor auf- grund der Federeigenschaften des Materialstreifen 6 gegen die Seitenwand 32 der Einsätze 3 drückt.
Gleichzeitig können die Materialstreifen 6 aufgrund ihrer Federwirkung die Einsätze 3 gegen die auf einer gegenüberliegenden Seite der Einsätze 3 angeordneten Peltierele- mente 5 drücken, so dass sowohl die Temperatursensoren 4 als auch die Peltierelemente 5 in thermischem Kontakt mit der Seitenwand 32 der Einsätze 3 gehalten werden.
Die Peltierelemente 5 sind mit ihrer Kaltseite an Trennwänden 72, die insbesondere einstückig mit der Wärmesenke 7 verbunden sind, angeordnet, wobei die Trennwände 72 senkrecht in Bezug auf die den Einsätzen 3 zugewandte Oberseite 71 der Wärmesenke 7 verlaufen. Die Probenaufnahme 2 weist Aussparungen 25 auf, durch die sich Trennwände 72 hindurch erstrecken.
Die seitliche Anordnung der Peltierelement 5 ermöglicht insbesondere die Durchführung der Durchlicht-PCR, wobei hierfür insbesondere Aussparungen im Bodenbereich 31 der Einsätze 3, im Bodenbereich 21 1 1 der Probenaufnahme 2 sowie entsprechende Aussparungen in der Wärmesenke 7 ausgebildet werden.
Die Figuren 2A - 2C zeigen eine erfindungsgemäße Vorrichtung (beispielsweise gemäß Figur 1 A oder Figur 1 B) von oben, wobei eine Mehrzahl von Aufnahmeöffnungen 21 in einem Raster angeordnet ist. Die jeder Aufnahmeöffnung 21 zugeordneten Temperatursensoren (nicht dargestellt) und Peltierelemente (nicht dargestellt) erlauben insbesondere das Durchführen einer individuellen PCR für jede der in den Aufnahmeöffnungen 21 angeordneten Proben. Beispielsweise ist es, wie in Fig. 2A dargestellt, möglich, dass un- terschiedliche Proben eine unterschiedliche Anzahl von Temperaturzyklen durchlaufen.
Des Weiteren ist denkbar, dass unterschiedliche Proben unterschiedlich temperiert werden, d.h. jeweils unterschiedliche Temperaturprofile durchlaufen (Figur 2B). Auch ist natürlich möglich, dass einige der Probenaufnahmen (in Figur 2C hell dargestellt) inaktiv sind, d.h. die zugehörigen Temperatursensoren und Peltierelemente abgeschaltet sind.
Beispielsweise ist es zudem auch möglich, per individueller Real-time-PCR die Menge des jeweils in den einzelnen Probengefäßen erzeugten DNA-Materials während der PCR zu überwachen. Hierzu werden die Ausgangsproben mit einem Farbstoff markiert und das Fluoreszenzsignal der einzelnen Proben individuell über die Zeit detektiert. Insbesondere ist die jeweilige Fluoreszenzintensität proportional zu der jeweils vorliegenden Menge des DNA-Materials. Figur 3 zeigt ein Beispiel derartiger Fluoreszenzkurven für unterschiedliche DNA-Proben in Abhängigkeit von der jeweils durchgeführten Zyklenanzahl. Es ist zur erkennen, dass mit zunehmender Zyklenanzahl, d.h. mit zunehmender Menge des DNA-Materials, die Fluoreszenzintensität ansteigt.
Mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist es insbesondere möglich, zum Beispiel nach Durchführen einer PCR, den Schmelzpunkt unterschiedlicher Proben gleichzeitig zu bestimmen. Hierbei wird für jede Probe, die mit einem Farbstoff-Marker markiert ist, indivi- duell die Veränderung der Fluoreszenzintensität mit der Temperatur in Abhängigkeit von der Temperatur ermittelt, d.h. es wird jede DNA-Probe mit einer individuellen Temperaturrampe beaufschlagt und die jeweilige Ableitung -d(RFU)/dT eines normierten Fluoreszenzsignals RFU ermittelt. Das Ergebnis einer derartigen Messung ist für verschiedene DNA-Proben in Figur 4 dargestellt. Die Ableitung -d(RFU)/dT des Fluoreszenzsignals weist bei der jeweiligen Schmelztemperatur ein Maximum auf, so dass durch Bestimmen des jeweiligen Maximums die jeweilige Schmelztemperatur ermittelt werden kann. Anhand der genauen Schmelztemperatur können, wie oben bereits erläutert, insbesondere Verunreinigungen oder Artefakte des vervielfältigten DNA-Materials bestimmt werden.
Bezugszeichenliste
1 PCR-Vorrichtung
2 Probenaufnahme
3 Einsatz
4 Temperatursensor
5 Peltierelement
6 elastischer Materialstreifen
7 Wärmesenke
8, 80 gedruckte Leiterplatte
21 Aufnahmeöffnung
22 Oberseite Probenaufnahme
31 Boden Einsatz
32 Seitenwand Einsatz
61 erste Ende
62 zweites Ende
71 Oberseite Wärmesenke
72 Trennwand
21 1 oberer Rand
212 Seitenwand
213 unterer Rand
214 Unterseite Probenaufnahme
21 1 1 Bodenbereich Probenaufnahme
21 12 Seitenwand Probenaufnahme