MUELLER, Daniel (Kilvertzheide 55, Hilden, 40724, DE)
BEGEMANN, Sebastian (Breslauer Ring 6, Barntrup, 32683, DE)
BRABETZ, Werner (Leisniger Platz 2, Dresden, 01127, DE)
MUELLER, Daniel (Kilvertzheide 55, Hilden, 40724, DE)
BEGEMANN, Sebastian (Breslauer Ring 6, Barntrup, 32683, DE)
| Patentansprüche 1. Eine Vorrichtung zur Bestimmung molekularer Wechselwirkungen von Nukleinsäuren und/oder Proteinen und/oder Peptide umfassend mindestens eine Hybridisierungs- /Reaktionskammer (3), und umfassend Sondenmoleküle ausgewählt aus der Gruppe umfassend Nukleinsäuren, Proteine und Peptide, wobei mindestens zwei die Hybridisierungs-ZReaktionskarnmer (3) begrenzende Flächen eine hydrophile Oberfläche besitzen, und wobei besagte Sondenmoleküle an mindestens eine der Oberflächen in besagter Hybridisierungs-/Reaktionskammer (3) immobilisiert sind. 2. Die Vorrichtung gemäß Patentanspruch 1, wobei alle die Hybridisierungs-/ Reaktionskammer (3) begrenzende Flächen eine hydrophile Oberfläche besitzen. 3. Die Vorrichtung gemäße Patentanspruch 1 oder 2, wobei die mindestens eine hydrophile Oberfläche dadurch gekennzeiclinet ist, dass sie unter Verwendung von entionisiertem Wasser einen Kontaktwinkel von weniger als 82° ausbildet. 4. Eine Vorrichtung gemäß irgendeinem der Patentansprüche 1 bis 3 umfassend einen oberen Teil (1) und einen unteren Teil (2), wobei der obere Teil mit dem unteren Teil über ein Vernetzungsmittel/Haftklebstoff verbunden ist und sich zwischen oberem und unterem Teil besagte mindestens eine Hybridiserungs-/Reaktionskammer (3) ausbildet, wobei der obere Teil im Bereich der mindestens einen Reaktionskammer mindestens eine Einlassöffhung (4) und mindestens eine Auslassöffhung (5), und wobei besagte Polynucleotide und/oder Peptide an die Oberfläche des unteren Teils gebunden sind. 5. Die Vorrichtung gemäß Patentanspruch 4, wobei der untere Teil planar ist. 6. Die Vorrichtung gemäß irgendeinem der Patentansprüche 1 bis 5, wobei die Klebeverbindung zwischen oberem und unterm Teil bei einem pH von 6 bis 9und/oder in einem Temperaturbereich von -20 C bis 90°C stabil bleibt. 7. Die Vorrichtung gemäß Patentanspruch 4 bis 6, wobei der obere Teil aus einer dreidimensionalen Folie (7) besteht, wobei die dreidimensionale Folie auf der dem unteren Teil zugewandten Seite mindestens eine seitlich begrenzte, nach unten offene Aussparung (8) aufweist, die zusammen mit dem unteren Teil die mindestens eine Hybridisieimgs- Reaktionskarnmer (3)ausbildet. 8. Die Vorrichtung gemäß Patentanspruch 4 bis 6, wobei der obere Teil aus einer Folienanordnung (15) besteht, wobei die Folienanordnung eine erste Folie (9) aus einem Kunststoff-Polymer und eine zweite Folie (10) aus einem Kunststoff-Polymer umfasst; wobei die zweite Folie (10) mindestens eine seitlich begrenzte Aussparung (11) aufweist, die zusammen mit der ersten Folie und dem unteren Teil (2) die mindestens eine Reaktionskammer ausbildet. 9. Eine Vorrichtung gemäß Patentanspruch 8, wobei sich das Vemetziingsmittel/Haftklebeverbindung zwischen zweiter Folie und unterem Teil (6) bei niedrigerer Temperatur und/oder höherem pH Wert löst, als die Verbindung (12) zwischen erster Folie und zweiter Folie. 10. Eine Vorrichtung gemäß Patentanspruch 1 bis 9, wobei der untere Teil Nukleinsäuren und/oder Peptide zur Bestimmung molekularer Wechselwirkungen umfasst. 11. Eine Folienanordnung zur Herstellung einer Vorrichtung gemäß Patentanspruch 1 bis 6 und 8 bis 10 umfassend i) eine erste Folie (9) aus einem Kunststoff-Polymer; ii) eine zweite Folie (10) aus einem Kunststoff-Polymer; wobei die erste Folie auf mindestens einer Seite eine hydrophile Oberfläche besitzt; wobei die zweite Folie mindestens eine seitlich geschlossene Aussparung (11) aufweist; wobei die Innenflächen der mindestens einen Aussparung (11) eine hydrophile Oberfläche besitzt; wobei .die erste Folie (9) im Wesentlichen die gleichen Ausmaße hat, wie die zweite Folie (10) und auf der Seite mit hydrophiler Oberfläche mit der zweiten Folie (10), im Wesentlichen seitlich bündig, verbunden ist und wobei die erste Folie (9) im Bereich der mindestens einen Aussparung (11) mindestens eine Einlassöffhung (4) und mindestens eine Auslassöffhung (5) aufweist; wobei auf die nicht mit der ersten Folie (9) verbundene Seite der zweiten Folie (10) eine Vernetzungsmittel/Haftklebstoff (13) aufgebracht ist und optional einen Vernetzungsmittel-/Haftklebstoff-freien Griffbereich (14) besitzt; wobei besagte hydrophile Oberflächen dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Kontaktwinkel von höchstens 82° besitzt. 12. Ein Arrayed Primer Ligation Verfahren umfassend die folgenden Schritte: i) das Einbringen der zur analysierenden Probe in die Reaktionskammer (3) der Vorrichtung gemäß den Patentansprüchen 1 bis 10 über die mindestens eine EinlassÖfmung (4); iii) Inkubation unter geeigneten Reaktionsbedingungen; i) entfernen des oberen Teils der Vorrichtung durch händisches Abziehen; ii) Waschen des DNA-Arrays (unterer Teil; 2) mit einem geeigneten Puffer und/oder Lösungsmittel; iii) Trocknen des DNA-Arrays (unterer Teil; 2) durch Abzentrifugieren und Abblasen der Restflüssigkeit im Stickstoffstrom; vii) Messen der Signale in einem Scanner oder Imager. 13. Ein Arrayed Primer Ligation Verfahren gemäß Patentanspruch 12, wobei die Schritte automatisiert erfolgen. 14. Die Verwendung einer Vorrichtung gemäß Patentanspruch 1 bis 10 oder einer Folienanordnung gemäß Patentanspruch 11 in einer Anwendung ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus„arrayed primer ligation" (ALR),„arrayed primer extension" (APEX), DNA-Microarray, DNA-Sequenzierung auf einem Array, Protein Microarray, „reverse phase protein" Microarray, Antikörper Microarray, Antigen Microarray und Proteindomänen Microarrays. 5. Ein Verfahren zur Herstellung einer Folienanordnung gemäß Patentanspruch 11 und/oder einer Vorrichtung gemäß einem der Patentansprüche 8 bis 10 umfassend die folgenden Schritte: (i) Das Aufbringen einer beidseitig klebenden Folie (zweite Folie; 10) auf einer Rolle, wobei die Klebeflächen der Folie durch Schutzfolien bedeckt sind; (ii) Stanzen von Aussparungen (11) in die zweite Folie (2); (iii) Entfernen einer Schutzfolie von der zweiten Folie (2); (iv) Verkleben der erfindungsgemäß ersten Folie (9) der hydrophilen Oberfläche auf die entschützte Seite der zweiten Folie (2), wobei besagte hydrophile Oberfläche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Kontaktwinkel von höchstens 82° besitzt; (v) Einstanzen der erfindungsgemäßen Einlass- (4) und/oder Auslassöfmungen (5) der Reaktionskammer in die ersten Folie; (vi) Entschützen der zweiten Klebefläche der zweiten Folie (10) und Verbund mit der erfindungsgemäßen ersten Folie (9); (vii) Verkleben des Verbundes aus erster und zweiter Folie (Folienanordnung(15)/oberer Teil (2))mit dem erfindungsgemäßen unteren Teil. |
Technisches Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Bestimmung molekularer Wechselwirkungen, im Speziellen eine Vorrichtung zur Durchfülirung von Microarray basierten Analysen, wie z.B. „arrayed primer ligation"- oder„arrayed primer extension"- Analysen.
Hintergrund der Erfindung In sogenannten Microarrayanalysen erfolgt die parallele Analyse von bis zu mehreren tausend Einzelnachweisen in einer geringen Menge biologischen Probenmaterials. Als Biochip oder auch Microarray wird ein Trägermaterial bezeichnet, auf dem sich eine große Zahl biologischer oder biochemischer Nachweise oder Tests auf engstem Raum in Testarealen befinden. Ein Testareal besteht dabei aus verschiedenen Spotbereichen, in denen spezifische Sondenmolekülen (Polynukleotide, Proteine, Liganden, Peptide etc.) immobilisiert sind.
Solche Microarray kommen unter anderem bei sogenannten„arrayed primer ligation" (ALR) Anwendungen oder„arrayed primer extension" (APEX) Anwendungen zum Einsatz.
Beide Verfahren beschreiben enzymatisch unterstützte Genotypisierungen auf DNA- Mikroarrays. Dabei nutzt man die zusätzliche Substratspezifität von DNA-Polymerasen oder DNA-Ligasen, um universelle Hybridisierungsbedingungen auf dem DNA-Chip bei gleichzeitigem Erhalt einer hohen Spezifität zu realisieren. Bei der Arrayed Primer Extension (APEX), auch als Arrayed Single Base Primer Extension oder Arrayed Minisequencing bekannt, handelt es sich um eine Methode zur Genotypisierung von DNA-Mutationen und - Polymorphismen unter Verwendung von DNA-Polymerasen auf DNA-Chips ( urg A, TÖnisson N, Georgiou I, Shumaker J, Tollett J, Metspalu A. Arrayed primer extension; solid- phase four-color DNA resequencing and mutation detection technology. Genet Test, 4:1-7, 2000; Case-Green S, Pritchard C, Southern E. Oligonucleotide arrays for genotyping: enzymatic methods for typing single nucleotide polymorphisms and short tandern repeats. Methods Mol Biol; 226: 255-269, 2003). Dabei werden sequenzspezifische Fängeroligonukleotide, deren Sequenz exakt stromaufwärts (upstream) der zu detektierenden Mutation liegt, in diskreten Arealen auf planaren Glas- bzw. Kunststoffoberflächen immobilisiert. Anschließend erfolgt eine Hybridisierung des Fängeroligonukleotides mit einzelsträngigen, genomischen DNA-Fragmenten, welche mittels Multiplex- Polymerasekettenreaktion (PCR) vervielfältigt wurden. Eine DNA-Polymerase verlängert dabei das Fängeroligonukleotid an seinem 3'-Ende um eine einzige für den nachzuweisenden „Single Nucleotide Polymorphism" (SNP) spezifische Nukleotidbase, welche als fluoreszenzmarkiertes Didesoxyribonukleotidtriphosphat, auch Stoppnukleotid genannt, im Reaktionsgemisch vorlag.
Bei der ALR handelt es sich um eine Chip-basierte Methode zur Genotypisierung von DNA- Mutationen und -Polymorphismen unter Verwendung von DNA-Ligasen (Case-Green et aL, 2003). Dabei werden sequenzspezifische Fängeroligonukleotide, deren 3 '-Ende beispielsweise SNP-spezifisch ist, in diskreten Arealen auf transparenten, planaren Trägern immobilisiert. Anschließend erfolgt wieder eine Hybridisierung des Fängeroligonukleotides mit einzelsträngigen, genomischen DNA-Fragmenten, welche mittels Multiplex-PCR vervielfältigt wurden. Dieses Mal werden jedoch der Hybridisierungslösung sequenzspezifische, fluoreszenzmarkierte Detektionsoligonukleotiden zugegeben, die exakt stromabwärts der Fängeroligonukleotide hybridisieren. Anschließend katalysiert das Enzym DNA-Ligase die spezifische kovalente Verbrückung von Fänger- und Detektionsoligonukleotid. Nach Waschschritten zur Entfernung des PCR-Produktes kann das Ergebnis der mutations-spezifischen Genotypisierung in einem Fluoreszenzscanner oder mittels einer CCD-Kamera ausgelesen werden. Der Nachweis der Wechselwirkung beruht auf einer spezifischen Wechselwirkung von Probenmolekülen mit den Sondenmolekülen. Dazu muss die Probe in direkten Kontakt mit den Sondenmolekülen gebracht und für eine bestimmte Zeit inkubiert werden.
Hierbei sind verschiedene Aufgaben zu beachten:
( 1 ) die Konzentrierung und homogene Verteilung der Probelösung über den Testarealen, (2) die Vermeidung von Kreuzkontaminationen im Falle mehrerer Testareale auf einem Biochip,
(3) die Verdunstung der Probenflüssigkeit während der Inkubationsdauer (insbesondere bei höherer Temperatur). Für die Lösung dieser Probleme sind verschiedene Konstruktionen zur Ausbildung von
Reaktionskammem beschrieben:
Schaffung von nach oben offenen Reaktionsräumen durch Mikrostrakmrierung des Trägermaterials und Inkubation in Hybridisierungsstationen mit wassergesättigter Luft. - LifterSlipTM (Electron Microscopy Sciences): Mikroskopische Deckgläser mit Kunststoffstegen an zwei Kanten.
Rahmenkonstruktionen mit und ohne Deckel zur Schaffung von Reaktionskammern, welche reversibel über Gummidichtungen und einem Halter mit Verklammerung angepresst werden oder fest mit dem Trägermaterial verklebt werden.
Beispiele zum Stand der Technik:
HybriWell Hybridization System (Grace Bio-Labs ,Bend Inc., OR, USA)
Maui Mixer Hybridization Chamber (bio MicroSystems)
ABgene Gene Frame Multiwell (Thermo Fisher)
- Secure Seal Hybridization Chambers SA6FL-6L (Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR, USA)
Secure Seal Hybridization Chambers SA6L-0.5 (Grace Bio-Labs Inc., Bend, OR, USA
Nachteile dieser Konstuktionen liegen vielfach darin, dass vom Benutzer ein hohes manuelles Geschick gefordert wird. Zusätzliche Fehlerquellen ergeben sich aus dem Umstand, dass der Benutzer die Reaktionskammer für jeden Biochip erneut auflegen muss. Die Dichtigkeit und der Verdunstungsschutz sind oft unzureichend. Soll nach der Inkubation der Sonden und Proben die Anbindung der Probe an die immobilisierte Sonde über Fluoreszenzmarkierung und unter Benutzung eines handelsüblichen Fluoreszenzscanners oder -imagers erfolgen, müssen die Reaktionskammem nach der Inkubation vom Trägermaterial abgelöst werden ohne dabei Rückstände auf dem Trägermaterial zu hinterlassen. Dies ist erforderlich, da die mechanische Zuführung des Biochips zum Messgerät an die exakten Abmaße (insbesondere Stärke) der Trägermaterialien ohne Reaktionskarnmer gebunden ist und/oder der optische Strahlengang im Messgerät keine am Trägermaterial gebundene Reaktionskammer während der Messung zulässt.
Ein besonderes Problem bei Vorrichtungen aus dem Stand der Technik stellen Luftblasen dar, die beim Befüllen der Reaktionskammem unvermeidlich entstehen. Hierdurch ist die gewünschte homogene Verteilung der Probelösung über den Testarealen nicht mehr gewährleistet. Es wurde nun festgestellt, dass durch die Verwendung der Folie„3M Anti-Fog Hydrophilic Film" als obere Begrenzung der Hybridisierungs-/Reaktionskammer die Bildung von Blasen verhindert und eine homogene Verteilung der Probelösung über den Testarealen gewährleistet wird. Nach Vergleich der Folie mit den Vorrichtungen aus dem Stand der Technik wurde festgestellt, dass die Folie der Firma 3M eine hydrophile Oberfläche besitzt, während sämtliche Vorrichtungen aus dem Stand der Technik hydrophobe Oberflächen aufwiesen.
Beschreibung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Bestimmung molekularer Wechselwirkungen von Nukleinsäuren und/oder Proteinen, umfassend mindestens eine Hybridisierungs-ZReaktionskammer, und umfassend Sondenmoleküle, wobei mindestens eine die Reaktionskammer begrenzende Fläche eine hydrophile Oberfläche besitzt, bevorzugt mindestens zwei die Reaktionskammer begrenzende Flächen eine hydrophile Oberfläche besitzen, besonders bevorzugt alle die Hybridisierungs-/Reaktionskarnmer begrenzende Flächen eine hydrophile Oberfläche besitzen; und wobei Sondenmoleküle an mindestens eine der Oberflächen in besagter Hybridisierungs-/Reaktionskarnmer (3) gebunden sind. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform besitzen alle die Hybridisierungs-/Reaktionskammer begrenzende Flächen eine hydrophile Oberfläche.
In einer Ausfuhrungsform umfasst die erfindungsgemäße Vorrichtung mindestens 2 Hybridisierungs-/Reaktionskammern, bevorzugt mindestens 4 Hybridisierungs- /Reaktionskammern, besonders bevorzugt mindestens 6 Hybridisierungs-/Reaktionsk-unmern.
Molekulare Wechselwirkungen können beispielsweise ausgewählt sein aus der Gruppe umfassend Protein-Protein- Wechselwirkungen und/oder Protein-Liganden- Wechselwirkungen und/oder Nukleinsäurehybridisierungen und/oder Genotypisierungen und/oder Enzymreaktionen.
Die erfindungsgemäßen Sondenmoleküle sind ausgewählt aus der Gruppe umfassend Nukleinsäuren, Kolenhydrate, Peptide, Proteine und andere für die entsprechende Anwendung geeignete Liganden. Sie dienen zur Bestimmung molekularer Wechselwirkungen von Probenmaterial mit besagten Polynukleotiden, Kohlenhydraten, Peptiden, bzw. Liganden. Hierzu ist es . erforderlich, dass die Polynukleotide und/oder Proteine an eine Oberfläche gebunden sind, d.h. sie sind immobilisiert. Die Bindung der Polynukleotide und/oder Proteine kann durch verschiedene - im Stand der Technik hinlänglich bekannte - Verfahren erfolgen. Oft werden Aldehydslides benutzt, bei denen an der Oberfläche der Chips Aldehydgruppen angebracht sind, die die aminomodifizierten Oligos über eine hninbildung binden (kovalente Bindung). Als die Erfindung nicht einschränkende Beispiele seien hier genannt:
Epoxymodifizierte Slides: aminomodifizierte Oligos binden an der Epoxidgruppe unter Bildung eines Amins.
- Streptavidin-modifizierte Slides: Biotin-modifizierte Oligos binden an dem Protein.
NHS Slides: Diese Slides sind mit NHS-Estergruppen beschichtet. Durch ein aminomodifiziertes Oligo bildet sich ein Amid. (NHS = N-Hydroxysuccinimid) Aminoslides: unmodifiziertes Oligo bindet an einer unbestimmten Stelle, während der Bestrahlung mit Licht,
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich um eine Vorrichtung zur Durchführung von Microarray basierten Verfahren. Der Begriff "Microarray" bezieht sich auf ein Substrat, das spezifische Moleküle hat, die in hoher Dichte auf vorbestimmten Bereichen immobilisiert sind. Beispiele des Microarrays umfassen Polynukleotidmicroarrays, Peptidmicroarrays und Proteinmicroarrays. Solche Microarrays sind im Stand der Technik gut bekannt, und Beispiele sind in den US Patenten 5,445,934 und 5,744,305 offenbart. Im Allgemeinen werden Microarrays unter Verwendung von photolithographischer Technologie hergestellt. In dem photolithographischen Verfahren wird ein vorbestimmter Bereich eines Substrats, das mit einem Monomer beschichtet ist, das eine entfernbare Schutzgruppe hat, einer Energiequelle ausgesetzt, um die Schutzgruppe von dem Monomer zu entfernen, und dann wird ein zweites Monomer, das eine entfembare Schutzgruppe hat, an das Monomer gekoppelt. Der Vorgang des Aussetzens einer Energiequelle, des Entfernens der Schutzgruppe und des Koppeins eines Monomers wird wiederholt, um ein gewünschtes Polynukleotid auf dem Substrat herzustellen. Alternativ dazu werden Microarrays unter Verwendung eines Verfahrens hergestellt, in dem ein bereits synthetisiertes Polynukleotid an einem vorbestimmten Ort auf dem Substrat immobilisiert wird, wie beispielsweise ein Spotting- Verfaliren, ein piezoelektrisches Druckverfaliren, zum Beispiel unter Verwendung eines Tintenstrahldruckers, und ein Micropipettierverfahren, usw. Dieser Ansatz ermöglicht das freie Anordnen von Biomolekülen und findet daher breite Anwendung. US 6,413,722 Bl, US 5,320,944, US 5,643,721 und US 5,071,746 offenbaren verfahren zur Modifizierung von Trägern und/oder Assaymaterialien.
In einer bevorzugten Ausführungsforrn ist die erfindungsgemäße Vorrichtung eine Vorrichtung zur Durchführung einer„arrayed primer ligation" (ALR), „arrayed primer extension" (APEX), DNA-Microarray, Protein-Microarray, „reverse phase protein" Microarray, Antikörper Microarray, Antigen Microarray und Proteindomänen Microarray, DNA-Sequenzierung auf Arrays.
Der untere Teil kann also erfindungsgemäß ein Microarray sein. In einer Ausführungsform sind besagte Nukleinsäuren und/oder Peptide und/oder Proteine in Testarealen angeordnet. Die Testareal, bzw. die Nukleinsäuren und/oder Peptide sind so angeordnet dass sie innerhalb der mindestens einen Hybridisierungs-/Reaktionskarnmer liegen. In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich in einer Hybridisierangs-/Reaktionskammer je ein Testareal.
Als Testareal wird erfindungsgemäß eine Fläche verstanden, auf der sich mindestens 2 immobilisierte Sondenmoleküle befinden, bevorzugt mindestens 10, weiter bevorzugt mindestens 100, bevorzugt mindestens 1000. Dem Fachmann ist ersichtlich, dass, abhängig von der Anwendung und der Größe der Testareale, auch mehr als 1000 immobilisierte Sondenmoleküle aufgebracht werden können.
Falls es sich bei den Sonden um Polynukleotide handelt können diese auf den Testarealen unterschiedlicher Länge sein. Die Länge der einzelnen Polynukleotiden kann dem jeweiligen Verfahren angepasst werden. Dem Fachmann sind Verfahren bekannt um die für eine Anwendung benötigte Länge der Polynukleotide zu bestimmen. In einer Ausfuhrungsform der vorliegenden Erfindung haben die immobilisierten Polynukleotide eine Länge von 5 bis 150 Nukleotiden, bevorzugt 8 bis 80 Nukleotide, besonders bevorzugt 15 bis 40 Nukleotide. Die Polynukleotide eines Testareals könne alle die gleiche Länge haben oder sich in ihrer Länge unterscheiden.
Als hydrophil werden erfindungsgemäß Oberflächen bezeichnet, die unter Verwendung von Wasser, bevorzugt entionisiertem Wasser, einen Kontaktwinkel von kleiner als 82° ausbilden, bevorzugt einen Kontaktwinkel von kleiner als 80°, besonders bevorzugt kleiner als 60°. In einer weitern Ausfuhrungsform bildet die erfindungsgemäß hydrophile Oberfläche unter Verwendung von entionisiertem Wasser einen Kontaktwinkel von weniger als 40°, bevorzugt weniger als 32°, besonders bevorzugt weniger als 20° aus. Durch die hydrophile Oberfläche wird eine gleichmäßige, vorzugsweise luftblasenfreie Verteilung der Flüssigkeit in der Hybridisierungs-/Reaktionskammer gewährleistet.
Als Kontaktwinkel (oder Benetzungswinkel) wird der Winkel bezeichnet, den ein Flüssigkeitstropfen auf der Oberfläche eines Feststoffs zu dieser Oberfläche bildet (Abbildung 9). Die Größe des Kontaktwinkels zwischen Flüssigkeit und Feststoff hängt von der Wechselwirkung zwischen den Stoffen an der Berührungsfläche ab. Je geringer diese Wechselwirkung ist, desto größer wird der Kontaktwinkel.Dem Fachmann sind Verfahren bekannt, den Kontaktwinkel und damit die Hydrophüie einer Oberfläche zu bestimmen und/oder zu berechnen. So lässt sich der Kontaktwinkel beispielsweise über den statischen Kontaktwinkel, den dynamischen Kontaktwinkel, den Rückzugs winkel, den Fortschreitwinkel bestimmen. Beispielsweise können auch Verfahren wie Tangenten- Verfahren, Höhen-Breiten- Verfaliren, Kreissegmentverfahren (Circle fitting), Young-Laplace (Sessile Drop Fitting), Oberflächenspannungsmessung am hängenden Tropfen und/oder Tropfenprofilerfassung mit Hilfe des "Robust-Shape-Vergleichs". Durch Oberflächenbehandlung kann der Kontaktwinkel verändert werden. So kann beispielsweise ein eigentlich hydrophobes Trägermaterial mit einer hydrophilen Beschichtung versehen und/oder entsprechend behandelt werden um so eine hydrophile Oberfläche zu gewinnen. Dem Fachmann sind solche Beschichtungen und Verfahren bekannt und/oder er kann bestimmen ob eine Beschichtung zur Herstellung einer hydrophilen Oberfläche geeignet ist. Im Stand der Technik bekannte Behandlungsmethoden um Oberflächen hydrophil zu machen umfassen Plasmabehandlung (Jeon SI, Andrade JD. Protein-surface interaction in the presence of Polyethylene oxide. J Coli B terf Sei 142, 159-166, 1991), Plasma- und Radikalpolymerisationsbehandlung (Schiller S, Hu J, Jenkins ATA, Timmons RB, Sanchez- Estrada FS, Knoll W, Förch R. Plasma Polarisation of maleic anhydride: film chemical strueture and properities. Chemistry of Materials, 14: 235-242, 2004; Yameen B, Alvarez M, Azzaroni O, Jonas U, Knoll W. Tailoring of poly(ether ether ketone) surface properties via surface-initiated atom transfer radical polymerization. Langmuir. 25:6214-6220, 2009; Chu LQ, Knoll W, Förch R. Plasma polymerized epoxide functional surfaces for DNA probe immobilization. Biosens Bioelectron 24: 118-122, 2008), PolymerbescMchtung (Consolandi C, Castiglioni B, Bordoni R, Busti E, Battaglia C, Bernardi LR, De Bellis G. Two efficient Polymerie chemical platforms for oligonucleotide microarray preparation. Nucleosides Nucleotides Nucleic Acids, 21: 561-580, 2002).
Das Trägermaterial kann entweder hydrophil oder hydrophob sein. Ist es hydrophob, so ist es erfindungsgemäß mit einer hydrophilen Beschichtung versehen. Dem Fachmann ist ersichtlich dass eine Vielzalil von Materialien als Trägermaterial geeignet ist. Das Trägermaterial kann also beispielsweise ausgewählt sein aus der Gruppe umfassend Glas, Silizium, CodeLink Slides (Surmodics, USA ist ein Glassubstrat), Polyethylen, PMMA (Polymetliylmethacrylat), Polysteren oder TOPAS® Cycloolefm Copolymere (COC).
Als Beschichtungsmaterial ist prinzipiell jedes Material geeignet, dass eine hydrophile Oberfläche bilden kann. Das Beschichtungsmaterial kann beispielsweise ausgewählt sein aus der Gruppe Dextran, Carboxymethyldextran, Polyethylenglycol (Cha T, Guo A, Jun Y, Pei D- Q, Zhu X-Y. Immobilization of oriented protein molecules on poly (ethylene glycol) coated Si(ll l)", Proteomics, 4: 1965-1976, 2004), Polylysin (Consolandi et al. } 2003), Polyacrylate, Polyester oder Chitosan. (Consolandi C, Severgnini M, Castiglioni B, Bordoni R, Frosini A, Battaglia C, Bernardi LR, Bellis GD A struetured chitosan-based platform for biomolecule attachment to solid surfaces: application to DNA microarray preparation. Bioconjug Chem. 17: 371-377, 2006) und deren chemische Derivate. EP 1 787 717 beschreibt ein Aminoterpolymer, ein Copolymer aus drei verschiedenen Monomereinheiten, welches ebenfalls zur Ausbildung hydrophiler Oberflächen geeignet ist. Des Weiteren sind Proteinbeschichtungen wie z.B. Avidine in der Literatur beschrieben (Henry M R, Stevens P W, Sun J, Kelso D M. Real-Time Measurements of DNA Hybridization on Microparticles with Fluorescence Resonance Energy Transfer. Analytical Biochemistry 276, 204-214, 1999).
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die erfindungsgemäße Vorrichtung einen oberen Teil (1) und einen unteren Teil (2), wobei der obere Teil (1) mit dem unteren Teil (2) über ein Vernetzungsmittel/Haftklebstoff verbunden ist und sich zwischen oberem (1) und unterem Teil (2) mindestens eine Reaktionskammer (3) ausbildet, wobei die Innenseiten der mindestens einen Hybridisierungs-/Reaktionskammer (3) eine hydrophile Oberfläche besitzen und wobei der obere Teil im Bereich der mindestens einen Hybridisierungs- /Reaktionskammer (3) mindestens eine Einlassöffhung (4) und mindestens eine Auslassöffiiung (5).
Als Hybridisierungs-ZReaktionskammer wird der Raum verstanden, in dem die gewünschten Reaktion, bevorzugt Hybridisierungsreaktionen und/oder Ligationsreaktionen und/oder Amplifikationsreaktionen stattfindet. Eine Hybridisierungs-ZReaktionskammer ist erfindungsgemäß nach außen abgegrenzt. In einer bevorzugten Ausfuhrungsform ist die erfindungsgemäße Reaktionskammer jedoch durch mindestens eine Öffnung mit der Umgebung verbunden. In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform ist die erfindungsgemäße Reaktionskammer durch mindestens eine Einlassöffhung und mindestens eine Auslassöffiiung mit der Umgebung verbunden. Dem Fachmann ist ersichtlich, dass besagte mindestens eine Auslassöffiiung und besagte mindestens eine Einlassöffiiung geeignet sind Flüssigkeiten in die Reaktionskammer einzufüllen bzw. aus der Reaktionskammer entnehmen zu können. Erfindungsgemäße Einlassöffhungen und erfindungsgemäße Auslassöffhungen haben deshalb einen Durchmesser von mindestens 0,5 mm, bevorzugt mindestens 1 mm, besonders bevorzugt mindestens 2 mm. Auch kann ein Durclifluss durch die mindestens eine Reaktionskammer erzeugt werden, indem eine Flüssigkeit in die mindestens eine Einlassöffiiung eingefüllt wird und diese nach Durchfließen der Reaktionskammer aus der mindestens einen Auslassöffiiung austritt. Dem Fachmann ist weiter ersichtlich, dass bei Einfüllen einer Flüssigkeit in die mindestens eine Einlassöff ung die mindestens eine Auslassöffiiung zum Entweichen der Luft aus der Hybridisierungs- /Reaktionskammer dient. Ein- und Auslassöffhungen können auch temporär erzeugt werden durch Einstechen von Hohlnadeln (Spritzennadeln) in eine Deckfolie aus elastischen Septummaterial (z.B. Silikon).
Durch die hydrophilen Oberflächen in der erfindungsgemäßen Hybridisierungs- /Reaktionskarnmer (3) wird eine gleichmäßige Verteilung von Lösungen und Puffern innerhalb besagter Kammer gewährleistet. Weiter wird hierdurch ein luftblasenfreies, substantiell vollständiges Befüllen der Hybridisierungs-/Reaktionskammer (3) ermöglicht. Dem Fachmann ist ersichtlich, dass substantiell vollständig in diesem Zusammenhang bedeuten kann, dass an der mindestens einen Einlassöffhung (4) und/oder an der mindestens einen Auslassöffiiung (5) ein nicht mit Lösung oder Puffer gefüllter Bereich entstehen kann. Entscheidend ist die vollständige Benetzung des Testareals innerhalb der Hybridisierungs- /Reaktionskammer (3) auf dem unteren Teil (2) der Vorrichtung.
Dem Fachmann ist ersichtlich, dass das Volumen der erfindungsgemäßen Hybridisierungs- /Reaktinoskammer (3) je nach Anwendung unterschiedlich gewälilt sein kann. Die Wahl des Volumens kann beispielsweise von der Menge an zu testender Probe abhängen. In einer Ausfuhrungsform hat eine erfindungsgemäße Hybridisierungs-ZReaktionskammer (3) ein Volumen von mindestens 10 μL, bevorzugt mindestens 20 μL, besonders bevorzugt mindestens 28 μΐ,. In weiteren Ausfuhrungsformen hat eine Hybridisierungs- /Reaktionskammer ein Volumen von mindestens 30 μL, bevorzugt mindestens 50 μL, weiter bevorzugt mindestens 100 μί,.
Der untere Teil (2) kann planar oder strukturiert sein. So können die Testareale in Vertiefungen sitzen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße untere Teil der Vorrichtung planar.
Der untere Teil (2) kann erfindungsgemäß ein Chipsubstrat sein, d.h. der untere Teil stellt einen Biochip zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen dar. m einer bevorzugten Ausfuhrungsform sind die Sondenmoleküle auf dem unteren Teil (2) der Vorrichtung immobilisiert. In einer Ausfuhrungsform sind besagte Sondenmoleküle in Testarealen angeordnet. Die immobilisierten Testmoleküle sind so angeordnet, dass sie innerhalb der mindestens einen Hybridisierungs-/Reaktionskammer (3) liegen.
In einer bevorzugten Ausführungsform löst sich der erfindungsgemäße obere Teil (1) nicht vom unteren Teil (2) bei direkten Kontakt mit Puffern und Lösungen, wie sie in Anwendungen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen verwendet werden. In einer Ausfuhrungsform ist die Klebeverbindung zwischen oberem und unterem Teil in einem Bereich von pH 4 bis pH 11, bevorzugt in einem Bereich von pH 5 bis pH 10, besonders bevorzugt in einem Bereich von pH 6 bis pH 9 stabil. Weiter können Puffer und Lösungen Salze in unterschiedlichen Konzentrationen aufweisen. Solche Konzentrationen liegen typischerweise in Bereichen von 2 bis 150 mM vor. Dem Fachmann ist ersichtlich, dass diese Konzentrationen je nach Anwendung und Salz differieren können. Es ist jedoch eine bevorzugte Ausführungsform, dass sich die Klebeverbindung (6) zwischen oberern (1) und unterem Teil (2) bei Salzkonzentrationen, wie sie in Lösungen und Puffern von anderen Reaktionen während z.B. einer ALR, APEX, LCR und/oder PCR vorliegen, nicht löst. Weiter ist es für den Fachmann ersichtlich, dass sich der obere Teil (1) der erfindungsgemäßen Vorrichtung in Temperaturbereichen, wie sie in Verfahren zur Bestimmung molekularer Wechselwirkungen notwendig sind, nicht vom unteren Teil (2) löst. In einer Ausführungsform löst sich also der obere Teil (1) nicht vom unteren Teil (2) bei einer Temperatur von -20 °C bis 100°C, bevorzugt nicht bei einer Temperatur von -20 °C bis 95 °C, besonders bevorzugt nicht bei einer Temperatur von -20 °C bis 80 °C.
Dem Fachmann ist ersichtlich, dass die Stabilität der Klebeverbindung auch von der Zeitdauer der Inkubation bei bestimmten pH und/oder Salzkonzentration und/oder Temperatur abhängt. Des Weiteren kann die Stabilität der Klebeverbindung auch vom Zusatz organischer Lösungsmittel wie Ethanol oder Dimethylsulfoxid (DMSO) und Formamid in den Reaktionsund/oder Waschlösungen abhängen. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Klebeverbindung zwischen oberem (1) und unterem Teil (2) der erfindungsgemäßen Vorrichtung in pH Bereichen und/oder Temperaturen einer ALR, APEX, LCR oder PCR Analyse für länger 30 min stabil, bevorzugt für länger als 1 Stunde, besonders bevorzugt für länger als 2 Stunden, weiter bevorzugt für länger als 3 Stunden.
In einer besonders bevorzugten Ausfuhrungsform sind die Klebeverbindungen bei Inkubation mit einem pH Wert von 7,0 bis 7,6 bei 70°C für mindestens 1 Stunde stabil. In einer weiter bevorzugten Ausführungsform sind die Klebeverbindungen bei Inkubation mit einem pH Wert von 9,5 bei 60°C für mindestens 1 Stunde stabil. In einer weiteren Ausführungsform sind die Klebeverbindungen bei Inkubation mit einer IM Natriumhydroxid oder 5 M Natriumliydroxidlösung, oder einer 3 M HO-Lösung oder einer 37%-HCl Lösung bei 25°C für mindestens 1 Stunde stabil. Dem Fachmann erschließt sich hieraus, dass in dieser Ausfuhrungsform die Klebeverbindungen bei einem pH von -1 bis -0,3 und bei einem pH von 14 bis 15 bei 25 °C für mindestens eine Stunde stabil ist.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Klebeverbindungen auch nach mehrmaligem Einfrieren bei -20°C und anschließendem Auftauen stabil, vorzugsweise geschieht das Einfrieren und Auftauen unter Vakuum.
Nach Durchfuhrung der Reaktionen ist es wünschenswert, dass der obere Teil der Vorrichtung entfernt wird um so eine Auswertung der molekularen Wechselwirkungen auf dem unteren Teil, z.B. durch Auslesen in einem Fluoreszenzscanner und/oder Fluoreszenzimager, ausführen zu können. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung löst sich die Klebeverbindung zwischen dem oberen (1) und unterem Teil (2) der erfindungsgemäßen Vorrichtung bei Änderung des pH Wertes der Lösung oder Puffers und/oder bei Änderung der Temperatur. Dem Fachmann ist ersichtlich, dass das Lösen der Klebeverbindung (6) auch durch eine Kombination von Temperaturänderung und pH-Änderung hervorgerufen werden kann. In einer Ausfiihrungsform der vorliegenden Erfindung löst sich besagte Klebeverbindung (6) zwischen oberem (1) und unterem Teil (2) bei einem pH >9, bevorzugt bei einem pH >10, besonders bevorzugt bei einem pH >11. Dem Fachmann ist weiter ersichtlich, dass sich die Klebeverbindung (6) zwischen oberem (1) und unterem (2) erst nach einer Inkubationsdauer in besagtem pH und/oder Temperaturbereich löst. In einer weiteren Ausfülirungsform der vorliegenden Erfindung löst sich besagte Klebeverbindung (6) zwischen oberem (1) und unterem Teil (2), optional durch mechanisches Abziehen, nach einer Inkubationsdauer 10 Sekunden, besonders bevorzugt nicht länger als 20 Sekunden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform löst sich der obere Teil im Wesentlichen rückstandsf ei vom unteren Teil, wobei mit rückstandsfrei im erfindungsgemäßen Sinne gemeint ist, dass auf dem unteren Teil im Wesentlichen keine Rückstände an Vernetzungsmittel/Haftklebstoff und/oder Trägermaterial des oberen Teils und/oder Beschichtung des oberen Teils zurückbleiben.
Der obere Teil der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann starr oder flexibel sein.
Weiter besteht der obere Teil der erfindungsgemäßen Vorrichtung bevorzugt aus einer dreidimensionalen Folie (7), besonders bevorzugt ist jedoch eine Folienanordnung (15). Eine erfindungsgemäße dreidimensionale Folie (7) besitzt auf der dem unteren Teil zugewandten Seite mindestens eine seitlich begrenzte, nach unten offene Aussparung (8), die zusammen mit dem unteren Teil (2) die mindestens eine Hybridisierungs-/Reaktionskammer (3) ausbildet. Besagte Aussparungen (8) besitzen an ihren Innenseiten bevorzugt eine hydrophile Oberfläche. Dem Fachmann ist ersichtlich, dass die Maße sowie die Form der Aussparung und damit der mindestens einen Hybridisierungs-/Reaktionskammer je nach Verwendung angepasst werden kann. Eine besonders bevorzugte Ausführungsform für Form und Maße der Aussparung ist in Abbildung 8 dargestellt. In einer bevorzugten Ausführungsform befindet sich im Bereich besagter mindestens einen Aussparung (8) mindestens eine Öffnung, besonders bevorzugt mindestens eine Einlassöffhung (4) und/oder mindestens eine Auslassöffhung (5). Dem Fachmann ist ersichtlich, dass die Geometrie der Hybridisierungs- /Reaktionskammern (3) sowie die entsprechende Lage der Einlassöfmungen (4) und/oder Auslassöffhungen (5) je nach Anwendung angepasst werden können. Die Erfindung nicht einschränkende Ausführungsbeispiele, sind in den Abbildungen 1 bis 8 angegeben.
Eine erfindungsgemäße Folienanordnung umfasst i) eine erste Folie (9) aus einem Kunststoff-Polymer;
ii) eine zweite Folie (10) aus einem Kunststoff-Polymer; wobei die erste Folie (9) auf mindestens einer Seite eine hydrophile Oberfläche besitzt;
wobei die zweite Folie (10) mindestens eine seitlich geschlossene Aussparung (11) aufweist; wobei die Innenflächen der mindestens einen Aussparung (11) eine hydrophile Oberfläche besitzt;
wobei die erste Folie (9) im Wesentlichen die gleichen Ausmaße hat, wie die zweite Folie (10) und auf der Seite mit hydrophiler Oberfläche mit der zweiten Folie (10), im Wesentlichen seitlich bündig, verbunden ist und wobei die erste Folie im Bereich der mindestens einen Aussparung (11) in der zweiten Folie mindestens eine Einlassöffhung (4) und mindestens eine Auslassöffhung (5) aufweist;
wobei auf die nicht mit der ersten Folie verbundene Seite der zweiten Folie (10) eine Veraetzungsmittel Haftklebstoff (13) aufgebracht ist und optional besitzt einen Vernetzungsmittel- Haftklebstoff-freien Griffbereich (14) besitzt;
wobei besagte hydrophile Oberflächen dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Kontaktwinkel von weniger als 82° besitzt
Dem Fachmann sind Vemetzungsmittel/Haftklebestoffe bekannt, die geeignet sind in der erfindungsgemäßen Vorrichtung und/oder der erfindungsgemäßen dreidimensionalen Folie und/oder der erfindungsgemäßen Folienanordnung zur Anwendung zu kommen. Bevorzugte Vernetzungsmittel/Haftklebestoffe sind zur Herstellung der erfindungsgemäßen Klebeverbindungen geeignet. Dem Fachmann ist ersichtlich, dass die unterschiedlichen Eigenschaften der Klebeverbindungen zwischen erster (9) und zweiter Folie (10) und zwischen zweiter Folie (10) und unterem Teil (2) sowohl durch unterschiedliche Vemetzungsmittel/Haftklebestoffe bedingt sein können als auch durch die unterschiedlichen Materialen der verklebten Teile, bzw. Folien. Der Vemetzungsmittel/Haftklebstoff-freie Grifft) ereich kann in einer Ausfuhrungsform auch durch eine gegenüber der ersten Folie (9) verkürzten zweiten Folie (10) zustande kommen.
Dem Fachmann ist ersichtlich, dass die Kunststoff-Polymere der erfindungsgemäßen Folien frei gewählt werden können, solange sie die erfindungsgemäßen Eigenschaften erfüllen. Die gewählten Kunststoff-Polymere sollten bei Bedingungen, denen Sie während der erfindungsgemäßen Verwendung ausgesetzt werden stabil sein. Weiter Eigenschaften der Kunststoff-Polymere ergeben sich aus den Eigenschaften der erfindungsgemäßen Vorrichtung und sind dem Fachmann ersichtlich. Bevorzugte Kunststofrbolymere sind Polymere ausgewählt aus der Gruppe umfassend Polyester, Polyethylene und Polycarbonat. Erste (9) und zweite Folie (10) können aus dem gleich Kunststoff-Polymer bestehen oder aus unterschiedlichen.
In einer bevorzugten Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die Klebeverbindung (6) zwischen oberem (1) und unterem Teil (2) stärker als die Klebeverbindung zwischen erster (9) und zweiter Folie (10). In einer bevorzugten Ausfuhrungsform löst sich die Klebeverbindung (6) bei einem um 1 niedrigeren pH- Wert als Klebeverbindung (12), bevorzugt bei einem um 2 niedrigeren pH-Wert, besonders bevorzugt bei einem um 3 niedrigem pH-Wert. Zusätzlich oder alternativ löst sich die Klebeverbindung (6) bei einer um 5°C niedrigeren Temperatur als Klebeverbindung (12), bevorzugt bei einer um 10 Q C niedrigem Temperatur, besonders bevorzugt bei einer um 15°C niedrigeren Temperatur. In einer weiteren Ausfuhrungsform löst sich durch mechanische Beanspruchung (händisches Ablösen) die Klebeverbindung (6) jedoch die Klebeverbindung (12) im Wesentlichen nicht.
Eine besonders bevorzugte Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen Folienanordnung, bzw. Vorrichtung umfasst als erfindungsgemäße erste Folie (9)„3M Anti-Fog Hydrophilic Film" der Firma 3M und als erfindungsgemäß zweite Folie (10) die Folie„3M Double Coated Medical Tape" der Firma 3M. Eine besonders bevorzugte Ausfuhrungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung umfasst als erfindungsgemäße erste Folie (9)„3M Anti-Fog Hydrophilic Film" der Firma 3M und als erfindungsgemäß zweite Folie (10) die Folie„3M Double Coated Medical Tape" der Firma 3M und einem CodeLink Slide (Surmodics, USA) als untern Teil (2), umfassend mindestens ein Testareal zur ALR Analyse. Dem Fachmann ist ersichichtlich, dass die unterschiedlichen Eigenschaften der Klebeverbindung (6) und (12) in dieser besonders bevorzugten Ausführungsform durch die unterschiedlichen verbundenen Materialen bedingt sind.
Ein Arrayed Primer Ligation Verfahren umfassend die folgenden Schritte: i) das Einbringen der zur analysierenden Probe in die Reaktionskammer (3) der erfindungsgemäßen Vorrichtung über die mindestens eine Einlassöffnung (4); ii) Inkubation unter geeigneten Reaktionsbedingungen;
iii) entfernen des oberen Teils der Vorrichtung durch händisches Abziehen;
iv) Waschen des DNA-Arrays mit einem geeigneten Puffer und/oder Lösemittel; v) Trocknen des DNA-Arrays durch Abzentrifugieren und Abblasen der Restflüssigkeit im Stickstoffstrom;
vi) Messen der Signale in einem Scanner oder Imager.
Geeignete Puffer und/oder Lösungsmittel zum Waschen des DNA-Arrays sind dem Fachmann bekannt. Sie können beispielsweise ausgewählt sein aus der Gruppe umfassend Wasser, bevorzugt entionisiert, 0,1 - 1% Sodium Dodecylsulfat oder andere Detergentien in Wasser oder 0,1 M Natronlauge, und käufliche Waschlösungen wie Alconox (Alconox, Inc., White Plains, NY, USA) in 0,3%iger wässriger Lösung.
Dem Fachmann wird ersichtlich, dass durch die Eigenschaften der erfindungsgemäßen Vorrichtung die Automatisierung besagter Schritte des Verfahrens ermöglicht wird: i) das automatische Einbringen der zur analysierenden Probe in die Reaktionskammer (3) der erfindungsgemäße Vorrichtung über die mindestens eine Einlassöffhung (4) mit Hilfe einer Spritzenpumpe oder eine andere automatischen Pipettiervorrichtung;
ii) Inkubation unter geeigneten Reaktionsbedingungen unter kontrollierten thermischen Bedingungen;
iii) automatisches Entfernen der Reaktionslösung aus der Reaktionskammer mit Hilfe der Spritzenpumpe durch die mindestens eine Einlass und/oder Auslassöffhung;
iv) Waschen des DNA-Arrays (unterer Teil; 2) mit einem geeigneten Puffer oder Lösungsmittel mit Hilfe der Spritzenpumpe;
v) Mechanisches Abziehen der Deckfolie;
vi) Trocknen des DNA-Arrays (unterer Teil; 2) durch Abzentrifigieren und Abblasen der Restflüssigkeit im Stickstoffstrom;
vii) Messen der Signale in einem Scanner oder Imager.
Die vorliegende Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Folienanordnung und/oder einer erfindungsgemäßen Vorrichtung umfassend die folgenden Schritte:
(i) Das Aufbringen einer beidseitig klebenden Folie (zweite Folie; 10) auf
einer Rolle, wobei die lebeflächen der Folie durch Schutzfolien bedeckt sind;
(ii) Stanzen von Aussparungen (11) in die zweite Folie (2);
(iü) Entfernen einer Schutzfolie von der zweiten Folie (2);
(iv) Verkleben der erfindungsgemäß ersten Folie (9) der hydrophilen
Oberfläche auf die entschützte Seite der zweiten Folie (2), wobei besagte hydrophile Oberfläche dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Kontaktwinkel von höchstens 82° besitzt;
(v) Einstanzen der erfindungsgemäßen Einlass- (4) und/oder
Auslassöffnungen (5) der Reaktionskammer in die ersten Folie;
(vi) Entschützen der zweiten Klebefläche der zweiten Folie (10) und
Verbund mit der erfindungsgemäßen ersten Folie (9);
(vii) Verkleben des Verbundes aus erster und zweiter Folie
(FoIienanordnung(15)/oberer Teil (2)) mit dem erfmdungsgemäßen unteren Teil. Eine Schutzfolie (auch mit dem englischen Begriff„release liner" bezeichnet) kann z.B. eine Papierfolie, bzw. ein Papier sein, welche optional mit Silikon imprägniert sind.
Abbildungslegenden :
Schematischer Aufbau einer bevorzugten Ausführung mit 4 Hybridiserungs- /Reaktionskammer für DNA-Chips im Standard-Objektträgerfonnat. A) Explosionsdarstellung. Gezeigt ist die erste Folie (9) mit den Einlass- (4) und Auslassöffhungen (5). Mittig dargestellt ist die zweite Folie (10) mit den vier Aussparungen. Der untere Teil (Glasobjekträger) (2) mit den mittels Oligonukleotidsonden funktionalisierten Testarealen (16) ist unten dargestellt. B) Handhabung der Vorrichtung. In B) ist die aus erster Folie (9), zweiter Folie (10) und dem unteren Teil (2) verklebte Reaktionseinheit mit vier Reaktionskammem dargestellt. C) Nach der erfolgten Reaktion können die erste (9) und die zweite Folie (10), die zusammen den oberen Teil (1) bilden rückstandslos vom funktionalisierten Objektträger entfernt werden.
Abb. 2: Querschnitt durch eine Ausfülirungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bestehend aus oberem Teil (1) und unterem Teil (2) verbunden durch das Vernetzungsmittel/Haftklebeverbindung (6). Gezeigt ist eine Ausführungsform mit vier Hybridisierungs-/Reaktionskammera (3) mit je einer Einlassöffhung (4) und einer Auslassöffnung (5).
Abb. 3: Querschnitt durch eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung, bestehend aus einer Folienanordnung und einem unteren Teil (2), wobei die Folienanordnung aus einer ersten Folie (9), einer zweiten Folie (10) besteht die durch ein Vernetzungsmittel/Haftklebeverbindung (12) verbunden sind. Die Folienanordnung und der untere Teil sind druch ein Vernetzungsmittel/Haftklebeverbindung (6) miteinander verbunden. Gezeigt ist eine Ausführungsform mit vier Hybridisierimgs-/Reaktionskarnmern (3) mit je einer Einlassöffhung (4) und einer Auslassöf nung (5). Abb.4: Aufsicht auf eine Vorrichtung gemäße Abbildung 2 oder Abbildung 3.
Abb.5: Querschnitt durch eine Ausfülirungsform der erfindungsgemäßen dreidimensionalen
Folie (7). Gezeigt ist eine Ausführungsform mit vier nach unten offene Aussparungen (8) wobei jede Aussparung ein Einlassöffung (4) und eine Auslassöffhung (5) besitzt. Auf der Unterseite ist ein Vernetzungsmittel/Haftklebestoff (13) aufgetragen, wobei ein Vemetzungsmittel/Haftklebestoff-freier Griffbereich (14) nicht damit bedeckt ist.
Abb. 6: Querschnitt durch eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Folienanordnung
(15). Die erste Folie (9) und die zweite Folie (10) sind durch eine Vernetzungsmittel-/Haftklebeverbindung (12) miteinander verbunden. Gezeigt ist eine Ausführungsform mit 4 Aussparungen (11) in der zweiten Folie, wobei die erste Folie (9) in den Aussparungsbereichen je eine Einlassöffnung (4) und einer
Auslassöffung (5) besitzt. Die untere Seite ist mit einem Vemetzungsmittel/Haftklebestoff (13) aufgetragen, wobei ein Vemetzungsmittel/Haftklebestoff-freier Griffbereich (14) nicht damit bedeckt ist. Abb. 7: Unteransicht der dreidimensionalen Folie aus Abbildung 5 oder der
Folienanordnung aus Figur 6.
Abb. 8: Eine bevorzugte Ausführungsfonn der Hybridisierungskammern. Zu beachten ist, dass bei dieser Ausführung der zweiten Folie (10) aus Figur 1, 3 und 6 am linken Rand um 4 mm eingekürzt wurde. Damit entsteht eine Lippe der Abdeckfolie, welche nicht mit dem Glasobjektträger verklebt ist und somit das mechanische Abziehen der Einheit 1 und 2 (siehe Figur 1 C) vom unteren Teil (2) in Figur 1 A) erleichtert (siehe auch Figur IC). Verwendet wurde die hydrophile Abdeckfolie #9962 als erste Folie (9) (160 μηι stark; 3M Deutschland GmbH, Neuss), der doppelseitige Klebefilm #1522 als zweite Folie (10) (100 μιη stark; 3M
Deutschland GmbH, Neuss) und die Glasobjektträger CodeLink™ als unterer Teil (2) (SurModics Inc., Owings Mills, MD, USA) Die Angaben sind in mm.
Abb. 9: Prinzip der Kontaktwinkelmessung
Abb. 10: Darstellung der verwendeten Kammersysteme
Abb. 11: Kontaktwinkelmessung Folie 1 mit 10 μl ddH20; Kontaktwinkel Abb. 12: Kontaktwinkelmessung Folie 1 mit 10 μl lxLigase-Puffer; Kontaktwinkel = 47,74° Abb. 13: Kontaktwinkelmessung Folie 2 mit 10 μl ddH20; Kontaktwinkel = 84,92° Abb. 14: Kontaktwinkelmessung Folie 2 mit 10 μl lxLigase-Puffer; Kontaktwinkel = 53,55° Abb. 15: Kontaktwinkelmessung Folie 3 mit 10 μl ddH20; Kontaktwinkel = 82,06° Abb. 16: Kontaktwinkelmessung Folie 3 mit 10 μl lxLigase-Puffer; Kontaktwinkel = 51,27°
Abb. 17: Kontaktwinkelmessung Folie 4 mit 10 μl ddffiO; Kontaktwinkel = 92,43° Abb. 18: Kontaktwinkelmessung Folie 4 mit 10 μl lxLigase-Puffer; Kontaktwinkel = 52,28° Abb. 19: Kontaktwinkelmessung Folie 5 mit 10 μl ddH20; Kontaktwinkel= 31,94°
Abb. 20: Kontaktwinkelmessung Folie 5 mit 10 μl lxLigase-Puffer; Kontaktwinkel = 17,18° Abb. 21: Kontaktwinkelmessung Glasslide mit 10 μl ddH20; Kontaktwinkel = 28,35°
Abb. 22: Kontaktwinkelmessung Glasslide mit 10 μl lxLigase-Puffer; KontaktwinkeI=
16,37°
Abb. 23: Kontaktwinkelmessung CodeLink Slide mit 30 μl ddffiO; Kontaktwinkel = 25,55°
Abb. 24: Kontaktwinkelmessung CodeLink Slide mit 10 μl ddffiO; Kontaktwinkel = 27,68°
Abb. 25: Kontaktwinkelmessung CodeLink Slide mit 10 μl lxLigase-Puffer; Kontaktwinkel
= 5,73°
Abb. 26: Biotype Hybridisierangskammer (oben) vs. HybriWell™ Hybridization System, Grace Bio-Labs (unten). 30 μl einer 0.25%igen wässigen Cresol Red Lösung wurden mit einer 100 μl Pipette in den Kammerbereich pipettiert. Cresol Red diente zur Anfärbung der Flüssigkeit. Zur besseren Darstellung wurde das Kammerlayout mittels Software- Nachbearbeitung mit schwarzen Linien hervorgehoben.
BEISPIELE
Beispiel 1: Bestimmung der Hydrophilie verwendeter Folien verschiedener Hybridisierimgskammern mittels Kontaktwinkelmessung Hintergrund: Kommerziell erhältliche Kammersysteme zeigten in unseren Versuchen nur suboptimale Ergebnisse bei der Verteilung der Reaktionsflüssigkeit in der Kammer. Wir führen dies auf die hydrophoben Eigenschaften der verwendeten Folien zurück, welche das Kammersystem nach oben hin begrenzen. In Folge dessen wurde ein erfindungsgemäßes Kammersystem hergestellt, bei der die Folie sehr hydrophile Eigenschaften aufweist (Biotype Kammer System). Der Unterschied in der Hydrophilie kommerzieller Kammersysteme vs. · Biotype Kammersystem wurde mittels Kontaktwinkelmessung dokumentiert.
Versuchsaufbau: Für vier kommerzielle Kammersysteme und für das Biotype Kammersystem wurde die Kontaktwinkelmessung durchgeführt. Das Prinzip der Kontaktwinkehnessung ist in der Kontaktwinkelmessung ist in Abb. 9 dargestellt. Je kleiner der Winkel, desto stärker verläuft der Tropfen auf der Feststoff-Oberfläche (hier„Folie") und desto größer ist die Hydrophilie.
Die Kontaktwinkelmessung wurden folgende Geräte genutzt:
Kamera: Computar ® FC-65II (Computer Optics Inc., Hudson, USA)
Objektiv: Computar ® 55mm TELECENTRIC
Schirm: Kaiser Slimlite (Kaiser Fototechnik GmbH & Co. KG, Buchen)
Optische Bank von Spindler & Hoyer (Göttingen)
Software: surftense (OEG Gesellschaft für Optik, Elektronik & Gerätetechnik mbH, Frankfurt a. Main)
Bei den untersuchten Kammersystemen handelt es sich um: Folie 1 HybriWell Hybridization System (Grace Bio-Labs, Bend Inc., OR, USA)
Folie 2 -Secure Seal Hybridization Chambers SA6FL-6L (Grace Bio-Labs Inc., Bend,
OR, USA)
Folie 3 Secure Seal Hybridization Chambers SA6L-0.5 (Grace Bio-Labs Inc., Bend,
OR, USA)
Folie 4 ABgene Gene Frame Multiwell (ABgene UK, Epsom, UK)
Folie 5 Biotype Kammersystem
Zudem wurde die Hydrophilie der von uns verwendeten CodeLink Slides (Surmodics, USA) mit der von Standard-Glasslides (VWR, Deutschland) verglichen. Alle Messungen wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Reaktionsflüssigkeit wurde in einem Volumen von 10 bzw. 30 μl eingesetzt. Dabei handelte es sich entweder um ddH 2 0 oder um lx Ligase-Puffer [New England Biolabs, USA: 20 mM Tris-HCl pH 7,6 (bei 25°C), 25 mM Kaliumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 1 mM Nicotinsäureamid- Adenin-Dinukleotid (NAD), 10 mM Dithiothreitol, 0,1 % Triton X-100], Die Ergebnisse sind in den Figuren 10 bis 25 dokumentiert.
Ergebnis:
Fazit: Die Unterschiede in der Hydrophilie zwischen den kommerziellen Kammersystemen und des Biotype Kammersystems spiegeln sich in einem signifikant unterschiedlichen Kontaktwinkel wieder. Während die Folien 1 bis 4 bei Verwendung von lxLigase-Puffer einen Kontaktwinkel von ca. 50° aufweisen, wurde auf Folie 5 lediglich ein Kontaktwinkel von ca. 17 ° gemessen. Demnach besitzt die von der Fa. Biotype verwendete Folie gegenüber den Folien aller anderen getesteten Kammersysteme deutlich hydrophilere Eigenschaften. Beispiel 2: Hybridisierungskammer- Vergleich hinsichtlich der Hydrophüie
HybriWell™ Hybridization System vs. 3M Anti-Fog Hydrophüie Film
Ziel: Handelsübliche Kammersysteme, beispielsweise das HybriWell™ Hybridization System von Grace Bio-Labs, USA, neigen durch ihre hydrophobe Oberfläche zu einer suboptimalen Verteilung von Reaktionsflüssigkeiten in der Hybridisierungskammer. In der Praxis wird dadurch die Reaktionsoberfläche nur unzureichend mit Analyt inkubiert, was letztlich die Qualität der Hybridisierung beeinträchtigen kann. Die Unterschiede der Flüssigkeitsverteilung in Abhängigkeit zur Kammeroberfläche wollen wir in diesem Versuch dokumentieren. Dafür haben wir das kommerziell verfügbare Kammersystem HybriWell™ Hybridization System mit dem von uns entwickelten Kammersystem verglichen.
Versuehsaufbau: 30 μl einer 0.25%igen Cresol Red wurden mit einer 100 μl Pipette in den Kammerbereich pipettiert. Die Flüssigkeitsverteilung wurde mit einer Kamera dokumentiert.
Ergebnis: Das Ergebnis ist in Figur 26 wiedergegeben. Deutlich ist die unterschiedliche Flüssigkeitsverteilung in beiden Hybridisierungskammern zu erkennen. Wälirend sich der Tropfen in der Kammer des Biotype Kammersystem weitläufig verteilt, nimmt er im Fall des HybriWell™ Hybridization Systems der Fa. Grace Bio-Labs eine Kugelform an.
Fazit: Die hydrophilen Eigenschaften des Biotype Kammersystems erlauben, im Vergleich zu anderen, kommerziell verfügbarer Kammersystemen, eine deutlich verbesserte Flüssigkeitsverteilung in der Kammer.
Beispiel 3: Stabilität der Hybridisierungskammer im Verbund mit einem DNA- Chipsubstrat gegenüber physikalischen und chemischen Beanspruchungen
Hintergrund: Für die Automatisierung der Reaktions- und Waschschritte der ALR muss die Stabilität des Verbundes zwischen Hybridisierungskammer und Chipsubstrat unter den jeweiligen Reaktionsbedingungen gewährleistet sein.
Versuchsaufbau: Zur Testung wurde eine Ausfiihrungsform der vorliegenden Erfindung, wie in Abbildung 8 dargestellt und in deren Legende erläutert ist, benutzt. Die Kammern wurden mit folgenden wässrige Lösungen befüllt: Deionisiertes Wasser (MilliQ Plus Anlage, Millipore GmbH, Schwalbach, Deutschland), 1 M Natriumhydroxid, 5 M Natriumhydroxid, 3 M Salzsäure, 37%ige Salzsäure, Tag DNA Ligasepuffer (20 mM Tris(hydroxymethyl)- ammomethan/HCl pH 7,6 (bei 25 °C), 25 mM Kaliumacetat, 10 mM Magnesiumacetat, 1 mM Nicotinamide adenine dinucleotide, 10 mM Dithiothreitol, 0,1 % Triton X-100; New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Deutschland) und 0,3%iger-4Alcanox Powdered Precision Cleaner (Alcanox Inc. White Plains, New York, USA). Das Alcanox-Pulver ist laut Sicherheitsdatenblatt der Firma Alcanox zusammengesetzt aus 10-30 % Natrium- Dodecylbenzenesulfonat, 7-10 % Natriumcarbonat, 10-30 % Tetranatriumpyrophosphat, 10- 30 % Natriumphosphat und Ethylendiamin-tetraessigsäure in nicht genannter Konzentration. Der pH-Wert der 0,3%igen Gebrauchslösung betrug 9,5. Zur besseren visuellen Beurteilung der Kammerdichtigkeit wurden den Lösungen teilweise 0,05 Vol% einer gesättigten wässrigen Bromphenolblaulösung hinzugefügt. Die Inkubation erfolgte für 1 h in einem Thermomixer Comfort mit Wechselblock für 1 bis 4 Standardobjektträger (Eppendorf AG, Hamburg, Deutschland).
Ergebnisse: Für die genannten Natronlauge- und Salzsäurelösungen war die Klebeverbindung zwischen dem oberen Teil der Erfindungsgemäßen Vorrichtung und den DNA-Chipsubstrat stabil. Dies sogar bis zu einer Temperatur von 25 °C. Bei Inkubation mit einer 0,3%igen Alconox-Lösung war der Verbund bis zu einer Temperatur von 60 °C stabil. Bei Inkubation mit Wasser und DNA-Ligasepuffer war die Klebeverbindung erstaunlicherweise sogar bis zur einer Temperatur von 70 °C stabil.
Beispiel 4: Lager Stabilität nach wiederholtem Einfrieren und Auftauen Hintergrund: Um die Stabilität von funktionalisierten DNA-Arrays zu gewährleisten müssen diese im trockenen Zustand bei - 20 °C gelagert und versendet werden. Versuchsaufbau : Für die Testung wurde die Ausführungsform einer erfindungsgemäßen Vorrichtung aus einem DNA-Substrat und Hybridisierungskammer gemäß Abbildung 8 zusammen mit einem Tocknungsmittelbeutel (TA Mini Bag, Tropack Packmittel GmbH, Lahnau- Waldgirmes, Deutschland) in einem Aluminiumbeutel (BN 5695401352, Stroebel GmbH, Langenzenn, Deutschland) gelegt. Dieser wurde anschließend mit der Vakuum- Verpackungsmaschine Boss NT21 (Helmut Boss Verpackungsmaschinen KG, Bad Homburg, Deutschland) nach Herstellerangaben unter Anlegen eines Unterdrucks versiegelt und für 24 h bei -20 °C gelagert. Anschließend wurde die Verpackungseinheit aufgetaut und 6 h bei Raumtemperatur gelagert. Dieser Zyklus aus Einfrieren und Auftauen wurde insgesamt fünfmal durchgeführt. Anschießend wurde die Verpackung geöfmet und die Dichtigkeit der Kammern durch Befüllen und Inkubation mit DNA-Ligasepuffer (1 h, 70 °C, siehe Beispiel 3) und 0,3%iger Alcanox Powdered Precision Cleoner- ös ag (1 h, 60 °C, siehe Beispiel 3) geprüft. Ergebnis: Erstaunlicherweise konnte hierdurch gezeigt werden, dass die erfindungsgemäße Vorrichtung auch unter diesen Bedingungen ihre Dichtigkeit nicht verliert.