Vorrichtung zur Anreicherung/Abtrennung von nicht-methylierte CpG-Motive enthaltender DNA

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Anreicherung/Abtrennung von nicht-methylierte Cytidin-Phosphat-Guanosin-Dinukleotide (CpG-Motive) enthaltender DNA, wobei die Vorrichtung ein Protein umfaßt, das nicht-methylierte CpG-Motive einer DNA spezifisch bindet.

Durch Bakterien verursachte Infektionen sind eine der häufigsten Ursachen für Entzündungskrankheiten. Zur Prognose des Krankheitsverlaufes sowie insbesondere zur rechtzeitigen Auswahl geeigneter therapeutischer Maßnahmen ist der frühzeitige Nachweis der bakteriellen Erreger von entscheidender Bedeutung.

Zum Nachweis bakterieller Erreger werden auch heute noch hauptsächlich verschiedene kulturabhängige Methoden angewendet. Aktuelle Studien verdeutlichen jedoch die mangelnde Eignung von kulturabhängigen Methoden zum Erregernachweis (Hellebrand W., König-Bruhns C, Hass W., Studie zu Blutkulturdiagnostik im Jahr 2002, Poster Jahrestagung der Deutschen Gesellschaft für Hygiene und Mikrobiologie, Göttingen 2004; Sträube E (2003) Sepsis - microbiological diagnosis. Infection 31 :284). Demnach konnten nur bei ca. 15-16% aller untersuchten Blutkulturen die Erreger ermittelt werden. Die Nachteile dieser Methoden führten dazu, dass gerade in der letzten Dekade parallel zur stürmischen technologischen Entwicklung der Molekularbiologie verstärkt nach Alternativen gesucht wurde. Erste Berichte zum Einsatz kulturunabhängiger Nachweisverfahren bakterieller Erreger, welche auf dem Prinzip der Polymerasekettenreaktion (PCR) beruhen, stammen vom Anfang der 90er Jahre. So konnten beispielsweise Miller und Kollegen (Miller N, Journal of Clinical Microbiology, 1994 Feb;32(2):393-7) zeigen, dass kulturunabhängige Verfahren den klassischen Kultivierungs- und Mikroskopietechniken beim Nachweis von Mycobacterium tuberculosis überlegen sind. In letzter Zeit haben aber weitere molekularbiologische Methoden, die auf dem Nachweis erregerspezifischer Nukleinsäuren basieren, an Bedeutung gewonnen (z.B. M. Grijalva et al. Heart 89 (2003) 263-268; Uyttendaele M. et al. Lett Appl Microbiol. 2003,37(5): 386-91 ; Saukkoriipi A et al. Moi Diagn. 2003 Mar7(1 ): 9-15; Tzanakaki G. et al. FEMS Immunol Med Microbiol. 2003 Oct 24; 39(1 ): 31-6).

Neben der hohen Spezifität solcher molekularbiologischer Methoden ist der geringe Zeitbedarf als wesentlicher Vorteil gegenüber konventionellen kulturabhängigen Methoden zu nennen. Allerdings ist die Sensitivität des Nachweises prokaryonter DNA direkt aus Körperflüssigkeiten und nicht vorbehandeltem Untersuchungsmaterial im Vergleich zur Kultur der Mikroorganismen bislang viel zu gering. Eine für den direkten Erregernachweis aus nicht vorbehandeltem Untersuchungsmaterial ausreichende Menge an Nukleinsäuren von Bakterien wird auch im Bereich der 16S-rRNA- Analyse, mittels PCR der 16S Region auf dem bakteriellen Chromosom und der anschließenden Sequenzanalyse des PCR Fragmentes, trotz mehrerer Kopien im Genom nur eingeschränkt erreicht. Der direkte spezifische Erregernachweis mittels 16S-rRNA Sequenzanalyse setzt voraus, dass sich nur eine Erreger-Spezies in der zu untersuchenden Probe befindet. Befinden sich verschiedene Erreger-Spezies in der Probe, ist ein spezifischer Nachweis über Sequenzzierung der 16S-rRNA Region nur begrenzt möglich, da sich die Sequenzen der ausgewerteten Gene oft überlagern.

Am häufigsten erfolgt der erregerspezifische Nukleinsäurenachweis durch Nukleinsäure- Amplifikationstechniken (NAT), wie beispielsweise die Vervielfältigung der prokaryonten DNA mittels der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) bzw. der Ligase-Kettenreaktion (LCR). Der hohen Spezifität und schnellen Verfügbarkeit der Ergebnisse stehen die Störanfälligkeit durch Kontaminationen oder stark reaktionshemmende Faktoren in klinischen Proben gegenüber.

Bei einem herkömmlichen PCR-Nachweisverfahren muß für eine erfolgreiche Detektion von Erregern im Blut theoretisch mindestens 1 Target-DNA des Erregers in 10 μl Blut vorhanden sein. Das entspricht ca. 100 Targets in 1 ml Blut bzw. 1000 Targets in 10 ml Blut. Anders verhält es sich bei der Blutkultur zum Nachweis von Erregern einer Infektion. Hier liegt die untere Nachweisgrenze bei etwa 3-5 Bakterien pro 10 ml Blut. Diese Nachweisgrenze wird derzeit mit PCR-Verfahren noch nicht erreicht, auch nicht mit solchen, die ihre Zielsequenz im Bereich der 16S-rRNA Region auf dem Chromosom haben. Obwohl mehrere die 16S-rRNA kodierende Regionen auf dem bakteriellen Chromosom lokalisiert sind, meist 3 bis 6, bleibt die Voraussetzung, daß sich mindestens ein Molekül der Template-DNA im PCR-Reaktionsgemisch befindet, unerfüllt.

Eine verbesserte diagnostische Sicherheit ist von PCR-Verfahren zu erwarten, deren spezifische Zielsequenzen für speziesspezifische Proteine kodieren, entweder im Chromosom oder auf Plasmiden der Mikroorganismen. Auch hier ist die Nachweisgrenze im oben angegebenen Bereich. Gerade unter dem Einfluß einer laufenden Antibiotikatherapie kann das Wachstum der Erreger stark verlangsamt, eingeschränkt oder blockiert sein, auch wenn das eingesetzte Antibiotikum letztlich nicht optimal wirksam ist. Diese Situation ist gerade bei solchen Patienten häufig anzutreffen, die bereits unter Antibiotikatherapie stehen und bei denen aus diesem Grund keine krankheitsverursachenden Bakterien aus den Blutkulturen oder anderen Proben (wie z.B. Trachealabstrichen, bronchoalveolären Lavagen (BAL) etc.) angezüchtet werden können.

Wegen der unzureichenden Sensitivität hat der erregerspezifische Nukleinsäurennachweis ohne Amplifikationsschritt durch direkten Nachweis der prokaryonten DNA (Sondentechnik, FISH-Technik) nur bei ausreichend hoher Keimzahl im Untersuchungsmaterial diagnostische Bedeutung.

Die wesentliche Problematik des Nachweises prokaryonter DNA zur Identifikation bakterieller Erreger in Körperflüssigkeiten besteht neben den PCR-hemmenden Bestandteilen im Untersuchungsmaterial vor allem in der geringen Konzentration prokaryonter DNA und dem damit einhergehenden überschuß eukaryonter gegenüber prokaryonter DNA. Hierbei sind insbesondere kompetitive Prozesse bei der DNA-Analyse sowie die geringe Menge an prokaryonter DNA als hinderlich für einen qualitativen und quantitativen Erregernachweis anzusehen.

Die üblichen Methoden zur DNA-Isolierung reichern die Gesamt-DNA einer Körperflüssigkeit an, so daß das Verhältnis von Wirts-DNA zu mikrobieller DNA zwischen 1 :10 ^'6 und 1 :1er ⁸ betragen kann. Aus diesem Unterschied ist die Schwierigkeit des Nachweises mikrobieller DNA in Körperflüssigkeiten gut nachzuvollziehen.

Im Ergebnis werden dem klinisch tätigen Arzt durch die mangelnde Eignung von kulturabhängigen Methoden sowie aufgrund der oben genannten Probleme durch Nukleinsäuretestverfahren für den Erregernachweis fälschlicherweise negative Befunde übermittelt. Dadurch kann eine gezielte antibiotische Therapie entweder gar nicht oder nur viel zu spät eingeleitet werden. Der Arzt ist in solchen Fällen auf sein Erfahrungswissen und allgemeine Richtlinien (wie z.B. der Paul-Ehrlich-Gesellschaft) angewiesen und wird daher viel zu allgemein antibiotisch behandeln. Der nicht zielgenaue Einsatz von Antibiotika birgt eine Reihe von Risiken nicht nur für den einzelnen Patienten (wie z.B. unnötige Nebenwirkungen in Form von Nierenschäden etc.), sondern auch für die gesamte Gesellschaft (z.B. die Entwicklung zusätzlicher Antibiotikaresistenzen wie MRSA (Methicillinresistente Staphylocuccus aureus, etc.). Der Nachweis der klinisch bedeutsamen Pathogenitätsfaktoren und Resistenzen von Bakterien auf chromosomaler und Plasmid-Ebene, also letztendlich auf DNA-Ebene, bietet für die Diagnose vieler Infektionserkrankungen, aber auch der Sepsis, erhebliche Vorteile. Dies gilt um so mehr, da auf dieser Ebene auch eine Unterscheidung zwischen pathogenen und kommensalen Bakterien getroffen werden kann. Es wäre demnach eine Vorrichtung wünschenswert, die es ermöglicht, die Sensivität der kulturunabhängigen Nachweisverfahren zu steigern.

Prokaryonte DNA unterscheidet sich von eukaryonter DNA durch das Vorkommen nicht-methylierter CpG-Motive (Hartmann G et al., Deutsches ärzteblatt, Jg. 98/15:A981-A985 (2001 ). In der prokaryonten DNA befinden sich CpG-Motive in einem 16-fachen überschuß im Vergleich zu eukaryonter DNA, die solche Motive nur übergangsweise enthält, z.B. in Krebszellen oder Promotorregionen. In prokaryonter DNA sind diese Motive nicht-methyliert, wohingegen sie in eukaryonter DNA zum größten Teil methyliert sind, was die Unterschiedlichkeit nochmals erhöht.

Nicht-methylierte CpG-Motive sind nicht-methylierte Deoxycytidylat-Deoxyguanylat-Dinucleotide innerhalb des prokaryonten Genoms oder innerhalb von Fragmenten desselben.

Es ist weiterhin bekannt, dass sich aus unterschiedlichen Methylierungsmustern innerhalb der humanen DNA diagnostische Aussagen für Krebserkrankungen ableiten lassen (Epigenetics in Cancer Prevention: Early Detection and Risk Assessment (Annais of the New York Academy of Sciences, VoI 983) Editor: Mukesh Verma ISBN 1-57331-431-5). Anhand von methylierten und nicht- methylierten Cytosinen im Genom lassen sich gewebe-, aber auch krankheitsspezifische Muster identifizieren. Die spezifischen Methylierungsmuster für eine Krankheit ermöglichen zum einen eine Diagnose zu einem sehr frühen Zeitpunkt, zum anderen auch eine molekulare Klassifikation einer Krankheit und die wahrscheinliche Reaktion eines Patienten auf eine bestimmte Behandlung. Ausführliche Informationen hierzu können beispielsweise aus Beck S, Olek A, Walter J.: From genomics to epigenomics: a loftier view of life.", Nature Biotechnology 1999 Dec;17(12):1144 oder aus WO 200467775 entnommen werden.

In Cross et al. wurde gezeigt, dass es möglich ist, unterschiedlich methylierte genomische humane DNA zu trennen, indem die methylierte CpG-Motive an ein Protein gebunden werden (Cross SH, Charlton JA, Nan X, Bird AP, Purification of CpG islands using a methylated DNA binding column, Nat Genet. 1994 Mar. 6(3):236-44). Dieses Verfahren dient zur Bindung methylierte CpG-Motive enthaltender DNA. Eine ausreichende Trennung von nicht-methylierter und methylierter DNA ist aus technischen Gründen nicht möglich, da dass verwendete Protein auch nicht-methylierte DNA schwach bindet. Auch eine Anreicherung von nicht-methylierter DNA ist mit diesem Verfahren nicht möglich, da die Kapazität des verwendeten Proteins nicht ausreicht, um bei einem hohen überschuss an methylierter DNA in ausreichendem Maße von nicht-methylierter DNA zu trennen. Weiterhin bleibt durch die Bindung der methylierten DNA das Ausgangsvolumen in welchem sich die nicht-methylierte DNA befindet unverändert, so dass keine Anreicherung erreicht wird.

Aus Voo et al. ist bekannt, dass das humane CpG-bindende Protein (hCGBP) in der Lage ist, nicht- methylierte CpG-Motive zu binden. Die Publikation beschreibt den transkriptionsaktivierenden Faktor hCGBP, von dem gezeigt wurde, dass er eine Rolle in der Regulation der Expression von Genen innerhalb von CpG-Motiven spielt.

In der EP 02020904 wurde ein Verfahren beschrieben, das die Trennung und Anreicherung von prokaryonter DNA aus einem Gemisch aus prokaryonter und eukaryonter DNA durch Bindung der prokaryonten DNA an ein spezifisch nicht-methylierte DNA bindendes Protein ermöglicht.

In der DE 10 2004 010 928.1 wurde ein Protein näher beschrieben, das in der Lage ist, spezifisch CpG-Motive enthaltende DNA zu binden. Weiterhin wurde in der DE 10 2005 001 889.0 ein Verfahren beschrieben, das die Bindungsstärke und -effizienz des Proteins aus der DE 10 2004 010 928.1 steigert.

Es wäre also wünschenswert, nicht-methylierte DNA von methylierter DNA abtrennen und nicht- methylierte DNA anreichern zu können, um so prokaryonte von eukaryonter DNA bzw. unterschiedlich methylierte humane DNA voneinander zu trennen. Es wäre zudem wünschenswert und von hohem gesundheitsökonomischen Interesse, dass die Trennung und Anreicherung von nicht-methylierter DNA auch aus einem Gemisch (beispielsweise Vollblut) erreicht werden könnte, das durch einen hohen überschuß an methylierter DNA charakterisiert ist.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung bereitzustellen, die die Abtrennung und/oder Anreicherung von nicht-mehtylierte CpG-Motive enthaltender DNA, insbesondere die Anreicherung/Abtrennung prokaryonter DNA, aus Untersuchungsproben mit hohem Anteil methylierte CpG-Motive enthaltender DNA, insbesondere eukaryonter DNA, beispielsweise von Patienten mit Infektionen, ermöglicht.

Erfindungsgemäß wird dies durch eine Vorrichtung gemäß dem Schutzanspruch 1 erreicht, die ein Reaktionsgefäß mit mindestens einer öffnung und ein Protein, das nicht-methylierte CpG-Motive über eine Bindungsstelle spezifisch erkennt, wobei das Protein eine 25%ige bis 35%ige Homologie zum Wildtyp-CGPB-Protein aufweist und gegenüber diesem verkürzt ist, wobei sich das Protein innerhalb des Rekationsgefäßes befindet, umfaßt.

Bevorzugte Ausführungsformen sind in den Schutzansprüchen 2 bis 14 angegeben.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung umfaßt ein Protein, das nicht-methylierte CpG-Motive bindet, wobei es eine 25%ige bis 35%ige, insbesondere etwa 27,6%ige, Homologie zum Wildtyp-CGPB- Protein aufweist, wobei die Bindungsstelle für nicht-methylierte CpG-Motive in dem Protein der erfindungsgemäßen Vorrichtung enthalten ist, und es gegenüber dem Wildtyp-Protein verkürzt ist, vorzugsweise bis maximal zur Länge der Bindungsstelle für nicht-methylierte CpG-Motive. Dies bedeutet, daß es nur maximal soweit verkürzt ist, daß die Bindungsstelle für nicht-methyliert CpG- Motive erhalten bleibt.

Als Wildtyp-CGPB-Protein (oder CPGbP656) wird im folgenden das humane CGPB-Protein (vgl. Voo et al., Mol Cell Biol. 2000 Mar; 20(6): 2108-21 ) bezeichnet. Proteine, die bevorzugt in der erfindungsgemäßen Vorrichtung eingesetzt werden können, werden im folgenden als CPGbPI 87 und CPGbP181 bezeichnet.

Das Wildtyp-CGPB-Protein CPGbP656 bindet nicht-methylierte CpG-Motive prokaryonter DNA, wobei ein Protein-DNA-Komplex gebildet wird. Dieser kann z.B. auf einem Träger gebunden sein oder werden, wodurch eine Trennung und/oder Anreicherung der DNA erfolgen kann. Das Protein der erfindungsgemäßen Vorrichtung besitzt eine verbesserte Bindungseigenschaft gegenüber nicht- methylierten CpG-Motiven prokaryonter DNA als das Wildtyp-CGPB-Protein und Varianten davon mit 80% oder mehr Homologie, insbesondere das Protein CPGbPI 87 mit 187 Aminosäuren (SEQ ID Nr. 1 ), und das CPGbPI 81 mit 181 Aminsäuren (SEQ ID Nr. 2), die eine 27,6%ige Homologie zum Wildtyp-CGPB-Protein aufweisen.

Das in EP 02020904 beschriebene Protein (CPGbP241 ), das eine verkürzte Variante des Wildtyp- CGPB-Proteins (CPGbP656) ist und als Grundlage für das Protein CPGbPI 81 und das Protein CPGbPI 87 der erfindungsgemäßen Vorrichtung dienten, hat eine Länge von 241 Aminosäuren.

Das Wildtyp-CGBP-Protein hat eine Länge von 656 Aminosäuren, 135 positiv und 94 negativ geladene Reste.

Das Protein der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird bevorzugt durch Klonierung der entsprechenden cDNA-Sequenz in ein Plasmid und Expression in Escherichia coli hergestellt. Ein das Protein exprimierender E.co//-Stamm wurde am 16. Februar 2004 unter der Nr. DSM 16229 bei der Deutschen Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen hinterlegt. Alternativ können andere, dem Fachmann vertraute Verfahren zur Herstellung angewendet werden. Die Nutzung des Plasmids pQE9 stellt dabei eine beispielhafte Möglichkeit dar, aber jedes andere geeignete Plasmid ist als Vektor einsetzbar. Die Expression in E. coli stellt ebenfalls nur ein Beispiel dar. Eine Expression in anderen prokaryonten System als auch in einem eukaryonten System als auch die chemische oder enzymatische Synthese oder die Aufreinigung aus einer genetisch veränderter Tabakpflanze sind weitere mögliche Ausführungsformen der Proteingewinnung. Das Protein kann sowohl im Labormaßstab (z.B. im Erlenmeyerkolben) als auch im industriellen Maßstab (z.B. Fermenter) hergestellt werden. Das erfindungsgemäße Protein kann z.B. mittels Bindung von an den Anfang oder das Ende des Proteins eingebrachten Histidin-Reste (His-tag) an eine geeignete nickelhaltige Matrix gereinigt werden, eine Methode, die dem Fachmann bekannt ist.

Weitere Möglichkeiten der Reinigung können jegliche Art von Fusionsproteinen umfassen, die eine Aufreinigung über geeignete Matrices (Säulen, Gele, Beads etc.) erlauben. Andere Formen von tag's können Fusionspeptide / -proteine, z.B. Streptavidin-tag, Myc-tag und andere sein.

Eine bevorzugte Form des Proteins der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist die native Form, aber auch eine denaturierte Form ist zur Bindung nicht-methylierter CpG-Motive geeignet. Unter „denaturierten Formen" im Sinne der vorliegenden Erfindung werden andere Sekundärstrukturen als die in der Natur vorkommenden verstanden.

Die native oder auch denaturierte Form des Proteins stellt eine beispielhafte Ausführungsform dar. Die Erfindung schließt die in wfro-Synthese sowie alle weiteren chemischen oder enzymatischen Modifikation des Proteins ein, wie z.B. Einbau von Disulfidbrücken, Glykosylierungen, Phosphorylierungen, Acylierungen, Aminosäureaustausche sowie Fusion mit Proteinen oder anderen Molekülen ein. Solche Modifikationen können z.B. durch Rekombination und/oder Expression und/oder chemische und/oder enzymatische Modifikation einzelner oder mehrerer Aminosäuren erzielt werden.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung weist eine Vielzahl von Vorteilen auf. So kann über das darin enthaltene Protein besser als das Wildtyp-CGPB-Protein oder Varianten davon mit 80% oder mehr Homologie nicht-methylierte CpG-Motive enthaltende DNA beispielsweise prokaryonte DNA über nicht-methylierte CpG-Motive binden. Dadurch ist es beispielsweise möglich, aus einem Gemisch von prokaryonter und eukaryonter DNA die prokaryonte DNA spezifisch abzutrennen und/oder anzureichern. Dies ermöglicht letztendlich einen schnellen und einfachen Erregernachweis sowie eine frühzeitige Diagnose von Infektionen, die durch bakterielle Erreger verursacht sein können. Vice versa kann die Erfindung auch zur Abreicherung mikrobieller DNA im Sinne einer Reinigung bei klinischen Zuständen angewandt werden, die mit einem unphysiologischen Vorkommen von Bakterien oder deren Spaltprodukten Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, von Patienten einhergehen. Dies gilt um so mehr, da gut belegt ist, daß Bakterien aber auch deren Spaltprodukte, wie beispielsweise bakterielle DNA, für eine Vielzahl den Patienten schädigenden biologischen Effekte verantwortlich sind.

Antikörper, die gegen die Proteine der erfindungsgemäßen Vorrichtung gerichtet sind, können mono- oder polyklonale Antikörper sein. Sie können in an sich bekannter Weise hergestellt werden, wozu der Fachmann die notwendigen Materialien und Methoden kennt. Die Antikörper können zur Isolierung und Quantifizierung der Proteine verwendet werden. Auch hierbei handelt es sich um an sich bekannte Einsatzmöglichkeiten, für die der Fachmann die notwendigen Materialien und Methoden kennt.

Die Erfindung wird nachfolgend unter Bezugnahme auf die Figuren beschrieben, wobei

Figur 1 eine Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung wiedergibt;

Figur 2 eine weitere Ausführungsform der Vorrichtung zeigt; und

Figur 3 eine hochparallele Ausführungsform der Vorrichtung wiedergibt.

Der Begriff "Homologie" im Sinne der vorliegenden Erfindung bezeichnet den Grad der übereinstimmung von zwei Protein-Sequenzen. Dabei bedeutet 60%ige Homologie, daß 60 von 100 Aminosäure-Positionen in den Sequenzen übereinstimmen. Der Ausdruck "verkürzt" wie er zur Charakterisierung des erfindungsgemäßen Proteins verwendet wird, bedeutet, daß die Länge der Aminosäuresequenz des Proteins gemäß SEQ-ID Nr. 1 kürzer als die Länge der Aminosäuresequenz des Wildtyp-CPGB-Proteins (CPGbP656) ist. Die Verkürzung erfolgt am N-terminalen und am C-terminalen Ende der Wildtyp-Proteinsequenz. Die größte Verkürzung stellt dabei die Reduktion der Sequenz bis zur DNA-Bindestelle des Proteins dar.

Das Reaktionsgefäß der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann jede beliebige Form besitzen, welche in der Lage ist, das nicht-methylierte DNA bindende Protein aufzunehmen. Als vorteilhafte Ausführungsform hat sich ein Reaktionsgefäß erwiesen, das eine zylindrische Form besitzt.

Das Reaktionsgefäß besitzt mindestens eine öffnung, die zum Befüllen des Reaktionsgefäßes dient. Diese öffnung kann derart gestaltet sein, dass sie mittels eines Schraubverschlusses oder einer Passung kraftschlüssig und lösbar verschlossen werden kann (Figur 1 ).

In einer weiteren Ausführungsform besitzt das Reaktionsgefäß sich gegenüberstehende öffnungen.

In einer weiteren Ausführungsform ist das sich in dem Reaktionsgefäß befindende Protein an eine Matrix gekoppelt. Das Protein kann hierbei direkt oder indirekt an die Matrix gekoppelt sein. Als Matrix kommen hierbei Filtermembranen, Harze, Perlzellulose, Sepharose, Silica, Mikropartikel oder andere dem Fachmann bekannte Trägermaterialien zum Einsatz. In einer weiteren Ausführungsform ist das Protein an einen gegen das Protein gerichteten Antikörper gekoppelt.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Reaktionsgefäß mit einem Auffanggefäß verbunden, so dass eine öffnung des Reaktionsgefäßes durch das Auffanggefäß umschlossen wird. Mit dieser Ausführungsform wird ein im wesentlichen abgeschlossener Hohlraum zwischen Reaktionsgefäß und Auffanggefäß geschaffen, der zur Aufnahme der Wasch- und Elutionsflüssigkeiten dient (Figur 2).

Die erfindungsgemäßen Vorrichtungen können für eine parallele Reaktionsführung so angeordnet werden, dass die Anordnung eine Mehrzahl der erfindungsgemäßen Vorrichtungen umfaßt, bevorzugt in Form einer Matrix, besonders bevorzugt im Mikrotiterplattenformat. Mit dieser Anordnung wird ein Einsatz in automatisierter Form mittels Pipetierrobotern ermöglicht.

Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Beispielen erläutert, ohne sie aber darauf einzuschränken.

Beispiel 1 : Herstellung eines Proteins der erfindungsgemäßen Vorrichtung

Aus der DNA Sequenz für das komplette CPGbP Protein wurden die Primer 1 (GGATCCGGTGGAGGGCGCAAGAGGCCTG -fw, SEQ ID Nr. 3) und 2 (AAGCTTAGAGGTAGGTCCTCAT-CTGAG-rv, SEQ ID Nr. 4) konstruiert, die ein verkürztes DNA- Fragment amplifizieren, das für ein verkürztes CPG-bindendes Protein, CPGbPI 81 (SEQ ID Nr. 2), kodiert. Das DNA-Fragment wurde nach Spaltung mit den Restriktionsenzymen BamHI und Hind III in den Vektor pQE9 (Qiagen) ligiert. In pQE9 entsteht ein offener Leserahmen, in dem an das 5' Ende ein für 6 x His-Tag kodierendes DNA Fragment fusioniert wird (pQE9[6HisCPGbP181]).

Das Plasmid pQE9[6HisCPGbP181] wurde in den E. coli Expressionsstamm M15[pREP4] (Qiagen) transformiert. Der Klon wird im weiteren M15[pCPGbP181] bezeichnet und das exprimierte Protein rCPGbP181. Die Expression des Proteins rCPGbP181 erfolgte nach folgendem Protokoll: Eine Kolonie des Expressionsstammes M15[pCPGbP181] wird in 2 ml Luria Medium mit 100μg/ml Ampicillin und 25μg/ml Kanamycin bei 37°C unter Schütteln über Nacht angezüchtet. Anschließend wird die Vorkultur in 200 ml vorgewärmtes Nährmedium, das die gleichen Antibiotikakonzentrationen enthält, überführt. Nach 3 Stunden Wachstum bei 37°C unter Schütteln wird IPTG zur Induktion der Expression zugegeben und weitere 5 Stunden inkubiert. Danach werden die Bakterien abzentrifugiert und das Sediment in 5 ml 0.2 M Trispuffer, pH 7.5 resuspendiert. Die Bakterien werden im Eisbad 5 x 1 min mit Ultraschall behandelt. Nach der Zentrifugation wird das Sediment in 10 ml 0.2 M Tris, 2M Harnstoff, pH7.5 resuspendiert und 15 min geschüttelt. Nach erfolgter Zentrifugation wird das verbliebene Sediment in 0.2 M Tris, 6M Guanidinhydrochlorid, 0.001 M Dithioeritrit (DTE), 0.02 M Imidazol aufgenommen und suspendiert. Die Inclusionbodies werden unter Agitation für 1 Stunde bei Raumtemperatur gelöst. Nach Zentrifugation befindet sich das Rohprotein im überstand und kann direkt auf eine 3 ml Ni-Agarosesäule aufgetragen werden. Die nächsten Schritte sollten im Kühlraum bei +4 bis +6°C erfolgen. Zunächst wird die Säule mit 0.2 M Tris, 6M Guanidinhydrochlorid, 0.001 M Dithioeritrit (DTE), 0.02 M Imidazol Puffer, pH7.5 gewaschen bis die Extinktion die Nulllinie erreicht hat. Von hier aus kann rCPGbP181 auf verschiedenen Wegen gewonnen werden: 1. Als denaturiertes Protein gelöst in 6M Guanidinhydrochlorid oder 6 M Harnstoff und 2. als natives Protein löslich in Puffern physiologischer Konzentration. Im 2. Fall ist die Ausbeute aber geringer.

Reinigung nach Methode 1 (denaturiert):

Das Protein rCPGbP181 wird von der Ni-NTA Agarose mit einem Imidazolgradienten von 0 - 0.5 M eluiert M in dem Puffer 0.2 M Tris, 6M Guanidinhydrochlorid, 0.001 M Dithioeritrit (DTE), 0.02 M Imidazol, pH7.5 als Grundlage. Dabei wird rCPGbP181 bei 0.2 - 0.3 M Imidazol von der Säule abgelöst. Das so gewonnene Protein wird gegen 0.2 M Tris, 6M Harnstoff, 0.001 M Dithioeritrit (DTE), pH7.5 dialysiert und eingefroren. Bei Dialyse gegen physiologische Puffer fällt so gereinigtes rCPGbP181 aus.

Reinigung nach Methode 2 (nativ):

Nach dieser Methode wird die Guanidinhydrochlorid Konzentration von 6 molar auf der Ni-NTA Agarose mit dem gebundenem rCPGbP181 über einen Gradienten auf 0 molar Guanidinhydrochlorid gebracht. Grundlage ist der Puffer 0.2 M Tris, 0.5 M NaCI, 0.001 M Dithioeritrit (DTE), 0.02 M Imidazol, pH7.5. Die Flussgeschwindigkeit betrug 0.5 ml/min. Danach wurde zur Elution ein Imidazolgradient von 0 bis 0.5 molar angelegt in Puffer 0.2 M Tris, 0.5 M NaCI, 0.001 M Dithioeritrit (DTE), pH7.5 als Grundlage. Auch hier wurde ein wesentlicher Anteil des gebundenen Proteins (20%) bei 0.2 bis 0.3 molar Imidazol eluiert. Dieses native rCPGbP181-Eluat blieb in diesem Puffer gelöst, auch nach Dialyse in PBS. Von Nachteil ist aber, dass ca. 80% des an Ni-NTA Agarose gebundenen rCPGbP181 unter diesen Bedingungen auf der Säule verblieben und nachträglich nur unter den denaturierenden Bedingungen von Methode 1 noch gewonnen werden konnten. Das heißt, die Ausbeute der verwendeten Methode 2 ergab nur 20% natives, in physiologischen Puffern lösliches rCPGbP181.

Beispiel 2:

Abtrennung/Anreicherung von bakterieller DNA aus einem Gemisch von humaner und bakterieller DNA mittels einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Dieses Beispiel wird anhand der

Figur 4, die eine schematische Beschreibung des Protokolls für den Nachweis bakterieller DNA wiedergibt und der

Figur 5, die einen Vergleich der Ergebnisse der 16S rRNA Gen-PCR zum Nachweis von bakterieller DNA, welche ohne bzw. mit der Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung aus dem buffy coat klinischer Proben gewonnen wurde, zeigt,

beschrieben.

Als beispielhafte Anwendung diente der Nachweis von bakterieller DNA in Vollblutproben von Patienten. Die zu untersuchende DNA wurde mittels dem Fachmann bekannten Verfahren aus dem Buffy Coat des Vollbluts klinischer Proben gewonnen. Somit stand ein Gemisch von humaner und bakterieller DNA für den Nachweis zur Verfügung. Die Beschreibung des Beispiels mit bakterieller DNA dient zur Beschreibung des Ausführungsbeispiels mit einer nicht-methylierte CpG-Motive enthaltende DNA und stellt keine Einschränkung der Erfindung dar.

Kopplung des Proteins gemäß Seq-ID Nr. 1 an die mit Aminohexyl- (AH)-Spacern präparierte Matrix (Sepharose).

Zunächst wurde 1 ml AH-Sepharose nach Zugabe der bivalenten Substanz Glutaraldehyd 15 Minuten bei Raumtemperatur aktiviert. Anschließend wurde die Glutaraldehyd-aktivierte AH-Sepharose mit 0,1 molarem Na ₂ HPO ₄ gewaschen.

Abschließend wurde das Protein (CPGbPI 87 gemäß SEQ ID Nr. 1 ) zur Kopplung auf die Matrix gegeben. Die Bindung des Proteins wurde über dessen freie Aminogruppen an die Glutaraldehyd-aktivierte AH-Sepharose nach einer zweistündigen Inkubation bei Raumtemperatur erreicht. Das überschüssige Protein wurde durch Waschen entfernt.

Nach anschließendem Waschen der Protein-AH-Sepharose mit 0,1 molarem Na ₂ HPO ₄ und Zugabe von 0,1 molarem Glycin wurde die Protein-AH-Sepharose zur Absättigung freier Bindungsstellen 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde die Protein-AH-Sepharose erneut mit 0,1 molarem Na ₂ HPO ₄ gewaschen.

Zur Reduktion der Schiff sehen Base und Stabilisierung der Bindung wurde die Protein-AH-Sepharose mit Natriumborhydrid versetzt und 1 Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde die Protein-AH-Sepharose mit 0,1 molarem Na ₂ HPO ₄ gewaschen. Die Lagerfähigkeit der Protein-AH-Sepharose bei 4°C wird durch Zugabe von 20% Ethanol erreicht.

Konfektionierung der Vorrichtung zur Trennung/Anreicherung von bakterieller DNA

Die Vorrichtung besteht aus einem kommerziell erhältlichen Minizentrifugenröhrchen. Dieses zylindrische Minizentrifugenröhrchen besitzt eine öffnung zum Befüllen sowie einen im Durchmesser kleineren Auslass auf der gegenüberliegenden Seite. Zur Verhinderung des Auslaufens der Protein-AH-Sepharose befindet sich im unteren Drittel des Reaktionsgefäßes eine Fritte, die für Flüssigkeiten jedoch nicht für die Protein-AH-Sepharose durchlässig ist. Nach Befüllen des Reaktionsgefäßes mit Protein-AH-Sepharose wurde das Reaktionsgefäß anschließend mit

TRIS-Puffer gewaschen und stand für die Trennung/Anreicherung von prokaryonter DNA zur Verfügung.

Zugabe des DNA-Gemisches

Zunächst wurde das DNA-Gemisch in das präparierte Reaktionsgefäß gegeben. Das DNA-Gemisch wurde mittels eines Vortex gleichmäßig in dem Reaktionsgefäß verteilt und ca. 1 Minute bei Raumtemperatur inkubiert. Danach wurde das Reaktionsgefäß bei 15000 x g 30 Sekunden bei Raumtemperatur zentrifugiert. Anschließend wurden ca. 100 μl Waschpuffer (W) (10 mM Tris, 1OmM EDTA; pH 7,5) in das Reaktionsgefäß pipettiert und bei 15000 x g 30 Sekunden bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach Wiederholung dieses Waschvorgangs wurden 1000 μl Elutionspuffer (E1 ) (10 mM Tris, 1OmM EDTA, 0,5M NaCI; pH 7,5) in das Reaktionsgefäß pipettiert und wiederum bei 15000 x g 30 Sekunden bei Raumtemperatur zentrifugiert. Nach Wiederholung dieses Elutionsschrittes wurde mit einem weiteren Elutionspuffer (E2) (10 mM Tris, 1OmM EDTA, 1 M NaCI; pH 7,5) in gleicher weise verfahren.

Fällung der bakteriellen DNA

Die in den Elutionspuffern (E1 und E2) gewonnene bakterielle DNA wurde anschließend mit 0,7 Volumenanteil Isopropanol (700μ1 ) gefällt. Das Präzipitat wurde 30 Minuten mit 15000 x g in der Tischzentrifuge sedimentiert, der überstand vorsichtig abgekippt und verworfen. Das Sediment wurde mit 1 ml 70%-igen eiskaltem Ethanol gewaschen und 5 Minuten bei 15000 x g und Raumtemperatur zentrifugiert. Der verbleibende überstand wurde vorsichtig dekantiert. Das Pellet wurde in der Vakuumzentrifuge getrocknet und anschließend in 30-50 μl TE-Puffer aufgenommen.

Nachweis der Abtrennung/Anreicherung der bakteriellen DNA aus dem DNA-Gemisch

Zum Nachweis der Funktionsweise der erfindungsgemäßen Vorrichtung wurden sowohl die aus dem Buffy Coat ohne Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung gewonnene DNA als auch die verschiedenen Fraktionen, welche unter Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung gewonnen wurden, mittels einer 16S rRNA Gen-PCR auf das Vorhandensein von bakterieller DNA untersucht (Figur 4).

Die Qualität der durchgeführten PCR wurde durch Zufügen von Positiv- (Staphylocuccus aureus -DNA als Template) und Negativkontrollen (Mastermix ohne DNA-Zugabe) abgesichert. Des weiteren wurde parallel zu der ohne Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung verwendeten DNA eine definierte Menge an bakterieller DNA (S.aureus-DNA) als Inhibitionskontrolle mitgeführt.

Die Ergebnisse wurden anschließend mittels einer Agarosegelelektrophorese analysiert (Figur 5). Die in Figur 5 gezeigten Banden des Agarosegels haben folgende Bedeutung (von links nach rechts):

F Durchlauf-Fraktion (unter Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung)

W Wasch-Fraktion (unter Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung)

E1 Elutionspuffer 1 (unter Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung)

E2 Elutionspuffer 2 (unter Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung)

DNA aus Buffy coat isolierte DNA (ohne Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung)

I Inhibitionskontrolle (ohne Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung)

P Positivkontrolle

N Negativkontrolle

S Standard

Das Beispiel verdeutlicht, dass in der Durchlauf- und Waschfraktion, in der Negativkontrolle sowie in der DNA, welche ohne Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung untersucht wurde, keine bakterielle DNA nachgewiesen werden konnte. Demgegenüber konnte in den Elutionspuffern 1 und 2, der Positiv- und Inhibitionskontrolle eindeutig das Vorhandensein von bakterieller DNA durch Nachweis des 16S rRNA Gens mittels PCR gezeigt werden. Das positive Ergebnis der Inhibitionskontrolle schließt eine mögliche Hemmung der DNA-Probe, welche ohne Nutzung der erfindungsgemäßen Vorrichtung analysiert wurde, aus.

Somit zeigen die Ergebnisse, dass die beschriebene erfindungsgemäße Vorrichtung in der Lage ist, bakterielle DNA aus Patientenproben mit einem hohen Anteil humaner DNA abzutrennen/anzureichern und für eine anschließende Analyse verfügbar zu machen.