РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

Предложенное устройство относится к медицине и медицинской биотехнологии, а именно к регенеративной медицине и клеточной технологии и может быть использовано для обработки жировой ткани, полученной при липосакции, для дальнейшего использования в качестве источника мезенхимальных стромальных клеток, стромальной васкулярной фракции жировой ткани, для липофилинга или криоконсервирования.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ

Интактная жировая ткань представляет собой богатую кровеносными сосудами ткань, состоящую из зрелых жировых клеток (адипоцитов), стромально- васкулярной клеточной фракции и поддерживающей стромы.

Стромально-васкулярная клеточная фракция (СВФ) - это клеточный комплекс, включающий в себя стволовые клетки жировой ткани (СКЖТ), эндотелиальные и гладкомышечные клетки кровеносных сосудов и их предшественники, перициты, фибробласты, клетки крови - эритроциты и лейкоциты. Основным компонентом СВФ являются стволовые клетки жировой ткани, способные к самообновлению и мультипотентной дифференцировке. Благодаря их пластичности, они считаются наиболее перспективными объектами для клеточной терапии, находят свое применение при лечении различных травм и заболеваний.

Впервые выделение стромально-васкулярной фракции жировой ткани было описано в 2001 г. году в журнале «Tissue Engineering* Zuk с соавт. Для выделения СВФ авторы использовали ферментативную обработку с последующей отмывкой и осаждением центрифугированием ядросодержащих клеток. СВФ изначально использовалась для получения чистой популяции СКЖТ путем культивирования.

С этого времени были проведены многочисленные исследования возможностей клинического применения SVF и ADSCs, показавшие значительные перспективы использования этих клеток в клинической практике. Клиническое применение стромально-васкулярной фракции включает регенерацию мягких тканей и костей, косметические дефекты, хронические трофические и лучевые язвы, ожоги, болезнь Крона, рассеянный склероз, при реакции трансплантат против хозяина, при инфаркте миокарда и инсультах различного генеза.

В то же время существует целый ряд ограничивающих факторов и, в первую очередь, связанных с разработкой эффективной и безопасной технологии выделения и изоляции клеточного материала.

Известен способ выделения стволовых клеток из жировой ткани с использованием ручного метода (Zuk P. A., Zhu М., Mizuno Н. et al. Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Eng. 2001 ; 7(2): 21 1 -28.). Данный метод основан на обработке липоаспирата 0,075% раствором коллагеназы I типа при температуре 37°С в течение 30 минут и последующим центрифугированием получившейся суспензии при 800 д. После центрифугирования суспензия клеток разделяется на две фракции: в верхнем слое - супернатанте находятся адипоциты, а в осадке - стромально-васкулярная фракция с примесью эритроцитов, которые удаляли во время инкубации в лизирующем растворе хлорида аммония. Недостатками данного метода являются высокие временные и организационные затраты, наличие «человеческого фактора», высокий риск нарушения стерильности процесса и контаминации биологического материала и конечного продукта.

Из предшествующего уровня техники известно устройство (System for processing lipoaspirate cells ЕР 1921 133 A2, CYTORI THERAPEUTICS, INC (US), МПК A61 K31 /436, опубл. 14.05.2008), представляющее собой замкнутую систему для обработки липоаспирата, полученного в ходе липосакции. Система подсоединяется непосредственно к липоаспирационной канюле. Включает вакуумный насос, контейнер для сбора липоаспирата, миксер для смешивания обработанного биоматериала с добавками и активаторами, систему из двух фильтров с порами разного диаметра. Первый фильтр разделяет липоаспират на 2 фракции, где одна фракция содержит популяцию клеток, включающую в себя стволовые клетки жировой ткани, а другая фракция содержит липиды, кровь, адипоциты и солевой раствор. При этом первый фильтр вращается и конструктивно делит ёмкость на две камеры, для соответствующих фракций, а второй фильтр концентрирует клеточную фракцию перед подачей в миксер. Проводящая магистраль позволяет извлечь конечную фракцию, не нарушая герметичности системы и направить её в центрифугу, затем асептично извлечь полученную фракцию. Устройство позволяет вводить активаторы и добавки. Также система имеет встроенный контроллер температуры. Основным недостатком данного устройства является то, что на первом этапе обработки липоаспират фильтруется без обеспечения разрушения стромы ткани, которая фиксирует клетки стромально-васкулярной фракции и не позволяет им пройти через фильтр, снижая тем, самым концентрацию клеток в пермеате. Также недостатками системы являются магистрали большой протяженности и значительное количество примыканий, являющиеся средой для адгезии и потери целевых клеток.

Из предшествующего уровня техники известно устройство (Device for separating adult stem cell US 20130344589 A1 , HUMAN MED AG (DE), ПК C12M1 /00, опубл, 26.12,2013), представляющее собой систему, включающую контейнер для жировой ткани, снабженный устройством для подачи жидкости с целью отмывки биоматериала, смеси необходимых реагентов, попеременно с извлечением фракции содержащей стволовые клетки, клапаном для выравнивания давления, поршнем, вибратором, полупроницаемой мембраной имеющей электростатический заряд и клапаном, которые делят контейнер на 2 части, контроллером температуры. Одна из камер снабжена устройством для перемешивания исходного биоматериала с добавками, совершающего вращательные и/или маятниковые движения. Основным недостатком данного устройства является метод создания давления за счет поршня, что приводит высокой механической нагрузке на целевые клетки из-за продавливания через фильтр и краевого разрушения клеток в месте примыкания поршня к стенке цилиндра.

В качестве прототипа выбрано устройство для выделения стволовых клеток жировой ткани (System and methods for preparation of adipose-derived stem cells, US 20130012921 A1 , PUSTILNIK FELIX, ПК A61 M37/00, опубл. 10.01 .2013), представляющее собой конусовидную емкость, герметично закрытую крышкой, снабженную разъемами для введения и выведения биоматериала и жидкостей для его обработки, а также вспомогательную пробирку для концентрации, полученной стромально-васкулярной фракции. Недостатками данной системы являются наличие двух пробирок-емкостей, что увеличивает риск контаминации материала, его потери при перенесении между емкостями, влечет дополнительные требования к вспомогательному оборудованию. Кроме этого, в системе отсутствует разделение первичного липоаспирата на фракции, содержащие целевые клетки и побочные продукты обработки, загрязняющие конечный продукт.

РАСКРЫТИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Технической задачей настоящего изобретения является повышение эффективности выделения стромально-васкулярной фракции с сохранением максимальной жизнеспособности клеток и сохранения ее регенераторного потенциала.

Общим техническим результатом изобретения является выделение стромально-васкулярной фракции жировой ткани, характеризующейся высокой концентрацией и жизнеспособностью клеток, отсутствием дебриса и остатков стромы и жировой ткани.

Техническая задача достигается за счет использования герметичного устройства, состоящего из двух камер, расположенных одна над другой и разделенных по крайней мере одним сетчатым фильтром, причем обе камеры представлены в одном корпусе, а нижняя камера объемом 3 - 9 мл имеет килевидную форму, расположена под углом 10 - 45 градусов и вытянута по всей длине устройства.

Предложенное устройство представляет собой замкнутую герметичную систему в виде прозрачной конусовидной емкости с крышкой объемом 300 - 500 мл, с нанесенной внешней градуировкой по объему и системой внутренних пристеночных каналов, причем емкость разделена, по крайней мере, одним сетчатым фильтром, прилегающим заподлицо к границе раздела камер, на две камеры - рабочая камера для обработки ткани с параболическим дном без острых углов в рабочем пространстве и камера для концентрирования клеток, причем камера для концентрирования клеток имеет объем 3 - 9 мл, имеет килевидную форму, расположена под углом 10 - 45 градусов и вытянута по всей длине устройства. Устройство имеет, по крайней мере, 6 изолированных каналов, расположенных на боковых стенках емкости с внутренней стороны, причем вход каждого канала имеет крепление для штуцеров-переходников типа «луер-лок».

Устройство имеет канал для введения биологического материала, заканчивающийся в рабочей камере для обработки ткани.

Устройство имеет канал для введения реагентов и промывочных буферов, заканчивающийся в рабочей камере для обработки ткани.

Устройство имеет по крайней мере 3 канала для отбора супернатанта, причем один заканчивается в рабочей камере у места крепления сетчатого фильтра, а два других заканчивается в области 1 /3 - 1 /2 длинны внутренней камеры.

Устройство имеет канал для отбора конечного продукта - стромально- васкулярной фракции жировой ткани, заканчивающийся у основания емкости в камере для концентрирования клеток, причем выход канала расположен в остром конце киля камеры для концентирования клеток.

Устройство может иметь дополнительные каналы для внесения или отбора компонентов, заканчивающихся в рабочей камере для обработки ткани и/или в камере для концентрирования клеток.

Устройство имеет бактериологический фильтр для выравнивания давления внутри системы, причем бактериологический фильтр расположен на крышке устройства.

Таким образом, биологическая ткань, помещенная в устройство, отмывается от остатков циркулирующей крови; подвергается ферментативной обработке, за счет чего происходит лизис стромальной ткани и выход стромально- васкулярной фракции в среду, разделение клеточного компонента и остатков стромальной и жировой ткани центрифугированием через микрофильтр с последующей отмывкой клеточной фракции от остаточных ферментов и ее концентрирование. За счет параболического дна без острых углов у камеры для обработки ткани и килевидной формы камеры для концентрирования клеток повышается выход клеток. За счет расположения камеры для концентрирования клеток под углом и по всей длине устройства минимизируется риск появления «мертвых» зон и повышается выход клеток. Наличие каналов ввода - вывода с выходами на разном уровне внутри стенки системы позволяет минимизировать общую площадь внутренней поверхности системы, что снижает риск адгезии клеток на поверхности трубок; позволяет контролируемо пристеночно вносить биологический материал и реактивы, что снижает физическое воздействие на биологический материал и повышает степень выживаемости клеток; позволяет полностью отбирать супернатант с остатками стромы жировой ткани, не затрагивая осадок; позволяет полностью отбирать осадок в виде стромально- васкулярной фракции жировой ткани.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

На Фиг. 1 - изображен трехмерный общий вид устройства для фракционирования жировой ткани и выделения стромально-васкулярной фракции

На Фиг. 2 - изображено устройство для фракционирования жировой ткани и выделения стромально-васкулярной фракции в разрезе ОСУЩЕСТВЛЕНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Сущность изобретения поясняется чертежами, где на Фиг.1 и Фиг.2 изображено устройство для фракционирования жировой ткани и выделения стромально-васкулярной фракции, представляющее собой герметичную емкость (А) с крышкой (Б), разделенную сетчатым микрофильтром (В) на две камеры - камеру для обработки ткани (Г) и камеру для концентрирования клеток (Д). Устройство имеет систему внутренних пристеночных каналов: для внесения липоаспирата (1 ), для внесения реактивов и буферов (2), для отбора супернатанта и излишек жидкости (3-5), для отбора стромально-васкуклярной фракции (6).

ПРИМЕР ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ СПОСОБА

Приведенный пример не предназначен для ограничения изобретения, а предложен исключительно в качестве иллюстрации.

В общем виде работа устройства представляет собой процесс постадийной отмывки и обработки жировой ткани протеолитическими ферментами с целью выделения стромально-васкулярной фракции, где жировую ткань - липоаспират вносят в устройство - герметичную емкость (А), а именно в камеру для обработки ткани (Г) через канал (1 ). Биологическая ткань отмывается от остатков крови в буферном растворе, внесенном через канал (2). Излишки жидкости удаляются из системы через канал (3-5). Биологическая ткань подвергается ферментативной обработке смесью протеолитических ферментов, внесенных через канал (2). Устройство подвергается центрифугированию при котором стромально- васкулярная фракция проходит через микрофильтр (В) в камеру для концентрирования клеток (Д). Излишки жидкости удаляются через канал (3-5), осадок отмывается от остатков ферментов буферным раствором. Конечная стромально-васкулярная фракция отбирается через канал (6).

Стромально-васкулярную фракцию выделяли из трех образцов липоаспирата, полученного из взрослых здоровых доноров, подписавших добровольное информированное согласие. Забор жира проводили по стандартной методике шприцевой туминесцентной липосакции под местной инфильтрационной анастезией в области передней брюшной стенки.

Перед ферментативной обработкой липоаспират промывали раствором Хартмана, доводя его объем до 400 мл в колбе. Через 5 минут после добавления раствора Хартмана, всю жидкую часть удаляли шприцем через порт для сбора СВФ. Оставшийся объем жировой ткани измеряли с использованием мерной шкалы на колбе. Ферментативное расщепление проводили добавлением эквивалентного объема раствора коллагеназы NB-6 (GMP Grade, SERVA Electrophoresis GmbH, 0,3 PZ/ml), при 37°C в течение 30 минут при постоянном помешивании. После этого колбу центрифугировали ЗООд, 10 мин, 25°С. После центрифугирования всю жидкость и расщепленный жир (масло) с элементами стромы удаляли через соответствующие порты. Затем процедуру отмывки повторяли еще раз, добавляя 300 мл раствора Хартмана. После последнего центрифугирования весь объем жидкости в верхней камере колбы удаляли шприцем через порты для промывки. Стромально-васкулярную фракцию отбирали шприцем из нижней камеры через порт для сбора СВФ. Объем конечного продукта составлял 10 мл.

Аликвоту СВФ объемом 1 мл использовали для подсчета количества ядросодержащих клеток с помощью гемацитометра.

Для оценки жизнеспособности СВФ использовали окраску клеток трипановым синим. Для оценки гетерогенности клеточной популяции СВФ использовали моноклональные антитела CD45-PerCp-Cy5.5, CD34-PE-Cy-7, CD146-FITC, CD31 - АРС-Су7, CD90-PE, CD105-APC, CD73-PE, CD133/1 -PE, CD309-APC, CD4-PE, CD14-PerCp-Cy5.5, CD3-APC, CD235-FITC, CD1 17-АРС, NG2-PE (BD Biosciense, США). Окрашивание производили по методике производителя. Анализ полученных популяций проводили с помощью цитофлуориметра FACS Cantoll и програмного обеспечения BD FACS Diva™ Software v.6.1 .3 (BD Biosciense, США).

Таблица 1 . Общая характеристика липоаспирата и стромально-васкулярной фракции, полученной с использованием предложенного устройства

Таблица 2.

Фенотипическая характеристика стромально-васкулярной фракции, полученной с использованием предложенного устройства

Стволовые клетки

жировой ткани (включая

супра-адвентициальные _CD34+ dim _{CD 1 46} -

4.2 6.7 5.9 клетки) (Adipose Derived CD31 CD45 ^"

Stromal Cells (including

supraadventitial cells) )

Гладко-мышечные клетки _CD34+ d,m _CD45 - сосудов (Vascular Smooth CD31 ^" CD146 ⁺ 28.7 22.3 26.7 Muscle Cells) CD105 ⁺ CD90 ⁺

Неидентифицированные CD34 CD146 CD31 ^"

18.1 19.0 17.0 клетки (Unidentified Cells) CD45-

Общее количество (%) 100 100 100 100

Хотя настоящее изобретение было подробно описано на примерах вариантов, которые представляются предпочтительными, необходимо помнить, что эти примеры осуществления изобретения приведены только в целях иллюстрации изобретения. Данное описание не должно рассматриваться как ограничивающее объем изобретения, поскольку в этапы описанных устройств специалистами в области медицинской биотехнологии и клеточной технологии и др. могут быть внесены изменения, направленные на то, чтобы адаптировать их к конкретным устройствам или ситуациям, и не выходящие за рамки прилагаемой формулы изобретения. Специалисту в данной области понятно, что в пределах сферы действия изобретения, которая определяется пунктами формулы изобретения, возможны различные варианты и модификации, включая эквивалентные решения. ССЫЛКИ

1 . System for processing lipoaspirate cells ЕР 1921 133 A2

2. Method and Apparatus for Separating a Material US 201 10251041 A1

3. Regenerative cell extraction device WO 2013183797 A1

4. Device for separating adult stem cell US 20130344589 A1

5. System and methods for preparation of adipose-derived stem cells, US 20130012921 A1 , WO 201401 1213 A1