Beschreibung

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Analyse und Transfektion von Zellen oder Partikeln gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 und ein Verfahren zur Analyse und Transfektion von Zellen oder Partikeln in vitro gemäß dem Oberbegriff des Anspruchs 1 1 .

Die Erfindung betrifft insbesondere ein Hochdurchsatzverfahren zum Einschleusen von Genen in Zellen oder Partikel mittels Transfektion, speziell durch Transfektion mittels Laserstrahlung, sowie eine apparative Anordnung zur Durchführung des Verfahrens. Dieses Hochdurchsatzverfahren kann insbesondere automatisiert durchgeführt werden.

Als Transfektion bezeichnet man das Einbringen von Fremdmolekülen, vorzugsweise DNA oder RNA (wie etwa siRNA), in das Zellinnere eukaryotischer Zellen oder in Partikel. Man unterscheidet dabei zwischen dem nur zeitweiligen Einbringen (transiente Transfektion) und dem dauerhaften Einbau der Moleküle in das Genom der Wirtszelle (stabile Transfektion). Hierfür müssen bei tierischen und humanen Zellen die Zellmembran passiert und die Zellvitalität erhalten werden, damit von der Zelle das Genprodukt über die Stimulation des Proteinsynthese-Apparates gebildet werden kann. Es ist bekannt, dass der Transfer von Molekülen durch Zellmembranen sehr effizient mit Hilfe biologischer Systeme erfolgen kann (meist unter Einsatz von Viren und Bakterien), allerdings besteht hierbei stets ein latentes Risiko in der Reaktivierung einzelner abgeschwächter Keime. Diese können insbesondere ein erhöhtes Gesundheitsrisiko für immungeschwächte Patienten darstellen. Aus Sicherheitsgründen werden in der Medizin und Biotechnologie daher nicht-virale bzw. nonvirale Transfektionsmethoden bevorzugt. Im Gegensatz zum viralen Gentransfer werden die Moleküle beim nonviralen Gentransfer ohne virale Vektoren zu den Zellen oder Partikeln transportiert. Zwar verfügt diese Technik über ein wesentlich höheres Sicherheitspotential, jedoch sind die Effizienz des Molekültransfers und die Zellvitalität bisher deutlich geringer als unter Einsatz viraler Transfektionsmethoden.

Von hohem Nutzen wären daher nonvirale Transfersysteme, die nicht nur sicher, sondern auch effizient arbeiten. Hierbei ergibt sich das Problem, dass die Membran einer eukaryotischen Zelle eine kompakte und nahezu undurchlässige Barriere für Fremdmoleküle darstellt. Um diese für den Transfer von Molekülen zu überwinden, wurden zahlreiche Techniken und Hilfsstoffe entwickelt. Der nonvirale Transfer von Molekülen in das Innere von Zellen oder in Partikel erfolgt bislang: mittels chemischer Agenzien (z.B. Ca-Phosphat-Präzipitation),

mit Hilfe physikalischer Verfahren (z.B. Mikroinjektion, Elektroporation oder Beschu mittels der sogenannten Gene Gun), oder

mittels biologischer Techniken (z.B. Immunoporation).

Der Molekültransfer mittels Mikroinjektion ist zeit- und kostenintensiv und liefert nur geringe Erfolgsraten. Eine Vielzahl der Zellen sterben bei diesem Verfahren ab, entweder aufgrund der großen Perforationszone, verursacht durch den relativ großen Durchmesser der eingesetzten Glaskapillaren oder wegen unerwünscht eingetretener Glaspartikel in das Zellinnere.

Als Hilfsstoffe kommen bei den vorgenannten Verfahren häufig kolloidale Partikel, Nano- oder Mikrosphären, Emulsionen oder Liposomen unterstützend zum Einsatz. Die Nachteile bestehen häufig in einer geringen Transfektionseffizienz und/oder in einer niedrigen Überlebensrate der Zellen, oft auch bedingt durch eine potentielle Toxizität der verwendeten Hilfsstoffe bzw. Chemikalien. Einige Verfahren sind zeitaufwendig oder nicht für empfindliche Primärzellen, insbesondere nicht für Stammzellen, geeignet.

Bekannt ist auch der Transfer von Molekülen durch optische Perforierung der Zellmembran mittels Laserlicht. Zum Beispiel können Femtosekundenlaser Zellmembranen schonend und transient eröffnen, so dass Moleküle in das Zellinnere sehr kurzzeitig eintreten können. Dies ist beispielsweise in der Publikation von Tirlapur und König: „Targeted transfection by femtosecond laser", Nature (2002) 18, Seiten 290-291 und in der WO 03/100069 A1 beschrieben. Dabei kommt bei diesem Verfahren ein Mikroskop zum Einsatz, das den Probendurchsatz naturgemäß auf einem sehr niedrigen Niveau hält.

Bei dem in der WO 03/100069 A1 beschriebenen Verfahren wird von einer Transfektionseffizienz und Zellvitalität von nahezu 100 % berichtet. Dieses Verfahren hat jedoch den Nachteil, dass es nur für adhärent wachsende Zellen geeignet ist, die in einer Zellkulturflasche statisch kultiviert werden. Für die Aufgabe der Transfektion müssen die Zellen entweder manuell unter Sichtkontrolle oder automatisch mittels einer Erkennungssoftware angesteuert werden, wodurch nur circa 4 Zellen pro Minute manipulierbar sind. Das Verfahren hat den weiteren Nachteil, dass es keine exakten Aussagen über die qualitative und quantitative Zusammensetzung des Probenmaterials liefert.

Aus dem Stand der Technik ist zudem ein Mikrofluidsystem zur Transfektion von Zellen bekannt, das einen hohen Probendurchsatz von Zellen ermöglicht (New HT Nucleofector™, Fa. Lonza). Technisch gesehen, verwendet dieses System jedoch das Prinzip der Elektroporation. Dieses Verfahren ermöglicht zwar einen hohen Probendurchsatz, weil aber sämtliche Zellen in der eingesetzten Küvette gleichermaßen elektroporativ behandelt werden, ist keine selektive Auswahl ganz bestimmter Zellarten möglich. Von hohem Nachteil ist bei der Elektroporation auch, dass der zu transfizierenden Probe chemische Agenzien als Hilfsmittel für die Transfektion zugesetzt werden müssen. Dadurch wird die Probe in ihrer ursprünglichen biologischen Zusammensetzung nicht nur stark verändert, vielmehr können empfindliche Zellen, beispielsweise Primärzellen, infolgedessen sogar absterben. Von weiterem Nachteil ist, dass der Anwender keine Kenntnis über Art, Quantität und Qualität der unbekannten Probe erhält. Diese Bezugsgrößen müssen vor jeder Transfektion mittels geeigneter apparativer Vorrichtungen und Geräte ermittelt werden.

Aus dem Stand der Technik sind Lösungen und Apparaturen bekannt, die unter Verwendung von Laserstrahlung Zellen oder Partikel im Hochdurchsatzverfahren analysieren können. Hier handelt es sich um Großgeräte, sogenannte Durchflusszytometer. Mit der Durchflusszytometrie können unterschiedliche Zelleigenschaften ermittelt werden.

Marchington et al.: „Optical injection of mammalian cells using a microfluidic platform", Biomedical Optics Express (2010) 1 , Seiten 527-536 beschreiben ein mikrofluidisches Photoporationssystem, bei dem eine hydrodynamische Fokussierung der zu transfizierenden Zellen durchgeführt wird. Dadurch werden die Zellen und die zur Transfektion eingesetzten Substanzen signifikant verdünnt, was in einer verringerten Effizienz des beschriebenen Systems resultiert. Zudem ermöglicht das System keine Analyse und keine selektive Transfektion der zu transfizierenden Zellen.

Es sind demnach keine Verfahren und Apparaturen bekannt, die die selektive Transfektion von Zellen oder Partikeln in einem Hochdurchsatzverfahren effizient und schädigungsarm ermöglichen. Es ist insbesondere kein Verfahren bekannt, mittels dessen eine Zählung, Analyse, gezielte Ansteuerung und Manipulation von Zielzellen (sogenannten Targetzellen) durchgeführt werden könnte, die sich schwimmend in einer heterogen zusammengesetzten Zellpopulation (Mischpopulation) befinden.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, die vorgenannten Nachteile des Stands der Technik zu überwinden. Insbesondere soll eine apparative Vorrichtung bereitgestellt werden, die eine effektive Möglichkeit zum berührungsfreien Molekültransfer in schwimmende Zellen oder Partikel schafft und die geeignet ist, eine Transfektionssubstanz wie etwa DNA, RNA, Proteine, Peptide, Aminosäuren oder Kohlenhydraten möglichst schädigungsarm und dauerhaft in das Innere von Zellen oder Partikeln einzubringen. Aufgabe der Erfindung ist insbesondere auch die Bereitstellung eines Verfahrens, das neben der Zählung und Analyse von Zellen oder Partikeln insbesondere die selektive Transfektion von Targetzellen oder Targetpartikeln ermöglicht, die sich innerhalb einer potentiell heterogen zusammengesetzten Zellpopulation befinden. Dabei soll vorzugsweise ein hoher und automatisierter Probendurchsatz ermöglicht werden, insbesondere unter Verzicht auf eine mikroskopische Apparatur.

Diese Aufgabe wird mit einer Vorrichtung mit den Merkmalen des Anspruchs 1 gelöst.

Eine derartige Vorrichtung zur Analyse und Transfektion von Zellen oder Partikeln weist die folgenden Komponenten auf:

ein Probenreservoir zur Aufnahme einer Probe, welche zu transfizierende Zellen oder Partikel enthält,

eine Mikrokapillare, die in Strömungsverbindung mit dem Probenreservoir steht, eine Pumpe, die in Strömungsverbindung mit der Mikrokapillare steht und die dafür vorgesehen und eingerichtet ist, durch die Mikrokapillare einen Teil einer in dem Probenreservoir befindlichen Probe aus dem Probenreservoir herauszusaugen, einen Behälter zur Aufnahme transfizierter Zellen oder Partikel, der in Strömungsverbindung mit der Mikrokapillare und der Pumpe steht, und

einen ersten Laser zur Analyse von zu transfizierenden Zellen oder Partikeln im Bereich der Mikrokapillare.

Die Vorrichtung zeichnet sich dadurch aus, dass sie einen zweiten Laser zur Manipulation von zu transfizierenden Zellen oder Partikeln aufweist, wobei die Vorrichtung dazu vorgesehen und eingerichtet ist, im Betrieb Zellen oder Partikel im Durchfluss zu transfizieren.

Die Vorrichtung eignet sich somit für die Zählung, Analyse und Transfektion von Zellen oder Partikeln mit dem Ziel des berührungslosen Einschleusens von Molekülen, bevorzugt von DNA und RNA, aber auch von Peptiden, Proteinen, Aminosäuren und Kohlenhydraten, in das Innere von Zellen oder Partikeln. Geeignete Anwendungsgebiete sind der nonvirale Gentransfer, beispielsweise in Stammzellen, die Herstellung und Applikation von Pharmaka, insbesondere synthetischer Vakzine, die Produktion von Biomasse, die Tier- und Pflanzenzucht, die Kryokonservierung von Zellen oder Partikeln oder das Kodieren beliebiger Substanzen mit einer Markierungssubstanz (Barcoding). Als Partikel werden dabei insbesondere nichtzelluläre nukleinsäurehaltige Einheiten wie etwa Viren angesehen. Die Partikel können vorzugsweise umhüllt sein, also eine Partikelumhüllung aufweisen. Als Zellen werden insbesondere eukaryotische Zellen, aber auch prokaryotische Zellen oder künstlich erzeugte Zellen (künstliche Zellen) angesehen.

Neben klassischen Transfektionssubstanzen wie DNA und RNA (insbesondere siRNA) und Peptiden, Proteinen und Aminosäuren können durch die erfindungsgemäße Vorrichtung auch Kohlenhydrate in das Innere von Zellen oder Partikeln eingeschleust werden, wodurch Zellen oder Partikel schonend und sicher kryokonserviert werden können. Potentielle Anwendungsgebiete sind beispielsweise die In-Vitro-Fertilisation, die Aquakulturtechnik oder das Anlegen von Biobanken. Vorzugsweise kann zur Bereitstellung einer erfindungsgemäßen Vorrichtung ein Durchflusszytometer, das generell nur für die Analyse von Zellen oder Partikeln ausgelegt ist, in der Art und Weise technisch verändert werden, dass das Gerät auch die Manipulation von Zellen oder Partikeln, insbesondere die Transfektion, durchführen kann, beispielsweise mittels fokussiertem, beugungsbegrenztem Laserlicht.

Die Vorteile dieses apparativen Aufbaus bestehen darin, dass die in ein Durchflusszytometer integrierte Transfektionsvorrichtung technisch in der Lage ist, definierte Zellen oder Partikel über die kurzzeitige Aussendung von Laserlicht schonend und transient zu perforieren. Es hat sich gezeigt, dass die natürliche Barrierefunktion von Zellmembranen vorzugsweise nur über eine spezielle, laserinduzierte Laserstrahlung überwunden werden kann, sodass auch erst dann Moleküle in das Innere von Zellen oder Partikeln aktiv eindringen können, wenn die Zellen oder Partikel mit dem zweiten Laser bestrahlt wurden. Kurz nach der Bestrahlung schließt sich die Zellmembran bzw. die Partikelumhüllung, und keine weiteren Moleküle können mehr in die Zelle oder den Partikel eindringen. Der Laser kann nach vorgegebenen Anweisungen auf Basis von vorab erzeugten Analysedaten gesteuert werden. Das Auslösen des Laserstrahls kann durch einen schnellen Computer (wie etwa einen Personalcomputer, PC) mit entsprechender Software gesteuert und über einen impulsgesteuerten Shutter beendet werden.

Der zweite Laser kann vorzugsweise derart angeordnet sein, dass er zur Manipulation von Zellen oder Partikeln im Bereich der Mikrokapillare geeignet ist. Dabei soll eine Manipulation von Zellen oder Partikeln vorzugsweise stromabwärts von derjenigen Stelle erfolgen, an der der erste Laser eine Zellanalyse vornehmen kann. Der zweite Laser kann aber auch zur Manipulation von Zellen oder Partikeln im Bereich einer zweiten Mikrokapillare vorgesehen sein, die der ersten Mikrokapillare in Strömungsrichtung nachgeordnet ist. Statt einer zweiten Mikrokapillare kann ferner ein Mikrochip zur Einkopplung des zweiten Lasers vorgesehen sein. Eine Mikrostrukturierung des Mikrochips würde dabei als Mikrokapillare wirken. Zur Vereinfachung wird nachfolgend überwiegend von „der Mikrokapillare" gesprochen, wobei hierunter auch die Verwendung zweier Mikrokapillaren oder einer Mikrokapillaren und eines Mikrochips zu verstehen ist. Ferner kann auch nur ein einzelner Mikrochip vorgesehen sein, dessen Mikrostrukturierung eine Mikrokapillare im Sinne der vorliegenden Erfindung darstellt.

Eine geeignete Mikrokapillare ist beispielsweise in der US 7,078,318 B2 beschrieben.

Vorzugsweise sind die Mikrokapillare und/oder der Mikrochip derart dimensioniert, dass sich die Zellen oder Partikel im Betrieb der Vorrichtung einzeln und nacheinander darin bewegen.

Vorzugsweise handelt es sich bei dem zweiten Laser um einen gepulsten Laser, der eine Impulsdauer im Femtosekundenbereich aufweist (Femtosekundenlaser).

Vorzugsweise ist der zweite Laser ein modensynchronisierter Femtosekundenlaser hoher Folgefrequenz, der eine Emission im Wellenlängenbereich zwischen 700 nm und 1200 nm, insbesondere zwischen 800 nm und 1 100 nm und ganz besonders zwischen 900 und 1000 nm aufweist und der multiple Laserimpulse mit einer Impulsdauer unter 500 fs, insbesondere unter 300 fs, und Impulsenergien im Bereich von Mikrojoule bis wenigen Nanojoule ermöglicht.

In einer weiteren bevorzugten Ausführung ist der zweite Laser ein gepulster Festkörperlaser hoher Strahlgüte (TEM ₀₀ -Mode). Dieser kann eine Emissionswellenlänge von 800 nm, eine hohe Folgefrequenz (ca. 80 MHz), eine Impulsdauer von weniger als 500 fs und eine Impulsenergie von wenigen Nanojoule (<100 nJ) aufweisen.

Eine Transfektion der zu transfizierenden Zellen oder Partikel wird erfindungsgemäß also durch den zweiten Laser ausgeführt, der vorzugsweise ein gepulster nah-infraroter (NIR) Laser mit einer Impulsbreite bzw. -dauer im Femtosekundenbereich ist.

Der zweite Laser sowie die zugehörigen Optiken, mechanischen Zubehörteile und elektronischen Steuersysteme können innerhalb oder auch außerhalb der insbesondere als Durchflusszytometer ausgestalteten Vorrichtung positioniert sein, weil lediglich der Laserstrahl in geeigneter Weise auf die zu transfizierenden Zellen oder Partikel ausgerichtet sein muss. Hierbei wird der Laserstrahl mittels geeigneter Elemente fokussiert und vorzugsweise beugungsbegrenzt auf Zellen oder Partikel gelenkt, die vorzugsweise als Einzelzellen bzw. Einzelpartikel vorliegen. Gleichermaßen können sämtliche weitere mechanische, optische, elektronische und physikalische Elemente im Bereich der Mikrokapillare, aber auch an anderer Position der Vorrichtung, insbesondere des (modifizierten) Durchflusszytometers, positioniert sein.

Es kann sich dabei als vorteilhaft für die Exaktheit und räumliche Abgrenzung erweisen, wenn der Laserstrahl beugungsbegrenzt und mit einem Submikrometer-Spot starr fixiert auf einen definierten Bereich einer Mikrokapillare fokussiert wird, vorzugsweise auf eine zentrale Zone innerhalb der Mikrokapillare, die von den Zellen oder Partikel im Betrieb der Vorrichtung passiert wird. Hierfür wird eine Ummantelung der Mikrokapillare (sofern vorhanden) oder des Mikrochips an definierter Position entfernt, so dass der Laserstrahl durch dieses Fenster auf die vorbei fließenden Zellen oder Partikel gerichtet werden kann.

In einer Variante ist der zweite Laser als (realer) Bessel-Strahl ausgestaltet. Ein solcher, dem Fachmann auch als Bessel-Beam bekannter Strahl, verändert im Idealfall seine Breite nicht während der Ausbreitung. Während ideale Bessel-Strahlen nach dem derzeitigen Kenntnisstand nicht erzeugt werden können, sind reale Bessel-Strahlen (die noch eine geringfügige Breitänderung bei ihrer Ausbreitung aufweisen) erzeugbar.

Durch den Einsatz eines Bessel-Strahls kann eine wesentlich höhere Transfektionsrate erzielt werden. Besonders vorteilhaft ist, dass der Bessel- Laserstrahl für die Eröffnung der Zellmembran bzw. die Partikelumhüllung nicht exakt auf die Plasmamembran bzw. die Partikelumhüllung fokussiert werden muss.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kommt ohne den Einsatz eines Mikroskops aus. In einer Variante weist sie gerade kein Mikroskop auf. Die Vorrichtung ähnelt in ihrer Funktionsweise einem Durchflusszytometer, dient aber gleichzeitig dazu, Zellen oder Partikel zu transfizieren. Sie kann daher als Transfektionszytometer bezeichnet werden. In einer Variante beträgt die Impulsdauer des zweiten Lasers weniger als 500 Femtosekunden (fs), insbesondere weniger als 400 fs, insbesondere weniger als 300 fs, insbesondere weniger als 200 fs und ganz besonders weniger als 100 fs.

Für die Erhaltung der Zellvitalität kann es sich als vorteilhaft erweisen, wenn der Laserstrahl im Laserspot auf der Targetzelle Impulsenergien von weniger als 100 nJ aufweist. In einer Variante weist der der zweite Laser daher eine Impulsenergie von weniger als 100 Nanojoule (nJ), insbesondere weniger als 90 nJ, insbesondere weniger als 80 nJ, insbesondere weniger als 70 nJ, insbesondere weniger als 60 nJ, insbesondere weniger als 50 nJ, insbesondere weniger als 40 nJ, insbesondere weniger als 30 nJ und ganz besonders weniger als 20 nJ auf.

In einer weiteren Variante ist ein Shutter vorgesehen, der zwischen dem zweiten Laser und der Mikrokapillare angeordnet sein kann und der dazu vorgesehen und eingerichtet ist, zu verhindern, dass ein von dem zweiten Laser ausgesandter Laserstrahl auf die zu transfizierenden Zellen oder Partikel trifft. Dieser, dem zweiten Laser nachgeordnete, vorzugsweise schnelle Shutter kann der Realisierung von Bestrahlungszeiten unter 1 Sekunde und Impulsenergien im Mikro- bis Nanojoulebereich dienen. In Abhängigkeit der Fließgeschwindigkeit der Probe und der Schnelligkeit des Shutters wird dabei die Zellmembran bzw. die Partikelumhüllung nur ein bis wenige Male und vorzugsweise über eine Fläche kleiner als 1 μηι ² transient eröffnet.

Grundsätzlich kann mit einem solchen Shutter, der vorzugsweise elektronisch gesteuert wird, auch ein permanent ausgesendeter Laserstrahl über die Dauer eines definierten Zeitintervalls kurzzeitig und exakt blockiert werden, um einen klassischen Femtosekundenlaser nachzubilden. Eine derartige Anordnung würde ebenfalls einen Femtosekundenlaser im Sinne der vorliegenden Erfindung darstellen.

In einer weiteren Variante weist die Vorrichtung eine Kontrolleinheit auf, die dafür vorgesehen und eingerichtet ist, den zweiten Laser derart anzusteuern, dass nur Zellen oder Partikel mit bestimmten physikalischen, biologischen oder chemischen Eigenschaften transfiziert werden. Diese Eigenschaften werden vorzugsweise mittels des ersten Lasers bestimmt, so dass eine Analyse und Auswertung der Analyse mit anschließender Ansteuerung des zweiten Lasers in einem einzigen Arbeitsschritt erfolgen kann, während die Zellen oder Partikel durch die Vorrichtung, insbesondere durch die Mikrokapillare, strömen.

Vorzugsweise wird ein Impuls für die kurzzeitige Aussendung der Laserstrahlung über eine softwaregestützte Kontrolleinheit gesteuert und erfolgt insbesondere ausschließlich nach vorgegebenen Ein- und Ausschlusskriterien, die durch den Anwender in einem Steuerprotokoll vorab definiert werden können. In diesem Steuerprotokoll kann beispielsweise definiert werden, dass nur Zellen oder Partikel mit bestimmten physikalischen, biologischen und chemischen Eigenschaften transfiziert werden sollen, beispielsweise Stammzellen. Von Bedeutung ist, dass, insbesondere basierend auf der Analyse des ersten bzw. eines weiteren vorgeschalteten Lasers, die Auslösung des Laserstrahls des zweiten Lasers nur dann erfolgt, wenn sämtliche im Steuerprotokoll vorgegebenen Kriterien durch die Targetzelle oder den Targetpartikel eindeutig erfüllt sind. Mittels der apparativen Zusammensetzung, Anordnung und Steuerung der verschiedenartigen Lasersysteme ist es somit möglich, dass ausschließlich Zellen oder Partikel transfiziert werden, die definierte Merkmale aufweisen. Andere Zellen oder Partikel passieren unbehandelt den Laserstrahl. Das hat zur Folge, dass nunmehr kein Großgerät (Sorter) zum selektiven Transfizieren von Zellen oder Partikeln mehr erforderlich ist. Im Nachgang der Transfektion können auf Wunsch die selektiv transfizierten Zellen oder Partikel gezielt und schonend aus der Gesamtpopulation unter Einsatz bekannter Standardtechniken isoliert oder heraussortiert werden.

In einer weiteren Variante ist eine Kontrolleinheit vorgesehen, die dafür vorgesehen und eingerichtet ist, den zweiten Laser auf der Basis von Analysedaten anzusteuern, die vorab mittels des ersten Lasers erzeugt wurden. Eine derartige Ansteuerung des zweiten Lasers kann beispielsweise dazu verwendet werden, ausschließlich Zellen oder Partikel mit bestimmten physikalischen, biologischen oder chemischen Eigenschaften zu transfizieren, die sich in einem heterogen zusammengesetzten Zellmilieu befinden. Dabei wird eine Transfektion wunschgemäß auch nur an diesen spezifisch ausgewählten Zellen oder Partikeln durchgeführt. Da die Strömungsgeschwindigkeit, mit der sämtliche Zellen oder Partikel durch die Mikrokapillare strömen, regelmäßig bekannt ist oder aber zumindest abgeschätzt werden kann, ist es ohne Weiteres möglich, aus einem Analyseergebnis, das mittels des ersten Lasers gewonnen wurde, abzuschätzen, wann genau die betreffende Zelle an dem zweiten Laser vorbeiströmt und wann genau der zweite Laser einen oder mehrere Laserpulse aussenden muss, um die entsprechende Zelle zu treffen. Das bedeutet, dass die Vorrichtung bzw. Apparatur in einer Variante nicht nur aus einem Durchflusszytometer besteht, das Zellen oder Partikel in einem singulären Probendurchlauf zählen, analysieren und transfizieren kann, indem Membranen oder Umhüllungen der Zellen oder Partikel transient eröffnet werden können. Vielmehr ist in einer bevorzugten Ausführung auch die selektive Transfektion von bestimmten Zellen oder Partikeln bzw. die Manipulation von Targetzellen oder Targetpartikeln auf Basis definierter Ein- und Ausschlusskriterien möglich. Das heißt, es können ganz gezielt spezifische Zellen oder Partikel transfiziert werden, während andere Zellen oder Partikel in der Vorrichtung nicht transfiziert werden. Eine weitere erfindungsgemäße Ausführung erschließt Möglichkeiten zum Aussortieren und Sammeln der transfizierten bzw. selektiv behandelten Zellen oder Partikel. Die Vorrichtung stellt in einer Variante also eine Apparatur zur selektiven Transfektion und nachfolgenden Sammlung von (transfizierten) Targetzellen oder Targetpartikeln dar.

In einer alternativen Ausgestaltung ist die Vorrichtung dazu vorgesehen und eingerichtet, die Probe der Mikrokapillare ohne hydrodynamische Fokussierung zuzuführen. Eine hydrodynamische Fokussierung wird häufig auch mit dem Begriff des Aufbauens eines Hüllstroms beschrieben. Auch in der Mikrokapillare selbst findet vorzugsweise keine hydrodynamische Fokussierung statt. Dies ist mit mehreren, nachfolgend erläuterten Effekten und Vorteilen verbunden.

Dass die Transfektion der Zellen oder Partikel ohne hydrodynamische Fokussierung erfolgen kann, ist für die Transfektionseffizienz von sehr großem Nutzen. Dies hat zunächst den Vorteil, dass für die physikalische Einengung des Probenstroms keine großen Mengen einer physiologischen Substanz benötigt werden. Denn dies wäre mit dem Nachteil verbunden, dass dadurch die Probe (und somit auch die einzubringenden Moleküle) um das circa Hundertfache oder Hundertfünfzigfache verdünnt werden. Durch den Verzicht auf eine hydrodynamische Fokussierung werden die Probe und somit auch die einzubringenden Moleküle (also die Transfektionssubstanz) folglich nicht verdünnt oder gar verunreinigt. Ferner bleibt ihre ursprüngliche, physiologische Zusammensetzung unverändert. Durchflusszytometer mit hydrodynamischer Fokussierung sind zudem technisch aufwändig herzustellen, so dass ein Durchflusszytometer ohne hydrodynamische Fokussierung kostengünstiger als ein Gerät mit hydrodynamischer Fokussierung herzustellen ist. Auch die einzusetzende Mikrokapillare kann preiswert hergestellt und mit wenig Aufwand ausgewechselt werden. Zudem sind verschiedene Größen und Ausformungen von Mikrokapillaren kommerziell erhältlich, die für jede Zellart optimale Fließbedingungen bieten. Insgesamt eröffnet die beschriebene apparative Ausgestaltung neue Einsatzfelder für konventionelle Durchflusszytometer, die über die eigentliche Zellanalyse weit hinausgehen. Für eine exakte Identifikation der Targetzellen oder Targetpartikel können und sollten die Parameter Zelldichte bzw. Partikeldichte im Probenstrom sowie die Durchflussrate in der Mikrokapillare optimal aufeinander eingestellt sein. In einer weiteren Variante weist die Vorrichtung mehr als einen Behälter zur Aufnahme transfizierter Zellen oder Partikel auf, wobei die Vorrichtung dazu vorgesehen und eingerichtet ist, einen bestimmten Behälter zur Aufnahme transfizierter Zellen oder Partikel in Abhängigkeit eines Ergebnisses einer Analyse zu transfizierender Zellen oder Partikel durch den ersten Laser auszuwählen. Die Vorrichtung ist also vorzugsweise selbst in der Lage, transfizierte von nicht transfizierten Zellen oder Partikeln und verschiedene Typen transfizierter Zellen oder Partikel voneinander zu trennen.

Damit kann der apparative Aufbau auch Möglichkeiten für eine selektive Transfektion von Targetzellen oder Targetpartikeln realisieren, wobei insbesondere die positiv transfizierten Zellen oder Partikel nach erfolgter Transfektion in getrennte Sammelgefäße geleitet oder unter Einsatz bekannter Standardtechniken vorzugsweise schonend aus der Gesamtpopulation herausisoliert werden können. Ein zellsortierendes Großgerät (sogenannter Sorter) wird hierfür nicht benötigt. Der apparative Aufbau zum Transfizieren von Zellen oder Partikeln kann auch in einen sogenannten Flusssortierer (ebenfalls als Sorter bekannt) integriert werden. Durch diese vorteilhafte Anwendung werden die transfizierten Zellen oder Partikel nach erfolgter Transfektion sofort in spezielle Probenbehältnisse geleitet und separat aufgefangen. In einer weiteren Variante ist die Vorrichtung mit einer Einrichtung zur Erzeugung eines Magnetfeldes im Bereich einer mit den zu transfizierenden Zellen oder Partikeln in Kontakt kommenden, insbesondere von den zu transfizierenden Zellen oder Partikeln zu durchströmenden Leitung ausgestattet. Bei dieser Leitung kann es sich beispielsweise um die Mikrokapillare, um eine in Flussrichtung vor der Mikrokapillare oder um eine in Flussrichtung hinter der Mikrokapillare angeordnete Leitung handeln. Ferner kann es sich bei dieser Leitung um ein Auffanggefäß bzw. einen Sammelbehälter handeln. Damit wird es möglich, magnetisch markierte Zellen oder Partikel durch Anlegen eines Magnetfeldes vorübergehend zu fixieren und von magnetisch nicht markierten Zellen oder Partikeln zu trennen.

Auf diese Weise können beispielsweise im Nachgang einer Transfektion die überschüssigen, nicht aufgenommenen Fremdmoleküle über einen solchen Magneten wieder entfernt werden, bevor ein potentielles Zusammenführen der transfizierten und nichttransfizierten Zellen oder Partikel abschließend erfolgen kann. Andere geeignete technische Systeme zur Entfernung überschüssiger, nicht aufgenommener Fremdmoleküle, beispielsweise Filter, können alternativ oder zusätzlich vorgesehen sein.

Durch den Einsatz einer Einrichtung zur Erzeugung eines Magnetfelds ist es mit anderen Worten möglich, dass beispielsweise antikörperbeladene magnetische Kügelchen (sogenannte Beads) mit Zellen oder Partikeln und einzubringenden Molekülen, insbesondere DNA, in einem initialen Probengefäß über eine definierte Zeit vermischt werden. Dadurch binden antikörperbeladene Moleküle spezifisch an Zellen oder Partikel, die über die erforderlichen Zielsequenzen verfügen. Die heterogen aufgebaute Zellsuspension wird anschließend über die Mikrokapillare in Bereiche geführt, auf die beispielsweise magnetische Felder wirken; insbesondere kann das ein endständiges Auffanggefäß sein. Während der Zellwanderung durch die Kapillare werden nicht nur sämtliche Zellen oder Partikel analysiert, vielmehr erfolgt auch eine transiente Öffnung der Zellmembran bzw. Partikelumhüllung, wodurch die bereits in großer Nähe zur Zelloberfläche befindlichen, an die Beads gebundenen Moleküle leichter ins Zellinnere eindringen können. Eine Abtrennung der spezifisch gebundenen Beads kann dann durch die magnetische Vorrichtung (also die Einrichtung zur Erzeugung eines Magnetfeldes), die sich beispielsweise unter dem Probenauffanggefäß befinden kann, erfolgen. Dadurch kommt es zu einer schnellen Sedimentierung der Targetzellen oder Targetpartikel, wobei die Zelloberfläche bzw. Partikelumhüllung eröffnet und die DNA ebenfalls in die transient eröffneten Zellen oder Partikel eindringen kann. Weil die einzuschleusende DNA dem Trägermedium von Beginn an zugesetzt ist, kommen verfahrensgemäß alle Zellen oder Partikel, die sich in der Probenküvette befinden, mit den Fremdmolekülen gleichermaßen in Kontakt, jedoch dringt die DNA nur in die Zellen oder Partikel ein, deren Zellmembran bzw. Partikelumhüllung eröffnet wurde.

Diese Vorrichtungsvariante ermöglicht eine Verfahrensdurchführung, die an die grundsätzlich bereits bekannte Magnetofektion erinnert, welche nachfolgend erläutert werden wird.

In einer Variante können zusätzliche technische Elemente für eine Elektroporation und/oder für eine Magnetofektion und/oder für eine Immunoporation und/oder für die Aussendung von Mikrowellen und/oder für die Aussendung von Ultraschallwellen in die erfindungsgemäße Vorrichtung (insbesondere in ein entsprechend ausgestaltetes Durchflusszytometer) integriert werden. Anders gesagt, die durchzuführende Transfektion kann zusätzlich auch an räumlich anderen Positionen innerhalb oder außerhalb der Vorrichtung z.B. mittels Elektroporation, Magnetofektion, Mikrowelle oder Ultraschall erfolgen.

Bei der Elektroporation werden Löcher in biologischen Membranen erzeugt, um Moleküle in lebende Zellen einzuschleusen. Durch die Pulse eines sich entladenden Kondensators, auch Elektroporator genannt, wird kurzzeitig ein elektrisches Feld erzeugt, das in Zellwänden Löcher hervorruft, die sich sofort wieder schließen. Der Elektroporator verfügt über eine Küvette, in die man die Zellsuspension pipettiert, wobei die Küvette selbst zwei Elektroden aus Aluminium besitzt. Über ein elektrisch erzeugtes Feld wird die Zellmembran permeabilisiert, so dass Fremd-DNA durch diese Öffnungen in Bakterien-, Pflanzen- oder sogar Säugerzellen eintreten kann. Die Vorteile dieser Methode bestehen darin, dass hohe Transformationsraten erzielt werden können.

Bei der Magnetofektion werden polykationisch oder polyanionisch beschichtete Magnetpartikel, beispielsweise mit nackter Nukleinsäure oder Genvektoren, in salzhaltiger Lösung gemischt. Durch elektrostatische Wechselwirkung und/oder salzinduzierte Kolloidaggregation kommt es zur Bindung. Die Präparate werden Zellkulturüberständen zugegeben und die Zellkulturplatte anschließend auf eine Magnetplatte positioniert. Innerhalb von Minuten wird die applizierte Vektordosis durch die Magnetkräfte auf die Zellen sedimentiert. Dadurch kommt es zu raschem und effizientem Nukleinsäuretransfer, insbesondere wenn Membranen der zu transfizierenden Zellen durch den zweiten Laser vorab transient eröffnet wurden.

Bei der Immunoporation werden magnetische Beads mit Antikörpern gekoppelt, die auf der Oberfläche der Targetzellen spezifisch binden. Nach der Bindung werden die Beads durch Scherkräfte von den Zellen wieder abgetrennt. Dabei werden Löcher in die Zellmembranen gerissen und Moleküle können in das Zellinnere eindringen.

Über eine bevorzugte elektronische Kopplung der in der beschriebenen Vorrichtung, insbesondere in einem entsprechend ausgestatteten Durchflusszytometer, standardmäßig vorhandenen Lasersysteme und Detektoren für die Analyse von Zellen oder Partikeln mit zusätzlich eingeführten Elementen, die für die Manipulation von Zellen oder Partikeln ausgelegt sind, werden diese durch Anweisung eines Steuerprotokolls in geeigneter Weise ausgeführt. In einer Variante ermöglicht die beschriebene Vorrichtung, insbesondere ein entsprechend in Bezug auf seine Möglichkeiten erweitertes Durchflusszytometer, die selektive Transfektion von Zellen oder Partikeln in einem Hochdurchsatzverfahren. Von höchstem Nutzen ist, dass der Anwender in einer Variante das für die Überwindung der Zellmembran bzw. Partikelumhüllung am besten geeignete Verfahren apparativ auswählen kann. Beispielsweise lassen sich primäre Zellen, wie z.B. Stammzellen, nur mittels sehr schonender Techniken transfizieren, wohingegen permanente Zellen weniger empfindlich auf die Manipulation reagieren. Sollten spezielle Epitope bekannt sein, für die bereits ein Antikörper existiert, kann z.B. die Magnetofektion oder die Immunoporation zu guten Ergebnissen führen. Der große Vorteil eines Ausführungsbeispiels der Erfindung liegt in der breiten Anwendungspalette, der methodischen Flexibilität und hohen Informationsfülle, die über die Gesamtheit der bisher mit dieser Technologie erzeugten Analysedaten weit hinausgeht. Der Vorteil dieser in einer Variante der Erfindung einzusetzenden Technik besteht also darin, dass die einzuschleusenden Moleküle mit einer für jede Zellart optimalen Transfektionsmethode unter Anwendung individueller Einstellungen eingebracht werden können. In Abhängigkeit von der zu transfizierenden Zellart und des zellumgebenden Milieus kann die Transfektion nicht nur mittels Lasertransfektion, sondern bei Bedarf zusätzlich auch mittels Elektroporation und/oder Magnetofektion und/oder Immunoporation oder anderer bisher unbekannter Methoden erfolgen. Mittels der apparativen Zusammensetzung, Anordnung und Steuerung der verschiedenartigen Systeme ist es in einer Variante somit wiederum möglich, dass ausschließlich Zellen oder Partikel transfiziert werden, die definierte Merkmale aufweisen. Zellen oder Partikel ohne diese Eigenschaften passieren das Durchflusszytometer gänzlich unbehandelt.

In einer Variante ist die Vorrichtung dermaßen gestaltet, dass die Durchflussraten, insbesondere die Durchflussrate der zu transfizierenden Zellen oder Partikel und/oder die Durchflussrate der Probe, variiert werden können.

In einer weiteren Variante ist die Vorrichtung derart ausgebildet und eingerichtet, dass das Probenmaterial steril eingebracht und steril aufgefangen werden kann.

In einer Variante können die zuvor beschriebene Analyse-, Transfektions- und Sammeleinheit auch in eine mikroskopische Vorrichtung integriert werden. Hierdurch wird das Potential des sogenannten Transfektionsmikroskops auf Suspensionszellen oder suspendierte Partikel ausgeweitet. Dadurch können ein höherer Durchsatz und genaue Analysewerte der transfizierten Probe erzielt werden. Besonders vorteilhaft ist, dass die positiv und negativ transfizierten Zellen oder Partikel getrennt aufgefangen werden können.

Die der Erfindung zugrunde liegende Aufgabe wird auch durch ein Verfahren mit den nachfolgenden Schritten gelöst. Ein derartiges Verfahren eignet sich insbesondere zur Analyse und Transfektion von Zellen oder Partikeln in vitro. Zunächst erfolgt ein Aufsaugen einer Probe, welche zu transfizierende Zellen oder Partikel und eine Transfektionssubstanz, mit der die Zellen oder Partikel transfiziert werden sollen, enthält, in eine Mikrokapillare. Anschließend erfolgt ein Bestrahlen der zu transfizierenden Zellen oder Partikel mit einer ersten Laserlichtstrahlung eines ersten Lasers, um die Zellen oder Partikel zu analysieren. Danach erfolgt ein Bestrahlen der zu transfizierenden Zellen oder Partikel mit einer zweiten Laserlichtstrahlung eines zweiten Lasers, um die Zellen oder Partikel zu manipulieren, wobei durch das Bestrahlen mit der zweiten Laserlichtstrahlung eine Zellmembran oder Partikelumhüllung der zu transfizierenden Zellen oder Partikel transient geöffnet wird, so dass Moleküle der Transfektionssubstanz in das Innere der zu transfizierenden Zellen oder Partikel eindringen. Abschließend erfolgt ein Auffangen der transfizierten Zellen oder Partikel in mindestens einem Behälter. Das Verfahren zeichnet sich dadurch aus, dass das Bestrahlen der zu transfizierenden Zellen oder Partikel mit der zweiten Laserlichtstrahlung erfolgt, während die Zellen oder Partikel durch die Mikrokapillare strömen.

Der Nutzen der Erfindung besteht darin, dass das Verfahren gleichermaßen für Suspensionszellen oder suspendierte Partikel als auch für trypsinierte, adhärent wachsende Zellen oder Partikel geeignet ist. Statt einer Vielzahl nachteiliger Handgriffe, wie sie z.B. bei der Mikroinjektion oder der mikroskopgestützten Lasertransfektion nach WO 03/100069 A1 erforderlich sind, können sehr viel mehr Zellen oder Partikel pro Zeiteinheit bearbeitet werden.

Das Verfahren kann nahezu vollständig automatisiert durchgeführt werden und liefert exakte Aussagen über die Art und Zusammensetzung des transfizierten Probenmaterials. Im Gegensatz zu etablierten Transfektionsverfahren wird für das Führen und Halten von Zellen oder Partikeln auch keine optische Pinzette benötigt, und es werden keine chemischen Agenzien wie bei der Elektroporation zugesetzt. Daher ist diese Technik besonders für empfindliche Zellen oder Partikel, wie etwa Primärzellen, geeignet. Im Vergleich zur Elektroporation, bei der immer die Gesamtpopulation transfiziert wird und dadurch eine Vielzahl von Zellen absterben, Zellorganellen unerwünscht ins Kulturmedium austreten und die Qualität der Probe schädigen, ermöglicht das erfindungsgemäße Verfahren nicht nur die selektive Transfektion von Zellen oder Partikeln, sondern auch den Ausschluss toter Zellen oder Partikel von der Transfektion durch Setzen von Schwellenwerten, sogenannter Thresholds.

Es erweist sich als höchst vorteilhaft für die Qualitätssicherung, dass sämtliche Zellen oder Partikel unmittelbar vor der Transfektion anhand ihrer Größe, Granularität und Fluoreszenzintensität gezählt, analysiert und charakterisiert werden. Diese qualitativen und quantitativen Parameter sind wichtige Referenzwerte und dienen der Optimierung und Standardisierung der Transfektionsprotokolle.

Der Laserstrahl des zweiten Lasers wird vorzugsweise mittels geeigneter Elemente fokussiert und beugungsbegrenzt durch einen sehr schmalen Schlitz definierter Höhe und Breite einer Messkapillare (der Mikrokapillare) gelenkt, die ansonsten von lichtundurchlässigem Material gänzlich umgeben ist.

Vorzugsweise weist der zweite Laser eine Impulsdauer im Femtosekundenbereich auf.

In einer Variante ist die Transfektionssubstanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus DNA, RNA (insbesondere siRNA), Proteinen, Peptiden, Aminosäuren und Kohlenhydraten. Damit ermöglicht das Verfahren in dieser Variante auf schonende und effiziente Weise den Transfer von DNA, RNA, Proteinen, Peptiden, Aminosäuren oder Kohlenhydraten in Einzelzellen oder einzelne Partikel und eignet sich vorzugsweise zur Manipulation bzw. Transfektion humaner, tierischer, pflanzlicher oder künstlicher Zellen. Potentielle Anwendungsgebiete sind der nonvirale Gentransfer, die Herstellung und Applikation von Pharmaka, insbesondere synthetische Vakzine, die Tier- und Pflanzenzucht oder die Produktion von Biomasse, beispielsweise von Biokraftstoff. Mögliche klinische Anwendungen sind der zielgerichtete Transfer von Molekülen in Stammzellen, beispielsweise zwecks Unterstützung einer Chemotherapie. Es wird die Möglichkeit für eine weitgehend automatisierte Zählung, Analyse und Transfektion von Zellen oder Partikeln geschaffen, wobei eine Transfektionssubstanz in das Innere von Suspensionszellen oder suspendierte Partikel berührungsfrei und effizient eingebracht wird, vorzugsweise ohne den Zusatz von Hilfsstoffen. Es wird auch eine Möglichkeit für die selektive Transfektion von Targetzellen oder Targetpartikeln bereitgestellt. Vorzugsweise wird das Verfahren nur für solche Zellen oder Partikel angewandt, die bereits in isolierter Form vorliegen und/oder die ohne Zerstörung menschlicher Embryonen gewonnen werden können.

Vorzugsweise wird das Verfahren derart durchgeführt, dass die Transfektionssubstanz allen zu transfizierenden Zellen oder Partikel in im Wesentlichen gleicher Konzentration zur Verfügung steht. Die mittels Transfektion einzuschleusenden Moleküle, insbesondere DNA, RNA, Peptide, Proteine oder Aminosäuren, liegen dabei in gelöster Form, vorzugsweise in bekannter Konzentration und homogen verteilt im Zellmedium vor und stehen allen Zellen oder Partikel, die durch die Mikrokapillare wandern, in gleicher Konzentration zur Verfügung. Zellen oder Partikel, die nicht vom Laserstrahl penetriert werden, können diese Moleküle allerdings nicht aufnehmen. Alternativ können die Moleküle auch an räumlich anderen Positionen der einzusetzenden Vorrichtung, insbesondere des einzusetzenden (modifizierten) Durchflusszytometers, den Zellen oder Partikeln zugeführt werden.

In einer weiteren Variante wird das Verfahren als Hochdurchsatzverfahren durchgeführt. Das derartige Hochdurchsatzverfahren zeichnet sich unter anderem dadurch aus, dass keine potentiell pathogenen Mikroorganismen und pathogenen Substanzen für den Transport der Fremd-DNA zu den Targetzellen oder Targetpartikel verwendet werden. Als Hochdurchsatzverfahren wird ein Verfahren verstanden, bei dem mehr als 3.000 Zellen oder Partikel pro Minute, insbesondere mehr als 5.000 Zellen oder Partikel pro Minute, insbesondere mehr als 7.000 Zellen oder Partikel pro Minute und ganz besonders mehr als 10.000 Zellen oder Partikel pro Minute analysiert und transfiziert werden können.

In einer Variante umfasst die Probe eine heterogen zusammengesetzte Mischpopulation von Zellen und/oder Partikeln. Die mit dieser Variante der Erfindung erzielten Vorteile bestehen insbesondere darin, dass unbekannte Zellen oder Partikel innerhalb einer heterogen zusammengesetzten Population (z.B. einer Blutprobe) zweifelsfrei identifiziert und nachfolgend selektiv transfiziert werden können.

In einer Variante umfasst die Mischpopulation auch Zellen oder Partikel, die nicht transfiziert werden sollen, wobei keine Bestrahlung der nicht zu transfizierenden Zellen oder Partikel mit der zweiten Laserlichtstrahlung erfolgt.

Das Verfahren eignet sich insbesondere zur Identifikation von Targetzellen oder Targetpartikel, die sich schwimmend in einer heterogen zusammengesetzten Zellsuspension befinden und realisiert Möglichkeiten für eine selektiv durchgeführte Transfektion dieser Targetzellen oder Targetpartikel. Die Zellvitalität wird kaum beeinträchtigt. Nennenswerte schädliche Nebeneffekte, wie phototoxische Effekte, werden weitgehend vermieden.

Weil die Probe durch ein in sich geschlossenes System wandert, kann die Probe steril eingebracht und auch wieder steril entnommen werden. In einer Variante wird das Verfahren daher steril durchgeführt.

Um die Zeit- und Handhabungsvorteile des beschriebenen Verfahrens besonders vorteilhaft auszunutzen, wird es in einer Variante derart durchgeführt, dass die vorgenannten Schritte an den zu transfizierenden Zellen oder Partikeln in einem singulären Probendurchlauf ausgeführt werden. Statt einer Vielzahl nachteiliger Handgriffe wie sie z.B. bei der Mikroinjektion oder Lasertransfektion erforderlich sind, können in einem solchen vorzugsweise automatisiert arbeitenden Hochdurchsatzverfahren sehr viele Zellen oder Partikel in kürzester Zeit analysiert und bearbeitet werden, weil die Zuhilfenahme einer mikroskopischen Apparatur nicht mehr erforderlich ist. Beispielsweise kann das Verfahren in einem modifizierten Durchflusszytometer durchgeführt werden, das einen Probendurchsatz von circa 5.000 Zellen oder Partikel pro Sekunde erlaubt.

Für eine bevorzugte Verfahrensausgestaltung werden über eine Zweiwegevorrichtung auf Basis eines Analyseprotokolls Targetzellen oder Targetpartikel (also zu transfizierende Zellen oder Partikel) und restliche Zellen oder Partikel (also nicht zu transfizierende Zellen oder Partikel) voneinander getrennt und in zwei voneinander getrennte Bereiche geführt. Dabei werden die Targetzellen oder Targetpartikel über eine weitere Kapillare in einen definierten Bereich innerhalb oder außerhalb einer erfindungsgemäßen Vorrichtung, insbesondere eines (modifizierten) Durchflusszytometers, geleitet und dort der bevorzugten Transfektionsmethode über kurze Zeit ausgesetzt. Hingegen werden die nicht ausgewählten Zellen oder Partikel in ein Auffanggefäß geführt und bleiben unbehandelt. Damit nur die Targetzellen oder Targetpartikel mit der einzuschleusenden DNA Kontakt erhalten, werden bei dieser bevorzugten Ausgestaltung die Fremdmoleküle (Moleküle der Transfektionssubstanz) an räumlich anderer Position als die Zellen oder Partikel zugeführt.

In einer Verfahrensvariante wird zur Transfektion von Targetzellen oder Targetpartikel eine mit Mikrokügelchen (sogenannten Microbeads) und fluorochrommarkierten Antikörpern gefärbte Zellprobe mit Hilfe eines Pumpsystems in ein Durchflusszytometer über eine vorgeschaltete Anreicherungssäule eingebracht, wobei die Zellen oder Partikel zu einem Analysepunkt geleitet werden, wo sie einen rechtwinklig zum Probenfluss angeordneten Laser passieren. Am Kreuzungspunkt des Laserstrahls mit dem Probenstrom werden an den einzelnen Zellen oder Partikel Licht gestreut und Fluoreszenzen angeregt. Linsen, Spiegel und Filter trennen dabei die emittierten Lichtanteile und stellen sicher, dass nur bestimmte Wellenlängenbereiche zu den Detektoren gelangen. Das Detektionssystem und die Elektronik quantifizieren die Fluoreszenz- und Streulichtemission jeder einzelnen Zelle und speichern sie in digitaler Form ab und ermöglichen so eine genaue Zellanalyse sowie Zellzählung und auch das elektronische Ansteuern oder Auffinden von Zellen oder Partikeln.

In einer vorteilhaften Ausführung können die Analyse und nachfolgend die Transfektion von Zellen oder Partikeln unabhängig voneinander wahlweise mit oder ohne Fluoreszenz- Anregung erfolgen.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführung kommen für die Perforation der Zellmembran bzw. Partikelumhüllung multiple Laserimpulse mit einer Impulsfolgefrequenz im MHz-Bereich oder höher zur Anwendung. Vorzugsweise werden Laserimpulse mit Energien im Bereich von wenigen Nanojoule und mittlere Lichtintensitäten im Bereich TW/cm ² verwendet. In Abhängigkeit des verwendeten Probenmilieus, der Zellart und Zelldichte können die am besten geeigneten Parameter in Vorversuchen ermittelt und an die jeweiligen Bedingungen angepasst werden.

In weiteren modifizierten Anwendungen kann das beschriebene Verfahren beispielsweise auch in einen Bioreaktor, in ein Dialysegerät oder in ein System, das für die Apharese ausgelegt ist, integriert werden.

Bevorzugte Ausgestaltungen der beschriebenen Vorrichtung sind in analoger Weise auf das beschriebene Verfahren übertragbar und umgekehrt.

Die vorliegende Erfindung wird nachstehend anhand von Beispielen und Figuren näher erläutert. Es zeigen:

Figur 1 eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels

Vorrichtung zur Analyse und Transfektion von Zellen oder Partikeln, Figur 2 eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels

Vorrichtung zur Analyse und Transfektion von Zellen oder Partikeln,

Figur 3 eine schematische Darstellung eines dritten Ausführungsbeispiels

Vorrichtung zur Analyse und Transfektion von Zellen oder Partikeln,

Figur 4 eine schematische Darstellung eines Ausführungsbeispiels einer

Mikrokapillare und

Figur 5 eine schematische Darstellung eines vierten Ausführungsbeispiels

Vorrichtung zur Analyse und Transfektion von Zellen oder Partikeln.

Die Figur 1 zeigt ein erstes Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung zur Analyse und Transfektion von Zellen oder Partikeln. Der Einfachheit halber wird im Nachfolgenden (auch in Bezug auf die weiteren Ausführungsbeispiele) nur noch die Transfektion von Zellen beschrieben, wenngleich die Ausführungsbeispiele ebenso zur Transfektion von Partikeln geeignet sind.

Diese Vorrichtung weist ein Probenreservoir 1 auf, in das zu transfizierende Zellen und eine Transfektionssubstanz gefüllt werden können. Neben zu transfizierenden Zellen kann das Probenreservoir auch Zellen aufnehmen, die nicht transfiziert werden sollen. Die beschriebene Vorrichtung ist in der Lage, zu transfizierende Zellen von nicht zu transfizierenden Zellen zu trennen.

Die im Probenreservoir 1 enthaltene Probe wird in eine Mikrokapillare 2 aufgesaugt. Dabei durchläuft die Probe einen Messpunkt 6 eines ersten Lasers 3, der für eine Zellanalyse vorgesehen und eingerichtet ist. Der erste Laser 3 kann auch als Analyselaser bezeichnet werden. Dem ersten Laser 3 sind im optischen Weg optische Systeme 4 nachgeordnet, die eine Fokussierung des von dem ersten Laser 3 ausgesandten Laserstrahls 5 auf die in der Mikrokapillare 2 befindliche Probe gewährleisten. Der Laserstrahl 5 des ersten Lasers 3 wird durch die in der Mikrokapillare 2 befindliche Probe gestreut. Dabei ergibt sich ein Streuanteil in Vorwärtsrichtung 7 und ein Streuanteil in Seitwärtsrichtung 8.

Der Streuanteil in Vorwärtsrichtung 7 wird mittels eines Photomultipliers oder einer Photodiode 50 detektiert, so dass ein Signal des Vorwärtsstreulichts 56 erzeugt wird. Dieses Signal des Vorwärtsstreulichts 56 wird auch als Forward Side Scatter (FSC) bezeichnet. Das Signal des Vorwärtsstreulichts 56 wird einem Signalwandler 57 zugeführt und dort in elektrische Impulse umgewandelt.

Der Streulichtanteil in Seitwärtsrichtung 8 (oder auch das Seitwärtsstreulicht) wird ebenfalls über Photodioden 50 detektiert. Dazu wird das Seitwärtsstreulicht 8 über mehrere Spiegel 51 unterschiedlichen Photodioden 50 zugeführt, die unterschiedliche Anteile des Seitwärtsstreulichts 8 detektieren können. Auf diese Weise wird ein Signal des Seitwärtsstreulichts 52, das auch als Sideward Scatter (SSC) bezeichnet wird, detektiert. Ferner wird ein Kanal FL-1 53, ein Kanal FL-2 54 und ein Kanal FL-3 55 mit entsprechenden Anteilen des Seitwärtsstreulichts 8 beaufschlagt. Die entsprechenden Signale der Kanäle 53, 54 und 55 sowie das Signal des Seitwärtsstreulichts 52 werden dem Signalwandler 57 zugeführt. Die vom Signalwandler 57 erzeugten elektrischen Impulse werden über eine Leitung 58 an einen Personal Computer (PC) 59 übergeben. Dieser Personal Computer ist mit entsprechender Analysesoftware ausgestattet und kann auf einem Bildschirm 60 die ermittelten Parameter des Vorwärtsstreulichts 7 und Seitwärtsstreulichts 8 anzeigen.

Der FSC ist dabei ein Maß für die Größe der Zelle, während der SSC die Granularität einer Zelle erfasst. Über die spezifische Bindung eines fluoreszenzmarkierten Antikörpers in einer Zelle können über die Kanäle 53, 54 und 55 zusätzliche Informationen über den biologischen Ursprung einer Zelle generiert werden. Zusammenfassend ermöglichen die aus dem Vorwärtsstreulicht 7 und dem Seitwärtsstreulicht 8 detektierten Signale eine exakte Analyse hinsichtlich der Quantität und Qualität einer in der Mikrokapillare 2 analysierten Zelle. Während bei aus dem Stand der Technik bekannten Durchflusszytometern nach erfolgter Analyse die analysierten Zellen einfach entsorgt werden, sieht die vorliegend beschriebene Vorrichtung zur Analyse und Transfektion von Zellen eine anschließende Transfektion der zuvor analysierten Zellen vor. Zu diesem Zweck werden die in der Mikrokapillare 2 befindlichen Zellen unmittelbar nach ihrer Zählung und Analyse durch den ersten Laser 3 in einen Messbereich 13 eines zweiten Lasers 9 überführt. Daher verdient es besondere Erwähnung, dass bei der zuvor erfolgten Zellzählung und Zählanalyse die biologischen Strukturen der gezählten und analysierten Zellen in keiner Weise verändert wurden. Demgegenüber soll bei der nun erfolgenden Transfektion eine transiente Eröffnung der Zellmembran durchgeführt werden. Für eine schonende und dennoch effektive Transfektion sollten die einzustellenden physikalischen Parameter möglichst exakt ermittelt werden, um eine höchstmögliche Transfektionseffizienz zu erzielen. Von besonderer Bedeutung ist dabei die Wahrung der Zellvitalität. Um potentielle Messfehler bei der Zellanalyse zu vermeiden, erfolgt die Transfektion vorzugsweise in ausreichender Entfernung zum Laserstrahl 5 des ersten Lasers 3.

Der zweite Laser 9 bzw. Transfektionslaser sendet einen zweiten Laserstrahl 1 1 aus, der über optische Systeme 10 für den zweiten Laser 9 auf den Messpunkt 13 an der Mikrokapillare 2 gerichtet wird. Dabei kann zusätzlich ein Shutter 12 vorgesehen sein, der den zweiten Laserstrahl 1 1 bei Bedarf unterbrechen kann.

Durch ein Zusammenwirken des ersten Lasers 3 und des zweiten Lasers 9 ist somit eine Analyse und Transfektion von Zellen in einer gemeinsamen Apparatur während eines gemeinsamen Probendurchlaufs möglich. Dabei erfolgt die Transfektion der die entsprechenden Probe enthaltenen Zellen zeitlich kurz nach der Analyse, aber immer noch in einem singulären Probendurchlauf.

Die Figur 2 zeigt ein zweites Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung zur Analyse und Transfektion von Zellen. Dabei wurden Elemente, die bereits im Zusammenhang mit dem ersten Ausführungsbeispiel erläutert wurden, wieder mit dem gleichen Bezugszeichen versehen. Auf eine diesbezügliche erneute Erläuterung wird verzichtet. Es wird insofern auf die Erläuterungen zur Figur 1 verwiesen.

Aus Vereinfachungsgründen sind nicht sämtliche für die Analyse der Zellen erforderlichen Details in der Figur 2 dargestellt. Vielmehr fokussiert sich die Darstellung der Figur 2 auf ein Ausführungsbeispiel zum effizienten Probentransport.

Wie bereits im Zusammenhang mit der Figur 1 erläutert, wird die in dem Probenreservoir enthaltene Probe durch die Mikrokapillare 2 aufgesaugt. Dies erfolgt gemäß dem Ausführungsbeispiel der Figur 2 dadurch, dass die Mikrokapillare 2 mittels einer Befestigung 14 an einer ersten Leitung 15 fixiert ist. Diese erste Leitung 15 geht in eine zweite Leitung 16 über, welche mit einem ersten Ventil 17 verbunden ist. Dem ersten Ventil 17 in Strömungsrichtung nachgeordnet ist ein T-förmiges Verbindungsstück 18, das einerseits mit einer Pumpe 19 und andererseits mit einem zweiten Ventil 24 verbunden ist. Die Pumpe 19 weist einen mit einem Kolben verbundenen Pumpstängel 20 auf, der mittels einer Ansaugautomatik 21 bewegt werden kann. Dazu weist die Ansaugautomatik 21 eine Gewindestange 22 auf, die über einen Mitnehmer 23 mit dem Pumpstängel 20 verbunden ist. Auf diese Weise ist es der Ansaugautomatik möglich, eine Probe aus dem Probenreservoir 1 aufzusaugen, wenn das erste Ventil 17 geöffnet und das zweite Ventil 24 geschlossen ist. Ferner ist es der Ansaugautomatik 21 auf diese Weise möglich, die Probe in ein erstes Sammelgefäß 28 zu überführen, wenn das erste Ventil 17 geschlossen und das zweite Ventil 24 geöffnet ist. Dazu steht das zweite Ventil 24 über eine dritte Leitung 25 und ein drittes Ventil 26 sowie ein Verbindungsstück 27 mit dem ersten Sammelgefäß 28 in Strömungsverbindung.

Um das erste Ventil 17, das zweite Ventil 24, das dritte Ventil 26 und die Ansaugautomatik 21 gezielt ansteuern zu können, ist eine Steuerungseinheit 48 vorgesehen. Diese ist in bidirektionaler Weise mit einem Prozessor 49 eines Computers, beispielsweise des Computers 59 der Figur 1 , verbunden. Dadurch ist es auch möglich, in Abhängigkeit der von dem Computer 59 empfangenen Analysesignale des ersten Lasers 3 die Ansauggeschwindigkeit der in dem Probenreservoir 1 enthaltenen Probe zu regulieren und ein Überführen der Probe in das erste Sammelgefäß 28 zu gewährleisten.

Der in der Figur 1 dargestellte Personal Computer 59 kann also insbesondere dafür verwendet werden, den ersten Laser 3, den zweiten Laser 9, das optische System 4 des ersten Lasers 3, das optische System 10 des zweiten Lasers 9, die Pumpe 19, die Ansaugautomatik 21 und damit die Gewindestange 22, den Mitnehmer 23 und den Pumpstängel 20 sowie die Steuerungseinheit 48 zu betätigen bzw. anzusteuern. Die Figur 3 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung zur Analyse und Transfektion von Zellen, das im Wesentlichen dem in der Figur 2 dargestellten Ausführungsbeispiel entspricht. Aus Vereinfachungsgründen wurden dabei die Systeme zur Betätigung der Pumpe 19 und zur Ansteuerung der Ventile und der Pumpe nicht gesondert dargestellt. Um Wiederholungen zu vermeiden, wird lediglich auf die Unterschiede zwischen dem Ausführungsbeispiel der Figur 3 und dem Ausführungsbeispiel der Figur 2 eingegangen.

Statt einer einfachen Mikrokapillare 2 ist beim Ausführungsbeispiel der Figur 3 ein Mikrochip 29 vorgesehen. Dieser Mikrochip 29 weist eine Mikrostrukturierung auf, die die Funktion der Mikrokapillare 2 übernimmt. Eine derartige Mikrostrukturierung eines Mikrochips ist dabei als Mikrokapillare im Sinne der vorliegenden Erfindung zu sehen. Der Mikrochip 29 ist über ein erstes Mikrochipverbindungsstück 30 mit der Mikrokapillare 2 und über ein zweites Mikrochipverbindungsstück 31 mit der ersten Leitung 15 verbunden. Eine Einkopplung des zweiten Laserstrahls 1 1 des zweiten Lasers 9 erfolgt dabei an einem Punkt des Mikrochips 29, an dem die dem Mikrochip 29 durchströmende Probe eine im Wesentlichen rechtwinklige Richtungsänderung vornehmen muss. Der zweite Laserstrahl 1 1 trifft dabei in Strömungsrichtung auf die den Mikrochip 29 durchströmende Probe. Sofern der Mikrochip 29 eine Ummantelung aufweist, ist diese kleinformatig im Bereich 13 des Auftreffens des zweiten Laserstrahls 1 1 auf dem Mikrochip 29 entfernt, damit der zweite Laserstrahl 1 1 auch tatsächlich auf die den Mikrochip 29 durchströmende Probe treffen kann.

Unabhängig davon, ob der zweite Laserstrahl 1 1 auf die Probe in derselben Mikrokapillare 2 wie der erste Laserstrahl 5 trifft (vergleiche hierzu Figur 2) oder ob dies im Bereich des Mikrochips 29 erfolgt, der der Mikrokapillare 2 in Strömungsrichtung nachgeordnet ist (vergleiche hierzu Figur 3), kommen bei der Vorrichtung bei der Analyse und Transfektion von Zellen bevorzugt Lasersysteme zum Einsatz, deren Laserleistung, Pulsdauer und Pulswiederholungsrate so gestaltet sind, dass sich die Zellmembran der zu transfizierenden Zellen sehr kurzzeitig öffnet und sofort danach wieder vollständig verschließt. Mit anderen Worten, es werden Lasersysteme eingesetzt, die für die Transfektion von Zellen besonders gut geeignet sind. Dadurch werden letale Effekte an den zu transfizierenden Zellen vermieden. Die Bestrahlungsdauer wird über die Wanderungsgeschwindigkeit der Zellen in der Mikrokapillare 2 bzw. der Mikrokapillare 2 und dem Mikrochip 29 eingestellt. Dazu ist die eingesetzte Pumpe 19 elektronisch ansteuerbar. Ferner kann der optional vorhandene Shutter 12 die Bestrahlungsdauer der Zellen durch den zweiten Laser 9 reduzieren.

Die Figur 4 zeigt eine Detaildarstellung des Mikrochips 29, der in dem Ausführungsbeispiel der Figur 3 eingesetzt wird. In dieser Detaildarstellung ist der Ort 13, an dem der zweite Laserstrahl 1 1 auf die den Mikrochip 29 durchströmende Probe trifft, besonders gut erkennbar. Wie bereits oben erläutert, trifft der zweite Laserstrahl 1 1 auf die Probe in deren Strömungsrichtung. Dies erfolgt jedoch genau an einem Ort, an dem die Probe aufgrund der Mikrostrukturierung des Mikrochips 29 eine im Wesentlichen rechtwinklige Richtungsänderung ausführen muss. Der Laserstrahl trifft die den Mikrochip 29 durchströmende Probe dabei von hinten in Richtung der neuen Strömungsrichtung der Probe.

Die Figur 5 zeigt ein weiteres Ausführungsbeispiel einer Vorrichtung zur Analyse und Transfektion von Zellen. Gleiche Elemente werden dabei wieder mit den gleichen Bezugszeichen versehen. Es wird insoweit auf die Erläuterungen zu den vorherigen Abbildungen verwiesen. Nachfolgend werden nur die Unterschiede zu den bisherigen Ausführungsbeispielen erläutert.

Im Unterschied zu den bisherigen Ausführungsbeispielen ist es beim Ausführungsbeispiel der Figur 5 vorgesehen, die Transfektionssubstanz nicht mit in das Probenreservoir 1 zu füllen, sondern den zu transfizierenden Zellen separat zuzuführen.

Dazu ist das Probenreservoir 1 über eine erste Zuleitung 37 und ein viertes Ventil 34 mit einer zweiten Zuleitung 300 verbunden. Über die erste Zuleitung 37 können sowohl zu transfizierende Zellen als auch nicht zu transfizierende Zellen in die zweite Zuleitung 300 überführt werden. Durch eine dritte Zuleitung 38, die über ein fünftes Ventil 35 mit der zweiten Zuleitung 300 in Strömungsverbindung steht, kann die Transfektionssubstanz in die zweite Zuleitung 300 eingebracht werden. Schließlich ist noch eine vierte Zuleitung 39 vorgesehen, die über ein sechstes Ventil 36 ebenfalls mit der zweiten Zuleitung 300 verbunden ist. Die vierte Zuleitung 39 dient dabei der Zufuhr von Waschlösungen für eventuell durchzuführende Wasch- bzw. Desinfektionsvorgänge.

Im Ausführungsbeispiel der Figur 5 ist zudem eine Hochgradienten-Separationssäule 32 vorgesehen, auf die das Magnetfeld eines starken Magneten 33 einwirken kann. Diese Hochgradienten-Separationssäule 32 ist dabei an ihrer Eingangsseite mit der zweiten Zuleitung 300 verbunden. An ihrer Ausgangsseite ist sie mit einer weiteren Zuleitung 301 verbunden, die wiederum in Strömungsverbindung mit der Mikrokapillare 2 steht.

Die Hochgradienten-Separationssäule 32 dient zur Unterstützung einer selektiven Transfektion von Targetzellen. Dies wird nachfolgend anhand eines typischen Betriebsablaufs der in der Figur 5 dargestellten Vorrichtung zu Analyse und Transfektion von Zellen näher erläutert.

Um eine selektive Transfektion von Targetzellen zu erreichen, wird die in dem Probenreservoir 1 aufgenommene Zellprobe vorab mit Antikörper-konjugierten Nanokügelchen (sogenannte Nanobeads), beispielsweise mit MACS-Nanobeads, angefärbt. Wahlweise können die in die Targetzellen einzuschleusenden Moleküle der Transfektionssubstanz der Gesamtpopulation entweder direkt in das Probenreservoir 1 zugegeben werden, oder aber über die dritte Zuleitung 38. Folgt eine Zufuhr über die dritte Zuleitung 38, hat dies den Vorteil, dass lediglich die zu transfizierenden Targetzellen den Molekülen der Transfektionssubstanz ausgesetzt werden, nicht jedoch die nicht zu transfizierenden Zellen. Denn eine Zufuhr der Transfektionssubstanz über die dritte Zuleitung 38 kann zu einem vordefinierten Zeitpunkt während des Betriebs der Vorrichtung erfolgen.

Das vierte Ventil 34, das fünfte Ventil 35 und das sechste Ventil 36 können ebenso wie das erste Ventil 17, das zweite Ventil 24 und das dritte Ventil 26 (vergleiche hierzu Figur 2) über die in der Figur 2 ebenfalls dargestellte Steuerungseinheit 48 angesteuert werden.

Die im Probenreservoir 1 aufgenommene Probe, welche sowohl mit Nanobeads markierte Targetzellen als auch nicht zu transfizierende, unmarkierte Zellen umfasst, wird nun über die erste Zuleitung 37 und die zweite Zuleitung 300 zur Hochgradienten-Separationssäule 32 überführt. An diese Hochgradienten-Separationssäule 32 wurde mittels des Magneten 33 ein Magnetfeld angelegt. Dadurch verbleiben die mit den magnetischen Nanobeads markierten Targetzellen größtenteils innerhalb der Hochgradienten-Separationssäule 32, während die nicht markieren Zellen über die weitere Zuleitung 301 der Mikrokapillare 2 und den weiteren Leitungen der Vorrichtung zugeführt werden. Die Hochgradienten-Separationssäule 32 kann dabei beispielsweise eine MACS-Säule sein, die beispielsweise mit eisenmagnetischer rostfreier Stahlwolle oder Eisenkügelchen gefüllt ist. Dabei kann die Hochgradienten- Separationssäule 32 mit einem Vorfilter ausgestattet sein. Solange das von den Magneten 33 aufgebaute Magnetfeld auf die Hochgradienten- Separationssäule 32 einwirkt, sind die Targetzellen, die an die Nanobeads gebunden haben, in der Hochgradienten-Separationssäule 32 fixiert. Diejenigen Zellen, die nicht an die Antikörper-konjugierte Nanobeads gebunden haben, da sie nicht die gewünschten zellulären Eigenschaften aufweisen, (Negativzellfraktion), binden unabhängig vom Magnetfeld des Magneten 33 nicht an die Hochgradienten- Separationssäule 32. Vielmehr strömen sie durch die Pumpleistung der Pumpe 19 durch die Mikrokapillare 2 und können dort vom ersten Laser 3 analysiert werden. Der Magnet 33 blockiert während seiner Aktivität (während der die Targetzellen an die Hochgradienten- Separationssäule 32 gebunden bleiben) gleichzeitig auch den Betrieb des zweiten Lasers 9. Daher erfolgt keine Transfektion der Negativzellfraktion. Vielmehr werden die nicht transfizierten Zellen der Negativzellfraktion mittels der Pumpe 19 in das Sammelgefäß 28 überführt. Damit die Zellen in der Negativzellfraktion nur in das Sammelgefäß 28, nicht jedoch in andere Sammelgefäße gelangen, wird ein siebtes Ventil 40 geschlossen gehalten. Dieses siebte Ventil 40 ist in Strömungsrichtung hinter einem T-förmigen Verbindungsstück der dritten Leitung 25 angeordnet, an dem zugleich auch das dritte Ventil 26, welches das erste Sammelgefäß 28 öffnen und verschließen kann, angeordnet ist.

Weil keine Transfektion der Negativzellfraktion erwünscht ist, sondern lediglich deren Zellzählung und Analyse, kann die Durchflussgeschwindigkeit dieser Zellen durch die Mikrokapillare 2 verhältnismäßig groß gewählt werden. Es ist daher von hohem Nutzen, dass hier ein Durchsatz von beispielsweise 10.000 Zellen pro Sekunde eingestellt werden kann.

Nachdem die Negativzellfraktion vollständig analysiert und insbesondere auch vollständig in das Sammelgefäß 28 überführt wurde, kann eine Analyse und Transfektion der Targetzellen erfolgen. Dazu wird das Magnetfeld des Magneten 33 ausgeschaltet, so dass die Targetzellen nicht mehr an die Hochgradienten-Separationssäule 32 binden. Vielmehr strömen sie durch die weitere Zuleitung 301 in die Mikrokapillare 2. Die Durchflussrate wird dabei auf ein deutlich niedrigeres Niveau reduziert. Eine Elution der Targetzellen von der Hochgradienten-Separationssäule kann dabei beispielsweise über ein Ansaugen von einer Lösung der Transfektionssubstanz erfolgen, die über die dritte Zuleitung 38 in das System eingebracht wird. Alternativ kann ein Zufluss von Puffer über die vierte Zuleitung 39 erfolgen. Die Targetzellen werden zunächst als Einzelzellen am ersten Laserstrahl 5 des ersten Lasers 3 vorbeigeführt. Hier erfolgt eine Zellzählung und Zellanalyse, wie bereits oben beschrieben. Nach Abschluss der Analyse wandern die Targetzellen weiter durch die Mikrokapillare 2 aufgrund einer entsprechenden Bewegung der Pumpe 19. Sie gelangen damit zum Ort der Transfektion 13, wo der zweite Laserstrahl 1 1 auf die Targetzellen trifft. Es ist von Bedeutung, dass über die Deaktivierung des Magneten 33 zeitgleich der zweite Laser 9 aktiviert wurde, der nun den zweiten Laserstrahl 1 1 für die Transfektion der Zellen zeitnah aussendet. Die Wechselwirkung zwischen den einzelnen Elementen der Vorrichtung zur Analyse und Transfektion von Zellen wird dabei - wie bereits oben erwähnt - über die in der Figur 2 dargestellte Steuerungseinheit 48 ausgeführt. Durch den zweiten Laserstrahl 1 1 wird die Zellmembran der Targetzellen transient geöffnet, so dass die Moleküle der Transfektionssubstanz in die Targetzellen eindringen können. Nach erfolgter Transfektion werden die transfizierten Zellen durch weitere Pumpbewegungen der Pumpe 19 in ein zweites Sammelgefäß 43 überführt, das in Strömungsverbindung nach dem siebten Ventil 40 angeordnet ist. Das zweite Sammelgefäß 43 ist dabei über ein achtes Ventil 41 und ein Verbindungsstück 42 mit dem entsprechenden Leitungssystem verbunden.

Ferner ist bei diesem Ausführungsbeispiel noch ein drittes Sammelgefäß 47 vorgesehen, dass von der Zuleitung zum zweiten Sammelgefäß 43 über ein neuntes Ventil 44 und ein zehntes Ventil 45 abgetrennt werden kann. Durch geeignete Ventilstellung können beispielsweise Waschlösungen in das dritte Sammelgefäß 47 überführt werden. Dazu müssen das dritte Ventil 26 und das achte Ventil 41 geschlossen sein, während das siebte Ventil 40, das neunte Ventil 44 und das zehnte Ventil 45 geöffnet sein müssen. Die weiteren möglichen bzw. erforderlichen Ventilstellungen zur gezielten Ansteuerung des ersten Sammelgefäßes 28 und des zweiten Sammelgefäßes 43 sind, soweit sie nicht schon explizit erläutert wurden, für einen Fachmann ohne weiteres ersichtlich.

Die in dem zweiten Sammelgefäß 43 aufgenommenen transfizierten Zellen können nach Abschluss des Transfektionsverfahrens zügig aus dem zweiten Sammelgefäß 43 entnommen und weiteren Untersuchungen oder einer Kultivierung im Brutschrank zugeführt werden.

Um eine zügige Überführung der bereits transfizierten Zellen in das zweite Sammelgefäß 43 zu erreichen, kann die Geschwindigkeit der Pumpe 19 nach der Transfektion der Targetzellen erhöht werden. Die jeweils optimalen Pumpgeschwindigkeiten für die einzelnen Schritte des durchzuführenden Verfahrens können in der Software des angeschlossenen Personal Computers 59 hinterlegt sein und über die Steuerungseinheit 48 an die einzelnen Elemente der Vorrichtung zur Analyse und Transfektion von Zellen übermittelt werden (vgl. hierzu auch die Figuren 1 und 2). Ausführungsvarianten der Erfindung werden nun anhand von Beispielen näher dargestellt. Beispiel 1 : Erster beispielhafter Verfahrensablauf

Eine mit Antikörpern spezifisch angefärbte Zellprobe wird mit den einzuschleusenden Molekülen, meist DNA oder RNA, vermischt. Anschließend wird diese Probe in ein modifiziertes Durchflusszytometer eingebracht.

Eine vorab mit Antikörper-konjugierten Nanokügelchen (sogenannten Nanobeads), beispielsweise MACS-Nanobeads, gefärbte Zellprobe wird in ein Durchflusszytometer eingeführt, z. B. per Pipettierroboter. Zunächst wird die Probe über das Pumpsystem in eine Hochgradienten-Separationssäule (z.B. eine MACS-Säule) eingebracht, wie dies bereits zuvor erläutert wurde. Diese Fraktion wird im Folgenden als Targetzellen bezeichnet, weil sie größtenteils die Targetzellen enthält. Sie bleibt an der Säule gebunden, solange das Magnetfeld bestehen bleibt. Diejenigen Zellen, die im Folgenden als Negativfraktion bezeichnet werden, weil sie nicht über die gewünschten Eigenschaften verfügen und somit nicht an die Separationssäule binden, werden dabei mittels kontinuierlicher Pumpleistung sofort durch die Säule hindurchgeführt und direkt in die Mikrokapillare eingeleitet. Währenddessen wird mit stetem, höheren Druck Trägerflüssigkeit in die Mikrokapillare eingeschleust, welche den aus Negativzellen bestehenden Probenstrahl erfasst, mit einem Hüllstrom umschließt und somit gleichermaßen koaxial zentriert. Hierbei kann nun beobachtet werden, dass der Abstand zwischen direkt aufeinander folgenden Zellen erweitert wird, wenn durch eine Querschnittsverringerung in der Messkammer beide Flüssigkeitsströme beschleunigt und somit verjüngt werden. Diese sogenannte hydrodynamische Fokussierung ermöglicht, dass die Zellen nun jeweils als Einzelzellen den Laserstrahl an einer definierten Stelle passieren. Alternativ kann auch eine Messkapillare ohne Hüllstrom zum Einsatz kommen, wobei insbesondere eine Messkapillare mit einer speziellen inneren Ausformung dafür sorgen kann, dass die Zellen als Einzelzellen zentral durch die Messkapillare fließen. Zunächst werden diese sogenannten Negativzellen innerhalb der Messkapillare zu einem Analysepunkt geleitet, wo sie nacheinander an einem rechtwinklig zum Probenfluss ausgerichteten Laserstrahl vorbeigeführt werden. (Dieser wird beispielsweise erzeugt durch einen sogenannten blauen Laser mit 388 bzw. 488 nm). An jenem Punkt, an dem der Laserstrahl den Probenstrom kreuzt, werden an den einzelnen Zellen Licht gestreut und Fluoreszenzen angeregt. Hierdurch erfolgt die Zellzählung und Analyse. Denn trifft ein Lichtstrahl auf eine Zelle, streut diese aufgrund ihrer physikalischen Eigenschaften das Licht, das jedoch nicht in alle Richtungen gleichmäßig abgelenkt wird. Der größte Anteil wird in Vorwärtsrichtung, d.h. im Winkel bis zu 10° entlang des einfallenden Lichtstrahls gebeugt und als Vorwärtsstreulicht (FSC, forward scatter) gemessen. FSC beschreibt dabei die Zellgröße. Das restliche, im rechten Winkel zum einfallenden Lichtstrahl abgelenkte Licht wird als Seitwärtsstreulicht (SSC, sideward scatter) detektiert und ist ein Maß für die intrazelluläre Granularität. Nach Abschluss der Zellzählung- und Analyse wandern die Zellen dann zu einem räumlichen Bereich, wo sie vom Strahl eines für die Transfektion von Zellen geeigneten Lasers erfasst werden.

Nachdem die sogenannten Negativzellen den Laserstrahl für die Zellanalyse passiert haben, gelangen die Streulicht- und Fluoreszenzsignale der Zellen in die Sammeloptik und werden mit Hilfe von Linsen, Spiegeln und Filtern zerlegt und zu den Detektoren (Photodioden und PMTs, engl, für„photomultiplier tubes") geleitet. Spezielle optische Filter lassen dabei nur Licht einer bestimmten Wellenlänge passieren und ermöglichen somit die Spezifität der Detektoren. Abhängig von der Bauart des Durchflusszytometers können unterschiedlich viele Fluoreszenzsignale getrennt detektiert werden.

Während diese erste, nichtgebundene Zellfraktion als Einzelzellen durch die Mikrokapillare wandert, werden fortlaufend Fluoreszenzsignale emittiert, die in den PMTs eine proportionale Anzahl von Elektronen freisetzen. Damit wird ein Spannungspuls erzeugt. Der zeitliche Verlauf der Spannung für jede einzelne Zelle wird durch die Parameter Pulshöhe, Pulsfläche und Pulsweite charakterisiert. Diese Parameter werden durch die Pulsverarbeitung erfasst, anschließend in elektrische Signale umgewandelt und an einen Computer weitergeleitet. Auf Basis dieser Daten erstellt der PC mit Hilfe einer speziellen Software eine genaue Analyse über Anzahl und Art dieser Zellen. Hierfür werden die erzeugten optischen Signale (Photonen) in den Photodektoren in elektronische Signale (Spannungspulse) konvertiert, deren Höhe mit der Intensität des Lichtsignals korreliert. Die Fluoreszenz- und Streulichtemissionen jeder einzelnen Zelle werden in digitaler Form im FCS-Format gespeichert (FCS steht für den englischen Fachbegriff flow cytometry Standard), wobei die Rohdaten die Messwerte jeder Zelle als auch die ihr zugehörigen Geräteeinstellungen enthalten. Üblicherweise werden die Messergebnisse über 4 Dekaden in 1024 Kanäle gerastert.

Weil die Software keine zu transfizierenden Targetzellen ermittelt, werden die sogenannten Negativzellen nicht transfiziert. Das wird dadurch bewerkstelligt, indem die Software des Computers auf Basis der Analysewerte keinen Befehl zum Öffnen des Strahlengangs für den Laserstrahl des Transfektionslasers erteilt. Somit bleibt der Shutter dauerhaft in einer Position, in der kein Laserstrahl auf die Zellen der Negativfraktion ausgesendet wird. Nach Abschluss der Analyse können daher die Zellen völlig unbehandelt mittels einer Pumpe in den sogenannten negativen Container weitergeleitet werden, wo sie steril aufgefangen werden. Nun werden die sogenannten Targetzellen, die für die Transfektion vorgesehen sind, freigesetzt, indem das Magnetfeld, das auf die Anreicherungssäule einwirkt, abgeschaltet wird. Anschließend werden die Targetzellen ebenfalls über das Pumpsystem auf die Mikrokapillare eluiert. Hier werden sie auf gleiche Art und Weise wie die negative Fraktion analysiert. Nach Abschluss der Analyse wandern die Zellen weiter durch die Mikrokapillare aufgrund fortlaufender Pumpbewegungen. Dabei werden sie jedoch an definierter Position vom Laserstrahl des Transfektionslasers erfasst, der allerdings sehr kurzzeitig auf jede einzelne Zelle einwirkt. Es kann sich hierbei als vorteilhaft erweisen, wenn Elektroden entlang der Mikrokapillare und insbesondere in räumlicher Nähe des starr ausgerichteten Transfektionslaserstrahls platziert werden, wodurch die Software des Computers vertiefte Kenntnis über die räumliche Lokalisation der Targetzellen innerhalb der Mikrokapillare erhalten kann, wodurch auch ein schneller Shutter angeleitet werden kann.

Zur Transfektion der Targetzellen wird nun ein dauerhaft ausgesendeter, starr fixierter Laserstrahl eines für die Transfektion von Zellen geeigneten Lasers auf einen definierten Bereich innerhalb einer Mikrokapillare beugungsbegrenzt ausgerichtet, durch den mit hoher Wahrscheinlichkeit die Targetzellen fließen. Der Laser für die Transfektion von Zellen kann beispielsweise ein Femtosekundenlaser sein. Sein fokussierter Laserstrahl erfasst dabei die Targetzellen, vorzugsweise während sie noch als Einzelzellen und mit hoher Fließgeschwindigkeit nach Abschluss der Analyse weiterhin durch die Messkapillare in Richtung des potentiellen Ausgangs wandern. Allerdings wird der Laserstrahl des Transfektionslasers sofort mit Hilfe eines schnellen Shutters für ein definiertes Zeitintervall blockiert, vorzugsweise kurz nachdem eine Zelle in den Transfektionslaserstrahl eingetreten ist. Spätestens nach Austritt der Zelle aus dem Strahlengang des Transfektionslasers öffnet der Shutter erneut den Strahlengang, damit der Laserstrahl die nächste Zelle penetrieren kann. Der Shutter kann dabei eine begrenzte Einwirkung der Laserstrahlung auf die Zelle realisieren, vorzugsweise eine Bestrahlungsdauer von einigen Millisekunden (100 ms oder weniger) bis zu einigen Mikrosekunden (10 με oder mehr). In Abhängigkeit der Fließgeschwindigkeit der Probe sowie der Schnelligkeit des Shutters wird dabei jede Targetzelle, die den Laserstrahl passiert, ein bis wenige Male und vorzugsweise über eine Fläche kleiner als 1 μηι ² eröffnet, sodass Moleküle in das Zellinnere kurzzeitig eindringen können. Beispiel 2: Zweiter beispielhafter Verfahrensablauf

In einer Variante kann die Transfektion von Zellen auch ohne vorgeschaltete magnetische Anreicherungssäule und ohne die Verwendung magnetischer Beads ausgeführt werden. Hierfür werden die Targetzellen auf Basis zuvor erzeugter Analysewerte mit Hilfe der Software des Computers identifiziert, insbesondere über die Parameter FSC, SSC sowie der emittierten Fluoreszenz. Dabei kann die Software des PC nicht nur potentielle Targetzellen innerhalb einer heterogen zusammengesetzten Population auffinden, sondern diese Zellen während ihrer Passage durch die Mikrokapillare auch softwaremäßig nachverfolgen, weil verfahrensgemäß keine Vermischung der Zellpopulation innerhalb der Mikrokapillare auftreten kann. Insbesondere kann der PC exakt die Zeit vorauseilend berechnen, die eine positiv identifizierte Zelle nach Abschluss der für die Zellanalyse erforderlichen Pulsverarbeitung weiterhin räumlich und zeitlich innerhalb der Mikrokapillare schwimmend zurücklegen muss bis exakt zu dem Bereich, wo sie nachfolgend von dem fokussierten Transfektionslaserstrahl kurzzeitig getroffen werden wird. Dabei kann der PC auch den schnellen Shutter anweisen, den Strahl des Transfektionslasers sofort zu unterbrechen, nachdem eine Targetzelle in den Laserstrahl eingetreten ist, um dadurch eine sehr begrenzte Einwirkung der Laserstrahlung auf die Targetzelle zu realisieren. Hierdurch wird die Zelle transient eröffnet, sodass Moleküle in das Zellinnere kurzzeitig eindringen können. Die restlichen Zellen, die nicht über die biologischen, chemischen und physikalischen Merkmale der Targetzellen verfügen, passieren den Laserstrahl völlig unbehandelt, weil der Shutter den Laserstrahl auf Befehl der Software nicht freigibt und demzufolge auch keine Moleküle in diese Zellen eindringen können. Beispiel 3: Weitere Verfahrensmodifikationen

Die Identifikation unbekannter Targetzellen mit dem Ziel der selektiven Transfektion kann auch auf Basis von Pulsverarbeitungsanalysen gelöst werden, insbesondere mit Hilfe der Parameter Pulshöhe (englisch„height", z.B. FL1 -H), Pulsfläche (englisch„area", z.B. FL1 -A) und Pulsweite (englisch„width", z.B. FL1 -W).

Die erfolgreiche Transfektion von Zellen kann beispielsweise mit Hilfe des Plasmid-DNA- Vektors pEGFP-N1 (4,7 kb) gezeigt werden. Die selektive Integration des DNA-Plasmids in die entsprechenden Targetzellen und die Expression des grün-fluoreszierenden Proteins kann mittels durchflusszytometrischer Analyse im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle quantifiziert werden. Targetzellen können z.B. zytotoxische T-Zellen sein, die erfolgreich das Reportergen GFP exprimieren. Die erfolgreiche Transfektion von Zellen kann beispielsweise auch über die Verwendung von Propidiumiodid (PI) und/oder Caicein AM (CAM) nachgewiesen werden. Hierüber kann auch der prozentuale Anteil vitaler Zellen ermittelt werden.

Beispiel 4: Berechnung der Durchsatzrate für eine Variante des beschriebenen Transfektions-Durchflusszytometers (Transfektionszytometer).

Den nachfolgenden Berechnungen liegen folgende Annahmen zu Grunde:

• Die Zellen bewegen sich in einem Suspensionsstrom mit einer Geschwindigkeit v und passieren einzeln und nacheinander eine Wechselwirkungszone, in der ein fokussierter fs-Pulslaser auf die Zellen für eine bestimmte Dauer einwirkt. · Die für die optische Perforation der Zellmembran erforderlichen Laserparameter, wie Pulsenergie, Pulsdauer, Pulswiederholungsrate und Einwirkungsdauer wurden aus der Literatur entnommen und entsprechen den in der WO 03/100069 A1 berichteten Parametern. Allerdings wurde dort die Transfektion mit Hilfe eines Lasertransfektionsmikroskops an CHO-Zellen vorgenommen, die adhärent an einer festen Matrix (z.B. den Boden einer Zellkulturflasche) wachsen. Vorliegend soll eine

Transfektion von Zellen im Durchfluss erfolgen.

Für die Perforation mittels des Lasertransfektionsmikroskops gemäß WO 03/100069 A1 wurden folgende Laserparameter vorgeschlagen:

Mittlere Laserleistung Pav = 75 mW (von 50 mW bis 100 mW)

Pulsdauer tp = 200 fs

Pulswiederholungsrate frep = 80 Mhz

Bestrahlungsdauer Texp = 16 ms

Die Pulsenergie berechnet sich damit zu ca. Wp ~ 1 nJ.

Mit Hilfe der oben aufgeführten Werte können die erforderliche Zahl der Laserpulse und die Gesamtenergie abgeschätzt werden, die für die Transfektion benötigt werden. Die Zahl der Pulse berechnet sich aus Np = Texp frep und die Gesamtenergie aus Wexp = Np Wp. Demzufolge wurden in der WO 03/100069 A1 für die Perforation der Zellmembran c

1 ,3 x 10 Pulse und als Gesamtenergie Wexp 1 ,3 mJ benötigt. In den in der WO 03/100069 A1 dargestellten Experimenten wird weiterhin von der Annahme ausgegangen, dass der Durchmesser des fokussierten, beugungsbegrenzten Laserstrahls circa 0,6 μηι breit ist. In den nachfolgenden Berechnungen wird daher von einem Strahldurchmesser von 2w = 0,6 μηι ausgegangen.

Um die maximal zulässige Durchflussgeschwindigkeit und den Durchsatz von Suspensionszellen in einer Mikrokapillare zu berechnen, muss man beachten, dass sich die Zellen während der optischen Bestrahlungsdauer in der Mikrokapillare infolge der Strömung relativ zur Wechselwirkungszone bewegen. Daher wird im Folgenden die maximal zulässige Geschwindigkeit auch unter Einbeziehung einer zu erwartenden Abweichung berechnet. Hierfür wird eine Verschiebung der Zellen von circa 15 % vom Lochdurchmesser toleriert; dann ist AdLoch = 0,1 dLoch = 0,1 μηι. Aus den bekannten Werten für die Bestrahlungsdauer, dem Laserstrahldurchmesser und der maximal zulässigen Verschiebung der Zellen während der Bestrahlungsdauer kann die maximal zulässige Geschwindigkeit berechnet werden. Diese errechnet sich aus v = AdLoch Texp. und entspricht unter Zugrundelegung der obigen Zahlenwerte

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v = 6,3 x 10 m/s.

Bei bekannter Geschwindigkeit lässt sich der Durchsatz an Zellen aus deren Abstand L zueinander im Probenstrom berechnen. Realistisch beträgt in üblichen Durchflusszytometern mit fokussiertem Probenstrom der mittlere Abstand von Zelle zu Zelle etwa L ~ 100 dZelle- Für den Zelldurchmesser nehmen wir dZelle = 7 μπι an. Die Durchsatzrate berechnet sich aus k = v/L. Bei einem konventionellen Durchflusszytometer ist z.B. v = 1 m/s und mit L = 700 μηι beträgt k = 1 ,4 kHz.

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Mit der für die fs- Laserperforation erforderlichen Zellgeschwindigkeit von v = 6,3 x 10 m/s ergibt sich für denselben Abstand L = 700 μηι zwischen den Zellen eine Durchsatzrate von

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k = 9 x 10 m/s oder k = 0,54 / Minute. Die Durchsatzrate kann deutlich erhöht werden, indem der Zell-zu-Zell-Abstand verringert wird. Die mit dem minimal möglichen Abstand erreichbare Durchsatzrate auf Basis der Daten gemäß WO 03/100069 A1 beträgt

54 / Minute oder 3.240 / Stunde. Die Durchsatzrate kann durch die Absenkung der Bestrahlungsdauer deutlich erhöht werden. Stattdessen realisiert ein Shutter eine mehrmalige, insbesondere 2- bis 4-malige Bestrahlung der Zellen.

Die Durchsatzrate kann stark erhöht werden bei Verwendung von Bessel-Strahlen, sogenannter multipler„non-diffracting" Bessel Beams. Dadurch ist es nicht mehr erforderlich, den Laserfokus auf die Plasmamembran zu fokussieren.

Die Durchsatzrate kann stark erhöht werden bei Verwendung eines Mikrochips, wobei die multiplen Bessel Beams gezielt auf bestimmte Bereiche der Fließzone gerichtet werden und dort die vorbeifließenden Zellen bestrahlen. Je nach Art und Anzahl der Spuren vervielfacht sich der Durchsatz.

Die Durchsatzrate kann z.B. durch Goldnanopartikel oder andere Kleinstmoleküle erhöht werden. Die Zellen können z.B. auch durch Fiberglasröhren oder ähnliches geleitet und dort transfiziert werden.

Die Transfektionseffizienz kann stark durch weitere Transfektionsarten und Transfektionszusätze, die für sich genommen zum Stand der Technik gehören, erhöht werden. Beispielsweise können über den Zusatz von Mikropartikeln Mikroblasen, sogenannte Microbubbles, erzeugt werden. Diese können Schockwellen auslösen, wodurch Membranen von Nachbarzellen ebenfalls transient eröffnet werden. Die Durchsatzrate kann also durch die kontrollierte Erzeugung von Microbubbles, erhöht werden.

Die Zellen können durch jede Art und Material von Röhren zum Ort der Transfektion geleitet werden und an verschiedenen Positionen innerhalb des Durchflusszytometers transfiziert werden. Die Transfektion der Zellen kann an jeder räumlich anderen Position nach Verlassen einer Mikrokapillare und Eintritt in ein Rohr, z.B. in einem zwischengeschalteten Mikrochip, erfolgen.