Partikeln

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfahren zur automatischen Detek- tion von biologischen Partikeln.

In der US 6 268 143 B1 sowie der US-A-5 972 721 sind Verfahren und Vorrichtungen zur automatischen Extraktion und Detektion von biologischen Partikeln, insbesondere Mikroorganismen wie Bakterien beschrieben. Dabei wird das Prinzip der paramagnetischen Separation oder der immunomagnetischen Untersuchung angewandt. Hierzu werden Trennpartikelkörper, die derart beschichtet sind, dass sie ganz spezielle zu untersuchende Partikel an sich binden, aus paramagnetischem Material verwendet. Diese Trennpartikelkörper - Beads genannt - lassen sich in einem Magnetfeld festhalten und damit extrahieren. Dadurch werden auch die daran anhaftenden speziellen Partikel mit extrahiert.

Weitere Beispiele sowie spezielle Beads sind in der WO 03/010563 A2, der WO 2006/112771 A1 , der WO 2006/021410 A1 , EP 0 687 501 A2, US 6 207 463 B1 und der US 5 821 066 A beschrieben.

Die paramagnetische Separation wird außerdem in den folgenden Publikationen näher erläutert: β Olsvik O, Popovic T, Skjerve E, Cudjoe KS, Hornes E, Ugelstad J, Uhlen M

Magnetic Separation techniques in diagnostic microbiology. Clin Microbiol Rev. 1994 Jan; 7(1 ):43-54. Review und β Mullane NR, Murray J, Drudy D, Prentice N, Whyte P, Wall PG, Parton A ₁

Fanning S.

Detection of Enterobacter sakazakii in dried infant milk formula by cationic- magnetic-bead capture.

Appl. Environ Microbiol. 2006 Sep; 72(9):6325-30.

Gegenwärtig existiert jedoch keine Möglichkeit zum vollautomatischen und schnel- len Nachweis von Mikroorganismen und biologischen Partikeln aus Gasen bzw. Luft.

Eine Detektion von Mikroorganismen aus der Luft oder einem Gas erfolgt derzeit mittels sog. Airsampier, die mit Nährmedien bestückt sind. Diese müssen nach der Probennahme mehrere Stunden oder Tage inkubiert werden, bevor ein Nachweis möglich ist. Systeme zur Überprüfung und Anreicherung von Mikroorganismen aus der Luft in eine Flüssigkeit sind gleichfalls bekannt, jedoch fehlt diesen Systemen die Möglichkeit zur vollautomatischen Extraktion und Detektion.

Beispiele für zuvor genannte Airsampier finden sich in der US-A-5 902 385 sowie der US-A-5 904 752.

Das Prinzip des Airsamplings ist aus den weiter näher in folgenden Publikationen erläutert: » Hogan CJ JR, Kettleson EM, Lee MH, Ramaswami B, Angenent LT, Biswas

P.,

Sampling methodologies and dosage assessment techniques for submicro- metre and ultrafine virus aerosol particles. J Appl Microbiol. 2005; 99(6):1422-34. » Agranovski IE, Agranovski V, Grinshpun S A, Reponen T, Willeke K,

Collection of airborne microorganisms into liquid by bubbling through porous medium.

Aerosol Science and Technology, Volume 36, Number 4, 1 April 2002, pp.

502-509(8) und » Lödding H, Koch, W, Möhlmann C, Kolk A,

Sammelverhalten von Impingem als Bioaerosolsammier Gefahrstoffe- Reinhaltung der Luft- Ausgabe 7-8/2007

Aufgabe der Erfindung ist es, eine Vorrichtung und ein Verfahren zur Detektion von Partikeln in einem Partikel-Fluid-Gemisch zu schaffen, die vollautomatisch betreibbar bzw. durchführbar sind, universell einsetzbar und in einem kompakten und einfach aufgebauten, vorzugsweise mobilen System implementiert werden können.

Diese Aufgabe wird durch eine Vorrichtung mit den Merkmalen des Patentanspruches 1 sowie ein Verfahren mit den Schritten des Nebenanspruches gelöst.

Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind Gegenstand der Unteransprüche.

Mit einem besonders bevorzugten hier vorgestellten System ist eine schnelle und vollautomatische Anreicherung, Extraktion und Detektion von Mikroorganismen (z.B. Bakterien, Protozoen, Pilze, Viren) und biologischen Partikeln (z.B. Sporen) möglich. Die Anreicherung, Extraktion und Detektion kann sowohl aus Gasen, ins- besondere der Luft, als auch aus Flüssigkeiten erfolgen. Neben der Detektion biologischer Materialien ist auch eine Anreicherung, Extraktion und Detektion nichtbiologischer bzw. synthetischer Materialien möglich, insbesondere Sprengstoffe, Flüssigsprengstoffe und Drogen.

Mit der hier beschriebenen neuen Technik wird insbesondere der Einsatz paramagnetischer Kügelchen (sog. Beads) in Verbindung mit einer Sammeleinrich- tung, insbesondere einem Airsampier, vorgeschlagen. Die Beads sind mit Antikörpern beschichtet, welche wiederum Moleküle oder Partikel biologischen oder nicht biologischen Ursprungs binden können. Durch die Entwicklung spezieller Anrei- cherungstechniken wird die extreme Aufkonzentrierung und Immobilisierung der so beladenen Beads erreicht. Außerdem wird eine auf die Aufkonzentrierung folgende vollautomatische Extraktion und Detektion der gebundenen Moleküle oder Partikel vorgeschlagen. Die hohe Aufkonzentrierung ermöglicht einen hochemp- findlichen Nachweis der Analyten.

Insbesondere werden folgende Vorteile durch die Erfindung oder deren vorteilhaften Ausgestaltungen erreicht:

« schneller und empfindlicher Nachweis von Mikroorganismen und anderen ge- fährlichen Substanzen (insbesondere biologische Toxine) sowie von Sprengstoffen aus einer gasförmigen Phase, insbesondere Luft; β schnelle Detektion von Mikroorganismen und anderen gefährlichen Substanzen aus Flüssigkeiten und flüssigen Lebensmitteln aller Art; β Zusammenfassung und Automatisierung der drei Bereiche Anreicherung, Ex- traktion und Detektion in einem einheitlichen, kompakten und mobilen System und/oder β schneller Nachweis von Krankheitserregern aus Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Speichel, Tränenflüssigkeit und Urin (medizinische Diagnostik).

Ausführungsbeispiele der Erfindung werden nachfolgend anhand der beigefügten Zeichnung näher erläutert. Darin zeigt:

Fig. 1 eine schematische Darstellung zur Erläuterung der Erkennung und Bindung von Partikeln (Antigene) durch Antikörper, die auf einer Bead- Oberfläche über Biotin und Streptavin immobilisiert wurden;

Fig. 2 eine schematische Darstellung zur Erläuterung einer Erkennung und Bindung von Bakterien durch Phagenproteine, die auf einer Bead- oberfläche via Biotin und Streptavin immobilisiert wurden; Fig. 3, 3a verschiedene Schnittansichten eines an sich bekannten Airsampiers, der bei dem hier vorgestellten System verwendbar ist, bei einer entsprechenden Anwendung;

Fig. 4 eine schematische Darstellung einer Anreicherung der paramagnetischen Beads durch einen externen Magneten;

Fig. 5 eine schematische Darstellung einer Anreicherung der paramagneti- sehen Beads durch einen magnetischen Kolben;

Fig. 6 eine schematische Darstellung der Anreicherung der paramagnetischen Beads über eine dehnbare Membran;

Fig. 7 eine Seitenansicht eines Gesamtsystems als Vorrichtung zur Detektion von Partikeln;

Fig. 8 eine Draufsicht auf das Gesamtsystem;

Fig. 9 eine DNA-Sequenz nach dem Modell eines Reißverschluss und

Fig. 10 eine schematische Darstellung der Anreicherung von Partikeln aus Flüssigkeiten über eine Flusszelle; und

Fig. 11 eine schematische Darstellung von zwei miteinander verbunden Mikroli- terpipetten. Im folgenden werden Ausführungsbeispiele eines Systems näher beschrieben, das zur vollautomatisierten Probennahme („Sampling"), Anreicherung, Extraktion und Analyse von Gasen und Flüssigkeiten eingesetzt werden soll.

I. Einführung:

Vorrangiges Ziel für eine Detektion sind alle Partikel, insbesondere Bakterien, Viren, Sporen, Protozoen und biologische Toxine. Ein Einsatz für die Analyse von biologischen und nicht-biologischen Substanzen ist gleichfalls mit dem hier be- schriebenen Gerät möglich. Einzige Voraussetzung ist das Vorhandensein von spezifischen Bindemolekülen (z.B. Antikörper) mit ausreichender Affinität. Da ein Antikörper nahezu gegen jede Substanz gebildet werden kann, kann das hier beschriebene Gerät zur Detektion mannigfaltiger Stoffe eingesetzt werden.

II. Paramagnetische Beads mit immobilisierten Antikörpern oder anderen Bindeproteinen:

In bevorzugter Ausgestaltung werden bei der neuen Technologie als Trennpartikelkörper zum Abtrennen oder Separieren der hier interessierenden Partikel pa- ramagnetische Kügelchen (Beads) eingesetzt, die mit Antikörpern bestückt sind und an welche die Partikel bzw. Mikroorganismen mit hoher Affinität binden. Die Beads selbst haben i. d. R. eine Größe im Bereich von unter 0,5 μm bis 10 μm und bestehen vorwiegend aus einem paramagnetischen Kern und einer Hülle aus Silikat, Latex oder Polystyren.

Zur Bestückung der Beads mit Antikörpern (sog. Coating) können verschiedene Verfahren eingesetzt werden: a) passive Adsorption (z.B. über hydrophobe Wechselwirkungen), b) direkte chemische Kopplung (crosslinking) via Peptidbindung o.a., c) Kopplung via immobilisierter Antikörper Proteine, z.B. Protein A bzw. Protein G und/oder d) Kopplung via Biotin-Streptavidin-Bindung.

Die unter d) genannte Technik ist in Fig. 1 dargestellt. Sie nutzt die hohe Affinität (Bindungskraft) zweier biologischer Moleküle zueinander: Biotin 18 und Streptavi- din 20. Hierzu wird der Antikörper 10 an der seiner spezifischen Bindungsstelle abgewandten Seite (der sog. Fc-Domäne 22) mit dem Molekül Biotin 18 markiert. Gleichzeitig wird das Protein Streptavidin 20 auf die Oberfläche 14 der paramag- netischen Beads 16 gekoppelt. Dadurch werden Antikörper 10 praktisch irreversibel an die Kugeloberfläche 14 gebunden,

Nach der Immobilisierung der Antikörper 10 auf die paramagnetischen Beads 16 können diese für das gezielte „Einfangen" der Mikroorganismen bzw. Partikel ein- gesetzt werden. Hierbei binden die Antikörper an ihre sog. Antigene 12 (die zu detektierenden Partikel 13); insbesondere sind dies spezieile Oberflächenstrukturen von Mikroorganismen.

Wie in Fig. 2 dargestellt, können als Alternative zu Antikörpern 10 bestimmte Pha- genproteine 24 zur gezielten Erkennung und Bindung einiger Bakterienarten - ein Bakterium 26 ist als Beispiel dargestellt - eingesetzt werden. Phagen sind Viren, die ausschließlich Bakterien befallen und mit ihren speziellen Hüllproteinen an der Bakterienoberfläche andocken können. Mittels biotechnologischer Methoden ist es möglich, große Mengen dieser Phagenproteine 24 herzustellen und ebenfalls mit Biotin 18 zu markieren. Analog zu den Antikörpern 10 können diese Phagenproteine 24 ebenfalls an Streptavadin-beschichtete paramagnetische Beads 16 gekoppelt werden, wobei die so gebundenen Phagenproteine 24 ihrerseits mit den bakteriellen Andockstellen (Oberflächenproteine der Bakterien 26) interagieren. III. Probenentnahme und Anreicherung:

In normaler Umgebungsluft sind Keime etc. üblicherweise nur in sehr geringen Konzentrationen vorhanden. Zum Nachweis von Luftkeimen (bzw. anderen Parti- kein und Molekülen) ist deshalb eine Anreicherung notwendig. In der hier beschriebenen Technologie erfolgt diese Anreicherung in 3 Schritten:

1 ) Überführung der Partikel 13 von Luft in Flüssigkeit,

2) Bindung der Partikel 13 an paramagnetische Beads 16 und

3) Aufkonzentrierung der Beads 16 mittels magnetischem Feld.

Hierbei erfolgen Schritt 1 ) und Schritt 2) simultan.

In einem in Fig. 3 dargestellten sog. Airsampier 30 - wie beispielsweise in der US- A-5902385, auf die für weitere Einzelheiten ausdrücklich verwiesen wird, be- schrieben und gezeigt - wird die Umgebungsluft - Luftstrom 39 - durch den Ein- lass (Inlet) 32 angesaugt und die darin befindlichen Partikel 13 - insbesondere Luftkeime - mittels spezieller Düsen mit hoher Effizienz (ca. 90% Ausbeute) in ein kleines Flüssigkeitsvolumen überführt. Der Luftstrom 39 durch den Sampler beträgt z.B. 12,5 L/min; bei einer Probennahme-Zeit von z.B. 10 Minuten entspricht dies also einem Gesamtvolumen von 125 L Luft. Bei einem Volumen der Sammelflüssigkeit von typischerweise 5 mL wird hierdurch eine Aufkonzentrierung um den Faktor 25.000 erreicht.

Fig. 3 und Fig. 3a zeigen zwei Querschnittszeichnungen, die den Airsampier 30 mit Einlass 32, Auslass 34, Sammelbehälter 36 und Tangentialdüsen 38 illustrieren. Fig. 3a zeigt einen Querschnitt entlang der Linie M-N von Fig. 3. In Fig. 3 sind weiter zur Veranschaulichung der Anordnung und Ausrichtung der Tangentialdüsen 38 die Mittelachse 1 1 und eine Tangente 15 dargestellt. Die Sammelflüssigkeit 40 im Sammelbehälter 36 (collection vessel) ist beim hier beschriebenen System mit oben beschriebenen paramagnetischen Beads 16 versetzt. Die aus dem Luftstrom 39 (Fig.4) in die Sammelflüssigkeit 40 überführten Partikel 13 (Analyte) können während des Samplings an die spezifisch aktivierten paramagnetischen Beads 16 binden. Nach Beendigung der Probennahme werden die Beads 16 mittels eines magnetischen Feldes angezogen und in einem kleinen Volumen innerhalb des Dosiervolumens 43 einer Dosiereinheit 41 angereichert (Fig. 4). Dieses Volumen beträgt typischerweise ca. 50 μl_, wodurch eine weitere Auf konzentrierung um den Faktor 100 erreicht wird. Mit dem Gesamtsystem lässt sich also insgesamt z. B. eine 2,5 millionenfache Anreicherung von Luftkeimen (oder anderen Partikeln) erzielen.

Der 3. Schritt, also die Anreicherung der paramagnetischen Beads 16 aus dem Sammelbehälter 36 des Airsampiers 30, kann über drei unterschiedliche techni- sehe Verfahren erfolgen, die im folgendem näher erläutert werden.

III.A. Anreicherung über einen externen Magneten:

Im folgenden wird Bezug auf Fig. 4 genommen. An der Dosiereinheit 41 - bevor- zugt eine Spritze 42 - wird ein Magnet 44 an der Außenwand 46 angebracht. Die Sammelflüssigkeit 40 mit den paramagnetischen Beads 16 wird über einen Auslasskanal 45 aus dem Airsampier 30 in die Dosiereinheit 41 gezogen.

Während die Flüssigkeit 40 in die Dosiereinheit 41 strömt, lagern sich die Beads 16 automatisch an der Innenwand 48 der Dosiereinheit 41 im Bereich des magnetischen Feldes an.

Anschließend wird die Sammelflüssigkeit 40 wieder aus der Spritze 42 gedrückt. Die Beads 16 werden durch den Magneten 44 gehalten und zurückgehalten. Die Beads 16 können durch mehrmaliges Aufnehmen und Abgeben frischen Puffers gewaschen werden.

Für die Elution wird im letzten Waschschritt ein möglichst kleines Puffervolumen in der Spritze 42 belassen und der Magnet 44 wird von der Außenwand 46 der Dosiereinheit 41 entfernt.

Nach Resuspendierung der Beads 16 können diese nun zur weiteren Prozessierung in ein anderes Reaktionsgefäß - nicht dargestellt - überführt werden. Um ei- ne vollständige Entleerung der Spritze 42 zu gewährleisten, kann erneut ein kleines Volumen Flüssigkeit aufgenommen und eluiert werden.

III. B. Anreicherung über einen Teleskopkolben:

In einem in Fig. 5 dargestelltem zweiten Verfahren wird die Sammelflüssigkeit 40 ebenfalls aus dem Airsampier 30 über einen Auslasskanal 45 in die Dosiereinheit 41 , bevorzugt eine Spritze 42, gezogen. Die Spritze 42 besitzt einen hohlen Spritzenkolben 50, in welchem ein zweiter, magnetischer Kolben - Magnetkolben 52 - oder Stempel - mit dem Magnet 44 auf- und ab- bewegt werden kann (Teleskop- Prinzip).

Während des Aufziehens der Sammelflüssigkeit 40 ist der Magnetkolben 52 ganz in den Spritzenkolben 50 eingefahren. Die paramagnetische Beads 16 können sich somit am Kobenboden 54 anreichern.

Durch mehrfaches Heben und Senken des Spritzenkolbens 50 kann die Sammelflüssigkeit 40 gegen eine andere Flüssigkeit ausgetauscht werden (sog. Waschen). Zuletzt wird ein minimales Flüssigkeitsvolumen aufgezogen (z.B. 50 μl_). Zur Elution wird der Magnetkolben 52 nach oben gezogen, wodurch das Magnetfeld in der Spritze 42 quasi verschwindet und sich die Beads 16 vom Kolbenboden 54 ablösen. Dieses Konzept bietet den Vorteil, dass bei hochgezogenem Magnet 44 die Spritze 42 als normale Dosiereinheit 41 funktioniert.

In dem hier dargestellten Beispiel ist weiter im unteren Bereich der Dosiereinheit 41 ein Aufschlussmodul, insbesondere ein Ultraschallgerät 56, angebracht. Dies ist besonders bevorzugt in Verbindung mit dem Magnetkolben 52, da dann im un- teren Bereich kein Magnet angebracht werden muss und Platz für das Aufschlussmodul geschaffen ist.

III. C. Anreicherung über einen Magneten, der von einer dehnbaren Membran umschlossen ist:

Bei einem in Fig. 6 dargestellten dritten Verfahren zur Anreicherung der Beads 16 wird der Magnet 44 (bevorzugt ein Stabmagnet 58) direkt in die Sammelflüssigkeit 40 getaucht. Der Magnet 44 ist beweglich montiert und von einer dehnbaren Membran 60 geschützt. Nachdem sich die Beads 10 an der Membran 60 angela- gert haben, wird der Magnet 44 in ein neues Gefäß 62 mit geringem Flüssigkeitsvolumen eingetaucht. Der Magnet 44 wird entfernt und die Beads 16 können sich von der Membran 60 ablösen. Durch Verwendung von Ultraschall, der auf den Stabmagnet übertragen wird, kann eine Ablösung der Beads erleichtert werden. Auch durch den Gebrauch eines externen Ultraschallgeräts ist ein erleichtertes Ablösen der Beads möglich.

Der in Fig. 3, 3a gezeigte Airsampier 30 weist zwei Bauteile auf, ein Sammelgefäß - in Form des Sammelbehälters 36 - und einen Aufsatz mit Düsen - Düsenaufsatz 64. Durch den Einsatz einer Hub-Schwenkeinheit 66 kann der Sammelbehäl- ter 36 automatisch vom Düsenaufsatz 64 abgetrennt und verschwenkt werden. Dadurch ist ein einfacher Zugang zur Sammelflüssigkeit 40 möglich.

Fig. 6 zeigt das unter III. C. beschriebenen Verfahren in Kombination mit der Hub- Schwenkeinheit 66. Die Hub-Schwenkeinheit 66 kann jedoch ebenfalls in Kombination mit den unter III. A. bzw. III. B. beschriebenen Verfahren verwendet werden. Ein spezieller Auslasskanal 45 aus dem Sammelbehälter 36 ist dadurch nicht mehr erforderlich.

Nach der Anreicherung mit einem der oben beschriebenen Verfahren stehen die beadgebundenen Partikel 13 nun zur weiteren Analyse zur Verfügung. Sie werden zum Beispiel für eine molekularbiologische Detektion, insbesondere PCR oder Hybridisierung, weiter aufgeschlossen.

III. D Anreicherung und Dispensierung über zwei miteinander verbunden Mikroli- terpipetten.

Beim Entnehmen der Flüssigkeit aus dem Sammelgefäß sind relativ große Volumina zu handhaben (z.B. 5 ml), während nach dem Aufkonzentrieren ein mög- liehst kleines Volumen (z.B. 20 μl) gehandhabt werden soll. Dies ist eine sehr große Bandbreite (Faktor 250) zwischen den Volumina. Es ist sehr schwierig, für beide Bereiche eine hohe Genauigkeit sicherzustellen. Dies kann durch die im folgenden erläuterte Lösung erreicht werden, von der ein Ausführungsbeispiel in Fig. 1 1 dargestellt ist.

Fig. 11 zeigt eine alternative Ausführung der Dosiereinheit 41 . Durch Verwendung einer Mikroliterpipette 140 mit verlängerter Pipettenspitze 142 und zwei Saugeinheiten 144, 145 für verschieden Volumenbereiche ist sowohl das Waschen der Beads 16 als auch ein genaues Pipettieren in kleinen Volumina möglich. Auch hier werden die Beads 16 beim Spülen an der Innenseite der Pipettenspitze durch einen außen hinzugeschwenkten Magneten 44 zurückgehalten. Das hier beschriebene Pipetiersystem 146 kann problemlos in das Gesamtsystem integriert werden. Auch ein Betrieb mit der Hub-Schwenkeinheit 66 ist möglich.

IV. Beschreibung des Gesamtsystems:

Die zuvor beschriebenen Konzepte zur Anreicherung können mit weiteren Elementen zu einem Gesamtsystem verbunden werden. Das in den Fig. 7 und 8 nä- her dargestellte Gesamtsystem bildet eine Vorrichtung 70 zur automatischen De- tektion von insbesondere biologischen Partikeln und weist als Komponenten eine Sammeleinrichtung 72, eine Transferiereinheit 74, die Dosiereinheit 41 , den Magneten 44, eine Gruppe 76 von Reservoiren, eine Antriebseinheit 78, eine Aufschlusseinrichtung 80, eventuell mit Temperierungseinheit 82, eine Detektionsein- heit 84 und eine Steuerungseinheit 86 auf.

Diese möglichen Komponenten werden im folgenden näher erläutert.

IV. A. Sammeleinrichtung:

Als Sammeleinrichtung 72 ist bevorzugt der Airsampier 30, insbesondere ein Air- sampler 30 von der Firma SKC (siehe Fig. 3 sowie Patente US 5,902,385 und US 5,904,752) oder der Firma Bertin eingesetzt. Der Airsampier 30 transferiert Partikel 13, insbesondere Mikroorganismen (Bakterien, Viren) und Toxine aus der Gas- phase in die Sammelflüssigkeit 40.

IV.B. Transferiereinheit: Die Transferiereinheit 74 weist bevorzugt die Hub-Schwenkeinheit 66 auf. Da der bevorzugte Airsampier 30 modular aufgebaut ist, und insbesondere aus wenigstens zwei Bauteilen besteht, kann der Düsenaufsatz 64 abgetrennt und der Sammelbehälter 36 zur Anreicherungsposition transferiert werden. Hier können die paramagnetischen Beads 16 mit einem der in Abschnitt 3 beschriebenen Verfahren aufgenommen und angereichert werden.

IV.C. Dosiereinheit:

Die Dosiereinheit 41 ist bevorzugt als Spritze 42 ausgebildet. Mit der Dosiereinheit 41 wird die Sammelflüssigkeit 40 aufgezogen. Als Dosiereinheit 41 können auch die in III. C. oder III. D beschriebenen Konstruktionen dienen.

IV. D. Trenneinrichtung - Magnet

Der Magnet 44 dient als Trenneinrichtung dazu, die paramagnetischen Beads 16 in oder an der Dosiereinheit 41 zu konzentrieren. Damit lassen sich die Beads 16 von der sie umgebenden Flüssigkeit separieren.

IV. E. Gruppe von Reservoiren:

Die Gruppe 76 hat mehrere Reservoire (Gefäße) 91-98 mit unterschiedlichen Flüssigkeiten, die zur Prozessierung der Partikel 13 benötigt werden. Außerdem ist eine Ruheposition 99 vorgesehen. Insbesondere sind folgende Flüssigkeitsre- servoire vorgesehen: β Lösung mit paramagnetischen Beads (erstes Reservoir 91 ) » Äquilibrierungslösung (zweites Reservoir 92) β erste Aufschlusslösung (drittes Reservoir 93) » zweite Aufschlusslösung (viertes Reservoir 94) β Sammelflüssigkeit, z.B. Wasser (fünftes Reservoir 95) β Reinigungslösung (sechstes Reservoir 96)

• Konservierungslösung (siebtes Reservoir 97) e Abfallgefäß (achtes Reservoir 98)

Die Reservoire 91 -98 sind bevorzugt - zusammen mit der Ruheposition 99 sowie der Sammeleinrichtung 72 - auf einer Linie ausgerichtet. Dadurch lässt sich die Dosiereinheit 41 zwischen den Reservoiren 91 -98, eventuell der Ruheposition 99 und der Sammeleinrichtung 72 linear mittels eines einfach aufgebauten Linearan- triebes 100 bewegen.

Außerdem kann dann das Gesamtsystem einfach erweitert oder verkleinert werden (je nach Einsatzzweck).

IV. F. bis IV. I. Antriebseinheit:

Die Antriebseinheit 78 weist die im folgenden unter F) bis I) erläuterten Antriebe auf:

F) einen Linearantrieb 100 mit Einheit 102 zur Aufnahme der Dosiereinheit 41 zur Ansteuerung aller Positionen (bevorzugt in nur einer Dimension, hier in

X-Richtung);

G) eine erste Bewegungseinheit (erster Motor 104) zur Bewegung der Dosiereinheit 41 (bevorzugt zum Bewegen der Spritze 42) in Z-Richtung - erste Bewegung 112 -; H) eine zweite Bewegungseinheit (zweiter Motor 106) zur Flüssigkeitsdosierung (bevorzugt zur Bewegung eines Spritzenkolbens 50) - zweite Bewegung 114 - und

I) eine dritte Bewegungseinheit (dritter Motor 108) zum Annähern oder Entfernen des Magneten 44 (z.B. in Z-Richtung) - dritte Bewegung 1 16 -. IVJ. Aufschlusseinrichtung:

Die Aufschlusseinrichtung 80 weist bevorzugt das oben genannte Ultraschallgerät 56, insbesondere in Form eines Ultraschallbads 110, für den mechanischen Auf- schluss der Partikel, insbesondere Mikroorganismen, auf. Das Ultraschallbad 110 ist mit Flüssigkeit gefüllt, und die Dosierungseinheit 41 kann in diese Flüssigkeit eintauchen. In einer zweiten Funktion kann das Ultraschallbad 110, bei geringer Leistung, zur Resuspendierung der paramagnetischen Beads 16 verwendet wer- den.

IV. K. Aufschlusseinrichtung mit Temperierungseinheit und Temperierung der Reagenzien:

Die Aufschlusseinrichtung 86 weist in dem dargestellten Beispiel weiter eine erste Temperierungseinheit 82 auf, die gemeinsam oder separat mit dem Ultraschallbad 110 betrieben werden kann. Die Temperierungseinheit 82 dient zur Unterstützung biochemischer Verfahren zum Aufschluss der Partikel 13, insbesondere Mikroorganismen (z.B. enzymatischer Verdau). Auch thermische Aufschlussverfahren nahe des Siedepunkts sind mit der Temperierungseinheit möglich.

Für einen Betrieb des Gesamtsystems bei extremen Temperaturen ist eine Temperierung des Gesamtsystems vorgesehen. Insbesondere werden die Reagenzienreservoire 91-97, das Abfallgefäß 98 und der Sammelbehälter 36 temperiert. Dies ist z. B. durch eine in Fig. 8 beispielhaft als Heizspule angedeutete zweite Temperiereinheit 1 19 möglich.

IV.L. Detektionseinheit: Die Detektionseinheit 84 ist am Ende der Prozesskette vorgesehen. Je nach Art der Probenaufbereitung können alle bekannten Analysemethoden in das Gesamtsystem integriert werden.

Nachfolgend werden die wichtigsten Methoden zum Nachweis und zur Analyse biologischer Moleküle genannt: β PCR (Polymerase Chain Reaction), β ELISA (enzyme-Nnked hnmunosorbent assay), β Hybridisierungsverfahren.

Eine genauere Beschreibung der Methoden findet sich in Abschnitt VI.

IV. M. Steuerungseinheit:

Die Steuerungseinheit 86 dient zur Steuerung und Überwachung des Gesamtsystems. Als Steuerungseinheit 86 ist beispielsweise ein Computer oder Datenverarbeitungsgerät vorgesehen, in dem die einzelnen Steuerungsschritte zur vollautomatischen Durchführung des Detektionsverfahrens in Form von Steuerungsbefehlen als Software gespeichert sind.

Gleichzeitig ist über die Steuerungseinheit 86 ein Datentransfer beispielsweise über das Internet (online) möglich. Der Datentransfer wird zum Abgleichen der Resultate über eine Datenbank oder zur Alarmgebung benutzt. Auch eine Steuerung des Gesamtsystems ist online möglich, so dass das System über größere Distanzen betrieben werden kann.

V. Extraktion und Aufbereitung: In dem vorgestellten Gesamtsystem - Vorrichtung 70 - sollen je nach Detek- tionsmethode die angereicherten biologischen Partikel 13 aufbereitet und/oder aufgeschlossen werden. Eine Extraktion wäre für sämtliche molekularbiologischen Analysemethoden durchzuführen, um die Nukleinsäuren frei zugänglich zu ma- chen. Eine Probe wird für die Vermessung verschiedener Parameter eingesetzt (anwendungsspezifisch). In dem Gesamtsystem können mehrere unterschiedliche Extraktionsmethoden gleichzeitig, hintereinander oder einzeln durchgeführt werden. Folgenden Extraktionsmethoden können in das Gesamtsystem integriert werden: β chemische Aufschlussverfahren, β mechanische Aufschlussverfahren und/oder « biochemische Aufschlussverfahren.

V.A. Chemische Aufschlussverfahren:

Der chemische Aufschluss kann über chaotrope Salze, insbesondere Guanidinium hydrochlorid oder Guanidiniumthiocyanat, erfolgen. Diese werden mit dem dargestellten System automatisch in die Dosiereinheit 41 (vorzugsweise Spritze 42) aufgenommen, um die an den Beads 16 haftenden Partikel 13 aufzuschließen.

V.B. Mechanische Aufschlussverfahren:

Sowohl der Aufschluss über Ultraschall als auch über Hitze ist sehr effektiv. Hierzu könnte in das Gesamtsystem das Ultraschallgerät 56, 110 und/oder ein Heizmodul - Temperierungseinheit 82 und/oder 1 19 - integriert werden. Auch eine Extraktion über Scherkräfte (Glasbeads oder Gewebehomogenisator) kann in dem Gesamtsystem verwirklicht werden. Für diese besondere Art des Aufschlusses werden die beladenen Beads 16 in einen speziellen Homogenisator überführt, und durch Rei- bungskräfte zwischen den Glasbeads oder der Homogenisatorwand kann ein effektiver Aufschluss erfolgen.

V. C. Biochemische Aufschlussverfahren

Eine sehr erfolgreiche Methode zum Aufschluss biologischer Partikel 13 ist die biochemische Extraktion. Bei der biochemischen Extraktion können Enzyme, insbesondere Proteasen und RNasen, zum Einsatz. Sehr häufig wird für den Zellauf- schluss Proteinase K und für den Bakterienaufschluss Lysozym verwendet.

VI. Detektion:

Für die Detektion biologischer Partikel 13 sind eine Vielzahl von Detektionsmetho- den etabliert worden. In dem vorgestellten Gesamtsystem - Vorrichtung 70 - kann je nach Bedarf eine oder mehrere der hier vorgestellten Methoden integriert werden. Entscheidend für den Analyt-Nachweis ist die Messung von definierten Panels entsprechend der Anwendungsgebiete. Auch kann das Gesamtsystem für noch völlig unbekannte Methoden umgerüstet werden.

Nachfolgend werden die Detektionsmethoden vorgestellt, die für eine Integration in das Gesamtsystem am wahrscheinlichsten sind: • PCR bzw. Real time PCR,

« ELISA oder andere immunologische Methoden und/oder β Hybridisierungsverfahren.

VI. A. PCR bzw. Real time PCR:

Die PCR-Methode (Polymerase Chain Reaktion) ist ein Verfahren, mit dem in einer Kettenreaktion kleinste Mengen eines DNA-Abschnitts vervielfältigt werden können (Amplifikation). Die PCR-Methode wird heute sehr oft eingesetzt, wenn anhand bestimmter DNA-Sequenzen Nachweise geführt werden sollen, so z.B.: β in der Forensik oder beim Vaterschaftstest, β in der Mikrobiologie zur Detektion von Mikroorganismen (Bakterien und Viren), « in der medizinischen Diagnostik, wenn im Blut Viren-DNA oder -RNA nachzuweisen ist, oder

® in der Evolutionsbiologie, um Verwandtschaftsbeziehungen und Abstammungslinien zu verfolgen.

Um einen PCR-Nachweis führen zu können, müssen zwei kurze DNA-Stücke (Primer) vorhanden sein, die zu dem gesuchten DNA-Strang passen. Die von ihnen aus gestartete Kettenreaktion durchläuft bis zu 40 Zyklen, in denen die DNA- Menge jeweils verdoppelt wird. Durch die Verwendung spezieller fluoreszierender Probes (=Oligonukleotide) kann die Reaktion direkt beobachtet und quantitativ erfasst werden. Diese Sonderform der PCR wird als Real time PCR bezeichnet und dient einer sehr schnellen Detektion.

Eine weitere Sonderform der PCR ist die reverse Transkription - PCR (RT-PCT). Dieses Verfahren wird sehr häufig für die Detektion von Viren verwendet. Da die meisten Viren RNA anstatt DNA als Erbgut besitzen, ist eine Übersetzung (reverse Transkription) der RNA in DNA zwingend notwendig. Nach der reversen Transkription kann dann die eigentliche Detektion über eine normale PCR oder Real time PCR erfolgen.

VLB ELISA

ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) ist ein verbreitetes Verfahren, um spezifisch Proteine oder andere Makromoleküle (Antigene) nachweisen zu können. Dabei nutzt man die Mechanismen des Immunsystems: Wird eine Substanz vom Immunsystem als fremd erkannt, bildet es Antikörper, die an das fremde Molekül andocken und es so markieren. Diese so genannte Antikörper-Antigen- Interaktion wird für den ELISA-Test genutzt. Soll ein bestimmtes Protein nachgewiesen werden, müssen die dazu passenden Antikörper bekannt sein und zuvor mit verschiedenen gentechnischen oder zellbiologischen Verfahren hergestellt worden sein. Ist dann in einer Probe das gesuchte Protein vorhanden, bindet es an die auf eine Trägermedium immobilisierten Antikörper. Nach der Antigen- Antikörper-Interaktion wird eine von Enzymen gesteuerte Reaktion ausgelöst, die zu einem sichtbaren Signal (Farbreaktion, Fluoreszenz oder Chemolumineszenz) führt. ELISA-Tests sind heute in der medizinischen Diagnostik weit verbreitet. Sie werden aber auch in vielen anderen Bereichen genutzt, wenn spezielle Proteine oder biologische Toxine nachzuweisen sind. Im Falle einer Bakterien- oder Viren- detektion wird die spezifischen Oberflächenproteine von dem Antikörper erkannt.

VI. C Hybridisierungsverfahren

Eine DNA-Doppelhelix kann man sich als einen „Reißverschluss" vorstellen (Fig. 9). Die „Zähne" dieses Reißverschlusses sind die Basen Adenin (A), Cytosin (C), Guanin (G) und Thymin (T). Die Information, die die DNA enthält, ist verschlüsselt in der Reihenfolge dieser vier Buchstaben entlang des „Reißverschlusses".

Gegenüberliegende „Zähne" bilden dabei immer nur entweder AT- oder GC- Paare. Die Sequenz ACGCT etwa hat als komplementäres Gegenüber die Basenfolge TGCGA. Durch Erhitzen wird der „Reißverschluss" geöffnet, so dass Einzel- stränge vorliegen. Kurze, ebenfalls einzelsträngige DNA-Stücke, so genannte Sonden, können nun ihr passendes Gegenstück auf dem langen Einzelstrang finden. Beim Abkühlen binden diese Sonden an der passenden Stelle, man spricht dann von Hybridisierung. Man kann dies anhand von Markierungen (z.B. durch einen Fluoreszenzfarbstoff) sichtbar machen. Auf diese Weise kann herausgefun- den werden, ob spezifische Sequenzen, die z.B. für bestimmte Gene stehen, in der untersuchten DNA vorhanden sind oder nicht. Sehr bekannte Hybridisierungs- verfahren sind die in-situ-Hybridisierung insbesondere Fluoreszenz-in-situ- Hybridisierung (FISH) und Hybridisierung auf Microarrays.

VII. Beispiel für einen Ablaufplan des Gesamtsystems für eine Immundetektion (ELISA):

Im folgenden wird am Beispiel der ELISA-Methode ein Ablaufplan für die Durch- führung eines Detektionsverfahrens zum Nachweis von Partikeln in einem Fluid - insbesondere Luft - näher erläutert. Anhand dieses Ablaufplanes und seiner Teilsequenzen kann der Fachmann leicht die Steuerungseinheit 86 entsprechend ausbilden, beispielsweise durch Programmierung.

Der dargestellte Ablaufplan für das Gesamtsystem beinhaltet mehrere Teilabschnitte (A-E, siehe unten), die für eine Immunodetektion (ELISA) benötigt werden. In diesen Teilabschitten werden Grundbefehle ausgeführt, mit deren Hilfe das Gesamtsystem die entsprechenden Positionen einnehmen kann.

Nachfolgend sind zunächst alle Grundbefehle und alle Positionen aufgeführt:

Grundbefehle

- Spritze t; -I - Kolben T; I

- go to Pos ->; <- (gehe zu)

- Magnet on <-; Magnet off →

- Hub. Schwenkeinheit <-> T; Hub.-Schwenkeinheit i <->.

- Airsampier on/off (Airsampier 30 an/aus) - Ultraschallbad on/off (d.h. an/aus)

- go to Pos. X (gehe zu Position X)

- [Detektionseinheit on/off]

- [Temperatur on/off]

Positionen (Pos.):

Die im folgenden wiedergegebenen Positionen können durch den Linearantrieb 100 angefahren werden:

- Pos. Hub. -Schwenkeinheit

- Pos. Ruheposition

- Pos. mag. Beads

- Pos. Äquilibrierung - Pos. Aufschi uss 1

- Pos. Aufschluss2

- Pos. H ₂ O

- Pos. Reinigung

- Konservierungslösung - Pos. Abfall

- Pos. Ultraschallbad

- Pos. Detektionseinheit

VI I. A. Äquilibrieren des Systems:

Die folgenden Schritte werden zur Äquilibrierung durchgeführt. Dabei sind die durch die Steuerungseinheit 86 automatisch abgegebenen Befehle aufgeführt.

1 ) Gerät steht in Ruheposition; Spritze ist mit Konservierungslösung befüllt. Spritze in Pos. Ruheposition.

2) Entleeren der Konservierungslösung in den Abfall.

Spritze T; go to Pos. Abfall →; Spritze I; Kolben iti.

3) Spülen mit H ₂ O, 3 x 5 ml_:

Spritze t; go to Pos. H ₂ Ck-; Spritze I; Kolben t.

Spritze t; go to Pos. Abfall -»; Spritze 4-; Kolben -k

Spritze f ; go to Pos. H ₂ O-*-; Spritze I; Kolben t.

Spritze t; go to Pos. Abfall →; Spritze i; Kolben i.

Spritze t; go to Pos. H ₂ O*-; Spritze i; Kolben t. Spritze f ; go to Pos. Abfall →; Spritze i; Kolben i.

4) Spülen mit Äquilibrierungslösung, 3 x 5 ml_:

Spritze T; go to Pos. Äquilibrierungslösung <-; Spritze i; Kolben t.

Spritze t; go to Pos. Abfall →; Spritze i; Kolben i. Spritze t; go to Pos. Äquilibrierungslösung <-; Spritze i; Kolben t. Spritze t; go to Pos. Abfall →; Spritze i; Kolben i. Spritze t; go to Pos. Äquilibrierungslösung <-; Spritze i; Kolben T. Spritze f ; go to Pos. Abfall →; Spritze I; Kolben i.

5) Spritze geht zurück in Ruheposition: Spritze t; go to Pos. Ruheposition <-.

VII. B. Beladen des Airsampiers mit magnetischen Beads "Ix 5ml.

Zum Beladen des Airsampiers 30 werden folgende Befehle durch die Steuereinrichtung gesteuert ausgeführt:

Spritze t; go to Pos. mag. Beads <-; Spritze i; Kolben T4/i\ Hub. -Schwenkeinheit 4ΌT Spritze t; go to Pos. Hub.-Schwenkeinheit <-; Spritze I; Kolben i. Spritze t; go to Pos. Ruheposition <-; Spritze I.

VII. C. "Sampling" und Detektion mit ELISA

Zum Sampling und zur Detektion werden folgenden Schritte mit den jeweils angegebenen Befehlsfolgen durchgeführt:

1 ) Sampling starten

Hub.-Schwenkeinheit >U->t. Airsampier on.

2) Sampling beenden

Airsampier off.

Hub.-Schwenkeinheit l<-»t.

3) Magnet an die Spritze : Magnet on <- 4) Magnetische Beads mit der Spritze aus dem Airsampier ziehen 1 x 5 ml_ Spitze t; go to Pos. Hub. -Schwenkeinheit <-; Spritze I; Kolben ItIt.

5) 4 ml_ (von den 1 x 5 ml_) in den Abfall. Spritze t; go to Pos. Abfall -»; Spritze I; Kolben I 6) Magnet weg von der Spritze. Magnet off -».

7) Aufnahme von 4 ml_ Äquilibrierungslösung

Spritze t; go to Pos. Äquilibrierungslösung <-; Spritze I; Kolben t.

8) Magnet an die Spritze. Magnet on <-.

9) Einspritzen von 3 ml_ Äquilibrierungslösung in den Airsampier Spitze t; go to Pos. Hub. -Schwenkeinheit <-; Spitze I; Kolben I.

10) Wiederaufnahme der 3 ml_ Äquilibrierungslösung in die Spritze Spritze t; Spritze t; Kolben ItIt. 1 1 ) erste Wiederholung von Schritt 5 - 10.

12) zweite Wiederholung von Schritt 5 - 10.

13) Reduktion des Volumens auf 10 μl_.

Spritze T; go to Pos. Abfall →; Spritze i; Kolben i.

14) Magnet weg von der Spritze.

Magnet off ->.

15) 10 μL Beads in die Detektionseinheit; Spritze -l\ Kolben 4tit4.

16) Spülen der Spritze mit H ₂ O.

Routine VII.A.3): Spülen mit H ₂ O, 3 x 5 ml_. Spritze t; go to Pos. Ruheposition <-; Spritze I.

17) Starten der Detektion (ELISA) in der Detektionseinheit.

Detektionseinheit on.

VII. D. Reinigen

Zum Reinigen werden die folgenden Schritte mit den angegebenen Steuerungsbefehlen durchgeführt:

1 ) Spülen der Spritze mit H ₂ O, 3 x 5 mL Routine VII.A.3): Spülen mit H ₂ O, 3 x 5 m(_.

2) Reinigen mit Reinigungsmittel, 3 x 5 ml_.

Spritze t go to Pos. Reinigung →; Spritze 4-; Kolben t. Spritze t go to Pos. Abfall →; Spritze i; Kolben i. Spritze f go to Pos. Reinigung ->; Spritze i; Kolben T. Spritze t go to Pos. Abfall ->; Spritze i; Kolben I. Spritze t go to Pos. Reinigung ->; Spritze i; Kolben t. Spritze f go to Pos. Abfall ->; Spritze i; Kolben i.

3) Spülen der Spritze mit H ₂ O 6 x 5 ml_.

Routine VII.A.3): Spülen mit H ₂ O, 3 x 5 m(_ Routine VII.A.3): Spülen mit H ₂ O, 3 x 5 ml_

Spritze T; go to Pos. Ruheposition <-; Spritze I.

E) Konservieren

1 ) Spülen mit H ₂ O, 3x 5ml_.

2) Spülen mit Konservierungslösung 3x5mL

Spritze t go to Pos. Konservierung →; Spritze i; Kolben t. Spritze t go to Pos. Abfall →; Spritze i; Kolben i. Spritze t go to Pos. Konservierung →; Spritze 4-; Kolben t. Spritze t go to Pos. Abfall →; Spritze i; Kolben i. Spritze t go to Pos. Konservierung →; Spritze i; Kolben t. Spritze t go to Pos. Abfall -»; Spritze 1; Kolben i. Spritze t go to Pos. Ruheposition <-; Spritze i.

Abschluss des jeweiligen Samplings ist die Übergabe der Beads bzw. des Lysats in oder auf eine entsprechende Detektionseinheit 84. Insbesondere kann dies durch Injektion auf eine mikrofluidische Disk erfolgen.

Eine weitere Möglichkeit besteht im Aufbringen der Beads 16 auf eine Membran, bevorzugt auf einen mikromechanischen Filter (nicht dargestellt), dessen Oberfläche dann als Detektionsplattform genutzt werden kann. Die Detektion auf der O- berfläche eines mikromechanischen Filters wurde bereits in der deutschen Patentanmeldung 10 2006 026 559.5 sowie der 10 2007 021 387.7 ausführlich beschrieben. Ein verfeinertes Verfahren ist weiter Gegenstand einer parallel zu die- ser Anmeldung am gleichen Tag eingereichten deutschen Patentanmeldung mit dem Titel „Optischer Partikelfilter sowie Detektionsverfahren", bei der die Firma EADS Deutschland GmbH ebenfalls Anmelderin ist. Es wird für weitere Einzelheiten ausdrücklich auf die vorgenannten weiteren Patentanmeldungen verwiesen.

VIII. Weitere Alternativen und Anwendungen

VIII.A Anreicherung von Partikeln aus Flüssigkeiten

Durch geringfügige Modifikationen des hier vorgestellten Gesamtsystems ist auch eine Anreicherung von biologischen Partikeln aus Flüssigkeiten möglich. Hierzu wird, wie in Fig. 10 dargestellt, der Airsampier 30 durch eine Filtrationseinheit 120 ersetzt, die einen hohen Flüssigkeitsdurchsatz erlaubt. Gezeigt ist die Konstruktion einer Flusszelle 122, die von zwei Membranen 124, 126 begrenzt wird. Die Porengröße der Membranen 124, 126 sollte so gewählt werden, dass die Partikel 13, insbesondere Mikroorganismen, passieren können, die paramagnetischen Partikel 16 jedoch zurückgehalten werden. Zwischen den Membranen 124, 126 befinden sich die paramagnetischen Beads 16, an die die Partikel 13 effektiv binden.

Um eine homogene Verteilung der paramagnetischen Beads 16 zu gewährleisten, befindet sich in der Flusszelle 122 ein Rührer 128 (Rotor), der mittels des Durch- flusses 134 angetrieben wird.

Eine automatische Entnahme der Beads 16 erfolgt durch einen Verschluss in der Flusszelle 122, insbesondere durch ein Septum 130, das mit einer Injektionsnadel 132 durchstochen werden kann.

VIII. B. Verwendung alternativer Beads

Auch eine Verwendung nicht paramagnetischer Beads ist in dem Gesamtsystem denkbar. Eine Anreicherung der Beads nach dem „Air-Sampling" könnte anstatt mittels eines magnetischen Feldes über eine poröse Membran, bevorzugt einem mikromechanischen Filter, erfolgen. Dieses Filter würde die Beads zurückhalten, aber Flüssigkeiten passieren lassen. Demzufolge könnten sämtliche Wasch- und Detektionslösungen, die für eine Immunodetektion (ELISA) notwendig sind, über diese mikromechanische Filter gepumpt werden.

Beispiele für mikromechanische Filter sowie damit durchführbare Detektionsver- fahren und für solche Filter aufweisende Detektionsvorrichtungen finden sich in der deutschen Patentanmeldung 10 2006 026 559.9, der deutschen Patentanmeldung 10 2007 021 387.7 sowie den beiden parallel zu der vorliegenden Patentan- meidung eingereichten deutschen Patentanmeldungen mit der Firma EADS Deutschland GmbH als (Mit-)Anmelderin mit den Titeln „Optischer Partikelfilter sowie Detektionsverfahren" und „Partikelfilter sowie Herstellverfahren hierfür". Es wird für weitere Einzelheiten auf diese Patentanmeldungen verwiesen.

VIII. C. Verwendung von Beads mit Nukleinsäuren oder von Glasmilch

Eine weitere Möglichkeit zum Sampling von Mikroorganismen besteht in dem Einsatz von nukleinsäuregekoppelten Beads in dem Gesamtsystem. Hierzu werden die Mikroorganismen aus der Luft angereichert und aufgeschlossen (Extraktionsmethoden siehe oben). Nach der Extraktion werden die mit Nukleinsäuren beschichteten Beads zu dem Lysat gegeben und das Erbgut der Mikroorganismen kann mit der Nukleinsäure auf den Beads hybridisieren. Auch eine unspezifische Bindung der extrahierten DNA an Glasmilch (Silica-Matrix) ist möglich. Hierzu wird nach der Zelllyse eine entsprechende Menge Glasmilch zu dem Lysat gegeben und die freigesetzte DNA kann unspezifisch an die Silica -Partikel binden.

VIII. D. Abtrennung des Antikörper-Antigen-Komplexes von den Beads

Bei bestimmten Detektionsmethoden (z. B. ELISA) besteht die Notwendigkeit, den Antikörper-Antigen-Komplexes gemäß Fig. 1 von den Beads abzutrennen. Folgenden Abspaltungsmöglichkeiten können mit dem Gesamtsystem durchgeführt werden:

» Chemische Abspaltung durch Zerstörung der Biotin-Streptavidin Bindung

» Chemiche Abspaltung durch Verwendung von Sulfo-NHS-SS-Biotin β Thermische Abspaltung durch Denaturierung im Bereich des Siedepunkts » Biochemische Abspaltung durch Verwendung geeigneter Proteasen

(z.B. Papain)

« Physikalische Abspaltung durch Lichteinwirkung. Voraussetzung hierfür ist die Verwendung eines lichtsensitiven Biotin-Linkers, der bei Licht be- stimmter Wellenlänge zerfällt.

Eine anschließende Detektion könnte dann über die klassischen molekularbiologischen Methoden (PCR oder Hybridisierung, siehe oben) erfolgen.

VIII. E. Integration anderer Airsampier

In dem hier vorgestellten Gesamtsystem wurde der Airsampier der Firma SKC integriert. Der flexible und modulare Aufbau des Gesamtsystems lässt jedoch auch die Integration anderer Airsamplertypen zu (siehe Publikation Hogan et al. 2005). Folgende Airsamplertypen wären für eine Integration in das Gesamtsystem gleichfalls geeignet:

» AGI-30 (all-glas-impinger)

» Frit bubbler oder β Coriolis Air Sampler (Firma Bertin).

VIII. F Automatisches Reinigen/Desinfizieren

Ein vollautomatisches Reinigungs- und Desinfizierprogramm kann in dem Gesamtsystem etabliert werden. Sämtliche denkbaren Reinigungs- und Desinfizie- rungslösungen können in dem robusten System Verwendung finden. Bevorzugterweise können folgende Lösungen zum Einsatz kommen:

» Säuren,

» Laugen,

• Detergentien und/oder β Alkohole.

Dazu werden alle Komponenten des Airsampiers 30 automatisch gereinigt, indem die Lösungen zugefügt werden. Anschließend ist ein Spülschritt möglich. Durchge- führt wird dies durch ein Fluidiksystem, das die Reagenzien zur Verfügung stellt, auf- bzw. einbringt und anschließend wieder aufnimmt.

Neben der Reinigung des Airsampiers und des gesamten fluidischen Systems durch die oben genannten Flüssigkeiten, wird das System durch UV-Bestrahlung desinfiziert. Hierzu sind über dem System mehrere UV-Röhren angebracht, die das Gesamtsystem in einem relativ kurzen Zeitraum sterilisieren.

VIII. G Anwendungen des Gesamtsystems

Dem Gesamtsystem eröffnen sich mannigfaltige Anwendungen. Folgende Anwendungsmöglichkeiten sind denkbar: β medizinische Anwendungen in der Diagnostik, insbesondere eine schnelle De- tektion von Infektionskrankheits-Erregern aus Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Speichel, Tränenflüssigkeit und Urin; » militärische Anwendungen, insbesondere Integration des Gesamtsystems in militärische Fahrzeuge, Schiffe, U-Boote und Fluggeräte; » Anwendung als ein mobiles System in allen militärischen und zivilen Bereichen; β Anwendung im Bereich „Homeland Security", insbesondere zur Abwehr terro- ristischer Anschläge mit Biowaffen;

» Detektion von Sprengstoffen, insbesondere zur Abwehr terroristischer Anschläge; β Detektion diverser Betäubungsmitteln und Drogen, insbesondere im Einsatz bei Polizei, Bundespolizei und Bahnpolizei; β zivile Anwendungen, insbesondere bei der Lebensmittelüberwachung, Trinkwasserüberwachung und in der Baubiologie (Raumluft-Überwachung); β Anwendungen in der Luft- und Raumfahrt, insbesondere bei der Kontrolle des Bordwassers und der Kabinenluft sowie in Verbindung mit Weltraummissionen insbesondere zum Aufspüren extraterrestrischen Lebens.

Bezugszeichenliste

10 Antikörper

1 1 Mittelachse

12 Antigene 13 Partikel (insbesondere Mikroorganismus)

14 Oberfläche

15 Tangente

16 Bead 18 Biotin 20 Streptadivin

22 Fc-Domain

24 Phagenprotein

26 Bakterium

30 Airsampier 32 Einlass

34 Auslass

36 Sammelbehälter

38 Tangentialdüsen

39 Luftstrom 40 Sammelflüssigkeit (Anreicherungsflüssigkeit)

41 Dosiereinheit

42 Spritze

43 Dosiervolumen

44 Magnet 45 Auslasskanal

46 Außenwand

48 Innenwand

50 (hohler) Spritzenkolben

52 Magnetkolben 54 Kolbenboden

56 Ultraschallgerät

58 Stabmagnet

60 Membran 62 weiteres Gefäß

64 Düsenaufsatz

66 Hub-Schwenkeinheit

70 Vorrichtung (Gesamtsystem)

72 Sammeleinrichtung 74 Transferiereinheit

76 Gruppe von Reservoiren

78 Antriebseinheit

80 Aufschlusseinrichtung

82 Temperiereinheit 84 Detektionseinheit

86 Steuerungseinheit

91 erstes Reservoir (Beads; Lösung mit paramagnetischen Beads)

92 zweites Reservoir (Äquilibrierungslösung)

93 drittes Reservoir (erste Aufschlusslösung) 94 viertes Reservoir (zweite Aufschlusslösung)

95 fünftes Reservoir (Sammelflüssigkeit, zum Beispiel Wasser, H ₂ O)

96 sechstes Reservoir (Reinigungslösung)

97 siebtes Reservoir (Konservierungslösung)

98 Abfallgefäß 99 Ruheposition

100 Linearantrieb

102 Einheit zur Aufnahme der Dosiereinheit

104 erster Motor

106 zweiter Motor 108 dritter Motor

110 Ultraschallbad

1 12, Z1 erste Bewegung (Spritze in Z-Richtung)

1 14, Z2 zweite Bewegung (Spritzenkolben in Z-Richtung) 1 16, Z3 dritte Bewegung (Magnet in Z-Richtung)

1 18 Rückstrom zur Pumpe

120 Filtrationseinheit

122 Flusszelle

124 Membran 126 Membran

128 Rührer

130 Septum (Verschluss)

132 Injektionsnadel

134 Durchfluss 140 Mikroliterpipette

142 Pipettenspitze

144 erste Saugeinheit

145 zweite Saugeinheit

146 Pipetiersystem