D'ELEMENTS BIOCONTAMINANTS

DOMAINE DE L'INVENTION

La présente invention concerne un dispositif et un procédé de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants . Le dispositif selon la présente invention comprend plus particulièrement une matrice de pixels détecteurs ayant une face active sur laquelle une lumière est incidente, un support transparent à la lumière et qui recouvre la face active, sur lequel les éléments biocontaminants sont susceptibles de se déposer, des moyens d'éclairage, qui produisent un faisceau de lumière qui est incident sur la face active, et des moyens de visualisation aptes à visualiser, sous forme d'images fixes ou d'images vidéo, un signal numérique délivré par des moyens de traitement.

ART ANTERIEUR

La maîtrise de la biocontamination est un enjeu de santé publique, aussi bien au niveau de la sécurité alimentaire qu'au niveau des établissements de santé ou de la pharmacopée. De même, dans l'habitat, en particulier dans l'habitat collectif (établissements scolaires, restauration, crèche, école, garderie, maison médicalisée) , le respect des règles d'hygiène doit être garanti. Il est donc nécessaire de disposer de moyens de suivi de la qualité de l'air et de la propreté des environnements et surfaces.

Dans le domaine des salles propres et bio-propres, il existe des compteurs optiques pour le suivi particulaire (particule viable ou non) ainsi des échantillonneurs actifs de suivi des biocontaminants (par impaction, filtration ou barbotage) ou passifs par sédimentation (géloses) .

L'air est généralement contaminé par une flore microbienne diversifiée qui est souvent résistante et variable dans le temps et l'espace. Pour mettre en place une chaîne globale de la maîtrise de la propreté et de l'hygiène, il faut pouvoir mesurer de manière précise et réactive les biocontaminants . De plus, compte tenu de la cinétique de reproduction de ces biocontaminants (pour certaines bactéries, toutes les 20 à 40 minutes) , il faut pouvoir disposer de moyens de contrôle in situ, fiables et rapides de suivi de la croissance de ces biocontaminants . Pour les établissements de santé, les niveaux de propreté bactériologique sont définis dans la norme NF S 90 351. La norme NF S 90 351 recommande des performances techniques en fonction des zones à risques. Dans le domaine pharmaceutique, le guide des Bonnes Pratiques de Fabrication (BPF) propose quatre niveaux de propreté (cf. référence [1]) . Les BPF françaises et européennes proposent aussi une surveillance et une classification microbiologique des zones de production en activité, dans le cas de la fabrication des médicaments stériles.

La norme NF EN ISO 14698-1 décrit deux catégories de dispositifs de prélèvement d'air applicables aux environnements maîtrisés :

les échantillonneurs passifs : plaques de sédimentation

les échantillonneurs actifs : par impaction, filtration et barbotage. Toutes ces techniques de prélèvement reposent sur les méthodes conventionnelles de culture (ou culturales) c'est- à-dire l'aptitude des microorganismes, déposés sur un milieu de culture gélosé approprié, à donner naissance à des colonies visibles à 1 'œil nu, en fonction du milieu de culture utilisé et des conditions d'incubation (durée et température) .

La durée d'incubation est habituellement de 2 à 5 jours pour les bactéries et de 5 à 7 jours pour les levures et moisissures. En pratique, une première lecture est faite en laboratoire après 48h pour les bactéries et à 5 jours pour les levures et moisissures. La température d'incubation est habituellement de 30 à 35 °C pour les bactéries et 20 à 25°C pour les levures et moisissures. A noter le développement de méthodes alternatives (plus rapides que les méthodes conventionnelles) présentant un niveau de réponse plus court et un niveau de qualité des résultats au moins équivalent à celui des méthodes conventionnelles.

Parmi ces méthodes alternatives, retenons la cytométrie de flux, la fluorescence des particules, intrinsèque ou après marquage par un fluorochrome . Pour ce qui concerne le marquage reposant sur une réaction enzymatique avec le réactif fluorochrome, seuls les micro ^¬ organismes viables sont rendus fluorescents. Cette technologie allie la filtration de l'échantillon, le marquage direct des micro-organismes viables et le dénombrement de cellules par cytométrie à balayage laser et visualisation au moyen d'un microscope à épi-fluorescence automatisé, en moins de 3 heures. A ce jour, le suivi des processus de biocontamination s'effectue en utilisant des échantillonneurs passifs ou actifs . Les échantillonneurs actifs fonctionnent par sédimentation. La sédimentation est une méthode simple consistant à collecter les micro-organismes par gravité sur des boites de Pétri ouvertes contenant des milieux de culture gélosés. Les résultats sont exprimés par unité de surface pendant un temps donné. Cette méthode est requise par les Bonnes Pratiques de Fabrication de l'industrie pharmaceutique pour la fabrication des médicaments stériles. Cette méthode ne permet pas d'avoir un résultat quantitatif de 1 ' aérobiocontamination mais sert plutôt à évaluer le risque de biocontamination d'une surface exposée dans cet environnement, à partir d'un nombre de particules viables sédimentées sur la boite en fonction de la surface et du temps d'exposition. Les échantillonneurs actifs proposent une collecte active des biocontaminants . Les différentes méthodes de collecte des biocontaminants recueillis dans un certain volume aspiré d'air pendant un certain temps (ou biocollecteurs) sont :

- la méthode par impaction sur le milieu de culture qui est la plus répandue et qui impose une brève durée d'échantillonnage suivie d'une longue durée de mise en culture et d'analyse microbiologique ;

- la méthode par filtration qui permet des prélèvements plus longs (optimaux sur 8h) et le recours à différentes méthodes d'analyse microbiologique après récupération de la membrane filtrante en milieu liquide et dilutions successives de l'échantillon (il convient toutefois de s'assurer que les conditions de filtration n'affectent pas la viabilité des micro-organismes recueillis) ;

- la méthode par barbotage en milieu liquide qui a pour intérêt majeur d'éviter le risque de dessiccation de l'échantillon, les microorganismes étant transférés directement en milieu liquide. Cette méthode de collecte est jugée moins stressante pour les biocontaminants et serait donc à privilégier. L'art antérieur présente les inconvénients suivants.

Les échantillonneurs passifs sont des plaques témoins que l'on expose dans les mêmes conditions que celles dans lesquelles est exposé l'individu ou l'objet dont on cherche à surveiller la biocontamination.

Ces plaques témoin sont ensuite prélevées, conditionnées proprement et transportées jusqu'à une étuve pour une mise en incubation qui va favoriser la croissance des biocontaminants et permettre un dénombrement visible à l'ceil mais après une durée non négligeable pouvant aller jusqu'à 72h-une semaine suivant les microorganismes et les milieux de culture. C'est un processus long et fastidieux qui, de plus, ne garantit pas la qualité du résultat, dans la mesure où certains des micro-organismes présents sur les plaques peuvent mourir avant d'arriver au laboratoire d'analyses biologiques, ou encore se mettre en état dit « adverse », c'est-à-dire un état quasi léthargique, sans reproduction et donc non détectable.

Les résultats obtenus avec ces échantillonneurs actifs sont des résultats de biocontamination sédimentée exprimés en UFC par unité de surface. Les échantillonneurs actifs, ou biocollecteurs, présentent les mêmes inconvénients que les échantillonneurs passifs quant à leur temps de réponse longs liés à la période d'incubation.

A noter toutefois qu'il existe aujourd'hui des échantillonneurs actifs qui permettent de palier à cet inconvénient car ils sont couplés à des méthodes de microbiologie rapide (Rapid Microbiology Method ou R M) . Citons parmi ces RMM, les méthodes qui reposent sur 1 ' autofluorescence détectée par un système d'imagerie CCD ou CMOS. Une méthode encore plus efficace est la méthode de marquage fluorescent et excitation laser qui permet de détecter des microcolonnies en croissance. Les résultats de biocontamination obtenus avec ces préleveurs actifs sont des données de biocontamination aéroportée et s'expriment en UFC par unité de volume prélevé. II existe en conséquence au moins deux sources d'erreur dans le dénombrement actuel des micro-organismes selon les, techniques de l'art antérieur :

au niveau de la collecte dynamique des microorganismes (une étude récente (cf. référence [2]) a montré une efficacité physique qui varie entre 1 et 100% suivant les modèles de biocollecteurs,

- au niveau de la culture elle-même car la même étude montre que l'efficacité biologique de culture à partir d'un échantillon de L. Pneumophila par exemple en milieu liquide peut varier de 1 à 5.

Le dispositif selon l'invention ne présente pas ces inconvénients . Par ailleurs, on connaît, selon l'art antérieur, un dispositif de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants comprenant une matrice de pixels détecteurs ayant une face active sur laquelle une lumière est incidente, un support transparent à la lumière et qui recouvre la face active, support sur lequel les éléments biocontaminants sont susceptibles de se déposer, des moyens d'éclairage qui produisent la lumière qui est incidente sur la face active, des moyens de traitement aptes à transformer le signal délivré par la matrice de pixels détecteurs en signal numérique, et des moyens de visualisation aptes à visualiser sous forme d'images fixes ou d'images vidéo le signal numérique délivré par les moyens de traitement. Ce dispositif est décrit dans le document brevet FR 2 964 980 publié le 23/03/2010.

Toutefois, les images fixes ou vidéo obtenues par ce dispositif comportent des granularités laser, des tavelures et/ou présentent un chatoiement, formant des petites taches. En langue anglaise, ces taches sont dénommées "speckle".

RESUME DE L'INVENTION L'invention propose un dispositif de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants qui ne présente pas les inconvénients précités des dispositifs de l'art antérieur et qui, notamment, présente des images de qualité améliorée en s ' affranchissant du "speckle".

A cet effet, l'invention a pour premier objet un dispositif de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants , comprenant : une matrice de pixels détecteurs ayant une face active sur laquelle une lumière est incidente,

un support transparent à la lumière qui couvre la face active, sur lequel support, des éléments biocontaminants sont susceptibles de se déposer et de se multiplier,

des moyens d'éclairage qui produisent la lumière incidente sur la face active,

des moyens de visualisation aptes à visualiser, sous forme d'images fixes ou d'images vidéo, un signal numérique délivré par des moyens de traitement,

caractérisé en ce que la lumière est la lumière réémise par les éléments biocontaminants et en ce que le dispositif comprend en outre au moins un filtre, un polariseur et un analyseur, ledit polariseur et ledit analyseur étant positionnés en configuration croisée pour s'affranchir des granularités laser dans lesdites images.

Elle a pour second objet un procédé de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants comprenant les étapes de :

fourniture d'un dispositif comprenant une matrice (M) de pixels détecteurs ayant une face active sur laquelle une lumière est incidente, un support transparent à la lumière qui couvre la face active, sur lequel support les éléments biocontaminants sont susceptibles de se déposer et de se multiplier, des moyens d'éclairage qui produisent la lumière incidente sur la face active, des moyens de visualisation aptes à visualiser, sous forme d'images fixes ou d'images vidéo, un signal numérique délivré par des moyens de traitement, et au moins un filtre, un polariseur et un analyseur, ledit polariseur et ledit analyseur étant positionnés en configuration croisée ; dépose et multiplication des éléments biocontaminants sur le support ;

éclairage du support portant les éléments biocontaminants par les moyens d'éclairage ;

filtration de la lumière réémise par les éléments biocontaminants par le filtre, et polarisation et analyse de ladite lumière filtrée ;

acquisition d'un signal d'image par la matrice de pixels détecteurs ;

traitement de ce signal acquis par les moyens de traitement et communication du signal numérique aux moyens de visualisation en vue de la visualisation d'images fixes ou vidéo représentatives des éléments biocontaminants . De manière avantageuse, - le support comprend un ou plusieurs milieux de croissance des biocontaminants ; - le ou les milieux de croissance des biocontaminants sont des milieux nutritifs desdits biocontaminants ; - le ou les milieux de croissance des biocontaminants comprennent des marqueurs chimiques fluorescents ; - le support comprend une mosaïque de milieux de croissance des biocontaminants, les caractéristiques d'au moins deux de ces milieux de croissances étant différentes ; - le dispositif comprend un filtre de forte densité optique centré autour de la longueur d'onde d'émission du faisceau de lumière incident, avec une bande passante étroite, comprise entre plus et moins 20 nm ; le dispositif comprend un filtre passe haut filtrant le faisceau de lumière incident ; - le dispositif comprend un système de chauffage, et des moyens de contrôle de la température du ou des milieux nutritifs ; - le dispositif comporte en outre un couvercle opaque asservi ; - les moyens d'éclairage sont des moyens laser ; - la matrice et/ou le support sont mobiles ; - le support est divisé en une mosaïque de milieux de croissance des biocontaminants, les caractéristiques d'au moins deux de ces milieux de croissances étant différentes ; - le dispositif comprend en outre un couvercle opaque (C) , et l'ouverture et la fermeture de ce couvercle sont synchronisées avec la phase de détection ; et - le dispositif comprend en outre une pompe couplée à un débitmètre, de manière à prélever activement l'air de la salle, qui est projeté à la surface du support et les Unités Formant Colonies par m ³ d'air prélevé sont calculées, et 1 ' aérobiocontamination mesurée.

BREVE DESCRIPTION DES FIGURES

L'invention sera mieux comprise à la lecture de la description non limitative qui suit, rédigée au regard des dessins annexés, dans lesquels :

la figure 1 est une représentation schématique du dispositif selon l'invention ;

la figure 2 présente, de manière schématique, un mode de réalisation du dispositif selon l'invention, dans lequel le milieu de collecte forme une mosaïque de géloses spécifiques, et dans lequel le dispositif comprend un couvercle éventuellement chauffant visant à faciliter l'incubation, sur des courtes durées de l'ordre de l'heure, et à optimiser la détection et l'image des particules viables fluorescentes ; et

les figures 3A et 3B sont des images réelle (Fig. 3A) et obtenues au moyen d'un dispositif selon l'invention (Fig. 3B) dans le cas d'un exemple dans lequel une solution très concentrée (10 heures de culture en milieu liquide « LB » avec agitation à 32°C) de Bacillus subtilis dont les membranes ont été marquées par le marqueur fluorescent référencé FM 1-43 spécifique de la membrane plasmique de tout être vivant.

DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION

Des définitions sont données ci-dessous, de termes utilisés dans la présente description selon l'invention.

Bio-contamination :

Contamination d'une matière, d'un appareil, d'un individu, d'une surface, d'un liquide, d'un gaz ou de l'air par des particules viables selon la norme ISO 14698-1. Les biocontaminants présentent pour particularités supplémentaires par rapport à une contamination particulaire ou chimique :

- leur capacité à se reproduire très rapidement,

- leur capacité à muter, s'adapter aux conditions même les plus sévères.

Les grandes familles de biocontaminants sont :

- les bactéries,

- les virus,

- les levures, les moisissures et les champignons.

Bactéries :

Les bactéries sont des êtres vivants unicellulaires microscopiques, se reproduisant par scissiparité et dont le noyau n'est pas délimité par une membrane. Les bactéries, comme toutes les autres cellules, ont besoin d'énergie. L'ATP est la source d'énergie biochimique universelle. L'ATP est commune à toutes les formes de vie, mais les réactions d ' oxydoréduction impliquées dans sa synthèse sont très variées selon les organismes et notamment chez les bactéries. Elles peuvent ainsi utiliser une très large variété de source de carbone et/ou d'énergie.

Bien que leur nom dérive du grec baktêria, « bâton », les bactéries ont des formes variables :

- sphérique (cocci, du grec kôkkos, grain ou microcoques) ,

- en bâtonnet (bacilles pl. baccili, du Latin baculus, bâton) ,

- ou spiralée ( spirochètes ) . La taille des bactéries varie de 0,02 micromètre pour les nanobactéries à 0,75 millimètre pour Thiomargari ta namibiensis, visible à 1 'œil nu. La plupart mesure toutefois entre 0,5 et ΙΟΟμιη. Les bactéries se reproduisent de façon asexuée, par scissiparité (une simple division cellulaire) . Le matériel génétique est tout d'abord dupliqué, puis la bactérie s'allonge, se contracte en son milieu et se divise, formant deux cellules filles identiques à la cellule mère.

Ainsi, la descendance d'une cellule bactérienne est un clone de cellules génétiquement identiques, appelé colonie. On dénombre ensuite les bactéries en termes d'Unités Formant Colonies (UFC) . Certaines bactéries se divisent toutes les 20 à 40 min. Dans des conditions favorables, à raison d'une division toutes les 30 min, une seule cellule aura produit, en quinze heures seulement, un milliard de cellules-filles, colonie visible à l'oeil nu. En revanche, dans de mauvaises conditions, certaines espèces produisent des spores, formes dormantes de la cellule, capables de supporter des conditions extrêmes de température ou de sécheresse. Le taux de mutations spontanées des bactéries est très élevé, surtout lorsqu'elles sont placées dans un environnement défavorable.

Levure :

Une levure est un champignon unicellulaire (certaines levures sont cependant capables d'arborer un aspect pseudo pluricellulaire par la formation, par ex., de pseudomycélium) apte à provoquer la fermentation des matières organiques animales ou végétales. Les levures sont employées pour la fabrication du vin, de la bière, des spiritueux, des alcools industriels, du pain et d' antibiotiques . Ces micro-organismes, de forme variable selon l'espèce (sphérique, ovoïde, en bouteille, triangulaire) mais généralement ovales, d'environ 6 à 10 microns et jusqu'à 50 micromètres, se multiplient par bourgeonnement ou par scissiparité. Ils sont souvent capables d'accomplir une sporulation soit dans un but de dormance en milieu défavorable, soit dans un but de dispersion.

Micro-organismes : Les micro-organismes sont des entités microbiologiques, cellulaires ou non, capables de se reproduire ou de transférer du matériel génétique. Moisissures :

Les moisissures sont des organismes pluricellulaires . Ce sont des champignons microscopiques filamenteux du règne des mycètes. Il en existe des milliers de variétés différentes. Une espèce donnée de champignon microscopique peut générer plusieurs types de mycotoxines, et une même mycotoxine peut être produite par plusieurs espèces de moisissures. Ce sont des molécules de faible poids moléculaire (<1000 d) , le plus souvent thermostables en milieu non aqueux. Difficilement dégradables, elles peuvent subsister dans les denrées même après l'élimination des moisissures.

Plaque de sédimentation :

Une plaque de sédimentation est un réceptacle adapté, par exemple une boite de Pétri, de taille appropriée, renfermant un milieu de culture approprié, stérile, que l'on laisse ouvert pendant une durée définie afin de laisser se déposer des particules viables aéroportées (norme NF EN ISO 14698- 1) ·

Unité viable (UV) : Une unité viable est formée d'une ou plusieurs particules viables que l'on dénombre comme une seule unité. Lorsque l'on dénombre des unités viables sur un milieu gélosé, il est d'usage de les appeler « Unités Formant Colonies » (UFC) . Une UFC peut se composer d'une ou de plusieurs UV (norme NF EN ISO 14698-1) .

Classification des micro-organismes : Dans les normes actuellement accessibles de la série 14644 et 14698, il n'existe pas de classification de la biocontamination ni en volume, ni en surface. Toutefois, la norme ISO 14698-1 préconise des mesures visant à dénombrer des unités viables par dm ² et par heure pour évaluer des cinétiques de contamination.

L'invention concerne un dispositif de prélèvement, de détection précoce, et d'imagerie de microorganismes en croissance. Ce dispositif est montré à la figure 1. Ce dispositif constitue généralement un dispositif d'échantillonnage passif. Toutefois, dans certains modes de réalisation, ce dispositif est un dispositif d'échantillonnage actif.

De manière générale, le dispositif selon l'invention comprend :

une matrice M de pixels détecteurs ayant une face active FA sur laquelle une lumière L est incidente,

un support S transparent à la lumière qui couvre la face active FA, sur lequel support S, des éléments biocontaminants BC sont susceptibles de se déposer et de se multiplier, des moyens d'éclairage ME qui produisent la lumière L incidente sur la face active FA,

des moyens de visualisation MV aptes à visualiser, sous forme d'images fixes ou d'images vidéo, un signal numérique SMT délivré par des moyens de traitement MT,

caractérisé en ce que la lumière L est la lumière réémise par les éléments biocontaminants BC et en ce que le dispositif comprend en outre au moins un filtre F, un polariseur P et un analyseur A, ledit polariseur P et ledit analyseur A étant positionnés en configuration croisée pour s'affranchir des granularités laser dans lesdites images. L'invention propose un nouveau concept de plaques de sédimentation et de croissance dites actives, car elles permettent à elles seules un suivi en quasi temps réel de la biocontamination aéroportée sédimentée ou de biocontamination surfacique. Le dispositif selon l'invention ne modifie généralement pas l'aéraulique de la salle pour prélever les particules viables. Ces particules se déposent naturellement sur le milieu nutritif de collecte. Toutefois, dans certains modes de réalisation, une pompe est ajoutée au dispositif selon l'invention, et couplée à un débitmètre, de manière à prélever activement l'air de la salle, qui est projeté ensuite à la surface du support, en permettant un calcul des Unités Formant Colonies par m ³ d'air prélevé, pour la mesure de 1 ' aérobiocontamination .

Le support S forme une surface de collecte par sédimentation des microorganismes, recouverte d'une gélose G à propriétés optiques optimisées et intégrant, préfèrentiellement , des marqueurs fluorescents. Ces marqueurs marquent les particules viables telles que les membranes plasmiques, les acides nucléiques ou les réactions enzymatiques spécifiques. Leur utilisation permet d'augmenter le contraste des biocontaminants en croissance sur le milieu nutritif. Le support S est transparent à la lumière. Il couvre la face active FA d'éclairage et de détection. Il est traité pour permettre le développement des particules viables susceptibles de s'y déposer. Par ailleurs, le dioptre hublot- milieu nutritif est traité de manière à diminuer les pertes de signal émis par les particules viables. Une originalité supplémentaire de l'invention est associée à la possibilité d'utiliser des lames amovibles jetables recouvertes d'un milieu de culture spécifique ou non, en lieu et place du hublot collecteur. Ces lames pourront être chauffées in situ pour optimiser les conditions de croissance et permettre la visualisation de la croissance des UFC, voire des biofilms en temps réel. Enfin, un système de chauffage contrôle la température du support transparent afin de favoriser la croissance optimisée des particules viables collectées, et un système de contrôle de l'hygrométrie du milieu nutritif qui détermine la durée de vie du milieu nutritif avant changement .

Un dispositif de couverture C ou de cache opaque est disposé à la surface de collecte pour éviter, pendant la croissance, la dissémination des bactéries en développement dans l'environnement propre et optimisant les conditions de détection. Un asservissement synchrone permet la mise en place du cache opaque sur la surface de collecte avant le début de la détection automatique des particules viables déposées sur la surface de collecte. L'ouverture et la fermeture du couvercle sont donc synchronisées avec la phase de détection pour améliorer le rapport signal/bruit. Par ailleurs, le couvercle lui-même est éventuellement chauffant, en vue de faciliter l'incubation des biocontaminants sur une durée courte, et d'améliorer ainsi la détection. Le couvercle est éventuellement équipé d'au moins une buse d'aspiration, ladite au moins une buse d'aspiration étant reliée à une pompe par exemple à débit variable et contrôlé par un débitmètre autorisant des aspirations d'air à des débits notamment inférieurs à 100 L/min. L'entrée de l'air aspiré au niveau de ladite au moins une buse est effectuée sur la partie extérieure du capot, et la sortie de l'air aspiré est située face à la gélose collectrice des éléments biocontaminants , à l'aplomb de la matrice CCD ou CMOS. Les moyens d'éclairage ME produisent la lumière monochromatique qui est incidente sur la face active. Ces moyens comprennent par exemple une diode électroluminescente, une diode laser ou un laser.

La matrice M de pixels détecteurs est disposée directement au-dessous du support transparent. Elle a une face active sur laquelle une lumière est incidente. La matrice de pixels détecteurs est par exemple une matrice de capteurs CCD ou une matrice de capteurs CMOS. Les temps d'exposition du capteur sont avantageusement relativement importants, compris entre 10 et 100 ms . Les moyens d'imagerie, comprenant le détecteur et la matrice M, et/ou le support S, sont déplaçables dans un plan, selon des axes XY, ou dans l'espace, selon des axes XYZ .

Le filtre F comprend un filtre passe haut qui coupe le faisceau incident. Le dispositif comprend en outre un filtre supplémentaire, centré autour de la longueur d'onde d'émission, avec une bande passante fine, par exemple de l'ordre de +/-10 à 20 nm. Le polariseur P et l'analyseur A croisés permet de s'affranchir du « speckle » éventuel des moyens d'éclairage ME, notamment lorsqu'il s'agit d'une source de lumière laser.

Les moyens de traitement MT sont aptes à transformer le signal délivré par la matrice M de pixels détecteurs en signal numérique SMT . Ils comprennent des moyens aptes à dénombrer les éléments biocontaminants par unité de surface et/ou par unité de temps, et des moyens permettant de visualiser la morphologie des éléments biocontaminants en croissance .

Les moyens de visualisation MV sont aptes à visualiser sous forme d'images fixes ou d'images vidéo le signal numérique SMT délivré par les moyens de traitement afin de suivre la croissance des particules viables sur des longues périodes, notamment de l'ordre de la journée, à une semaine ou plus. Ces moyens permettent de suivre l'évolution de la taille d'une particule au cours du temps.

Le dispositif de l'invention peut permettre une classification de certains biocontaminants . Ces biocontaminants sont les bactéries GRAM+ et GRAM- . Un marqueur, qui pourrait être mis en œuvre pour cette classification, est un mélange d'hexidium iodide et de SYTO™ 13 de ThermoFisher™. Toutefois, lesdites bactéries GRAM+ et GRAM- peuvent aussi faire l'objet d'une identification a posteriori . Une telle identification a posteriori peut en outre être utilisée pour une classification d'autres éléments biocontaminants , tels que les levures, moisissures ou champignons. Elle peut se faire, par exemple, par observation directe des éléments biocontaminants , après croissance suffisamment longue. Elle permettrait de donner également des informations morphologiques sur les éléments biocontaminants (ex. coques, bacilles, etc.).

A cet effet, et ainsi que cela est montré à la figure 2, le dispositif dispose avantageusement d'un milieu de culture G « mosaïque ». Il s'agit, dans l'exemple de la figure 2, d'une mosaïque de 4 géloses différentes spécifiques de différentes particules viables. Le milieu de culture peut être un milieu apte à favoriser la croissance d'un grand nombre d'éléments biocontaminants différents ou un milieu de culture spécifique qui favorise un type de biocontaminant particulier. Chaque partie du milieu de culture est alors spécifique des contaminants à détecter soit parce qu'elle intègre - ou non - des marqueurs fluorescents ou des inhibiteurs de croissance ou un milieu nutritif spécifique de tel ou tel contaminant.

Selon encore une autre caractéristique supplémentaire de l'invention, les moyens de traitement MT comprennent des moyens aptes à visualiser la morphologie des éléments biocontaminants .

L'invention concerne également un système de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants , caractérisé en ce qu'il comprend un ensemble de dispositifs de détection et d'imagerie de microorganismes conformes à l'invention, les matrices de pixels détecteurs des dispositifs de détection et d'imagerie étant mises en réseau.

Pour la mise en œuvre du procédé de détection et d'imagerie d'éléments biocontaminants selon l'invention, un dispositif tel que décrit ci-dessus est fourni. Le couvercle opaque est ouvert, et lesdits éléments se déposent naturellement sur la gélose portée par le support, par sédimentation, ou alors, activement, si ledit couvercle est muni de buses reliées à une pompe d'aspiration couplée à un débitmètre. Ces éléments biocontaminants se multiplient sur le support. Pour la visualisation de ces éléments, le couvercle est refermé et le support transparent portant lesdits éléments est éclairé, par le dessous, par les moyens d'éclairage. La lumière produite par ces moyens d'éclairage est réémise par les éléments biocontaminants . Elle est filtrée, puis traverse l'ensemble croisé formé du polariseur et de l'analyseur, avant traitement, ce qui supprime les chatoiements dans les images. Un signal d'image est acquis par la matrice de pixels détecteurs et ce signal acquis est traité par les moyens de traitement, puis envoyé aux moyens de visualisation en vue de la visualisation d'images fixes ou vidéo représentatives des éléments biocontaminants .

En définitive, le dispositif et le procédé selon l'invention constituent un moyen simple et facilement transportable qui permet de suivre, in situ et en continu, voire en réseau, les microorganismes susceptibles de se développer en biofilm sur les surfaces. Une liste d'avantages du dispositif et du procédé selon l'invention est mentionnée ci-après :

contrôler les particules viables sédimentées des environnements à risques biologiques,

- permettre un suivi en continu et sur des longues périodes des particules viables en environnement contrôlé ou autre environnement même extérieur,

fournir en temps réel l'évolution des particules viables surfaciques déposées sur les surfaces d'une salle ou de plusieurs salles en même temps,

- ne pas modifier l' aéraulique de la salle par des prélèvements dynamiques,

- fournir des preuves objectives de la présence de ces particules viables avec prise de photos et suivi vidéo de leur évolution (traçabilité assurée) ,

- suivre la cinétique de croissance des unités formant colonies à partir d'une unité viable, - alerter au plus tôt de la présence de ces particules viables par détection des premiers instants de croissance, dans des temps l'ordre de l'heure,

- déduire une cinétique de biocontamination en fonction des conditions d'exploitation des salles, du nombre d'opérateurs, de visiteurs, de la température, du débit de filtration, etc. grâce au mode de prélèvement statique représentatif de la situation d'exposition des médicaments, patients ou aliments à protéger,

- permettre d'optimiser la fréquence de nettoyage des surfaces par un suivi en temps réel de la biocontamination des surfaces,

- permettre un gain réel de temps par rapport aux plaques témoins passives de l'art antérieur,

- améliorer la fiabilité des résultats en évitant tout transfert des plaques de collecte du point d'échantillonnage au point d'analyse,

- différencier les unités viables des unités mortes ou en état adverse par un suivi vidéo ou régulier de leur croissance,

- différencier les unités viables des unités mortes ou en état adverse par un éclairage laser UV et un milieu de culture intégrant des fluorochromes ,

- permettre le développement spécifique de tel ou tel micro-organisme en utilisant des milieux de culture sélectifs ,

- réaliser des procédés d'analyses de biocontaminants peu coûteux par rapport aux procédés d'analyse a posteriori en laboratoire de l'art antérieur.

L'invention trouve des applications dans toutes les industries (industrie pharmaceutique et agroalimentaire, mais aussi spatiale, micromécanique, optique, les nanotechnologies ) , et dans les établissements de santé et dans la lutte contre le bioterrorisme.

A ce jour, la maîtrise de la biocontamination passe par des prélèvements de courtes durées, via des échantillonneurs passifs ou actifs. Ensuite, ces prélèvements doivent suivre un long processus de culture à une température et pendant des durées pouvant atteindre sept jours. Le moyen de visualisation du dépôt de microorganismes en quasi temps réel proposé par l'invention est un substitut avantageux à ces échantillonneurs , d'autant qu'il est sur le concept très proche de la méthode de référence basée sur l'exposition passive de géloses aux points à risques de biocontamination de l'installation. Il permet de signaler instantanément que les niveaux d'alerte ou/et d'action sont atteints dans telle ou telle zone.

Exemple de mise en œuyre

Un dispositif selon l'invention a été réalisé en utilisant une boite de Pétri comprenant un milieu de culture TSA intégrant un marqueur fluorescent référencé FM 1-43 chez Thermofisher™. Une goutte de solution très concentrée (10 heures de culture en milieu liquide LB avec agitation à 32°C) de Bacillus subtilis a été déposée dans cette boite, l'objectif de l'expérience n'étant pas d'être représentatif du mode de dépôt mais bien de montrer le bon fonctionnement du dispositif opto-mécanique . Dans cet exemple, on a utilisé une source laser incidente monochromatique à 447 nm avec un polariseur et un analyseur croisés. Ces tests montrent que la configuration polariseur/analyseur croisés permet de s'affranchir du "speckle" de la source laser. Un filtre uniquement ne suffirait pas pour s'affranchir du "speckle". Un filtre passe-haut coupant les signaux lumineux réémis et imagé à 500 nm (DO de 6) a été utilisé. Un filtre supplémentaire, centré autour de la longueur d'onde d'émission du marqueur FM 1-43, ici centré à 600nm, avec une bande passante de +/- 16 nm a été utilisé pour n'analyser que la lumière émise par les bacillus subtilis. Les temps d'exposition ont été compris entre 10 et 100 ms et 8 et 20 images ont été acquises. Dans la configuration de cet exemple, avec l'objectif mis en œuvre, un pixel de l'image correspond à 18 μιη. Le capteur en lui-même présente des pixels de 6,45 μιη de côtés, ce qui peut être optimisé, compte tenu de la qualité des caméras disponibles aujourd'hui. Le montage du dispositif optimisé avec couverture opaque de la boite de Pétri correspond à la configuration optimisée en termes de contrastes des bactéries sur la gélose. La photographie de la figure 3A correspond à l'image réelle. La photographie de la figure 3B est l'image de fluorescence obtenue au moyen d'un dispositif selon l'invention, dans les conditions spécifiques mises en œuvre dans cet exemple. Il apparaît clairement que le dispositif selon l'invention permet de s'affranchir du "speckle".

Bibliographie

[1] Bonnes Pratiques de Fabrication de l'industrie pharmaceutique, Ministère de l'emploi, de la cohésion sociale et du logement, Ministère de la santé et des solidarités et AFSSAPS, bulletin officiel n°2007-l bis, fascicule spécial, JO du 28 décembre 2006 [2] T.L. Ha, L. Mathieu, E. Robine, Evaluation de biocollecteurs pour la détection de légionelles, Salles propres n°60, Pp 35-40, Mars 2009.