Erfindungsgemäß wird eine Vorrichtung und ein Verfahren zum Nachweis eines bestimmten Analyten in einer flüssigen Probe bereitgestellt. Die Vorrichtung, die in dem Verfahren verwendet werden kann, enthält mindestens eine Fluidleitung, mindestens einen Aufnahmebereich zur Aufnahme einer flüssigen Probe, mindestens einen Enzymbereich mit mindestens einem bestimmten Enzym und/oder mindestens einen Ansäuerungsbereich mit mindestens einer Säure. Ferner enthält die Vorrichtung mindestens einen Reaktionsbe- reich, der zur Ausbildung von Gasbläschen geeignet ist. Die mindestens eine Fluidleitung ist dazu geeignet, die flüssige Probe - über Kapillarkräfte und/oder mindestens eine Mikropumpe in der Fluidleitung - vom Aufnahmebereich über den Enzymbereich und/oder den Ansäuerungsbereich zum Reak- tionsbereich zu transportieren. Die Vorrichtung ermöglicht einen schnellen, einfachen und kostengünstigen Nachweis eines bestimmten Analyten in einer flüssigen Probe, wobei der Nachweis mit einer hohen Detektionssensitivität, Detektionsspezifität und Detektionspräzision möglich ist. Ferner werden Verwendungen der erfindungsgemäßen Vorrichtung vorgeschlagen.

Biomarker sind messbare Parameter für biologische Prozesse, die Rückschlüs- se auf Erkrankungen und den physiologischen Zustand zulassen. Zu den bekanntesten Biomarker-Molekülen gehören vor allem Hormone (z.B. T3/T4) Stoffwechsel produkte, Blutzucker als auch Cholesterin und andere Blutfette.

Biomarker liegen oft in sehr geringen Konzentrationen und im Komplex mit einer Vielzahl anderer Proteine vor, was die Charakterisierung sowohl erschwert als auch die Analyse kosten- und zeitaufwendig gestaltet. Kommerziell erhältliche, freiverkäufliche Schnelltests basieren meist auf einer qualitativen ja/nein-Antwort, aber erlauben keine quantitative Beurteilung der Konzentration eines bestimmten Analyten in einer flüssigen Probe.

Zum Nachweis von Biomarkern als Analyten werden sehr häufig serologische Methoden angewandt. Die Nachteile dieser Methoden sind ein hoher experimenteller Aufwand, da einerseits eine Auswahl geeigneter Antikörper getroffen werden muss, die Antikörper markiert werden müssen (z.B. mit einem Fluoreszenzfarbstoff) und die Bestimmungsverfahren zeitaufwändig sind. Ferner sind diese Bestimmungsverfahren mit einer hohen Detektionsunschärfe behaftet.

Viele der im Stand der Technik bekannten Verfahren zum qualitativen bzw. quantitativen Nachweis eines bestimmten Analyten in einer flüssigen Probe basieren auf der Detektion hochspezifischer Bindungsereignisse zwischen einem Epitop des zu bestimmenden Analyten (z.B. ein Epitop eines Antigens) und einem bestimmten Paratop am Detektormolekül (z.B. einem Paratop eines Antikörpers). Bekannte Verfahren zur Identifikation von Biomarkern sind beispielsweise der„enzyme-linked immunosorbant assay" („ELISA"), die Gelelektrophorese, die Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie (SPR- Spektroskopie), die Verwendung von „protein microarrays" (z.B. „mass- sensing BioCD protein array"), die oberflächenverstärkte Raman- Spektroskopie, kolorimetrische oder elektrochemische Verfahren und die Flu- oreszenzspektroskopie. Aktueller Goldstandard in der Diagnostik von Biomarkern sind Immunoassays, bei denen ein Fängerantikörper an eine feste Phase immobilisiert ist und die Reaktion mit dem Antigen mithilfe eines Sekundärantikörpers ausgelesen wird. Nachteil an diesen Immunoassays ist, dass unspezifische Bindungen von anderen Proteinen an die Sensoroberfläche das Ergebnis falsch positiv beeinflussen und damit stark verfälschen können.

Insgesamt sind die gegenwärtigen Verfahren zur Identifikation von Biomarkern durch einen hohen Zeitaufwand, einen hohen apparativen Aufwand, ei- nen Bedarf an Fachpersonal, eine geringe Detektionssensitivität, eine geringe

Detektionsspezifität und eine geringe Detektionsvarianz gekennzeichnet.

Ausgehend hiervon war es die Aufgabe der vorliegenden Erfindung, eine Vorrichtung und ein Verfahren bereitzustellen, die/das einen schnellen, einfachen und kostengünstigen Nachweis eines bestimmten Analyten in einer flüssigen

Probe ermöglicht, der/das zudem eine hohe Detektionssensitivität, eine hohe Detektionsspezifität und eine hohe Präzision in der Detektion ermöglichen. Ferner sollten Verwendungen einer solchen Vorrichtung vorgeschlagen werden.

Die Aufgabe wird gelöst durch die Vorrichtung mit den Merkmalen von Anspruch 1, dem Verfahren mit den Merkmalen von Anspruch 14 und der Verwendung mit den Merkmalen von Anspruch 18. Die abhängigen Ansprüche zeigen vorteilhafte Weiterbildungen auf.

Erfindungsgemäß wird eine Vorrichtung zum Nachweis eines bestimmten Analyten in einer flüssigen Probe über enzymkatalysierte und/oder säurevermittelte Umsetzung des Analyten zu mindestens einem Gas bereitgestellt, enthaltend

a) mindestens eine Fluidleitung;

b) mindestens einen Aufnahmebereich zur Aufnahme einer flüssigen Probe; c) i) mindestens einen Enzymbereich, der mindestens ein bestimmtes Enzym enthält, das dazu geeignet ist, die Umsetzung des zu bestimmenden Analyten zu mindestens einem Gas zu katalysieren; und/oder

ii) mindestens einen Ansäuerungsbereich enthält, der mindestens eine

Säure enthält; und d) mindestens einen Reaktionsbereich zur Ausbildung von Gasbläschen, wobei der Reaktionsbereich eine Kammer enthält oder daraus besteht, die mit der mindestens einen Fluidleitung fluidisch verbunden ist und flüssigkeitsdichte Wandungen aufweist;

dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Fluidleitung dazu geeignet ist, über Kapillarkräfte und/oder mindestens eine Mikropumpe in der Fluidleitung, die flüssige Probe vom Aufnahmebereich über den mindestens einen Enzymbereich und/oder den mindestens einen Ansäuerungsbereich zum Reaktionsbereich zu transportieren.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann somit entweder mindestens einen Enzymbereich mit den oben genannten Merkmalen oder mindestens einen Ansäuerungsbereich mit den oben genannten Merkmalen aufweisen oder aber sowohl mindestens einen Enzymbereich mit den oben genannten Merkmalen als auch mindestens einen Ansäuerungsbereich mit den oben genannten Merkmalen aufweisen.

Die Vorrichtung kann ferner eine Mikropumpe aufweisen, die dazu geeignet ist, die flüssige Probe aktiv (d.h. über einen Energieeintrag) vom Aufnahmebereich über den mindestens einen Enzymbereich und/oder den mindestens einen Ansäuerungsbereich zum Reaktionsbereich zu transportieren. Dieser aktive Transport kann einen passiven Transport (d.h. einen Transport über Kappilarkräfte) unterstützen. Die Vorrichtung (insbesondere die mindestens eine Fluidleitung) kann aber alternativ auch ohne Mikropumpe dazu geeignet sein, die flüssige Probe passiv (d.h allein über Kapillarkräfte) vom Aufnahmebereich über den mindestens einen Enzymbereich und/oder den mindestens einen Ansäuerungsbereich zum Reaktionsbereich zu transportieren.

Im Falle des Transports über mindestens eine Mikropumpe weist die erfindungsgemäße Vorrichtung bevorzugt eine Energiequelle auf, die bevorzugt ausgewählt ist aus Batterie, Akkumulator, photovoltaisches Element und Kombinationen hiervon. Die für den Betrieb der Mikropumpe nötige Energiequelle kann jedoch auch in einem optischen Detektionsgerät enthalten sein und die Vorrichtung bei Anordnung der Vorrichtung in oder an dem optischen Detektionsgerät die Energie durch die Energiequelle beziehen. Die Erfindung bezieht sich auf eine Vorrichtung zur Detektion von Biomarkern mithilfe gaserzeugende chemischer Reaktionen in einer geometrisch begrenzten Probenkammer. Durch diese Vorrichtung können bestimmte Analyten (z.B. Biomarker) einfach, schnell und kostengünstig charakterisiert werden.

Die Vorrichtung erlaubt die Bestimmung des Analyten in der flüssigen Probe mit einer hohen Detektionssensitivität, da der Analyt katalytisch über ein Enzym bzw. über Säure zu mindestens einem Gas umgesetzt wird und die Produktion bereits eines Mols Gas bei Normaldruck (1013 hPa) und Raumtempe- ratur (25°C) ein Volumen von 24,465 · 10 ^~3 m ³ (d.h. ca. 24,465 Liter) einnimmt.

Anders ausgedrückt wird bereits bei einer Umsetzung von einem Nanomol Analyt zu einem Nanomol Gas ein Gasvolumen von 24,465 Nanolitern freigesetzt, was über gängige optische Messverfahren ohne Weiteres messbar und quantifizierbar ist. Folglich verursacht die Gasproduktion eine Signalamplifika- tion, die eine hohe Detektionssensitivität bewirkt.

Ferner kann durch die erfindungsgemäße Vorrichtung eine hohe Detektions- spezifität bereitgestellt werden, da die Spezifität der enzymkatalysierten Umsetzungsreaktion von der Spezifität des Enzyms zu seinem Substrat abhängt und/oder da in einer bestimmten zu analysierenden Probe zwangsweise nur ein Analyt vorhanden sein kann, der sich durch eine Reaktion mit einer Säure zu einem Gas umwandelt (z.B. bei Blut als Probe: Umwandlung von HC0 ₃ ^" zu C0 ₂ + H ₂ 0). Im Falle einer Analyt-Bindung und Analyt-Umsetzung durch ein Enzym ist die Spezifität sogar höher als die Spezifität einer Vielzahl von Analyt- Antikörper-Bindungen, da anders als bei Analyt-Antikörper-Bindungen unspezifische Analyt-Enzym-Bindungen praktisch nicht bzw. kaum vorkommen. Selbst wenn der Analyt unspezifisch an das Enzym binden sollte, d.h. das Enzym nicht am aktiven Zentrum bindet, so kommt es zu keiner Umsetzung des Analyten und es wird kein Signal (in Form einer Produktion von Gas) generiert.

Darüberhinaus ist es durch die erfindungsgemäße Vorrichtung möglich, eine niedrige Detektionsvarianz bzw. eine hohe Präzision in der Detektion (d.h. eine hohe Nähe am wahren Wert), bereitzustellen, da die mindestens eine Fluidleitung der erfindungsgemäßen Vorrichtung dazu geeignet ist, die flüssige Probe über Kapillarkräfte und/oder über eine Mikropumpe zum Reaktionsbe- reich zu transportieren. Dies bewirkt, dass der für die erzeugte Signalhöhe verantwortliche kritische Schritt der Kontaktierung des Analyten mit dem Enzym und/oder der Säure„automatisiert" ist und in vorgegebenen Volumina erfolgt. Anders ausgedrückt entfallen hier Fehler, die durch manuelles Mischen bestimmter Volumina durch einen Benutzer bedingt werden (z.B. „Pipettierfehler"). Anders ausgedrückt ist die Mischgenauigkeit bestimmter Volumina bei der erfindungsgemäßen Vorrichtung von Versuch zu Versuch deutlich konstanter und die Varianz von Versuch zu Versuch deutlich kleiner. Ferner ist durch die Zugabe der flüssigen Probe auf den Aufnahmebereich der Vorrichtung der Start der Signalbildung exakt definiert („automatisierter" Start) und somit Ungenauigkeiten bezüglich eines durch einen Benutzer manuell bewirkten Starts der Reaktion nicht gegeben. Folglich verkleinert sich die Varianz von Messung zu Messung und die Präzision der Detektion ist erhöht.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann dadurch gekennzeichnet sein, dass sie mehrere Fluidleitungen enthält, bevorzugt mehrere Fluidleitungen, die dazu geeignet sind, über Kapillarkräfte und/oder mindestens eine Mikropum- pe in der Fluidleitung, die flüssige Probe vom Aufnahmebereich über mindestens einen Enzymbereich und/oder mindestens einen Ansäuerungsbereich zum Reaktionsbereich zu transportieren. Hierbei können die Fluidleitungen jeweils mit dem mindestens einen Enzymbereich, Ansäuerungsbereich und/oder Reaktionsbereich der erfindungsgemäßen Vorrichtung verbunden sein oder alternativ jeweils jede Fluidleitung mit einem eigenen Enzymbereich, Ansäuerungsbereich und/oder Reaktionsbereich verbunden sein. In letzterem Fall ist mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung die gleichzeitige Erfassung mehrerer, verschiedener Analyten möglich. Hierbei können die Fluidleitungen jeweils alle mit dem mindestens einen Aufnahmebereich der erfindungsgemäßen Vorrichtung verbunden sein oder alternativ jeweils mit einem eigenen Aufnahmebereich verbunden sein.

Die Vorrichtung kann mehrere Reaktionsbereiche enthalten, bevorzugt mehrere Reaktionsbereiche zur Ausbildung von Gasbläschen, wobei die Reaktionsbereiche jeweils eine Kammer enthalten oder daraus bestehen, die jeweils mit mindestens einer Fluidleitung fluidisch verbunden sind und jeweils flüssigkeitsdichte Wandungen aufweist. Die Kammer kann mindestens eine Wandung, bevorzugt mindestens zwei gegenüberliegende Wandungen, enthalten, die eine Transparenz für Licht einer Wellenlänge in einem Bereich ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IR- Bereich, sichtbarer Bereich, UV-Bereich und Kombinationen hiervon aufweist, bevorzugt eine Transparenz für Licht einer Wellenlänge im sichtbaren Bereich.

Die Kammer kann ferner eine Wandung, bevorzugt mindestens zwei gegenüberliegende Wandungen, enthalten, die eine Dichtigkeit für Flüssigkeiten, Gase und Kombinationen hiervon, aufweist, bevorzugt eine Dichtigkeit für Flüssigkeiten.

Die Vorrichtung kann mehrere Kammern enthalten. In diesem Fall können die hier genannten Merkmale der Kammer für alle Kammern der Vorrichtung gelten.

Die Vorrichtung kann dadurch gekennzeichnet sein, dass der mindestens eine Aufnahmebereich der mindestens einen Fluidleitung zur Aufnahme einer flüssigen Probe ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus wässrige Lösungen enthaltend oder bestehend aus Blut, Urin, Sputum, Nahrungsmittel, Flusswasser, Seewasser, Meerwasser, Grundwasser, Trinkwasser, Abwasser und Mischungen hiervon, geeignet ist.

Der mindestens eine Enzymbereich kann mindestens ein Enzym ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Urease, Laktatoxidase, Laktatdehydrogenase, Katalase, Pyruvatdecarboxylase, Thyreoperoxidase und Kombinationen hiervon enthalten.

Der mindestens eine Enzymbereich kann mindestens ein weiteres Enzym enthalten, wobei das mindestens eine weitere Enzym bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Catalase, Pyruvatdecarboxylase und Kombinationen hiervon.

Der mindestens eine Enzymbereich kann mindestens einen Cofaktor eines Enzyms enthalten, bevorzugt NAD ⁺ . Der mindestens eine Enzymbereich kann zwischen dem Aufnahmebereich zur Aufnahme einer flüssigen Probe und dem Reaktionsbereich zur Ausbildung von Gasbläschen angeordnet sein oder innerhalb des Reaktionsbereichs zur Ausbildung von Gasbläschen angeordnet sein. Falls die Vorrichtung mehrere Enzymbereiche aufweist kann eine solche Anordnung für alle Enzymbereiche der Vorrichtung gelten.

Der mindestens eine Enzymbereich kann das mindestens eine Enzym und/oder den mindestens einen Cofaktor des mindestens einen Enzyms in trockener Form, bevorzugt in lyophilisierter Form enthalten, oder in wässriger

Form, bevorzugt als wässrige Lösung, wässrige Suspension oder wässriges Gel, enthalten.

Der mindestens eine Enzymbereich kann biologische Zellen und/oder Zelllysat enthalten, wobei die biologischen Zellen und/oder das Zellysat bevorzugt das mindestens eine Enzym enthalten, das dazu geeignet ist, die Umsetzung des zu bestimmenden Analyten zu mindestens einem Gas zu katalysieren. Der Vorteil an dieser Ausgestaltungsform ist, dass eine Isolation (Reinigung) des Enzyms nicht nötig ist und dass das Enzym in einer Umgebung ist, in der es eine höhere Langzeitstabilität als in gereinigter Form aufweisen kann. Folglich kann die Vorrichtung eine höhere Langzeitstabilität aufweisen und kann kostengünstiger bereitgestellt werden.

Der mindestens eine Enzymbereich kann mindestens Urease enthalten. Der mindestens eine Enzymbereich kann Laktatoxidase und Catalase enthalten.

Der mindestens eine Enzymbereich kann Pyruvatdecarboxylase enthalten. Der mindestenns eine Enzymbereich kann Laktatdehydrogenase und Pyruvatdecarboxylase enthalten. Die mindestens eine Fluidleitung kann eine Membran enthalten, die bevorzugt einen Porendurchmesser von < 20 μιη, bevorzugt < 6 μιη, besonders bevorzugt < 2 μιη, insbesondere < 100 nm, optional < 1 nm, aufweist. Die Membran kann zur Abtrennung biologischer Zellen geeignet sein, bevorzugt zur Abtrennung von Blutzellen. Die Membran kann zwischen dem Aufnahme- bereich zur Aufnahme einer flüssigen Probe und dem Reaktionsbereich zur

Ausbildung von Gasbläschen angeordnet sein, bevorzugt zwischen dem Auf- nahmebereich zur Aufnahme einer flüssigen Probe und dem Enzymbereich und/oder dem Ansäuerungsbereich. Falls die Vorrichtung mehrere Membranen aufweist kann eine solche Anordnung für alle Membranen der Vorrichtung gelten.

Der mindestens eine Ansäuerungsbereich enthält bevorzugt eine Säure, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus bei Raumtemperatur und Normaldruck feste Säuren, HCl, H ₂ S0 ₄ , H ₃ P0 ₄ und Mischungen hiervon, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus bei Raumtemperatur und Normal- druck feste Säuren, besonders bevorzugt Citronensäure, Ascorbinsäure, Apfelsäure, Stearinsäure, Palmitinsäure, Myristinsäure, Laurinsäure und Mischungen hiervon

Der mindestens eine Ansäuerungsbereich ist bevorzugt zwischen dem Auf- nahmebereich zur Aufnahme einer flüssigen Probe und dem Reaktionsbereich zur Ausbildung von Gasbläschen angeordnet, besonders bevorzugt innerhalb des Reaktionsbereichs zur Ausbildung von Gasbläschen. Falls die Vorrichtung mehrere Ansäuerungsbereiche aufweist kann eine solche Anordnung für alle Ansäuerungsbereiche der Vorrichtung gelten.

Die Vorrichtung, bevorzugt die mindestens eine Fluidleitung, kann mindestens einen Oxidationsbereich enthalten, wobei der mindestens eine Oxidationsbe- reich mindestens ein Oxidationsmittel enthält, bevorzugt mindestens ein Oxi- dationsmittel und mindestens eine Säure.

Der mindestens eine Oxidationsbereich enthält bevorzugt ein Oxidationsmittel, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Kaliumpermanganat, Mangandioxid, NAD ⁺ und Mischungen hiervon. Der mindestens eine Oxidationsbereich enthält bevorzugt eine Säure, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus bei Raumtemperatur und Normaldruck feste Säuren, HCl, H ₂ S0 ₄ , H ₃ P0 ₄ und Mischungen hiervon, bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus bei Raumtemperatur und Normaldruck feste Säuren, besonders bevorzugt Citronensäure, Ascorbinsäure, Apfel- säure, Stearinsäure, Palmitinsäure, Myristinsäure, Laurinsäure und Mischungen hiervon. Der mindestens eine Oxidationsbereich ist bevorzugt zwischen dem Aufnahmebereich zur Aufnahme einer flüssigen Probe und dem Reaktionsbereich zur Ausbildung von Gasbläschen angeordnet, besonders bevorzugt zwischen dem Enzymbereich und dem Reaktionsbereich zur Ausbildung von Gasbläschen. Insbesondere überlappt der mindestens eine Oxidationsbereich mit dem Ansäuerungbereich zumindest bereichsweise oder ist mit diesem identisch.

Die mindestens eine Fluidleitung kann eine Länge von 0,1 bis 20 cm, bevorzugt 0,5 bis 10 cm, besonders bevorzugt 1 bis 5 cm, aufweisen. Die mindestens eine Fluidleitung kann eine Breite von 0,05 bis 20 mm, besonders bevorzugt 0,1 bis 10 mm, besonders bevorzugt 1 bis 5 mm, insbesondere 2 bis 4 mm, aufweisen. Die mindestens eine Fluidleitung kann eine Höhe von 0,05 bis 2 mm, besonders bevorzugt 0,1 bis 1 mm, besonders bevorzugt 0,2 bis 0,8 mm, insbesondere 0,4 bis 0,6 mm, aufweisen. Die mindestens eine Fluidleitung kann einen maximalen Durchmesser im Bereich von 0,05 bis 20 mm, bevorzugt 0,1 bis 10 mm, besonders bevorzugt 1 bis 5 mm, insbesondere 2 bis 4 mm, aufweisen.

Der bestimmte Analyt kann ausgewählt sein aus der Gruppe bestehend aus kleines organisches Molekül mit einer Masse von < 500 Da, Peptid, Protein und Mischungen hiervon, bevorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Hormon, Stoffwechselprodukt mit einer Masse von < 500 Da, Kohlenhydrat, Sterol, Triglycerid Carbonsäure, Amid-Derivat von einer Carbonsäure und Mischungen hiervon, besonders bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus T3-Hormon, T4-Hormon, Glukose, Cholesterin, Triglyceride aus dem Blut Milchsäure, Harnstoff und Mischungen hiervon.

Der bestimmte Analyt kann ein Analyt sein, der ein Marker für einen Zustand ist, der ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Erkrankung, Wasserverschmutzung, Lebensmittelverunreinigung, und Kombinationen hiervon.

Die Vorrichtung kann in oder an einem optischen Detektionsgerät angeordnet sein, bevorzugt in oder an einem optisches Mikroskop, wobei das optische Detektionsgerät (z.B. das optische Mikroskop) besonders bevorzugt dazu konfiguriert ist, den Reaktionsbereich der Vorrichtung optisch zu detektieren und eine qualitative und/oder quantitative Bestimmung der Konzentration des Analyts in der Probe durchzuführen.

Das optische Detektionsgerät (z.B. das optische Mikroskop) kann dazu konfi- guriert sein, qualitativ ein Vorhandensein des Analyten in der Probe zu bestimmen, wenn es im Reaktionsbereich zur Ausbildung von Gasbläschen kommt.

Das optische Detektionsgerät (z.B. das optische Mikroskop) kann dazu konfi- guriert sein, quantitativ die Konzentration des Analyten in der Probe über eine

Anzahl und ein Volumens der Gasbläschen pro Zeiteinheit zu bestimmen, insbesondere über den Zusammenhang, dass das Produkt aus Anzahl und Volumen der Gasbläschen pro Zeiteinheit direkt proportional ist zu der Konzentration des Analyts in der Probe.

Das optische Detektionsgerät kann eine Energiequelle enthalten, die dazu konfiguriert ist, die erfindungsgemäße Vorrichtung (z.B. mindestens eine Mik- ropumpe hiervon) mit Energie zu versorgen. Diese Energiequelle ist bevorzugt ausgewählt aus Energie aus einem Stromnetz, Batterie, Akkumulator, photo- voltaisches Element und Kombinationen hiervon.

Ferner wird erfindungsgemäß ein Verfahren zum Nachweis eines bestimmten Analyten in einer flüssigen Probe über enzymkatalysierte und/oder säurevermittelte Umsetzung des Analyten zu mindestens einem Gas bereitgestellt, umfassend die Schritte

a) Aufbringen einer flüssigen Probe, die möglicherweise den zu bestimmenden Analyten enthält, auf einen Aufnahmebereich einer erfindungsgemäßen Vorrichtung;

b) Optische Detektion des Reaktionsbereichs der Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zu einem Zeitpunkt, an dem die Enzym- haltige und/oder Säure-haltige flüssige Probe von der Fluidleitung zu dem Reaktionsbereich transportiert wurde; und

c) Bewertung, dass der bestimmte Analyt in der Probe vorhanden ist, wenn es im Reaktionsbereich zur Ausbildung von Gasbläschen kommt. Das Verfahren kann dadurch gekennzeichnet sein, dass die optische Aufnahme über ein optisches Detektionsgerät ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kamera, Mikroskop, Photometer, Refraktometer und Kombinationen hiervon erfolgt, bevorzugt über ein Mikroskop.

Das Verfahren kann eine quantitative Bestimmung der Konzentration des Analyts in der Probe umfassen, bevorzugt über eine Bestimmung der Anzahl und des Volumens der Gasbläschen pro Zeiteinheit, besonders bevorzugt über den Zusammenhang, dass das Produkt aus Anzahl und Volumen der Gasbläs- chen pro Zeiteinheit direkt proportional ist zu der Konzentration des Analyts in der Probe. kann die folgenden Schritte umfassen:

Aufbringen mindestens einer weiteren flüssigen Probe enthaltend eine bekannte Konzentration des zu bestimmenden Analyten auf einen Aufnahmebereich einer Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche;

Optische Detektion des Reaktionsbereichs der Vorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche zu einem Zeitpunkt, an dem an dem die Enzym-haltige und/oder Säure-haltige flüssige Probe von der Fluidleitung zu dem Reaktionsbereich transportiert wurde; und

Quantitative Bestimmung der Konzentration des Analyts in der Probe, bevorzugt über eine Bestimmung der Anzahl und des Volumens der Gasbläschen pro Zeiteinheit, besonders bevorzugt über den Zusammenhang, dass das Produkt aus Anzahl und Volumen der Gasbläschen pro Zeiteinheit direkt proportional ist zu der Konzentration des Analyts in der Probe.

Darüberhinaus wird die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur /n-wiro-Diagnose einer Krankheit vorgeschlagen, wobei die flüssige Probe be- vorzugt ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Blut, Urin, Sputum und

Mischungen hiervon. Ferner wird die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Qualitätskontrolle von Lebensmitteln, bevorzugt zur Qualitätskontrolle einer Lebensmittelflüssigkeit, besonders bevorzugt zur Qualitätskontrolle von Wein, Fruchtsäften und Kombinationen hiervon, vorgeschla- gen. Zudem wird die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur

Untersuchung einer Qualität von Wasser, bevorzugt einer Qualität von Fluss- wasser, Seewasser, Meerwasser, Trinkwasser und Kombinationen hiervon, vorgeschlagen.

Anhand der nachfolgenden Figuren und Beispiele soll der erfindungsgemäße Gegenstand näher erläutert werden, ohne diesen auf die hier dargestellten, spezifischen Ausgestaltungsformen einschränken zu wollen.

Figur 1 zeigt beispielhaft mögliche Enzyme und/oder Säuren (optional mit Oxidationsmittel) zur Umsetzung von bestimmten Analyten (Biomarkern), welche von der erfindungsgemäßen Vorrichtung enthalten sein können und in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden können. Insbesondere stellt die Figur auch die jeweiligen chemischen Reaktionen dar, welche der Gasentwicklung zu Grunde liegen.

Figur 2 zeigt beispielhaft eine mögliche erfindungsgemäße Vorrichtung 1 zum Nachweis eines bestimmten Analyten in einer flüssigen Probe 2 über enzymkatalysierte Umsetzung des Analyten zu mindestens einem Gas 7. Die Vorrichtung 1 enthält mindestens eine Fluidleitung 3, die fluidisch mit mindestens einem Aufnahmebereich 4 zur Aufnahme einer flüssigen Probe 2 (z.B. Blut) und fluidisch mit mindestens einem Enzymbereich 5 verbunden ist, wobei der Enzymbereich 5 mindestens ein bestimmtes Enzym enthält, das die Umsetzung des zu bestimmenden Analyten zu mindestens einem Gas 7 katalysiert. Ferner enthält die Vorrichtung 1 mindestens einen Reaktionsbereich 6 zur Ausbildung von Gasbläschen 7, wobei der Reaktionsbereich 6 eine fluidische Verbindung zur Fluidleitung 3 aufweist und ansonsten von einer gasdichten Wand 10 begrenzt ist. Die Vorrichtung 1 ist dadurch gekennzeichnet, dass die mindestens eine Fluidleitung 3 dazu geeignet ist, die flüssige Probe 2 vom Aufnahmebereich 4 über Kapillarkräfte zum Reaktionsbereich 6 zu transportieren, wobei hierbei das mindestens eine bestimmte Enzym vom Enzymbereich 5 zumindest teilweise mit in den Reaktionsbereich 6 transportiert wird. Bei dieser Ausgestaltungsform enthält die Vorrichtung 1 ferner zwischen dem Aufnahmebereich 4 und dem Enzymbereich 5 eine Membran 8, die zur Abtrennung biologischer Zellen geeignet ist (z.B. eine Membran zur Separation von Blutzellen von Blutplasma). Diese Membran 8 stellt sicher, dass keine biologischen Zellen über Kapillarkräfte von der Fluidleitung 3 bis zum Enzymbereich 5 gelangen. Zudem enthält diese Vorrichtung 1 noch einen Ansäuerungsbereich 9, der mindestens eine Säure (z.B. HCl) enthält und in diesem Fall mit dem Reaktionsbereich 6 zusammenfällt. Der Ansäuerungsbereich 9 stellt sicher, dass die flüssige Probe, die im Reaktions- bereich 6 Enzym enthält, angesäuert wird. Im Fall von Gasen, die sich unter Säurebildung in der flüssigen Probe lösen (z.B. Bildung von H ₂ C0 ₃ bei dem Gas

C0 ₂ ) wird durch die Ansäuerung das Gleichgewicht in Richtung Gasbildung verschoben und damit erfolgt eine stärkere (quantitative) Ausgasung von C0 ₂ . Kurz gesagt kann das Vorhandensein des Ansäuerungsbereichs 9 bei dieser Art von Gasen die Detektionssensitivität deutlich erhöhen.

Figur 3 zeigt eine Draufsicht auf eine Reaktionskammer 6 einer erfindungsgemäßen Vorrichtung. Es ist ein zeitlicher Verlauf während der Reaktion dargestellt, wobei die Gasbläschen 7 im lauf der Zeit zu größeren Gasbläschen 7 ^' anwachsen. Neben der endgültigen Volumenausdehnung der Gasbläschen 7 zu den größeren Gasbläschen 7 ^' kann auch die zeitliche Volumenzunahme vom Zustand der ursprünglichen Gasbläschen 7 bis zum Zustand der größeren Gasbläschen 7 ^' ausgenutzt werden.

Figur 4 zeigt einen Querschnitt eines Detektionsgeräts, welches dazu geeignet ist, eine optische Aufnahme des Reaktionsbereichs der erfindungsgemäßen

Vorrichtung vorzunehmen und eine quantitative Bestimmung der Konzentration des Analyts in der Probe durchzuführen und auszugeben. Die Gasbläschen 7, welche sich im Reaktionsbereich 6 der erfindungsgemäßen Vorrichtung ausbilden, werden durch elektromagnetische Strahlung 12 einer im We- sentlichen kohärenten oder nicht-kohärenten Lichtquelle 11 (z.B. eine LED, eine OLED, ein Laser und/oder eine Gasdrucklampe) vollständig beleuchtet. Ein Bildsensor 13 (z.B. in Form eines Diodenarrays), welcher sich unter dem Reaktionsbereich 6 befindet, nimmt das durch die Gasbläschen 7 erzeugte optische Bild 14 (d.h. deren charakteristisches Interferenzmuster) auf. Über ein Datenverarbeitungsprogramm kann aus diesem optischen Bild 14 das Produkt aus Anzahl und Volumen der Gasbläschen pro Zeiteinheit errechnet werden, welches direkt proportional ist zur Umsatzgeschwindigkeit und zur Konzentration des Analyten in der Probe. Zwischen dem Bildsensor und dem Reaktionsbereich kann sich ebenfalls noch eine optische Vorrichtung befinden (hier nicht dargestellt). Beispiel 1 - Grundlagen zum Verfahren zum Nachweis eines bestimmten Analyten in einer flüssigen Probe

Die maximale Umsatzgeschwindigkeit v _max einer enzymatischen Reaktion hängt ab von der Temperatur und dem pH-Wert der Lösung, in welcher die Reaktion durchgeführt wird. Für einen bestimmten, konstanten pH-Wert ist v _max abhängig von der Umgebungstemperatur der erfindungsgemäßen Vorrichtung. Ist auch die Umgebungstemperatur konstant (z.B. konstante 25 °C Raumtemperatur) so nimmt v _max einen ganz bestimmten Wert ein. In diesem Fall gilt, dass die gemessene Umsatzgeschwindigkeit v von Substrat (Analyt) abhängig ist von der Konzentration von Substrat (Analyt) in der Lösung (Mi- chaelis-Menten-Therorie). Es gilt hierbei die Gleichung v = (v _max · [Analyt]) / (k _m + [Analyt]) wobei [Analyt] die Analytkonzentration darstellt und k _m die Michaelis- Menten-Konstante des Enzyms repräsentiert.

Bei bekanntem v _max unter bestimmten Bedingungen und bekannter Michaelis- Menten-Konstante k _m kann somit über die Messung der Umsatzgeschwindigkeit des Substrats (Analyten) auf die Konzentration an Substrat (Analyt) in der flüssigen Probe rückgeschlossen werden.

Die Umsatzgeschwindigkeit ist direkt proportional zum produzierten Gasvolumen pro Zeiteinheit, also proportional zum Produkt aus Anzahl und Volumen detektierter Gasbläschen. Es gilt also der Zusammenhang v ~ [Anzahl(Gasbläschen) · Volumen(Gasbläschen)]

Viele der entstehenden Gasbläschen lösen sich schlecht in der flüssigen Probe, sodass der oben genannte Zusammenhang uneingeschränkt gilt.

Da Kohlenstoffdioxid in wässriger Lösung sehr gut löslich ist und zum Teil zu Kohlensäure dissoziiert, nutzt man die Änderung des pH-Wertes zum Umwandeln in den gasförmigen Aggregatzustand. Da die Probenkammer in alle drei Dimensionen von einer Gas undurchlässigen Schicht begrenzt wird, bilden sich Gasblasen, welche nicht aus der Probenkammer entweichen können. Die Menge und Größe der Gasblasen wird mithilfe einer optischen Methode untersucht. Die Menge und Größe der Gasblasen korreliert mit Quantität des Analyts in der Probe.

Beispiel 2 -Verfahren zum Nachweis von Harnstoff in einer flüssigen Probe

Zum Nachweis des Analyten Harnstoff enthält die erfindungsgemäße Vorrichtung das Enzym Urease in dem Enzymbereich. Wie in Figur 1 ersichtlich wird durch das Enzym Urease die Umsetzung von Harnstoff zu den beiden Gasen

Ammoniak und Kohlenstoffdioxid katalysiert.

Durch einen Ansäuerungsbereich auf der erfindungsgemäßen Vorrichtung wird sichergestellt, dass einerseits das entstehende Kohlenstoffdioxid nicht als H ₃ 0 ⁺ und HC0 ₃ ^" in Lösung geht, sondern quantitativ ausgast. Dadurch wird die

Sensitivität der Detektion der Vorrichtung für Harnstoff erhöht.

Die Ansäuerung bewirkt zudem, dass der entstehende Ammoniak bevorzugt als NH ₄ ⁺ und OH ^" in Lösung geht. Da Ammoniak aber ohnehin auch bei neutra- lern pH eine hohe Tendenz zur Lösung in wässrigen Medien aufweist wird durch die Ansäuerung das Gleichgewicht kaum in Richtung gelöstem Ammoniak verschoben. Anders ausgedrückt verringert die Ansäuerung die Produktion von Ammoniakgas kaum, sodass bezüglich der Herstellung von Ammoniakgas die Ansäuerung kaum einen negativen Einfluss auf die Detektionssensitivi- tät bewirkt.

Das Produkt aus Anzahl und Volumen (Menge) der Kohlendioxid-Gasblasen ist somit anhängig von der Harnstoffkonzentration in der eingesetzten flüssigen Probe. Die Menge an produzierten Gasblasen nimmt mit sinkender Harnstoff- konzentration ab.

Die Menge der Gasblasen kann über ein softwaregesteuertes Mikroskop aufgezeichnet werden und ausgewertet werden (z.B. bzgl. Ihrer Anzahl und ihrer geometrischen Eigenschaften).

Beispielhaft sei die Anwendung der Vorrichtung in der sog.„point of care"- Diagnostik von Harnstoff beschrieben:

Ein Tropfen Blut wird auf den mindestens einen Aufnahmebereich der Vorrichtung aufgebracht. Der Tropfen kann beispielsweise direkt von einem (frisch) punktierten Finger einer Person aufgenommen werden. Die Vorrichtung enthält in diesem Fall vorteilhafterweise eine plasmaseparierende Membran, sodass die Blutzellen zurückgehalten werden und nur Blutplasma bis zum Enzymbereich vordringen kann. Der Enzymbereich enthält vorteilhafterweise das Enzym Urease in lyophilisierter Form, da in dieser Form die Langzeitstabilität des Enzyms sehr hoch ist und dadurch auch die Vorrichtung eine lange Verwendbarkeit sicherstellt.

Das Blutplasma wird vom Aufnahmebereich über Kapillarkräfte entlang der Fluidleitung zum Enzymbereich gezogen, trifft dort auf die lyophilisierte Urease, die im Blutplasma in Lösung geht. Die Mischung aus Blutplasma und

Urease wird durch Kapillarkraft prompt über den Ansäuerungsbereich zu dem Reaktionsbereich transportiert, wo Kohlendioxid durch die Zersetzung von Harnstoff freigesetzt wird. Die Menge der gebildeten Gasbläschen wird mithil- fe einer optischen Methode (z.B. ein softwaregesteuertes Mikroskop) aufge- zeichnet, was Rückschlüsse über die Konzentration von Harnstoff in dem eingesetzten Blutstropfen erlaubt.

Beispiel 3 -Verfahren zum Nachweis von Laktat in einer flüssigen Probe Das Enzym Laktatoxidase wandelt Laktat selektiv in Pyruvat und Wasserstoffperoxid um (siehe Figur 1). In einem zweiten Schritt reagiert das Wasserstoffperoxid durch seine stark reduzierende Wirkung mit einer leicht schwefelsaurem Kaliumpermanganatlösung. Die Redoxreaktion führt zum einem zur Entfärbung der stark violett gefärbten Kaliumpermangantlösung und zum ande- ren zur Bildung von Sauerstoff (siehe Figur 1).

Für Reaktion des Wasserstoffperoxids mit der Schwefelsäuren Kaliumpermanganatlösung benötigt die Vorrichtung somit ferner einen Oxida- tionsbereich, der mindestens ein Oxidationsmittel (z.B. Mn0 ₄ durch gelöstes KMn0 ₄ ) und mindestens eine Säure (H ₃ 0 ⁺ z.B. durch gelöstes H ₂ S0 ₄ ) enthält. Das Produkt aus Anzahl und Volumen (Menge) der Sauerstoff-Gasblasen ist somit abhängig von der Laktatkonzentration in der eingesetzten flüssigen Probe. Die Menge an produzierten Gasblasen nimmt mit sinkender Laktatkonzentration ab.

Die Menge der Gasblasen kann über ein softwaregesteuertes Mikroskop aufgezeichnet werden und ausgewertet werden (z.B. bzgl. Ihrer Anzahl und ihrer geometrischen Eigenschaften).