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Title:
DEVICE AND METHOD FOR THE DETECTION OF CHARGED MACROMOLECULES
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2006/026946
Kind Code:
A1
Abstract:
The invention relates to a device for detecting charged macromolecules, comprising an ion-sensitive layer, on the surface of which a sample molecule is immobilized in order to detect a target molecule, the sample molecule and target molecules that are to be detected being able to create a specific bond. The inventive device is characterized in that the sample molecules are immobilized at a minimum distance from each other on the ion-sensitive layer such that a redistribution of the zone concentration is induced in the intermolecular interstices during bonding with the target molecule. Also disclosed is a method for detecting charged macromolecules with the aid of the inventive device.

Inventors:
Poghossian, Arshak (Liebigstrasse 4, Düsseldorf, 40479, DE)
Cherstvy, Andrey (Hohe Str. 61, Dresden, 01187, DE)
Schöning, Michael Josef (Marconistr. 2, Jülich, 52428, DE)
Ingebrandt, Sven (Koslarer Strasse 45, Aldenhoven, 52457, DE)
Keusgen, Michael (Commessmannstrasse 8, Rheinbach, 53359, DE)
Application Number:
PCT/DE2005/001423
Publication Date:
March 16, 2006
Filing Date:
August 12, 2005
Export Citation:
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Assignee:
FORSCHUNGSZENTRUM JÜLICH GMBH (Wilhelm-Johnen-Strasse, Jülich, 52425, DE)
Poghossian, Arshak (Liebigstrasse 4, Düsseldorf, 40479, DE)
Cherstvy, Andrey (Hohe Str. 61, Dresden, 01187, DE)
Schöning, Michael Josef (Marconistr. 2, Jülich, 52428, DE)
Ingebrandt, Sven (Koslarer Strasse 45, Aldenhoven, 52457, DE)
Keusgen, Michael (Commessmannstrasse 8, Rheinbach, 53359, DE)
International Classes:
C12Q1/68; G01N27/333
Domestic Patent References:
WO1999051330A1
Foreign References:
US20040035699A1
Other References:
POGHOSSIAN A ET AL: "Possibilities and limitations of label-free detection of DNA hybridization with field-effect-based devices" SENS ACTUATORS, B CHEM; SENSORS AND ACTUATORS, B: CHEMICAL NOV 11 2005, Bd. 111-112, Nr. SUPPL., 30. April 2005 (2005-04-30), Seiten 470-480, XP002355261
Attorney, Agent or Firm:
FORSCHUNGSZENTRUM JÜLICH GMBH (Fachbereich Patente, Jülich, 52425, DE)
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Claims:
P a t e n t a n s p r ü c h e
1. Vorrichtung zum Nachweis von Makromolekülen, umfassend einen ionensensitiven Sensor mit einer ionensensitiven Schicht, an deren Oberfläche Pro¬ benmoleküle immobilisiert sind, welche mit nachzu weisenden TargetMolekülen eine spezifische Bindung einzugehen vermögen, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenmoleküle derart in einem Mindestabstand voneinander auf der ionensensitiven Schicht immobi lisiert angeordnet sind, dass während der Bindung mit den TargetMolekülen eine Umverteilung der Io¬ nen in den intermolekularen Zwischenräumen der Pro¬ benmoleküle induziert wird.
2. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü che, dadurch gekennzeichnet, dass als Probenmolekül ein Molekül mindestens einer Nuk leinsäuresorte auf der ionensensitiven Schicht im¬ mobilisiert angeordnet ist.
3. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenmoleküle in einem MitteMitteAbstand voneinander zwischen 2,5 bis 11 Nanometer immobili siert angeordnet sind.
4. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, dadurch gekennzeichnet, dass die ionensensitive Schicht eine Ionenaustauscher¬ membran, eine Neutralcarriermembran, eine geladene Carriermembran, eine polymerbasierte Membran, eine auf der Ionenkoextraktion basierende Membran, eine Festkörpermembran und/oder eine Glasmembranen um fasst .
5. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, dadurch gekennzeichnet, dass die ionensensitive Schicht eine anorganische Schicht umfasst, deren Oberfläche mittels Ionen¬ implantation, Ionenindiffusion oder ionenkomplexie renden Molekülen modifiziert ist.
6. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, dadurch gekennzeichnet, dass die ionensensitive Schicht Oberflächengruppen so¬ wohl für Interaktion mit Ionen in einer Analytlö sung als auch zur Immobilisierung der Probenmolekü¬ le aufweist.
7. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, dadurch gekennzeichnet, dass . die ionensensitive Schicht empfindlich gegenüber eines mixedInterfacePotentials ist.
8. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenmoleküle mittels BiotinAvidin Komplexierung auf der ionensensitiven Schicht immo¬ bilisiert angeordnet sind.
9. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü che, dadurch gekennzeichnet, dass die Probenmoleküle direkt auf der ionensensitiven Schicht synthetisch hergestellt sind.
10. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü che, dadurch gekennzeichnet, dass der ionensensitive Sensor ein halbleiterbasierter kapazitiver Feldeffektsensor (EIS, EMIS) ist.
11. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü che, dadurch gekennzeichnet, dass der ionensensitive Sensor ein halbleiterbasierter LAPSSensor ist.
12. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü che, dadurch gekennzeichnet, dass der ionensensitive Sensor ein halbleiterbasierter Feldeffekttransistor ist.
13. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü che, gekennzeichnet durch eine Referenzelektrode oder ein Referenzelement .
14. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, dadurch gekennzeichnet, dass die Referenzelektrode bzw. das Referenzelement auf dem ionensensitiven Sensor integriert ist .
15. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, dadurch gekennzeichnet, dass der Gateisolator eine ionensensitive Schicht bil det.
16. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, dadurch gekennzeichnet, dass der ionensensitive Sensor ein konduktometrischer oder impedimetrischer Sensor ist.
17. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung einen zweiten ionensensitiven Sen sor mit immobilisierten Probenmolekülen aufweist, die nicht komplementär zu den nachzuweisenden Tar¬ getMolekülen sind.
18. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, gekennzeichnet durch einen kationen und einen anionensensitiven Sensor.
19. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, gekennzeichnet durch ein Edelmetall als Pseudoreferenzelektrode.
20. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, dadurch gekennzeichnet, dass diese eine Messelektronik zur Erfassung des Sensor¬ signals umfasst .
21. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, dadurch gekennzeichnet, dass diese eine Differenzanordnung umfasst .
22. Vorrichtung nach einem der vorhergehenden Ansprü¬ che, mit einem Array von Vorrichtungen nach einem der Ansprüche 1 bis 21.
23. Verfahren zum Nachweis der Bindung geladener Makromoleküle, mit einer durch eine Bindung induzierten Umvertei¬ lung der Ionen in den intermolekularen Zwischenräu men und/oder einer Änderung der Ionenempfindlich¬ keit einer ionensensitiven Schicht.
24. Verfahren nach vorhergehendem Anspruch 23, dadurch gekennzeichnet, dass das Messsignal zunächst in einer Lösung ohne Tar getMoleküle und danach in einer Lösung, die die nachzuweisenden TargetMoleküle enthält, erfasst wird.
25. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 23 oder 24, dadurch gekennzeichnet, dass für die Bindung die Vorrichtung in eine Analytlö sung mit einer beliebigen Ionenstärke, vorzugsweise im Bereich zwischen 5 rnM und 0,5 M getaucht wird.
26. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche 23 bis 25, dadurch gekennzeichnet, dass die Bindung von Probenmolekül und TargetMolekül zu einem nachweisbaren Messsignal führt, welches mit dem Grad der Bindung korreliert.
Description:
B e s c h r e i b u n g

Vorrichtung und Verfahren zum Nachweis von geladenen Makromolekülen

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung und ein Verfah- ren zum Nachweis von geladenen Makromolekülen.

DNA-Mikroarrays, auch DNA-Chips genannt, sind für den Einsatz in der Gen und Medizintechnik vor dem Hinter¬ grund einer parallelen Analyse von Nukleinsäuren- Sequenzen bedeutsam.

DNA-Chips bestehen typischerweise aus einem Glas- oder Siliziumsubstrat mit einem Array von Mikrospots für das eigentliche Bindungs- oder Hybridisierungsexperiment . Dabei hybridisieren zwei komplementäre Einzelstränge (ssDNA) zu einem doppelsträngigen Molekül (dsDNA) . Jeder Mikrospot weist einzelsträngig vorliegende DNA- Proben auf, die mit komplementären Target-Molekülen aus einer zu untersuchenden Analytlösung binden bzw. hybridisieren. Die DNA-Hybridisierung ist hochselektiv. Es können nur komplementäre Sequenzen der DNA effizient miteinander hybridisieren. DNA-Chips ermöglichen den simultanen Nachweis von verschiedensten Target-Mole¬ külen oder DNA-Fragmenten. Der Nachweis ist auch in komplexen Lösungsgemischen möglich.

Aus DE 10048997 Al ist eine feldeffektbasierende kapa- zitive Vorrichtung zum Nachweis geladener Makromolekü¬ le, insbesondere von Polynukleotidsequenzen, in einer elektrisch leitfähigen Lösung bekannt. Das angegebene Verfahren beruht darauf, dass viele Makromoleküle in Lösung in dissoziierter Form vorliegen und teilweise eine hohe Ladung tragen. Beim Nachweis der in der Probelösung dissoziierten Target-Makromoleküle mit an einer Gate-Isolatoroberflache fixierten DNA-Probe kann eine Anreicherung von Ladungen an der Isolatoroberflä¬ che stattfinden. Diese Anreicherung führt zu einer Verschiebung von Ladungsträgern im Halbleiter bzw. zu einer Verschiebung der C/V-Kennlinie (Kapazität/Span- nung) und damit zu einer Veränderung der Kapazität des aus dem System Halbleiter/Isolator/Probelösung/Metall (als Referenzelektrode) bestehenden Kondensators, wel¬ che erfasst werden kann.

Aus US 2003/0152929 Al ist zur Bestimmung unbekannter DNA ein Floating-gate-Feldeffekttransistor bekannt. Die Anordnung beinhaltet unterschiedliche Detektionsspots, wobei jeder aus einem PoIy-Si Floating-gate-Feldeffekt¬ transistor besteht. Bei einem Hybridisierungsereignis zwischen der bekannten DNA-Probe auf dem Gate des Transistors und der unbekannten, zu untersuchenden Target-DNA in der Analytlösung, erhöht sich die negati¬ ve Ladung auf dem Gate des Transistors. Dies hat eine nachweisbare Änderung des Drainstroms zur Folge.

Aus US 6482639 B2 ist ein Sensor auf Basis eines Verar- mungstyp-FET zur markierungsfreien, quantitativen De- tektion von ungeladenen und geladenen Target-Molekülen bekannt. Dabei fließt bereits bei einer Gatespannung von 0 V ein Drainstrom. Die DNA-Probe wird auf einer Au-Floating-gate-Elektrode immobilisiert, die wiederum auf einem SiO2-Si3N4 Gateisolator angeordnet ist. Der Sensor reagiert auf das Hybridisierungsereignis mit einer Änderung des Drainstromes des FET.

Eine Stromänderung wird durch eine Verdrängung des Elektrolyts auf Grund der Bindung zwischen Target-DNA und DNA-Probe induziert. Dies führt zu einer Änderung in der effektiven Schichtdicke des Gateisolators und damit zu einer Änderung der Kapazität. Die Stromände¬ rung wird auch durch die Anreicherung von. geladenen Molekülen auf dem Gate induziert, wodurch es zu einer Änderung in der SchwellSpannung des Transistors kommt.

Nachteilig wurden mit den oben beschriebenen feldef- fektbasierten Sensoren nur geringe Signalamplituden erreicht, da ein sogenannter Counter-ion-Screening- Effekt auftritt, bei dem die negative Ladung der DNA in Lösung durch positiv geladene Gegenionen abgeschirmt wird. Weitere Defizite sind die hohe Drift der Senso¬ ren, die Instabilität und die schlechte Reproduzierbar¬ keit der Sensorbauelemente, verursacht durch z. B. floating Gate, fehlende bzw. unzureichend realisierte Referenzelektrode und extrem dünne Gateisolatormateria¬ lien.

Das Prinzip der vorgestellten feldeffektbasierten Sensoren setzt voraus, dass während des Hybridi- sierungsereignisses die Ladung des Target-Moleküls die Ladung im Gatebereich des Sensors ändert . Eine gleich große aber entgegengesetzte Ladungsänderung wird im Halbleiter induziert, was sich in einer Änderung des Operationsverhaltens des Bauelementes bemerkbar macht (Änderung der Kapazität, Flachbandspannung, Schwell- Spannung, Leitfähigkeit im Kanal, Strom) . Tatsächlich können aber die elektrische Ladung von immobilisierten Proben- bzw. Target-Moleküle durch kleine Gegenionen in der Analytlösung mehr oder weniger vollständig abge- schirmt bzw. neutralisiert werden. Dies wiederum mas¬ kiert bzw. reduziert das in dem DNA-Hybridisierungs- experiment mögliche Messsignal . Im ungünstigsten Falle resultiert somit eine Nettoladung gleich Null, das heißt der sich unterhalb der DNA-Schicht befindliche Feldeffektsensor kann trotz des Hybridisierungser- eignisses kein Messsignal empfangen. Deshalb ist eine direkte Messung von Ladungen der geladenen Makromolekü¬ le in Lösungen mit hohen Ionenkonzentrationen, z. B. in physiologischen Lösungen, mittels den aus dem Stand der Technik vorgestellten feldeffektbasierten Sensoren ineffizient.

Um die Counter-ion-screening-Effekte zu reduzieren und ein ausreichend hohes Messsignal zu erzielen, muss mit den vorgestellten Sensoren in Analytlösungen mit niedriger Ionenkonzentration von wenigen milimol (mM) gearbeitet werden. Nachteilig sind in diesem Fall dann allerdings eine reduzierte Hybridisierungswahrschein- lichkeit sowie eine längere Hybridisierungsdauer.

Weiterhin nachteilig ist, dass eine Oberflachen-Inter- aktion während des Hybridisierungsereignisses nur zwischen immobilisierten DNA-Probenmolekülen und ihren komplementären Target-Molekülen stattfinden soll. Es darf keine Interaktionen zwischen kleinen Ionen in der Analytlösung und der Gateoberfläche auftreten. Um dies zu erreichen, muss die immobilisierte DNA-Probe als dichte und geschlossene Monoschicht ohne Poren und Löcher gebildet werden, was faktisch nicht realisierbar ist. Ein Eindringen kleiner anorganischer Ionen und Wassermoleküle zur Gateschicht ist nachteilig möglich. Weil diese Gateschichten üblicherweise in Form von SiO2, silanisiertem SiO2, Si3N4, Au oder ähnlichen Materialien elektroaktive oder chemosensitive Eigen¬ schaften, z. B. pH-, Ionen- und/oder Redoxsensitivität, aufweisen können, kann die Wechselwirkung zwischen kleinen Ionen aus der Analytlösung und Gateoberfläche zur Maskierung, Reduzierung und sogar Verfälschung des von nachzuweisenden Makromolekülen induzierten Signals führen. Diese Phänomene sowie mögliche Ladungsumvertei- lungseffekte (durch „Counter-ion-screening"-Effekte verursacht) am Interface zwischen Gateschicht und Analytlösung werden bei den oben beschriebenen Arbeiten nicht berücksichtigt.

Aufgabe der Erfindung ist es daher, eine Vorrichtung und ein Verfahren zum markierungsfreien Nachweis ge- ladener Makromoleküle bereit zu stellen, welches die im Stand der Technik aufgezeigten Mängel nicht aufweist.

Die Aufgabe wird durch eine Vorrichtung gemäß Hauptan¬ spruch und durch ein Verfahren gemäß Nebenanspruch gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen ergeben sich aus den darauf jeweils rückbezogenen Patentansprüchen.

Die Vorrichtung umfasst einen ionensensitiven Sensor, mit einer ionensensitiven Schicht. An der Oberfläche der ionensensitiven Schicht sind Probenmoleküle zum Nachweis von Targetmolekülen immobilisiert. Beide Molekültypen gehen unter geeigneten Bedingungen eine spezifische Bindung miteinander ein. Erfindungsgemäß sind die Probenmoleküle auf der Ober¬ fläche der ionensensitiven Schicht in einem Mindestab- stand zueinander immobilisiert. Der Mindestabstand wird so bemessen, dass je nach Größe von Probenmolekül und Target-Molekül sowie nach den sterischen Gegebenheiten an der Oberfläche der ionensensitiven Schicht bei der Bindung der Moleküle eine Umverteilung von Ionen und damit eine Änderung der Ionenkonzentration in den intermolekularen Zwischenräumen induziert wird. Diese Änderung der Ionenkonzentration und/oder der Ionenem¬ pfindlichkeit der ionensensitiven Schicht dient als Grundlage für das Messsignal.

Auf der ionensensitiven Schicht sind die Probenmoleküle in einem Interprobe-Abstand voneinander immobilisiert. Diese binden mit den nachzuweisenden komplementären Target-Molekülen in der Analytlösung. Die Vorrichtung erfasst das Bindungsereignis mittels Detektion der Umverteilung von Ionen in den intermolekularen Zwi¬ schenräumen und/oder der Änderung der Ionenempfindlich¬ keit der ionensensitiven Schicht.

Es wurde im Rahmen der Erfindung erkannt, dass die Bindung auf der ionensensitiven Schicht zu einer Änderung im Potential am Interface von ionensensitiver Schicht zur Analytlösung in den intermolekularen Zwischenräumen der Probenmoleküle führt . Die Änderung der Leitfähigkeit bzw. der Impedanz der ionensensitiven Schicht wird von dem ionensensitiven Sensor erfasst. Der ionensensitive Sensor wird als Transducer zum Nachweis der Bindung von geladenen Makromolekülen verwendet .

Die Vorrichtung ist insbesondere zum Nachweis einer Hybridisierung zwischen Nukleinsäuren geeignet. In diesem Fall, sind Probenmolekül und Target-Molekül zueinander komplementäre Nukleinsäuren, wie z. B. RNA oder DNA.

Es kann als Probenmolekül vorteilhaft mindestens eine Nukleinsäuresorte auf der ionensensitiven Schicht immobilisiert sein. Es können auch verschiedene Sorten Nukleinsäuren auf der Oberfläche immobilisiert sein. Die einzelsträngigen, immobilisierten ssDNA Nukleinsäu¬ ren hybridisieren mit ihren komplementären Nukleinsäu- ren zu doppelsträngiger dsDNA.

Durch die Immobilisierung der Probenmoleküle ist vorteilhaft gewährleistet, dass die Anzahl an ssDNA- Probenmolekülen, die für die Immobilisierung benötigt werden, reduziert werden kann, da für die Aufnahme des Messsignals keine dicht gepackte Schicht erforderlich ist. Dadurch lässt sich die Immobilisierungsdauer reduzieren. Der mittlere Abstand zwischen den einzelnen Probenmolekülen kann vorzugsweise im Bereich zwischen 2,5 nm und 11 nm liegen, was einer Moleküldichte von etwa 2,OxIO13 Molekülen/cm2 bis 1,OxIO12 Molekülen/cm2 entspricht. Im Speziellen können die Werte auf Bereiche zwischen 3,5 nm und 6 nm eingegrenzt werden, was einer Probendichte von zwischen 1,OxIO13 Molekülen/cm2 und 3,5xlO12 Molekülen/cm2 entspricht. Die ionensensitive Schicht ermöglicht eine spezifische Wechselwirkung mit dem entsprechenden Ion (z. B. Natrium, Kalium) in der Analytlösung. Eine besonders vorteilhafte Eigenschaft der ionensensitiven Schicht beruht darauf, dass diese aktive Bindungsstellen für die reversible Wechselwirkung mit Ionen der Analytlö¬ sung aufweist, z. B. eine Ionenbindung, einen Ionenaus¬ tausch oder eine Ionenextraktion. Als ionensensitive Schicht können sowohl kationen- als auch anionenselek- tive Membranen verwendet werden.

Die ionensensitive Schicht kann z. B. eine Ionenaustau¬ schermembran, neutrale Carriermembran, geladene Car- riermembran, polymerbasierte Membran, Festkörpermembran oder Glasmembran umfassen. Darüber hinaus können auch Membranen, basierend auf der reversiblen Ionenkoextrak- tion, als ionenselektive Schichten fungieren. Es ist denkbar, die ionenselektive Schicht aus anorganischen Schichten aufzubauen, die mittels Ionenimplantation (z. B. SiO2- oder Si3N4-Schicht, implantiert mit verschiede- nen chemischen Elementen, wie B, Al, Ga, In, oder Tl) , Ionendiffusion (z. B. Diffusion von F~-Ionen in SiO2) , oder mit ionenkomplexierenden Molekülen modifiziert wurde. Abhängig von der zu untersuchenden Analytlösung, kann der Gateisolator eines Feldeffektsensors direkt als ionensensitive Schicht fungieren.

Die ionensensitive Schicht kann Bindungsplätze auf der Oberfläche zur Immobilisierung der Probenmoleküle und Oberflächengruppen für Interaktionen mit Ionen aus der Analytlösung aufweisen. Weiterhin können dünne Polymerfilme mit wenig oberflä¬ chenaktiven Gruppen, wie z.B. Teflon, Parylene und Materialien, die empfindlich gegenüber einem so genann¬ ten mixed Interfacepotential reagieren, eingesetzt werden.

Die ionensensitive Schicht kann in einer weiteren Ausgestaltung der Erfindung auch aus einem Material bestehen, das einen pHpzc (point of zero Charge) be¬ sitzt, der größer als der pHs der Analytlösung ist, die für die Immobilisierung und/oder die Bindung benutzt wird. Für pHpzc>pHs, ist die Oberfläche der ionensensi¬ tiven Schicht positiv geladen und ermöglicht so eine schnelle Immobilisierung und/oder Hybridisierung der negativ geladenen DNA-Moleküle.

Als ionensensitiver Sensor kann sowohl ein kationen- als auch anionensensitiver Sensor verwendet werden. Der ionensensitive Sensor kann einen feldeffektbasierenden Halbleitersensor beinhalten, z. B. einen kapazitiven EIS- (electrolyte-insulator-semiconductor) oder EMIS- (electrolyte-membrane-insulator-semiconductor) Sensor, FET-Strukturen (field-effect-transistor) wie ISFET (ion-sensitive field-effect transistor) bzw. CHEMFET (chemically-sensitive field-effect transistor) , Dünn¬ film-Transistoren, organische FETs oder einen LAPS (light-addressable Potentiometrie sensor) .

Für einen stabilen Funktionsbetrieb enthält die Vor¬ richtung vorzugsweise eine Referenzelektrode bzw. ein Referenzelement, z. B. aus Ag/AgCl . Die Referenzelekt- rode bzw. das Referenzelement kann vorteilhaft auf dem ionensensitiven Sensor integriert sein.

Alternativ können konduktometrische bzw. impedimetri- sche Transducerprinzipien verwenden werden. Solche Sensoren basieren auf ionenkonzentrationsabhängigen Veränderungen in der Leitfähigkeit oder Impedanz der ionensensitiven Schicht und benötigen kein Referenzele¬ ment. Ein konduktometrischer bzw. impedimetrischer ionensensitiver Sensor weist Interdigitalelektroden auf.

Das Bindungs- bzw. Hybridisierungsereignis zwischen Proben- und Target-Molekülen generiert ein elektrisches Signal in der Messanordnung, wobei die Signalamplitude mit dem Grad der Wechselwirkung zwischen Proben- und Target-Molekül korreliert. Als Messgröße wird die Kapa¬ zitäts- oder Spannungsänderung einer EIS- und/oder EMIS-Struktur, der Photostrom beim LAPS oder die Änderung der Kanalleitfähigkeit bzw. des Stroms oder der Gatespannung beim FET dienen. Alternativ können die hybridisierten Moleküle auf Grund einer Änderung der Leitfähigkeit bzw. Impedanz bei einem auf dem kondukto- metrischen und/oder impedimetrischen Transducerprinzip basierenden Sensor, erfasst werden.

Die Vorrichtung kann einen kationensensitiven und einen anionensensitiven Sensor umfassen. Hierdurch wird vor¬ teilhaft bewirkt, dass die Empfindlichkeit der Vorrich¬ tung erhöht wird. Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist zum markierungs- freien simultanen Nachweis der Hybridisierung verschie¬ dener Target-Moleküle geeignet, sofern mehrere der vorab beschriebenen Vorrichtungen zu einem Array zusammengefasst werden. Mittels der Vorrichtung kann die Sequenz verschiedener Target-Moleküle bestimmt werden.

Die verwendeten Probenmoleküle können biologische oder synthetisch hergestellte Moleküle sein, die eine spezifische Affinität besitzen, um die Bindung, z. B. eine Hybridisierung mit den Target-Molekülen effizient durchführen zu können. Bevorzugt kommen hierfür ssDNA- Moleküle, Einzelstrang-RNA-Moleküle, Oligonukleotide und andere geladene Makromoleküle in Frage.

Die Probenmoleküle können direkt auf der ionensensiti¬ ven Schicht immobilisiert werden oder unter Zuhilfenah¬ me von Primern. Die Immobilisierung kann z. B. mittels Adsorption, Biotin-Avidin-Komplexierung oder Linkermo¬ leküle erfolgen. Die Probenmoleküle können auch direkt in der ionensensitiven Schicht synthetisiert vorliegen.

Als Target-Moleküle können ssDNA-Moleküle, Einzel¬ strang-RNA-Moleküle, Oligonukleotide und andere gelade¬ ne Makromoleküle, die komplementär zu den jeweiligen Probenmolekülen sind, verwendet werden.

Um Störgrößen auszublenden, kann die Vorrichtung als Differenzanordnung angeordnet sein. Störgrößen sind Änderungen des pH-Wertes und/oder der BuIk-Ionenkon¬ zentration im Analyten, der Temperatur, des Potentials der Referenzelektrode, und Effekte verursacht durch nichtspezifische Adsorption von Makromolekülen. Die Differenzanordnung weist einen zweiten ionensensitiven Sensor mit immobilisierten Probenmolekülen auf, welche sich nicht komplementär zu den nachzuweisenden Target- Molekülen verhalten. Die Amplitude des Differenzsignals zwischen beiden Sensoren dient als Messsignal für das Hybridisierungsereignis. Weiterhin ermöglicht die Differenzanordnung die Verringerung von Störgrößen im Sensorsignal, die durch nichtspezifische Adsorption von nicht-komplemetären Molekülen verursacht werden.

Zusätzlich kann ein Edelmetall als Pseudo-Referenz- elektrode benutzt werden. Pt oder Au sind als Materia¬ lien für die Pseudoreferenz denkbar.

Die Vorrichtung gemäß der Erfindung kann einen Array- aufbau aus mehreren ionensensitiven Sensoren umfassen, bei dem auf der ionensensitiven Schicht jedes ionensen¬ sitiven Sensors des Arrays ssDNA-Probenmoleküle be¬ stimmter Sequenz immobilisiert sind, um die jeweiligen Target-Moleküle in komplexen Analytlösungen zu binden. Da die DNA-Hybridisierung hochselektiv ist, können nur komplementäre Sequenzen der DNA effizient miteinander hybridisieren. Dadurch kann die Sequenz der Nukleotid- Basen innerhalb des Target-DNA-Fragmentes bestimmt werden. Ein solches Array ermöglicht den simultanen Nachweis verschiedenster Target-Moleküle oder DNA- Fragmente selbst in komplexen Analytlösungen.

Das Verfahren zum Nachweis der Bindung geladener Makromoleküle sieht vor, dass eine durch die Bindung induzierte Umverteilung der Ionen in den intermolekula- ren Zwischenräumen und/oder eine Änderung der Ionen¬ empfindlichkeit der ionensensitiven Schicht nachgewie¬ sen wird. Diese dient insbesondere zum Nachweis einer Hybridisie- rung zwischen Probenmolekülen und Target-Molekülen.

Vorteilhaft wird das Messsignal zunächst in einer Lösung ohne Target-Moleküle und danach in einer Lösung, die die nachzuweisenden Target-Moleküle enthält, erfasst, um die Kalibrierung durchzuführen.

Die Größe einer durch die Hybridisierung verursachten Änderung des Messsignals korreliert mit dem Grad der Wechselwirkung zwischen Target- und Probenmolekülen. Es wird auf diese Weise ein Differenzsignal generiert. Die Größe des resultierenden Differenzsignals korre- liert direkt mit dem Grad der molekularen Interaktion. Das gemessene Sensorsignal kann eine Kapazität, ein Strom, ein Photostrom, eine Spannung, eine Leitfähig¬ keit oder eine Impedanz sein.

Das Verfahren wird vorzugsweise derartig ausgeführt, dass die Vorrichtung zur Bindung zwischen Probenmolekü¬ le Target-Molekülen in die Analytlösung getaucht wird. Die Analytlösung weist hierzu eine beliebige Ionenstär¬ ke auf, vorzugsweise in einem Bereich zwischen 5 mM und 0,5 M.

Die Größe der durch die Bindung bzw. Hybridisierung verursachten Änderung des Messsignals korreliert mit dem Grad der Wechselwirkung zwischen Target- und Probenmolekül. Abhängig vom Typ des ionensensitiven Sensors kann das erzielte Messsignal eine Änderung, z. B. in der Kapazität, des Stroms, des Photostroms, der Spannung, der Leitfähigkeit oder der Impedanz sein. Das Hybridisierungsereignis kann in einer Analytlösung mit niedrigen bis hohen Ionenkonzentrationen von weniger als 1 mM bis mehr als 1 M, vorzugsweise im Bereich von 5 mM bis 0,5 M, durchgeführt werden.

Das Verfahren kann eine Differenzanordnung aus einem ionensensitiven Sensor mit immobilisierten Probenmole¬ külen, die zu den nachzuweisenden Target-Molekülen komplementär sind, und einem ionensensitiven Referenz- sensor mit immobilisierten Probenmolekülen, die zu den nachzuweisenden Target-Molekülen nicht komplementär sind, umfassen. Der Sensor mit hybridisierten DNA- Molekülen weist ein Messsignal auf, das sich anders verhält als bei Sensoren, die kein Hybridisierungs- ereignis zur Folge gehabt haben. Das Verfahren basiert auf der Erfassung des durch die Hybridisierung verur¬ sachten Differenzsignals, wobei die Größe des resultie¬ renden Differenzsignals direkt mit dem Grad der moleku¬ laren Interaktion korreliert.

Das Verfahren weist vorteilhaft eine erhöhte Empfind¬ lichkeit auf und kann sowohl in Analytlösungen niedri¬ ger und hoher Ionenstärke eingesetzt werden. Weiterhin vorteilhaft ist, dass die ionensensitive Schicht keine dicht gepackte Monoschicht an Probenmolekülen (z. B. ssDNA) an der Oberfläche aufweisen muss. Sie funktio¬ niert deshalb mit weniger dichten und/oder porösen Schichten immobilisierter Probenmoleküle und kann für eine kontinuierliche Messung der Bindung in der Real¬ zeit-Analyse eingesetzt werden. Das Verfahren kann zum quantitativen und qualitativen Nachweis geladener Makromoleküle verwendet werden.

Im Weiteren wird die Erfindung an Hand eines Ausfüh¬ rungsbeispiels und der beigefügten Figur näher be- schrieben.

Es zeigt Fig. 1 schematisch einen Querschnitt durch die erfindungsgemäße Vorrichtung.

Fig. 2 zeigt ermittelte Kurven zum Verhältnis der mittleren Kationen- und Anionenkonzentration in den intermolekularen Zwischenräumen vor und nach der Hybridisierung.

Die Vorrichtung umfasst einen ionensensitiven Sensor 1 mit einer ionensensitiven Schicht 2 auf einem Substrat (Fig. 1) . Die Oberfläche ist mit ssDNA-Probenmolekülen 3 belegt. Der Einfachheit halber sind die ssDNA-Mole- küle als stäbchenförmige Moleküle, die senkrecht zur Oberfläche orientiert sind, dargestellt. Üblicherweise sind ssDNA-Moleküle sehr flexible Moleküle, deren Orientierung zur Oberfläche unter anderem von der Immobilisierungsmethode, der Länge der Moleküle und der Oberflächen-Ladung abhängt. Die Moleküle können senk¬ recht angeordnet, jedoch auch flach auf der Sensorober¬ fläche liegen, oder einen gewissen Winkel zur Oberflä¬ che aufweisen. Nach der Hybridisierung verhalten sich kurze dsDNA-Fragmente eher stäbchenförmig als spulen- förmig. Auf der Sensoroberfläche sind die ssDNA-Probenmoleküle so arrangiert, dass sie mit einem mittleren Mitte- Mitte-Intermolekular-Abstand as voneinander getrennt sind. Die Zwischenräume 4 zwischen den einzelnen ssDNA- Molekülen sind mit Analytlösung gefüllt, so dass die unbedeckte Oberfläche 5 der ionensensitiven Schicht 2 in unmittelbarem Kontakt mit der Analytlösung steht.

Die mittleren Abstände zwischen den einzelnen DNA- Strängen liegen im Bereich zwischen 2,5 nm und 11 nm, was einer Moleküldichte von etwa 2,OxIO13 Molekülen/cm2 bis 1,OxIO12 Molekülen/cm2 entspricht.

Grundsätzlich erfasst der ionensensitive Sensor 1 die Änderung in der Zusammensetzung des Elektrolyten, das heißt die Konzentration oder Aktivität von Ionen mittels der Messung z. B. des Grenzflächenpotentials am Interface zwischen Analytlösung und ionensensitiver Schicht 2 oder der Leitfähigkeit der ionensensitiven Schicht .

In Abwesenheit immobilisierter Probenmoleküle bildet sich zunächst eine elektrochemische Doppelschicht senkrecht zur Oberfläche der ionensensitiven Schicht aus (nicht dargestellt) . Diese Situation ändert sich signifikant nach der Immobilisierung bzw. Hybridisie¬ rung von geladenen Makromolekülen. Da die ssDNA- und dsDNA-Moleküle in einem weiten pH-Bereich (pH 4 bis pH 11) negativ geladen sind, werden diese negativ gelade¬ nen Makromoleküle positiv geladene Gegenionen ein¬ schließlich Protonen anziehen, bzw. die Co-Ionen abstoßen. Als Resultat wird die DNA-Ladung von kleinen Gegenionen effektiv kompensiert oder neutralisiert. Dieser Vorgang wird als Gegenionen-Screening oder Gegenionen-Kondensationseffekt bezeichnet .

Dies führt zu einer lokalen Umverteilung der Ionen in den intermolekularen Zwischenräumen, das heißt zu einer Zunahme der Kationen- bzw. Abnahme der Anionenkonzen- tration, die von der Ionenkonzentration im BuIk- Elektrolyten abweicht .

Für Sensoranwendungen ist der Grad der durch eine Hybridisierung verursachten Änderung von der mittleren Ionenkonzentration in den intermolekularen Zwischenräu¬ men von großem Interesse.

Fig. 2 zeigt das Verhältnis (<nds>/<nss>) der mittleren Kationen- and Anionenkonzentration in den intermoleku- laren Zwischenräumen nach <ndS> und vor der Hybridisie¬ rung <nss> als Funktion des Mitte-Mitte-Intermolecular- Abstand as zwischen den immobilisierten ssDNA-Proben- molekülen und in 1:1 Salzlösungen mit unterschiedlichen BuIk-Ionenkonzentrationen von no=O,OO5, 0,05, 0,15 (physiologische Lösung) und 0,5 M. Die Berechnungen wurden unter Zuhilfenahme eines elektrostatischen Modells des Gegenionen-Kondensationseffekts durchge¬ führt. Dabei bilden die ssDNA und dsDNA ein Gitter mit einheitlich negativ geladenen, unendlich langen Zylin- dern mit einem Radius Nanome- ter. Der Gitterradius ist gleich Rs=as/2. Die Zylinder sind senkrecht zur Oberfläche orientiert mit einem Mitte-Mitte-Intermolekular-Abstand as von -2,5 nm bis zu etwa -10 nm, was einer Dichte der ssDNA-Proben- moleküle von etwa 2,OxIO13 Molekülen/cm2 bis zu l,3xlθ12 Molekülen/cm2 entspricht. Der Anteil der ssDNA- und dsDNA-Ladungen, die von angelagerten, kondensierten Kationen kompensiert wird, beträgt θ=0,7, was in guter Näherung einer 1:1 Salzlösung entspricht.

Die mittlere Ionenkonzentration in den intermolekularen Zwischenräumen nach der Hybridisierung unterscheidet sich von derjenigen, vor der Hybridisierung so stark, dass ein genügendes Sensorsignal sogar in Lösungen mit hoher Ionenstärke (0,5 M) nachgewiesen werden kann. Bei hoher Ionenstärke ist die Hybridisierung schneller und die Hybridisierungseffizienz ist hoch. Die durch die DNA-Hybridisierung induzierte Umverteilung der Ionen¬ konzentration kann qualitativ und quantitativ erfasst werden. Bei einer hohen Dichte von immobilisierter ssDNA von ca. 2xlO13 Molekülen/cm2 (as=2Rs~2,5 nm) , und unter der Annahme von 100% Hybridisierungseffizienz, ist abhängig von der Ionenstärke in der Analytlösung, die mittlere Ionenkonzentration in den intermolekularen Zwischenräumen nach der Hybridisierung ca. 3-4 mal höher (Kationen) bzw. niedriger (Anionen) als vor der Hybridisierung. Wird ein ionensensitiver Sensor mit einer theoretischen Nernst-Empfindlichkeit von 59 mV/Dek. Für einwertige Ionen eingesetzt, dann führt die durch die Hybridisierung induzierte Ionenkonzentration- änderung zu einem Sensorsignal von etwa 28-35 mV. Mit einer Abnahme der Dichte der immobilisierten ssDNA- Moleküle, sinkt das Verhältnis <nds>/<nss>, um so mehr als dass die Ionenstärke zunimmt. Deshalb ist es für ein hohes Hybridisierungssignal bei niedriger Dichte der immobilisierten ssDNA erforderlich, Lösungen mit niedriger Ionenstärke zu verwenden. Grundsätzlich kann jedoch eine ca. 2-fache Erhöhung der Amplitude des Messsignals erzielt werden, wenn die kationen- und anionensensitiven Sensoren in einer Differenzverschal- tung angebracht sind.

Ähnliche Ionen-Umverteilungseffekte treten auch auf, wenn die ssDNA-Moleküle flach oder mit einem gewissen Winkel auf der Oberfläche der ionensensitiven Schicht liegen, sogar falls diese Moleküle mit relativ kurzen Linkermolekülen auf der Oberfläche immobilisiert sind.

Aus diesen Gründen kann in der vorliegenden Erfindung, im Gegensatz zum Stand der Technik, der Abschirmungs- bzw. Kondensationseffekt der Gegenionen genutzt werden, um ein nützliches Signal zu erhalten. Darüber hinaus kann durch die Ausbildung einer zusätzlichen DNA- induzierten Doppelschicht, die parallel zur Sensorober¬ fläche vorliegt, die effektive Dicke der elektrochemi¬ schen Doppelschicht senkrecht zur Sensoroberfläche wachsen. Dies bedeutet, dass die Vorrichtung der vorliegenden Erfindung für die Detektion des Hybridi- sierungsereignisses sogar in Analytlösungen mit hoher Ionenstärke eingesetzt werden kann.

Zusätzlich zu dem Effekt der Umverteilung der Ionenkon¬ zentration in den intermolekularen Zwischenräumen kann sich die Ionenempfindlichkeit der ionensensitiven Schicht durch die DNA-Hybridisierung induzierte Varia¬ tion der Ionenbindungs- und/oder Ionenaustauschprozesse sowie effektiven Anzahl der aktiven Oberflächengruppen der ionensensitiven Schicht ändern. Wenn die immobili- sierten ssDNA-Moleküle, z. B. bevorzugt flach auf der ionensensitiven Schicht liegen, können sie die Oberflä¬ chengruppen bedecken bzw. abschirmen oder den Potenti- albildungsprozess für kleine Ionen verändern oder auch die Erreichung von potentialbestimmenden Ionen zur Oberfläche verhindern. Infolge dessen verändert sich die effektive Anzahl der Oberflächengruppen, die für eine Interaktion (Ionenbindung, Lonenaustausch) mit kleinen Ionen zur Verfügung stehen und hiermit auch die Ionenempfindlichkeit der ionensensitiven Schicht. Im Gegensatz dazu können die während des Hybridisierungs- ereignisses gebildeten stäbchenförmigen dsDNA-Moleküle die aktiven Oberflächengruppen für Ionen-Interaktionen freigeben, was wieder in einer zusätzlichen Modulation der Ionenempfindlichkeit der ionensensitiven Schicht und zu einer Änderung des Sensorsignals führen kann. Darüber hinaus ist es damit z. B. auch möglich, zwi¬ schen match und mismatch der Interaktion zu unterschei¬ den.

Deshalb können beide Mechanismen die Umverteilung der Ionen in den intermolekularen Zwischenräumen sowie die Veränderung der Ionenempfindlichkeit der ionenselekti¬ ven Schicht zu einer Veränderung des Messsignals (z. B. elektrische Antwort) der Vorrichtung führen, deren Amplitude mit dem Grad der Wechselwirkung zwischen Target- und Probenmolekülen korreliert. Im Gegensatz zum Stand der Technik weist die Vorrichtung der vorlie¬ gende Erfindung eine erhöhte Empfindlichkeit auf, funktioniert sowohl in Lösungen mit niedriger als auch hoher Ionenkonzentration, erfordert keine dichtgepackte ssDNA-Monoschicht, kann Hybridisierungsereignisse kontinuierlich überwachen und kann für die Realzeitana¬ lyse eingesetzt werden. Zusätzlich kann dadurch auch der Immobilisierungsprozess kontinuierlich überwacht werden.

Die Amplitude des Messsignals korreliert mit dem Grad der Wechselwirkung zwischen Target- und Probenmolekül. Die Messanordnung erfasst z. B. eine durch die Hybridi¬ sierung verursachte Änderung der Kapazität, des Stroms, des Photostroms, der Spannung, der Leitfähigkeit oder der Impedanz als Messgröße.

Es ist selbstverständlich denkbar, an Stelle von DNA andere Makromoleküle zu binden und nachzuweisen, z. B. RNA.