In dem Artikel Chemo- und Biosensoren mit optischen Transdu- cern, Günter Gauglitz, TM, Technisches Messen, 62 (1995) Seiten 204 bis 212 werden optische Sensoren zur Untersuchung von chemischen oder biologischen Proben beschrieben. Es wer- den optische Meßprinzipien, wie Absorption, Fluoreszenz und Reflexion erläutert. Insbesondere werden optische Sensor- prinzipien vorgestellt, die auf Evaneszent-Feldtechniken be- ruhen, wie Oberflächen-Plasmonen-Resonanz (surface plasmon resonance, SPR) oder bei denen eine abgeschwächte Totalre- flexion (attenuated total reflectance, ATR) oder Interferenzkontrast auftritt. Weiterhin werden Reflexionsinterferenz-Verfahren vorgestellt. Zudem werden Beispiele optischer, chemischer und biochemischer Sensoren der jeweils verwendeten Methode und für entsprechende Anwendungen beschrieben.

Optische Biosensoren beruhen in der Regel darauf, daß an eine optische Meßoberfläche Partikel wie Moleküle, Bakterien, Viren und ähnliches gebunden werden. Die Bindung erfolgt in der Regel über eine Ligand-Rezeptor-Wechselwirkung, wobei die optische Schichtdicke insbesondere der Brechungsindex eines dünnen Filmes auf der Meßoberfläche verändert wird. Diese Veränderung wird über ein optisches Verfahren nachgewiesen, wobei das optische Signal der Anzahl von an der Oberfläche gebundenen Analyt-Partikeln entspricht. Auf diese Weise ist es möglich, die Assoziationsgeschwindigkeit und die Dissoziationsgeschwindigkeit, die Bindungsstärke und die Konzentration der bindenden Partner zu zeigen.

Es sind verschiedene Verfahren bekannt, eine Flüssigkeit in einem optischen Biosensor an der optischen Meßoberfläche an- zukoppeln. Ein erstes Verfahren betrifft ein Küvettensystem, in dem eine Kammer oder ein Topf verwendet wird, bei dem eine Seitenwand oder der Boden die Sensoroberfläche bildet. Ein zweites Verfahren betrifft ein Flußsystem, bei dem über Flußkanäle die Flüssigkeit an der Meßoberfläche vorbeigepumpt wird. Dabei wird häufig ein flow injection-analysis-Verfahren verwendet, und die Flüssigkeit wird häufig in einer Flüssigkeitsschleife über die Meßoberfläche geführt.

Wie vorstehend beschrieben, wird eine Oberflächen-Bindungs- reaktion als sensorische Reaktion verwendet. Dabei ist das Ausmaß der Bindung in der Nähe der Oberfläche abhängig von der Konzentration der bindenden Moleküle, die für eine Bindung innerhalb der Bindungsreichweite der funktionellen Gruppen, die auf dem Sensorsystem immobilisiert sind, zur Verfügung stehen. Haben sich aufgrund vorangegangener Bindungsereignisse Moleküle oder größere Partikel aus der Flüssigkeit bereits an die Oberfläche gebunden, tritt lokal in unmittelbarer Nähe der Oberfläche (bis 1-10 m) eine Verarmung (depletion) oder ein Konzentrationsgefälle auf, welches die weitere Messung verfälscht. Insbesondere wenn kinetische Phänomene gemessen werden sollen, werden nicht die Reaktionsgeschwindigkeiten, sondern die Diffusion oder die Massentransport limitierte Bindungskinetik ("Massentransport limitierte Diffusion ") gemessen. Folglich werden die vom Sensor gemessene kinetische Konstante und Affinität nicht die tatsächlichen Verhältnisse wiedergeben, bei denen die Bindung zwischen Molekülen, die in einer Flüssigkeit gut vermischt sind, stattfindet. Beim üblichen Mischen wie z. B. Rühren oder Mikrodurchflußsystem, liegt in der Nähe der Meßoberfläche in der Regel ein laminarer Flüssigkeitsstrom vor und aufgrund von Newton-Reibung findet keine ausreichende Durchmischung statt, um eine Verarmung zu vermeiden. Die Messung ist auf Massentransportkinetik beschränkt.

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung und ein Verfahren bereitzustellen, mit dem Ab- stände zwischen einem Objekt und der Meßoberfläche bestimmbar sind und ein Nanodosiersystemsystem bereitzustellen, bei dem die Bildung von Verarmungszonen vermieden wird.

Diese Aufgabe wird gelöst mit den Merkmalen der Patentansprüche.

Die Erfindung geht von dem Grundgedanken aus, mit einer Sen- soreinheit bei oberflächengebundenen Analysesystemen im Be- reich des testenden Feldes eine Meßgröße zu bestimmen, die dem mittleren Brechnungsindex entspricht. Dieser mittlere Brechungsindex ergibt sich zum einen durch den Brechungsindex des Mediums, das der Transduceroberfläche benachbart ist und zum anderen durch ein in der Nähe der Transduceroberfläche angeordnetes Objekt, das aus einem Material besteht, dessen Brechungsindex von dem Brechungsindex des Mediums verschieden ist. Mit einer Auswerteeinrichtung, die mit der Sensoreinheit verbunden ist, wird eine Änderung der dem mittleren Brechnungsindex entsprechenden Meßgröße detektiert, die durch Annähern des Objekts an die Transduceroberfläche her- vorgerufen wird.

Die Erfindung ist anwendbar für alle optischen Meßprinzipien, bei denen eine Brechungsindexänderung benachbart zu einer Transduceroberfläche auftritt, wenn ein Objekt benachbart zur Transduceroberfläche angeordnet wird. Dabei kann die gewonnene Meßgröße zur Ermittlung des numerischen Wertes des mittleren Brechungsindexes verwendet werden, beispielsweise durch Kalibration der Meßgröße.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist zum einen eine Vor- richtung und ein Verfahren zur Bestimmung von Abständen eines Objekts von einer Transduceroberfläche im Nanobereich. Bei optischen Meßsensoren, die sichtbares Licht verwenden, ist die Bestimmung von Abständen im Bereich von ca. 0 bis 500 nm möglich. Bei Verwendung von elektromagnetischer Strahlung größerer Wellenlängen ist dieser Abstand entsprechend größer. Vorzugsweise werden evaneszente optische Felder eingesetzt zur Messung von mittleren Berechnungsindices in dem Raum oberhalb einer Meßoberfläche, in dem das evaneszente Feld genügend empfindlich auf Änderungen des Brechungsindex reagiert. Bevorzugt werden Methoden wie Oberflä- chenplasmonenresonanz (surface plasmon resonance, SPR), das Meßprinzip der abgeschwächten Totalreflexion (attenuated total reflectance, ATR) und Interferenzkontrast.

Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist weiterhin die Nut- zung der Vorrichtung bzw. des Verfahrens zur Abstandsbestim- mung beim Formen von sehr kleinen Volumina in Systemen, in denen evaneszente Felder oder auch andere Detektionsprinzi- pien, wie insbesondere Reflexionsinterferenz zur oberflä- chengebundenen Analyse von Proben verwendet werden. Dabei wird das Volumen durch Einsatz des erfindungsgemäßen Prinzips zur Abstandsmessung in einer Dimension senkrecht zur Sensoroberfläche kontrolliert und kann so eingestellt werden.

Insbesondere können kleinste Abstände bzw. optimale Abstände im Nanobereich eingestellt werden. Mit der Erfindung sind Nanodosiersysteme realisierbar. Ein zentraler Vorteil des erfindungsgemäßen Nanodosiersystems ist, daß es aus be- weglichen Teilen besteht, die insbesondere zum Zwecke der Reinigung ohne Probleme voneinander entfernt werden können, um dann anschließend wieder in die Sollposition bewegt zu werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform wird ein Nano- dosiervolumen gebildet, in dem ein Objekt, das vorzugsweise plattenförmig ist, oder ein Objekt mit einer Fläche, die der Sensoroberfläche zugewandt ist, und das im Hinblick auf einen optimale Analyttransport zu der Sensoroberfläche oder zu dem Meßpunkt auf der Oberfläche des Sensors geformt wurde, um die Flußcharakteristika zu optimieren, in der Nähe der Transduceroberfläche derart angeordnet wird, daß ein Volumen entsteht, durch das die zu untersuchende Flüssigkeit geleitet wird. Mit dem erfindungsgemäßen Detektorsystem lassen sich kleinste Abstände und damit geringe Höhen des Volumens im Nanometerbereich einstellen. Vorzugsweise wird dieses Nanodosiervolumen von Seitenwänden begrenzt, so daß ein Einlaß und ein Auslaß für die zu untersuchende Flüssigkeit bereitgestellt wird.

Gemäß einer alternativen Ausführungsform der Erfindung wird das Nanodosiersystem durch eine Dosiereinrichtung vorzugs- weise in Form einer Pipettenspitze realisiert, wobei die Do- siereinrichtung nahe an der Transduceroberfläche angeordnet werden kann. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Detektorsystems können kleine Abstände zwischen der Pipettenspitze und der Transduceroberfäche eingestellt werden. Mit diesem Nano- dosiersystem ist es möglich, Probenmaterial direkt an die Transduceroberfläche zu applizieren.

Die Antriebsvorrichtung für das Bewegen der Teile weist vor- zugsweise Systeme auf, mit denen Bewegungen mit genügend ho- her Auflösung möglich sind. Beispielsweise werden Schrittmo- toren unter Verwendung von Microsteps und/oder Piezotransla- toren eingesetzt. Dabei kann beispielsweise eine Kombination aus einem Schrittmotor für einen Feinantrieb und einem Pie- zotranslator für einen Feinstantrieb verwendet werden.

Mit dem erfindungsgemäßen System wird die Bildung von Verar- mungszonen vermieden bzw. erheblich vermindert. Bei den be- kannten Verfahren entstehen Verarmungszonen dadurch, daß die zu analysierenden Moleküle aus der Probe an die Sensorober- fläche gebunden werden, damit also aus einer oberflächennahen Schicht der Probe entfernt werden und ein Transport von weiteren Molekülen aus weiter entfernten Bereichen der Probe durch Diffusion nicht so schnell erfolgt, wie die Bindug an die Oberfläche. Dieses Problem tritt bei"stationären"Pro- benzuführungssystemen wie Küvetten aber auch bei Mikrofluß- systemen auf, wenn die Dimension der Mikroflußkammer senk- recht zur Oberfläche im Mikrometerbereich liegt und die Flüsse parallel zur Oberfläche ausgerichtet sind. Es läßt sich auch nicht dadurch überwinden, daß die Probe mit einem Geschwindigkeitsvektor senkrecht zur Oberfläche dosiert wird, wenn sich die Dosieröffnung im Mikrometerbereich oberhalb der Oberfläche befindet. Erst der Einsatz des erfindungsgemäßen Nanodosiervolumens bzw. die Dosierung aus einem Dosiersystem, dessen Dosieröffnung weniger als 1 gm von der Oberfläche befindet, überwindet das Verarmungs-Problem.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zum Bestimmen von Abständen und das zugehörige Verfahren ist in einer weiteren bevorzug- ten Ausführungsform der Erfindung einsetzbar beim Mischen einer Flüssigkeit mit Hilfe von Mischkörpern. Diese Misch- körper können durch Anlegen eines äußeren Feldes, insbeson- dere eines Magnetfeldes oberhalb der Transduceroberfläche bewegt werden. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Detektor- systems sind die Bewegungen der Mischkörper, insbesondere des Abstands der Mischkörper von der Transduceroberfläche bestimmbar. Vorzugsweise werden als Mischkörper Mischkügelchen (beads) eingesetzt. Alternativ werden als Mischkörper ein Netz (oder eine Membran) eingesetzt. Diese Ausführungsform der Erfindung hat den Vorteil, daß im Nanometerbereich oberhalb der Transduceroberfläche die Flüssigkeit gemischt und die Bildung von Verarmungszonen vermieden werden kann.

Die Erfindung wird nachstehend anhand eines Beispiels und der Zeichnung näher erläutert. Es zeigen : Fig. 1 eine schematische Darstellung einer bevorzugten Aus- führungsform der Erfindung, Fig. 2 eine schematische Ansicht eines Teils einer ersten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung, und Fig. 3 eine schematische Ansicht eines Teils einer zweiten bevorzugten Ausführungsform der Erfindung.

Fig. 1 zeigt den Prinzipaufbau eines Biosensors mit optischen Transducer, der bei dem vorliegenden Beispiel als Oberflächenplasmonenresonanzsensor ausgebildet ist. Im ein- zelnen weist die Meßanordnung einen optischen Transducer 10 auf, der in dem gezeigten Beispiel als Prisma mit einer Transduceroberfläche 12 ausgebildet ist. Von einer Licht- quelle 14 wird Licht in das Prisma eingeleitet und im Bereich der Transduceroberfläche eine Oberflächenplasmonenresonanz angeregt, wobei das reflektierte Licht von einer De- tektoranordnung 16 empfangen wird. Das Ausgangssignal der Detektoreinrichtung wird an eine Auswerteeinrichtung 40 ge- leitet. Auf der Transduceroberfläche ist eine Küvettenanord- nung 20 mit mindestens einer Küvette zur Aufnahme einer zu untersuchenden Flüssigkeit angeordnet. Dabei wird in dem ge- zeigten Beispiel der Boden 22 der Küvette von einem Teil der Transduceroberfläche 12 gebildet. Fig. 1 zeigt ferner ein im Abstand von der Transduceroberfläche angeordnetes Objekt 32.

Das Objekt 32 ist an einem Halter 34 angeordnet, der mit ei- ner Antriebseinrichtung 36 verbunden ist. Mit Hilfe der An- triebseinrichtung ist das Objekt 32 höhenverstellbar und kann bis dicht an die Transduceroberfläche mit hoher Präzision herangefahren werden. Mit Hilfe der Sensoreinheit, die aus der Lichtquelle 14, dem optischen Transducer 10 und der Detektoranordnung 16 gebildet wird, wird der Brechungsindex eines Mediums, das der Transduceroberfläche benachbart ist, bestimmt. Innerhalb der Reichweite des evaneszenten Feldes, das ausgehend von der Transduceroberfläche in den Raum in- nerhalb der Küvette hineinreicht, wird ein mittlerer Bre- chungsindex bestimmt. Ein Objekt, das an die Transducerober- fläche herangefahren wird, und in den Bereich des evaneszen- ten Feldes gelangt, führt zu einer Veränderung des mittleren Brechungsindexes. Diese Änderung des Brechungsindexes wird von der Detektoranordnung detektiert und von der Auswerte- einrichtung 40, die mit der Sensoreinheit verbunden ist, ausgewertet.

Die in Fig. 1 gezeigte Vorrichtung ist als Näherungssensor verwendbar, wobei eine Annäherung eines Objekts an die Transduceroberfläche eine Signaländerung bewirkt, die von der Auswerteeinrichtung erfaßt wird. Durch Kalibrieren der Meßvorrichtung, d. h. entsprechendes Auswerten eines Meß- signals abhängig von der Position des Objekts in bezug auf die Transduceroberfläche können mit der Vorrichtung Abstände bestimmt werden. Bei Verwendung einer präzisen hochauflösen- den Antriebseinrichtung 36, beispielsweise ein Schrittmotor mit Microsteps kann der Halter 34 mit dem daran angeordneten Objekt 32 hochgenau gegenüber der Transduceroberfläche 12 angeordnet werden.

Die erste bevorzugte Ausführungsform von Fig. 2 zeigt den schematischen Aufbau eines Nanodosiervolumens 50. Das Nanodosiervolumen 50 wird in dem Raum zwischen der Transdu- ceroberfläche 12 bzw. dem Küvettenboden 22 und dem Objekt 32 gebildet. In dem Beispiel ist ein plattenförmiges Objekt 32 gezeigt, dessen Unterseite im wesentlichen parallel zur Transduceroberfläche 12 angeordnet ist. In einer alternativen Ausführungsform (nicht dargestellt) wird das plattenförmige Objekt mit Hilfe von drei Antrieben und drei Haltern, die die Platte an beabstandeten Stellen halten, selektiv in der Höhe verstellt. Außerdem werden an vorzugsweise drei Meßflecken die jeweiligen Abstände zwischen Referenzpunkten an der Unterseite des Objekts und der Transduceroberfläche 12 bestimmt. Dies hat den Vorteil, daß die Plattenunterseite definiert z. B. parallel zur Transduceroberfläche ausgerichtet werden kann. Das Nanodosiervolumen 50 hat einen Einlaß 52 und einen Auslaß 54. Das Nanodosiervolumen wird außerdem begrenzt von zwei Seitenwänden 56, wobei in Fig. 2 nur die rückwärtige Seitenwand 56 gezeigt ist. Durch ein entsprechendes Einstellen der Lage des Objekts 32 mit Hilfe der An- triebseinrichtung wird das Objekt in den Bereich zwischen die Seitenwände 56 hineingefahren. Nach dem erfindungsgemäßen Prinzip kann bei optischen Meßsensoren, die sichtbares Licht verwenden, das Nanodosiervolumen 50 mit einer Höhe im Bereich von 0 bis etwa 500 nm ausgebildet werden. Mittels einer Ein- richtung zum Einleiten einer Flüssigkeit (nicht dargestellt) zum Einlaß 52 bzw. zum Absaugen der Flüssigkeit am Auslaß 54 wird dieser über die Meßoberfläche geleitet.

Bei der in Fig. 3 gezeigten Ausführungsform der Erfindung ist das Objekt eine Pipettenspitze 62, die wie das Objekt 32 mit einer Antriebseinrichtung 36 höhenverstellbar ist. Zwischen dem Ende der Pipettenspitze und der Transduceroberfläche wird ein Raum 60 gebildet, in dem über eine Dosiereinrichtung Flüssigkeit mit Probenmaterial eingeleitet werden kann, wobei mit Hilfe der Dosiereinrichtung Probenmaterial direkt an die Detektoroberfläche appliziert wird. Diese Anordnung bildet einen Spezialfall eines Nanodosiersystems.

Die vorstehende Beschreibung ist nur beispielhaft, wobei Mo- difikationen ohne weiteres möglich sind. Insbesondere kann mit Hilfe der erfindungsgemäßen Vorrichtung zum Bestimmen von Abständen eine Bestimmung der Position von Mischkörpern in einer Küvette vorgenommen werden. Zum Mischen mit Misch- körpern, wie Mischkugeln oder Netzen werden diese in die Kü- vette eingebracht und deren Lage über die Bestimmung des mittleren Brechungsindexes detektiert.