Taxane, insbesondere Paclitaxel (Taxol) sind zytotoxische Diterpene aus der Eibe, von denen einige die Zellreplikation hemmen. Dies geschieht dadurch, dass die Taxane, speziell Paclitaxel, an die Tubulinpolymere binden und diese stabili- sieren, so dass die dynamische Reorganisation des mikrotubu- lären Systems blockiert wird. Somit wird die Zellteilung in der G2/M-Phase des Zellzyklus inhibiert. Aufgrund diese Me- chanismus haben Taxane eine Antitumorwirkung und werden zu- nehmend gegen eine Reihe von Karzinomen, insbesondere Ovari- al-, Mamma-und Bronchialkarzinome eingesetzt.

Wegen der Antitumorwirkung von Paclitaxel besteht ein großer Bedarf an dieser Substanz. Viele Behandlungen können nicht oder nur unzureichend durchgeführt werden, da Paclitaxel le- diglich in geringen Mengen und zu hohen Kosten zur Verfügung gestellt werden kann.

Zur Zeit wird die Herstellung von Paclitaxel insbesondere <BR> <BR> auf die Aufarbeitung der Rinde von Taxus brevifolia (Nutt. ) gestützt. Da die Konzentration von Paclitaxel in der Rinde jedoch sehr niedrig ist, könnte dieses Verfahren absehbar zur Zerstörung des Eibenbestandes führen. Daher müssen öko- logisch und ökonomisch sinnvolle Alternativen in Form einer chemischen Synthese entwickelt werden.

Da eine Vollsynthese von Paclitaxel aufgrund ihrer geringen Ausbeuten nicht in Frage kommt, kann eine Semisynthese auf der Grundlage von 10-Deacetyl-baccatin III (10-DAB) erfol- gen.

Außerdem kann 10-DAB kann in signifikanten Mengen aus den Nadeln und Zweigen von Eiben gewonnen werden. Da dieses Ausgangsmaterial in großen Mengen in der Park-und Forst- wirtschaft anfällt und der Eibenverschnitt sowieso schwer zu entsorgenden ist, stellt sich hierbei nicht das oben ge- schilderte Problem der Bestandsgefährdung der Eibe. Auch un- ter Kostenaspekten ist diese Quelle zu bevorzugen.

Bei der Semisynthese von Baccatin III muss 10-DAB an Positi- on 10 stereospezifisch acetyliert werden (siehe dazu Figur 3). Es ist bekannt, dass diese Reaktion von Acetylasen ka- talysiért werden kann.

Die DE 198 22 881 A beschreibt ein Verfahren, bei dem 10-DAB mittels einer gereinigten Acetyltransferase aus Taxus bacca- ta unter Beigabe von Acetyl-Coenzym A zu Baccatin III umge- setzt wird.

Jedoch sind eine Reihe von Aspekten des Verfahrens gemäß der DE 198 22 881 A als nachteilig anzusehen : So muss die ver- wendete Acetyltransferase aus Taxus spec. zunächst gereinigt werden. Die Umsetzung muss zudem unter Beigabe eines Acetyl- Coenzym A regenerierenden Systems erfolgen, da das Acetyl- Coenzym A bei der Umsetzung zu Baccatin III verbraucht wird.

Auch werden bei diesem Verfahren halogenierte organische Lö- sungsmittel, wie ein Chloroform-Heptan-Gemisch, eingesetzt.

Es ist die Aufgabe der vorliegenden Erfindung Baccatin III als Vorstufe des Paclitaxels, ohne die oben genannten Nachteile herzustellen.

Diese Aufgabe wird durch die Vorrichtung gemäß Anspruch 1 gelöst.

Erfindungsgemäß wird eine Vorrichtung zur enzymatischen Her- stellung von semisynthetischen Taxen, insbesondere Baccatin III, in einem Enzymreaktor bereitgestellt, wobei der Enzym- reaktor eine Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran aufweist, wo- bei im Innern des Enzymreaktors eine Acetyltransferase aus Taxus spec. immobilisiert ist.

Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembranen zeichnen sich durch eine Vielzahl von Kapillarmembranen aus, so dass das Verhältnis Oberfläche zu Volumen sehr hoch ist, wobei gleichzeitig eine kompakte Bauweise erreicht werden kann. Somit kann eine ho- he Umsatzrate erzielt werden.

Unter Immobilisierung ist hier zu verstehen, dass die Ace- tyltransferase aus Taxus spec. sich in einem abgeschlossenen Kompartiment bzw. Kreislauf befindet. Die Acetyltransferase befindet sich, wie unten noch erläutert werden wird, in ei- ner wässrigen Phase innerhalb dieses auch als Reaktionsraum dienenden geschlossenen Kompartiments bzw. Kreislaufs und wird in der wässrigen Phase laufend umgewälzt.

Durch die Immobilisierung einer Acetyltransferase ergibt sich für die Synthese von Baccatin III eine verkürzte Reak- tionszeit.

Die Acetyltransferase aus Taxus spec. katalysiert die Über-

tragung einer Acetylgruppe auf die OH-Gruppe an Position 10 des 10-DAB, wodurch Baccatin III entsteht. Sie wird durch die Immobilisierung in konzentrierter Form bereitgestellt.

In einer vorteilhaften Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung weist die Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran Po- lysulfon und/oder Polyethersulfon auf, bzw. besteht aus Po- lysulfon und/oder Polyethersulfon. Insbesondere weist die Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran Polypropylenfasern auf, die mit Polypropylen-Glycol PPG-4000 oder Polybutylen-Glycol PBG-4800 oder flüssigen Polymeren imprägniert wurden. Aber auch Polyethersulfonmembranen der Hohlfaser-Ultrafiltratons- membran können mit flüssigen Polymeren imprägiert sein.

Weiterhin ist es von Vorteil, dass die Hohlfaser- Ultrafiltrationsmembran eine Porengrößenverteilung von klei- ner 10 nm oder Trenngrenze von kleiner 50 Kilodalton (kD) aufweist. Von besonderem Vorteil ist eine Porengrößenvertei- lung von kleiner/gleich 3 nm oder eine Trenngrenze von klei- ner/gleich 10 kD.

Weiterhin wird die Aufgabe wird durch ein Verfahren gemäß Anspruch 5 gelöst.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur enzymatischen Her- stellung von semisynthetischen Taxanen wie z. B. Baccatin III, insbesondere in einem Enzymreaktor, wird 10-DAB mittels eines eine Acetyltransferase aus Taxus spec. enthaltenden Zellrohsafts in einem Flüssigphasensystem, insbesondere ei- nem Zweiphasensystem, bestehend aus einer flüssigen wässri- gen Phase und einer flüssigen organischen Phase zu Baccatin III umgesetzt.

Von Vorteil bei diesem Verfahren ist es, dass ein Zellroh- saft zum Einsatz kommen kann, und keine aufwendigen Aufrei- nigungsschritte vor dem Einsatz der Acetyltransferase in der Synthese durchgeführt werden müssen. Außerdem werden mit dem Zellrohsaft weitere Enzyme bereitgestellt.

Der Zellrohsaft wird wie folgt gewonnen : Suspension von ge- eigneten Zellen in einem wässrigen Puffer, insbesondere Phosphatpuffer ; Zellaufschluss, insbesondere mittels Ultra- schall unter Zugabe einer DNase ; Abzentrifugation ; Fällung des Überstandes mit einer Polyethylenimin-Lösung ; Abzentri- fugation ; Versetzen des Überstandes mit Glycerin.

Durch die Verwendung der Acetyltransferase aus Taxus spec. erfolgt die Herstellung von Baccatin III, wobei dieses Bac- catin III praktisch enantiomerenrein vorliegt, da die Ace- tyltransferase eine stereospezifische Acetylierung an Posi- tion 10 des 10-DAB katalysiert.

Als flüssige wässrige Phase wird vorteilhafter Weise ein wässriger Puffer, insbesondere ein Phosphat-und/oder MOPS- puffer eingesetzt. Als organische Phase wird bevorzugt ein nicht-halogenierter Ether, insbesondere Diisopropylether o- der Dibutylether eingesetzt.

Diisopropylether und Dibutylether sind von Vorteil, da das synthetisierte Baccatin III in diesen organischen Lösungs- mitteln selektiv löslich ist und somit direkt nach der Syn- these aus der wässrigen Phase extrahiert wird, während das Substrat praktisch vollständig in der organischen Phase ver- bleibt.

Weiterhin sind Diisopropylether und Dibutylether gegenüber

nicht-halogenierten Lösungsmitteln in ökologischer Hinsicht vorteilhaft.

In einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die in dem Zellrohsaft befindliche Ace- tyltransferase im Enzymreaktor in der wässrigen Phase (A) immobilisiert, und zwar insbesondere durch eine Hohlfaser- Ultrafiltrationsmembran, wobei diese Ultrafiltrationsmembran vorteilhafterweise hydrophob ist. Die Hydrophobizität wird insbesondere dadurch erreicht, dass die Ultrafiltrations- membran Polysulfon und/oder Polyethersulfon aufweist bzw. aus Polysulfon und/oder Polyethersulfon besteht.

Durch die Immobilisierung wird die Acetyltransferase nicht durch den Fluss des Zellrohsaftes durch den Enzymreaktor ausgeschwemmt, sondern verbleibt in der wässrigen Phase.

Dies gewährleistet hohe Umsatzraten des Enzyms.

In einer besonders vorteilhaften Ausführungsform des Verfah- rens weist die Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran eine Poren- größenverteilung von kleiner 10 nm oder eine Trenngrenze von kleiner 50 kD auf. Besonders bevorzugt ist eine Porengrö- ßenverteilung von kleiner/gleich 3 nm oder eine Trenngrenze von kleiner/gleich 10 kD.

Die Hohlfaser-Ultrafiltrationsmembran trennt vorteilhafter Weise die organische von der wässrigen Phase, liegt also zwischen diesen beiden Phasen.

Die erfindungsgemäße Synthese von Baccatin III erfolgt enzy- matisch, wobei ein Coenzym notwendig ist, nämlich Acetyl- Coenzym A (Acetyl-CoA) (siehe dazu auch Figur 3). Daraus folgt, dass eine Regenerierung des Acetyl-Co A erforderlich

ist, um einen fortlaufenden Syntheseprozess zu gewährleis- ten.

Dem gemäß wird in einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens der wässrigen Phase zur Regene- rierung des durch die Umsetzung von 10-DAB zu Baccatin III verbrauchten Acetyl-Coenzyms A der wässrigen Phase Glucose und/oder Pyruvat zugesetzt.

Der eingesetzte Zellrohsaft verfügt über die benötigten En- zyme, um aus Glucose und/oder Pyruvat das bei der Umsetzung von Baccatin III anfallende Coenzym A zu acetylieren und so- mit zu regenerieren. Dadurch wird eine kontinuierliche Um- setzung von 10-DAB zu Baccatin III im Enzymreaktor ermög- licht.

Besonders vorteilhaft ist es in diesem Zusammenhang, wenn der Zellrohsaft aus Escherichia coli oder der Hefe Pichia pastoris oder aus Spalthefen gewonnen wird, da sich diese Organismen gut für die Expression heterologer Proteine in großen Ausbeuten eignen. Dafür können diese Organismen nach Einbringung geeigneter Plasmide zur Proteinexpression, die für die Acetyltransferase aus Taxus spec. kodieren, zur Her- stellung des Zellrohsaftes hergestellt werden. Die Verfah- ren zur Überexpression von heterologen Proteinen sind dem Fachmann bekannt.

Zur Herstellung des Zellrohsaftes kann der durch Aufschluss der Zellen gewonnenen Zellsaft durch Zugabe von mindestens einer Nuklease, insbesondere einer DNase, von Nukleinsäuren befreit werden.

Vor dem Einfüllen in den Enzymreaktor wird der Zellrohsaft

vorteilhafterweise durch Fällung mit einer Polyethylenimin- Lösung hergestellt, wobei ggf. Glycerin zur Stabilisierung verwendet werden kann. Dadurch werden insbesondere für das Verfahren nicht benötigte Proteine abgetrennt.

In einer weiteren vorteilhaften Ausführungsform des Verfah- rens geht die Herstellung von der Substanz 10-Deacetyl- baccatin III (10-DAB) aus. Das 10-DAB wird insbesondere aus Eibennadeln gewonnen. Dies ist insbesondere unter ökologi- schen Gesichtspunkten vorteilhaft, da somit der Eibenbestand geschont werden kann.

Die vorliegende Erfindung wird durch die nachfolgenden Figu- ren näher beschrieben. Darin zeigt : Figur 1A die Strukturformel von 10-DAB ; Figur 1B die Strukturformel von Baccatin III ; Figur 2 ein Fließbild des Enzymreaktors ; und Figur 3 die im Enzymreaktor ablaufende Umsetzung von 10-DAB in Baccatin III und die Regenerierung von Acetyl-Coenzym A.

Figur 1A zeigt die Strukturformel von 10-DAB. An der poly- zyklischen Ringstruktur befinden sich vier OH-Gruppen an den Positionen 1, 7, 10 und 13, die alle das Ziel einer Acety- lierung werden können. Durch die Verwendung einer Ace- tyltransferase aus Taxus spec., die spezifisch die OH-Gruppe an Position 10 acetyliert, wird erreicht, dass Acetylierun- gen an anderen Positionen vermieden werden

Figur 1B zeigt die Strukturformel von Baccatin III, das durch Acetylierung von dem in Fig. 1A gezeigtem 10-DAB in Position 10 erhalten wird.

In Figur 2 ist der Enzymreaktor R in einem Fließbild darge- stellt. Der Behälter B0, in dem die Umsetzung von 10-DAB zu Baccatin III erfolgt, weist mindestens eine Hohlfaser- Ultrafiltrationsmembran auf. Zwei Kreisläufe K1 K2 sind an den Behälter BO angeschlossen.

In einem ersten Kreislauf Kl zirkuliert die organische Pha- se, also mindestens ein nicht-halogenierter Ether, insbeson- dere Diisopropylether und/oder Dibutylether. Die Stömungs- richtung ist durch einen Pfeil angegeben. Innerhalb des ers- ten Kreislaufs Kl sind ein Behälter B1 als Vorratsbehälter, sowie der Drucksensor Dl am Übergang vom Behälter BO in die Rohrleitung und der Drucksensor D2 am Übergang von der Rohr- leitung in den Behälter BO angeordnet. Die Zirkulation der organischen Phase wird durch eine motorbetriebene Pumpe P1 gewährleistet.

In einem zweiten Kreislauf K2 zirkuliert die wässrige Phase, also der Zellrohsaft. Die Stömungsrichtung ist auch hier durch einen Pfeil angegeben. Zur Verbesserung des Extrakti- onsverhaltens kann die Strömungsrichtung jedoch auch umge- kehrt werden, womit die Extraktion im Gegenstromverfahren verläuft. Innerhalb des zweiten Kreislaufs K2 sind ebenfalls ein Behälter B2 als Vorratsbehälter, sowie der Drucksensor D3 am Übergang vom Behälter BO in die Rohrleitung und der Drucksensor D4 am Übergang von der Rohrleitung in den Behäl- ter. BO angeordnet. Der Behälter B2 weist Mittel zur Tempera- tur-und pH-Messung auf. Zwischen dem Drucksensor D3 und dem Behälter B2 ist zudem ein Regulierventil V zur Regulation

des Druckgradienten in der in dem zweiten Kreislauf K2 zir- kulierenden wässrigen Phase angeordnet. Die Zirkulation der organischen Phase wird durch eine motorbetriebene Pumpe P2 gewährleistet.

Eine Auffangwanne A dient dem Auffangen von Flüssigkeit im Falle eines Lecks. Ein im Enzymreaktor R angeordnetes Heiz- mittel H dient der Einstellung einer geeigneten Temperatur.

Mittels der Pumpen P1, P2 werden die organische und die wässrige Phase ständig im Kreis umgewälzt, so dass zum einen ständig neues Substrat in den Reaktionsraum im Behälter Bo geführt wird, andererseits das im Reaktionsraum gebildete Produkt ständig entfernt wird- Figur 3 zeigt die im Enzymreaktor ablaufende Umsetzung von 10-DAB in Baccatin III und die Regenerierung von Acetyl- Coenzym A. Die in der Mitte der Abbildung gezeigte Hohlfa- ser-Ultrafiltrationsmembran (M) trennt die auf der linken Seite gezeigte wässrige Phase (A) von der auf der rechten Seite gezeigten organischen Phase (B). Die wässrige Phase (A) besteht bevorzugt aus Phosphatpuffer und/oder MOPS- Puffer, die organische Phase (B) weist bevorzugt nicht- halogenierte Lösungsmittel, insbesondere Diisopropylether oder Dibutylether auf.

In der wässrigen Phase (A) findet die von der Acetyltransfe- rase katalysierte Umsetzung von 10-DAB zu Baccatin III statt, wobei Acetyl-Coenzym A (Acetyl-CoA) unter Übertragung der Acetylgruppe an Position 10 des 10-DAB zu Coenzym A um- gesetzt wird. Dabei ist die Acetyltransferase in der wäss- rigen Phase immobilisiert, so dass sie wiederholt zur Umset- zung des im Enzymreaktor befindlichen 10-DAB zur Verfügung

steht. Das Coenzym A wird mittels eines im Zellrohsaft vor- handenen Enzyms, insbesondere einer Dehydrogenase, Ligase oder einer Transacetylase unter Verwendung eines Acetylgrup- pendonors wieder zu Acetyl-CoA umgesetzt. Damit steht das Acetyl-CoA für eine erneute Umsetzung von 10-DAB zu Baccatin III zur Verfügung, so dass Baccatin III kontinuierlich her- gestellt werden kann.

Die vorliegende Erfindung wird durch das nachfolgende Bei- spiel näher beschrieben.

Beispiel : Alle Schritte werden bei 4 °C durchgeführt. 7,5 g Feuchtbio- masse von Escherichia coli des Stammes JM 109 rec-des Klo- nes pZPl, die zuvor bei-21°C gelagert wurden, wird in einem 50 mM Phosphatpuffer (KH2PO4 : 0,434 g/l, Na2HP04 * 2H20 : 8, 33 g/l, pH = 7, 8) zu einem Gesamtvolumen von 20 ml resuspen- diert. Die so erhaltene Suspension wird in einem Edelstahl- aufschlussgefäß mittels Ultraschall (Ultraschallprozessor Dr. Hielcher, Typ UP 400 s) 2 min aufgeschlossen (Amplitide 70 %, Zyklus 0,3). Der erhaltene Zellsaft wird unter Zugabe von 30 il DNase (90 Units, AppliChem) eine Stunde auf Eis gerührt. Anschließend wird der Zellsaft in ein 50 ml Falcon- röhrchen überführt und abzentrifugiert (Hettich Zentrifuge, Typ Rotanta 46 R, 3500 U/min, Temperatur 4 °C). Der erhalte- ne Überstand wird mit einer Polyethylenimin-Lösung (Endkon- zentration 0,5 %, Serva) gefällt und verbleibt 30 Minuten gerührt auf Eis. Dann wird der Zellsaft 30 min abzentrifu- giert und der Überstand mit 20 % Glycerin versetzt. Die so erhaltenen Flüssigkeit stellt den Zellrohsaft dar.

Die enzymatische Reaktion erfolgt in einem Enzymmembranreak-

tor (Hohlfasermodul MiniKross Sampler PS, Gehäusegröße 2, Trenngrenze 10 kD, Fläche 615 cm2, membraPure) unter folgen- den Bedingungen : Als Lösungsmittel kommt Diisopropylether (Riedel-deHaen) zum Einsatz. 750 ml werden in eine 11-Schottflasche abgefüllt und im Wasserbad auf 13 °C temperiert. 150 ml Zellrohsaft werden in eine 250 ml-Schottflasche überführt und mit 60 ßg 10-DAB (DeacetylbacCatin-III Coral Drugs ! welches in 2 mi Ethanol gelöst wurde, sowie 60 mg Glucose-Monohydrat (Fluka) versetzt und im Wasserbad bei 13 °C temperiert. Die Dii- sopropylether-Phase wird mit Hilfe einer Membranpumpe (Typ Dosierpumpe DME, Telab) mantelseitig mit einem Fluss von 985 ml/h gepumpt. Eine Schlauchpumpe (Typ : BV-GES, Ismatec) zir- kuliert den Zellrohsaft mit einem Volumenstrom von 984 ml/h durch die Hohlfaser. Es wird kein Überdruck angelegt. Ein Durchbruch einer der beiden Phasen über den gesamten Ver- suchszeitraum wurde nicht beobachtet.

Das gebildete Baccatin III wird kontinuierlich extraktiv aus der wässrigen Phase abgezogen und reichert sich in der Dii- sopropylether-Phase an. Ein Auswaschen des Substrates 10-DAB durch die organische Phase wird durch die Selektivität des verwendeten Lösungsmittels verhindert. Das Produkt Baccatin III wird durch Einrotieren der Lösungsmittelphase in einem Vakuumrotationsverdampfer nach Ablauf der enzymatischen Re- aktion erhalten. Das so erhaltene Produkt Baccatin III be- sitzt eine Reinheit von 97 %. Unter den genannten Bedingun- gen ergibt sich ein Umsatz von bis zu 70 %. Als Versuchsdau- er sind mindestens 24 Stunden anzusetzen.