Mit Brechnungsindexänderungen auf der Metalloberfläche einhergehende Adsorptions-oder Desorptionsprozesse lassen sich somit hochempfindlich in Echtzeit detektieren.

Sensorbasierende bioanalytische Verfahren und Instrumente nehmen seit einigen Jahren einen immer höheren Stellenwert in der biotechnologisch/ medizinischen Grundlagenforschung und in der Pharmaentwicklung ein. Der Grund für diese rapide Entwicklung liegt vor allem im steigenden Bedarf nach schnellen Analysenverfahren, die quantitative Daten über biomolekulare Wechselwirkungen liefern. Optische Affinitätssensoren kommen diesem Bedarf auf ideale Weise entgegen, da sie biomolekulare Bindungsereignisse verzögerungsfrei in Echtzeit und ohne die Verwendung interferierender Label zu detektieren vermögen.

Mit dem Aufkommen hochparalleler Ansätze zur Analyse komplexer Nukleinsäure- (Genomics) oder auch Proteingemische (Proteomics) sowie der steigenden Verwendung kombinatorischer Syntheseverfahren bei der pharmazeutischen Wirkstoffsuche wird darüber hinaus die Hochdurchsatzfähigkeit nachgeordneter Analyseverfahren zu einem zentralen

Kriterium. Dieser Bedarf ließe sich vorteilhaft durch optische Sensoren decken, mit denen eine Vielzahl von Bindungsreaktionen parallel gemessen werden können. Im Unterschied zu den heute erhältlichen Geräten müßten derartige Sensoren jedoch nicht mehr nur wenige einzelne Meßpunkte erfassen, sondern das Bild eines ganzen Sensorarrays analysieren können.

Aus dem Stand der Technik sind eine Reihe verschiedener optische Detektionsprinzipien bekannt, die zur Echtzeitanalyse von biomolekularen Wechselwirkungen eingesetzt werden können. Die meisten Verfahren nutzen hierfür durch Bindungsreaktionen an der Sensoroberfläche auftretende Brechungsindexänderungen. Am verbreitetsten ist wohl die weiter oben bereits erläuterte Oberflächenplasmonenresonanz-SPR (engl., Surface Plasmon Resonance'), die sich apparativ relativ einfach realisieren läßt. Die Verschiebung des SPR Minimums wird üblicherweise entweder spektral oder- häufiger-winkelaufgelöst vermessen. Die spektral aufgelöste Detektion, die in der Regel nicht so empfindlich wie die winkelaufgelöste Methode ist, wird mit Vorteil dort angewendet, wo aus apparativen Gründen eine winkelaufgelöste Detektion nicht möglich ist. Ein Beispiel stellt die faseroptische SPR dar (WO 94/16312 A1), in der man Licht einer breitbandigen Lichtquelle in eine goldbeschichtete optische Faser einkoppelt und die Verschiebung der Resonanzwellenlänge mißt.

Die winkelaufgelöste Detektion wird zum Beispiel in WO 90/05305 beschrieben. In diesem Aufbau wird der Metallfilm mit konvergenten Lichtstrahlen beleuchtet, und die Winkelverschiebung mittels einer Diodenarray/Linsensystemkombination verfolgt. Ein solches Gerät verlangt einen relativ großen, mechanisch sehr massiv ausgebildeten Meßkopf, der einen derartigen Aufbau aufwendig macht. Eine apparativ einfachere Variante, wie in DE 19817472 dargestellt, bedient sich zur Ermittlung der SPR Minimumsverschiebung lediglich zweier Photodioden und ist damit etwas einfacher im Aufbau. Ein grundsätzlich anderes Prinzip wird von Kooyman et al. beschrieben (R. P. H. Kooyman, A. T. M. Lenferink, R. G. Eenink und J. Greve (1990) Anal. Chem., 63, pp. 83-85). Hier wird der Winkel des einfallenden Laserstrahls mit einem Scannerspiegel über die Zeit variiert und die korrespondierende Intensitätsänderung des reflektierten Lichts mittels einer

Photozelle detektiert. Das dort beschriebene System liefert gute Ergebnisse für wenige Messpunkte und ist relativ unaufwendig.

Andere Detektionsprinzipien umfassen beispielsweise den Resonant Mirror (Cush, R., Cronin, J. M., Goddard, N. J., Maule, C. H., Molloy, J. und Stewart, W. J. (1993) Biosensors & Bioelectronics, 8, pp. 347-353), das integriert optische Interferometer (DE 4033357), das Differenzinterferometer (Fattinger, Ch., Koller, H., Schlatter, D. und Wehrli, P. (1993) Biosensors & Bioelectronics, 8, pp. 99-107), den Gitterkoppler (Tiefenthaler, K. (1992) Advances in Biosensors, Vol. 2, pp. 261-289) oder das reflektometrische Interferenzspektrometer (DE 19615366 A1). Bei allen hier genannten Techniken ist jedoch die Herstellung des austauschbaren Sensors deutlich aufwendiger als bei der SPR, so daß diese Verfahren-neben anderen Nachteilen-vor allem aus wirtschaftlich-produktionstechnischen Gründen der SPR unterlegen sind.

Allen oben aufgeführten Verfahren ist gemein, daß sie nicht ortsaufgelöst arbeiten und somit nicht multianalytfähig sind. Es wurden deshalb in den vergangenen Jahren mehrere Ansätze entwickelt, die paralleles Messen auf verschiedenen Teilflächen des Sensorchips ermöglichen. Eine diesbezügliche Weiterentwicklung des oben bereits erwähnten Gitterkopplers wird beispielsweise in WO 95/03538 oder EP 1031828 A1 beschrieben ; aus DE 19828547 A1 ist ein ortsaufgelöstes reflektometrisches Interferenzspektrometer bekannt. Neben dem Nachteil der aufwendigen Fertigung der austauschbaren Sensoren, haben diese Systeme zudem den Nachteil, daß sie die Sensorfläche in diskrete und relativ große Bereiche aufteilen und die Geräte folglich entweder recht groß werden oder eine eingeschränkte Kapazität aufweisen.

Da sich SPR Sensoren technisch leichter realisieren lassen und eine freie, theoretisch fast beliebig kleine Aufteilung der Sensorfläche ermöglichen, existieren hier deutlich mehr Lösungsansätze. So wurde bereits 1988 das erste bildgebende SPM (engl., Surface Plasmon Microscope') entwickelt (Knoll, W. und Rothenhäusler, B. (1988) Nature, 332, pp. 615-617). Bei diesem und anderen bekannten Verfahren (DE 19829086, sowie Frutos, A. G.

und Corn, R. M. (1998) Anal. Chem., July 1, pp 449A-455 A) wird ein aufgeweiteter Laserstrahl unter einem festen Winkel auf eine Metallfläche gestrahlt und die Intensitätsänderungen des auf eine CCD Kamera reflektierten Bildes ausgewertet. Hauptnachteil dieser Methode ist, daß für die einzelnen Bildpunkte lediglich Graustufenänderungen und nicht die Winkel der SPR Minima erfaßt werden. Hieraus resultiert eine deutlich schlechtere Empfindlichkeit und ein stark eingeschränkter dynamischer Bereich. Hinzu kommt, daß die Änderung einzelner Helligkeitswerte unter manchen Bedingungen nicht eindeutig ist-es läßt sich dann nicht feststellen, in welche Richtung das SPR Minimum verschoben wird.

Eine Verbesserung der beschriebenen SPM Technik ist in DE 3909144 offengelegt. Hier wird unter verschiedenen Einstrahlwinkeln ein Bild der Sensoroberfläche aufgezeichnet und mit einer nachgeschalteten Bildauswertung der SPR Minimumswinkel für bis zu 5 x 5 pm kleine Flächenabschnitte bestimmt. Obwohl mit diesem Verfahren prinzipiell eine recht hohe Genauigkeit erzielt werden kann, müssen zur Bilderzeugung sowohl Einstrahl-als auch Reflektionswinkel verändert werden, was mechanisch aufwendig ist und sich nur mit einer niedrigen Datenaufnahmefrequenz realisieren läßt. Eine zweidimensionale schnelle Echtzeitanalyse von Bindungsreaktionen auf der Chipoberfläche ist mit dieser Anordnung deshalb nicht möglich.

Aus WO 00/22419 ist ein ortsauflösender SPR Sensor mit spektraler Detektion bekannt. Dieser bedient sich jedoch beweglicher Loch-oder Schlitzblenden, um sukzessiv verschiedene Bereiche der Sensoroberfläche zu beleuchten, wodurch der apparative Aufwand steigt, die Datenaufnahmefrequenz verlangsamt wird und die Größe der einzelnen Meßpunkte von vorneherein festgelegt ist.

In WO 99/30135 wird ein SPR Gerät mit winkelauflösender und spektraler Detektion beschrieben. Für die Ausführung als bildgebender Sensor wird die Verwendung einer Maske oder eines Linsenarrays vorgeschlagen. Die Nachteile dieser Anordnung entsprechen weitestgehend denen des im vorhergehenden Abschnitt erwähnten Sensors.

Ein System mit mechanischer Veränderung des Einstrahlwinkels und ebenfalls mechanischer Änderung der xy Position des Meßpunktes auf dem Sensorchip

ist aus WO 00/46589 bekannt. Nachteilig sind hier vor allem der aufwendige Aufbau und die großen beweglichen Baugruppen, die eine niedrige Datenaufnahmefrequenz zur Folge haben.

Des weiteren beschreibt EP 0973023 einen kompakten SPR Transducer mit winkelauflösender Detektion. Hier wird der Meßbereich und das Detektorarray in mehrere Teilbereiche unterteilt, für die jeweils ein separates SPR Signal aufgenommen wird. Auch bei diesem Ansatz ist die Größe des Meßbereichs durch den Transducer determiniert und verhältnismäßig groß. Eine echte Hochdurchsatzfähigkeit dürfte deshalb nur begrenzt gegeben sein. Außerdem kann der Metallfilm (Sensorchip) nicht ausgetauscht werden, was die Einsatzmöglichkeit als Biosensor stark einschränkt.

WO 98/34098 beschreibt einen ortsauflösenden SPR Sensor bei dem mit Hilfe eines komplexen Linsen-und Spiegelsystems der SPR Minimumswinkel für eine Vielzahl von Bildpunkten synchron bestimmt wird. Mit diesem Aufbau läßt sich zwar eine relativ hohe Meßfrequenz realisieren, jedoch ist er apparativ sehr aufwendig.

Zusammenfassend kann gesagt werden, daß ein hochauflösender SPR Transducer mit schneller Erfassung des SPR Minimumswinkels für jeden Bildpunkt bis heute nur in einer sehr aufwendigen Bauweise entwickelt wurde.

Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein derartiges, apparativ einfach zu realisierendes Gerät zur Verfügung zu stellen.

Die Aufgabe wird durch die Vorrichtung gemäß unabhängigen Anspruch 1 und das Verfahren gemäß unabhängigen Anspruch 25 gelöst.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zur optischen Untersuchung dünner Schichten umfaßt einen Träger mit einer Fläche ; eine Vorrichtung zur Beleuchtung der Fläche des Trägers unter verschiedenen Einfallswinkeln mit parallel verlaufendem Licht ; einen Detektor zur ortsaufgelösten Erfassung der Intensität der von der Fläche des Trägers reflektierten Strahlung für verschiedene Einfallswinkel ; und eine Auswertungseinheit, zur ortsaufgelösten

Ermittlung der Abhängigkeit der Intensität des reflektierten Lichts vom Einstrahlwinkel anhand der für verschiedene Einfallswinkel ortsaufgelöst erfassten Intensität, wobei der Detektor zur Erfassung der reflektierten Strahlung für verschiedene Einfallswinkel der reflektierten Strahlung nicht nachgeführt werden muß.

Die Vorrichtung zur Beleuchtung der Fläche des Trägers mit parallel verlaufendem Licht umfaßt vorzugsweise eine monochromatische Lichtquelle, insbesondere eine Halbleiterdiode oder einen Laser. Zur Vermeidung bzw.

Minimierung von Intensitätsschwankungen sind stabilisierte oder geregelte Laser, insbesondere geregelte Halbleiterlaser oder stabilisierte He-Ne-Laser vorzuziehen. Vorzugsweise sollte die Intensitätsschwankung der Lichtquelle nicht mehr als 0,4% besonders bevorzugt nicht mehr als 0,2% betragen. Mit der bevorzugten Stabilität der Lichtquelle läßt sich ein RMS Rauschen des Resonanzwinkels von nicht mehr als 0, 7*10-3° erzielen, und mit der besonders bevorzugten Stabilität ist ein RMS Rauschen des Resonanzwinkels von nicht mehr als 0, 3*10-3°möglich.

Der Träger umfaßt zur Einkopplung des eingestrahlten Lichts beispielsweise ein dreieckiges oder trapezförmiges Prisma oder eine Platte mit einzelnen Prismen, wobei die Basis des Prismas bzw. der Prismen entweder die Trägeroberseite bzw. die Fläche ist, von der das eingestrahlte Licht reflektiert wird, oder als Fläche dient, auf der eine vorzugsweise in optischer Hinsicht planparallele Platte aufgesetzt wird. In diesem Fall erfolgt die Reflexion von der Oberfläche dieser planparallelen Platte, die dann die Trägeroberseite bildet.

Bei Vorrichtungen zur Durchführung der Oberflächenplasmonenresonanz- spektroskopie ist die Trägeroberseite mit einem Metallfilm beschichtet, der die Ausbildung einer möglichst scharfen Plasmonenresonanz ermöglicht. Hierzu sind insbesondere Ag-oder Au-Filme geeignet, wobei deren Dicke bevorzugt etwa 45 bis 55 nm beträgt.

In einer weiteren Ausgestaltung befindet sich die Goldschicht auf einem Gitter bzw. auf einer Vielzahl parallel angeordneter kleiner Prismen. Diese Anordnung hat den Vorteil, daß sie sich kostengünstig durch Spritzguß in Kunststoff realisieren läßt und der Träger und das Prisma eine Einheit bilden, die leicht ausgewechselt werden kann.

Der Detektor der erfindungsgemäßen Vorrichtung ist geeignet die reflektierte Strahlung von einem Abschnitt der Fläche des Trägers über einen hinreichend großen Winkelbereich zu erfassen. Der Winkelbereich beträgt vorzugsweise mindestens 1, 5° um einen mittleren Winkel, wobei der mittlere Winkel insbesondere etwa dem Resonanzwinkel einer Plasmonenresonanz entsprechen kann. Der mittlere Winkel ist in der derzeit bevorzugten Ausführungsform einstellbar, um die Position des Detektors den aktuellen experimentellen Bedingungen anzupassen. Während der des Betriebs der erfindungsgemäßen Vorrichtung, d. h. während der ortsaufgelösten Erfassung der von dem Träger reflektierten Strahlung braucht der Detektor dem geänderten Winkel allerdings nicht mehr nachgeführt zu werden, da die Detektorfläche hinreichend groß ausgelegt ist, die reflektierte Strahlung über den gesamten Winkelbereich zu erfassen.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ermöglicht somit eine schnelle Erfassung der reflektierten Intensität für verschiedene Winkel, da auf eine mechanische Nachführung des Detektors verzichtet werden kann, und somit auf die bei solchen Bewegungen auftretenden Beschleunigskräfte keine Rücksicht genommen werden muß. Dies führt zudem zu einem vereinfachten mechanischen und optischen Aufbau, der die Herstellungskosten der erfindungsgemäßen Vorrichtung erheblich reduziert.

Der von dem Detektor erfassbare Winkelbereich um einen mittleren Winkel beträgt weiter bevorzugt mindestens 2, 5°, und besonders bevorzugt mindestens 5°. Der erfassbare Winkelbereich um den mittleren Winkel ist vorzugsweise nicht größer als 20°, weiter bevorzugt nicht größer als 15°, und besonders bevorzugt nicht größer als 10°.

Der Detektor zur ortsaufgelösten Erfassung der Intensität der von der Trägeroberseite reflektierten Strahlung, ist bevorzugt ein Photodiodenarray oder eine CCD Kamera. Besonders bevorzugt sind jedoch CMOS-Kameras, welche insgesamt eine schnellere Bilderfassung ermöglichen.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist vorzugsweise als Plasmonenresonanzspektrometer ausgestaltet, prinzipiell können aber auch andere Nachweisprinzipien wie Brewsterwinkelspektroskopie und Elipsometrie zum Einsatz kommen.

Die Abhängigkeit der Intensität des reflektierten Lichts vom Einfallswinkel kann mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung ortsaufgelöst erfasst werden, wobei gleiche Punkte der bestrahlten Fläche des Trägers bzw. der Trägeroberseite während der Veränderung des Einstrahlwinkels auf verschiedenene Punkte des Detektors abgebildet werden.

Bei der derzeit bevorzugten Ausgestaltung wird der Einfallswinkel mit einem Drehspiegel bzw. Scannerspiegel variiert. Bei dieser Ausgestaltung fallen gleiche Teilstrahlen des einfallenden Strahlenbündels durch die Veränderung des Einstrahlwinkels auf verschiedenene Punkte der Fläche des Trägers bzw.

Trägeroberseite.

Der Scannerspiegel ist bevorzugt ein Galvanoscanner, dessen Steuerspannung ausreichend ist, den aktuellen Einstrahlwinkel zu ermitteln. In einer anderen Ausgestaltung der Erfindung wird ein Teilstrahl des von dem Spiegel reflektierten Lichts direkt auf einen zweiten Detektor reflektiert, wobei sich aus der Position dieses Teilstrahls auf dem zweiten Detektor der Einfallswinkel ermitteln läßt. In einer weiteren Alternative ist an der Achse des Scannerspiegels ein Winkelgeber angeordnet, der direkt ein winkelabhängiges Signal ausgibt. Anstelle eines Scannerspiegels mit einem oszillierenden Bewegungsablauf um einen mittleren Winkel kann auch ein Polygonspiegel mit monotoner Rotationsrichtung eingesetzt werden.

Die Auswertungseinheit kann beispielsweise einen Computer umfassen, mit vorzugsweise einem Speichermittel zum Speichern der für verschiedenen Winkel gemessenen ortsaufgelösten Intensitätsverteilung des von der Fläche reflektierten Lichtes ; und einer Datenverarbeitungseinheit, welche anhand der für verschiedene Winkel gemessenen ortsaufgelösten Intensitätsverteilungen, für verschiedene Punkte der Fläche des Trägers die Intensität als Funktion des Einfallswinkels ermittelt. Von dieser Datenverarbeitungseinheit oder einer anderen Datenverarbeitungseinheit kann dann anhand der winkelabhängigen Intensität für die verschiedenen Punkte der Fläche des Trägers mindestens eine Eigenschaft einer auf dem Träger präparierten Schicht bestimmt werden.

Diese Eigenschaft kann insbesondere die Schichtdicke oder die dielektrischen Eigenschaften der Schicht sein. Einzelheiten zur Ermittlung der Schichtdicke bzw. der dielektrischen Eigenschaften einer Schicht anhand der Winkelabhängigen Intensitätsverteilung sind beispielsweise dem Fachmann auf dem Gebiet der Plasmonenresonanzspektroskopie bekannt und brauchen hier nicht im einzelnen erörtert zu werden.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist vorzugsweise geeignet die beschriebene ortsaufgelöste winkelabhängige Intensitätsmessung und die Ermittlung der mindestens einen Schichteigenschaft fortlaufend durchzuführen. D. h., die winkelabhängige Intensitätsmessung über den fraglichen Winkelbereich und die nachfolgende Auswertung wird wiederholt durchgeführt.

Der Einfallswinkel wird bevorzugt von dem Computer der Auswerteeinheit gesteuert. Hierbei ist der zu überstreichende Winkelbereich vorzugsweise variabel einstellbar, um der jeweiligen experimentellen Fragestellung Rechnung zu tragen. Gleichermaßen ist bei einer bevorzugten Ausführungsform die Schrittweite zwischen den einzelnen Winkeln, bei denen eine Messung der Intensität erfolgt, variabel. In einer weiteren Ausführungsform ist vorgesehen, daß die Schrittweite nicht äquidistant ist, sondern dem Informationsgehalt der einzelnen Winkelbereiche entsprechend angepaßt werden kann, d. h. die Schrittweite kann beispielsweise um das Minimum der Plasmonenresonanz kleiner gewählt werden, als in

Winkelbereichen die außerhalb der Resonanz liegen. In einer weiteren Ausführungsform ist außerdem die automatische Ermittlung der Schrittweite möglich. Hierbei wird in einem Initialisierungsmodus zunächst die Intensitätskurve grob erfaßt, und anhand des ermittelten Kurvenverlaufs wird einerseits die Schrittweite für die einzelnen Winkelbereiche festgelegt und/ oder der gesamte Winkelbereich wird auf die relevanten Bereiche, beispielsweise den ermittelten Plasmonenresonanzwinkel 1, 25° oder 2, 5° bzw. 5° verkleinert. Für viele Anwendungsfälle ist die ungefähre Position des Resonanzwinkels insoweit bekannt, daß auf den Initialisierungsmodus im beschriebenen Sinne verzichtet werden kann. D. h. der erfaßte Wlnkelbereich erstreckt sich von Anfang an auf ein Intervall von beislpielsweise 2, 5° um den erwarteten ungefährenen Resonanzwinkel.

Die Datenanalyse des von der Probe reflektierten Lichteauf erfordert zunächst eine Korrektur für die Bildverschiebung. D. h. insofern als das Bild der Probe für verschiedene Winkel über die Detektorfläche wandert, ist eine Zuordnung der Signale für verschiedene Pixel des Detektors zu Punkten auf der Probe für verschiedene Winkel erforderlich. Die Verschiebung läßt sich an sich recht gut modellieren und korrigieren. Wenn jedoch der Detektor bzw. die Kamera Linsen aufweisen deren Randbereiche in den Strahlengang kommt es zu weiteren Bildverzerrungen die schwieriger analytisch zu beschreiben sind. Für diesen Fall wird bevorzugt, die Bidverschiebung einschließlich der Verzerrung experimentell zu ermitteln, indem beispielsweise die Abbildung eines reflektierenden hinreichend feinen Koordinatenrasters, welches anstelle einer Probe auf dem Probenträger angeordnet ist für verschiedene Einstrahlwinkel aufgezeichnet und gespeichert wird. Auf diese Weise ist eine eindeutige Zuordnung von Pixeln zu Probenpunkten für die verschiedenen Einfallswinkel gegeben. Sofern die resultierende Bildverschiebung für einen ersten Einfallswinkel zwischen einem zweiten und einem dritten Einfallswinkel hinreichen gut durch Interpolation zwischen den Bildverschiebung bei dem zweiten und dem dritten Einfallswinkel beschreibbar ist, so ist es ausreichend die Daten für Bildverschiebungen bei ausgewählten Einfallswinkeln als Stützstellen zu speichern und die Bildverschiebungen für andere Winkel durch Interpolation zu ermitteln.

Grundsätzlich stehen verschiedene Arten der Interaktion zwischen dem Detektor bzw. der Kamera und der Datenverarbeitungseinheit zur Verfügung.

In einer ersten Variante überträgt die Kamera für jeden gescannten Einfallswinkel sämtliche Bilddaten als Rohdaten an den Computer zur Auswertung. Diese Variante ist sehr Datenintensiv und damit zeitaufwendig.

In anderen Varianten erfolgt eine gewisse Vorprozessierung durch die Kamera. Hierbei werden für einen Winkel beispielsweise die Pixel von bestimmten Regionen von Interesse (ROI) zusammengefaßt, und für diese Regionen von interesse wird nur der erfaßte Intensitätsmittelwert, sowie der Minimalwert und der Maximalwert übertragen. In diesem Fall ist die zu übertragende Datenmenge erheblich geringer, und damit erfolgt die Datenübertragung schneller.

Die Beschränkung der Datenauswertung und Datenübertragung auf ROls ist insofern vorteilhaft, als das Abbild einer Probe auf dem Detektor durchaus uninteressante Bereiche enthält auf deren Signal es nicht ankommt. Sofern die Probe einen Mehrfachprobenträger, wie einen Micro-Array mit unterschiedlichen Analyten umfaßt, so ist der Bereich zwischen den einzelnen Analyten völlig uninteressant.

Insofern als die Bildpositionen der ROls für verschiedene Winkel beispielsweise nach dem oben beschriebenen Verfahren bekannt ist, kann das Auslesen des Detektors und die Analyse auf die Pixel beschränkt werden, auf die bei einem gegebenen Winkel Licht von den ROI reflektiert wird.

Insbesondere CMOS-Kameras sind zum selektiven Auslesen von Pixeln geeignet.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Untersuchung dünner Schichten, ist im wesentlichen ein Verfahren, bei dem die Schichten unter verschiedenen Einstrahlwinkeln so mit parallel verlaufendem Licht bestrahlt werden, daß das Licht auf einen zweidimensionalen Detektor reflektiert wird, und bei dem dann anhand der winkelabhängig unterschiedlichen Intensitäten des reflektierten

Lichts die Schichtdicke oder eine andere Schichteigenschaft ortsaufgelöst berechnet wird ; dadurch gekennzeichnet, daß durch die Winkeländerung bedingte Bildverschiebungen auf dem der Winkeländerung nicht nachgeführten Detektor vor der Ermittlung der Schichteigenschaften korrigiert werden. Die Korrektur erfolgt insbesondere durch elektronische Datenverarbeitung. Bevorzugt erfolgt vor der Ermittlung der Schichteigenschaften noch eine Korrektur der Helligkeitsschwankungen die nicht durch Eigenschaften der zu untersuchenden Probe bedingt sind. Hierzu kann beispielsweise eine Korrektur für die unterschiedlichen Intensitäten der verschiedenen Teilstrahlen des eingestrahlten Lichts gehören, und/oder eine Korrektur für die winkelabhängige Transmissionsfunktion der gesamten optischen Anordnung und/oder eine Korrektur für örtliche Inhomogenitäten des Detektors zur ortsaufgelösten Erfassung der winkelabhängigen Intensitätsverteilung des reflektierten Lichts.

Die Erfindung umfaßt auch ein Computerprogramm zur Steuerung einer Vorrichtung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens.

Weitere Vorteile und Gesichtspunkte ergeben sich aus den Unteransprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen.

Es zeigt : Fig. 1 eine schematische Ansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung ; Fig. 2 die Winkelabhängigkeit der Intensität der reflektierten Strahlung für verschiedene Probenpositionen ohne das Vorliegen einer Plasmonenresonanz ; Fig. 3a die Winkelabhängigkeit der Intensität der reflektierten Strahlung für verschiedene Probenpositionen bei Vorliegen einer Plasmonenresonanz ; Fig. 3b eine vergrößerte Darstellung des Resonanzminimums der Intensität der reflektierten Strahlung für verschiedene Probenpositionen ;

Fig. 4 die Winkelabhängigkeit der Signalposition auf dem Detektor für verschiedene Probenpunkte ; und Fig. 5 ein Flußdiagramm für ein Verfahren zur Ermittlung der Bildverschiebungen für verschiedene Winkel.

Die Erfindung soll nachstehend anhand eines in Figur 1 schematisch wiedergegebenen Ausführungsbeispiels näher erläutert werden. Gezeigt ist ein beispielhafter optischer Aufbau eines erfindungsgemäßen Oberflächenplasmonenresonanzsensors bzw. SPR Sensors (nach dem Englischen Surface Plasmon Resonance) sowie eines während des Meßprozesses auftretenden Strahlengangs.

Das optische System besteht aus einer bevorzugt monochromatischen Lichtquelle 1, vorzugsweise einem Laser oder einer Laserdiode geeigneter Wellenlänge, deren Strahlung mittels eines (nicht gezeigten) Polarisationsfilters parallel zur Einfallsebene des nachgeschalteten Sensorchips 4, der hier als Träger dient, polarisiert wird.

Der Durchmesser des Laserstrahls wird zunächst mit einem handelsüblichen Beam Expander 11 vergrößert und mit einem Scannerspiegel 2 unter verschiedenen Einfallswinkeln auf die Eintrittsfläche eines Prismas 3 gelenkt.

Ein Teilbereich des aufgeweiteten Strahls trifft unter verschiedenen Einfallswinkeln auf die Unterseite eines auf dem Prisma 3 befindlichen Sensorchips 4, der auf seiner Oberseite 5 mit einer SPR fähigen Goldschicht bedampft ist. Der Sensorchip 4 ist mittels Immersionsöl oder eines geeigneten Kunststoffs mit dem Prisma 3 optisch verbunden. Optional kann die Goldschicht auch direkt auf die Oberseite des Prismas 3 aufgedampft sein, jedoch ist der sensitive Bereich dann nicht mehr austauschbar.

Die Beleuchtung des Sensorchips unter verschiedenen Einfallswinkeln erfolgt derart, daß das parallele Strahlenbündel während der Messung über die Oberfläche hinwegstreicht, diese dabei aber zu jedem Zeitpunkt vollständig

ausleuchtet ; ein bestimmter Punkt a, b, c des Sensorchips wird also je nach Einfallswinkel von unterschiedlichen Teilstrahlen beleuchtet. In einer bevorzugten Anordnung wird der Einstrahlwinkel bei einer Lichtwellenlänge von 660 nm in einem Bereich von 5° um einen mittleren Winkel von etwa 75° gescannt.

Das von der mit Gold beschichteten Oberfläche 5 reflektierte Licht tritt aus dem Prisma aus und fällt auf einen abbildenden Detektor 6, vorzugsweise einen CCD Detektor oder ein Photodiodenarray.

Fig. 2 zeigt beispielsweise wie sich die unterschiedliche Intensität der verschiedenen eingestrahltenTeilstrahlen auf die Intensität des von den Punkten a, b, c der Oberfläche 5 reflektierten Lichts auswirken kann, welches bei dem Detektor 6 ankommt. In diesem Fall weist die Oberfläche 5 keine SPR-fähige Goldschicht auf. Alle Kurven zeigen die charakteristische Totalreflexionskante, und ansonsten das durch die Transmissionseigenschaften der Grenzflächen vorgegebene Verhalten. Die Kurven weichen jedoch insoweit voneinander ab, als die Punkte a, b, c bei unterschiedlichen Winkeln mit maximaler Intensität beleuchtet werden.

Fig. 3a zeigt, wie sich die zuvor beschriebenen unterschiedlichen Einstrahlintensitäten auf das vom Detektor empfangene Signal einer Plasmonenresonanz auswirken. Das eigentliche Resonanzverhalten ist in Kurve d gezeigt, wobei das vom Detektor 6 empfangene Signal von den Punkten a, b, c den mit den entsprechenden Buchstaben gekennzeichneten Verlauf hat. Durch Normierung mit den Kurven der Fig. 2 kann ggf. der eigentliche Resonanzverlauf d für die jeweiligen Punkte a, b, c gefunden werden.

Erschwerend kommt noch hinzu, daß die Punkte a, b, c des Sensorchips 4 je nach Einfallswinkel auf unterschiedliche Bereiche i, k des Arrays 6 abgebildet werden. Die winkelabhängige Bildverschiebung des Signals von den Punkten a, b, c ist schematisch in Fig. 4 dargestellt. Es ist deshalb notwendig, mittels einer zweckmäßigen Auswertungsvorrichtung und eines Korrekturalgorithmus

die einzelnen Bildpunkte i, k des CCD Arrays 6 je nach Einstrahlwinkel (Position des Scannerspiegels 2) einem bestimmten Punkt a, b, c auf der Sensorchipoberfläche 5 zuzuordnen. Gleichzeitig oder sequentiell können hierbei die oben erörterten beispielsweise durch Strahlinhomogenitäten verursachte Helligkeitsschwankungen der reflektierten Teilstrahlen korrigiert werden.

Die Auswirkung der beschriebenen Bildverschiebung und der Intensitätsinhomogenenitäten ist nochmals in Fig. 3b für den Bereich um den Plasmonenresonanzwinkel dargestellt. Ein erstes Pixel i empfängt mit anwachsendem Winkel zunächst von dem Punkt a, dann von dem Punkt b, und schließlich von dem Punkt c reflektiertes Licht vor dem Resonanzminimum. Zufällig erfaßt das gewählte erste Pixel i für diese Punkte bei den unterschiedlichen Winkeln etwa die gleiche Intensität. Ein zweites Pixel k empfängt die Signale von den Punkten a, b, c nach dem Durchgang durch das Resonanzminimum. Hier zeigt sich dagegen mit wachsendem Winkel ein dramatischer Anstieg der erfaßten Intensität für das Signal von den Punkten a, b, und c. Dieses Beispiel verdeutlicht, daß es für den Erfolg des beschriebenen Verfahrens daher von höchster Bedeutung ist, die von einem Pixel i, k erfaßten Signale dem richtigen Winkel und dem richtigen Punkt a, b, c der Chipoberfläche 5 zuzuordnen.

Fig. 5 zeigt ein Flußdiagramm, für ein Verfahren welches eine mögliche Grundlage für diese Zuordnung gibt. Danach wird ein kontrastreiches Koordinatengitter anstelle einer Probe eingesetzt, und dessen Abbild wird für verschiedene Winkel aufgezeichnet. Die Punkte des erfaßten Koordinatenbildes werden mittels eines Diskrimators entweder auf hell oder auf Dunkel gesetzt. Somit ist das Koordinatenbild identifizierbar und es ist eine eindeutige Zuordnung von Probenpositionen zu Pixeln für verschiedene Einfallswinkel gegeben. Die Bildverschiebung wird für verschiedene Einfallswinkel als Datenmatrixin einem Datenspeicher abgelegt. Und steht zur Auswertung zur Verfügung.

Nach den obigen Prinzipien läßt sich nun für die einzelnen Punkte a, b, c der Chipoberfläche 5 ortsaufgelöst die Intensität des reflektierten Signals in Abhängigkeit vom jeweiligen Winkel messen. Die so gemessene SPR Kurve kann zur Steigerung der Genauigkeit noch mit Hilfe der Fresnel-Theorie (vgl.

H. Wolter in, Handbuch der Physik', ed. S. Flügge, Springer) an simulierte Kurven gefittet werden. Der Einstrahlwinkel, unter dem die Intensität des reflektierten Lichts ein Minimum durchläuft, ist der sogenannte SPR Winkel.

Die zur Errechnung des SPR Winkels benötigte Position des Scannerspiegels 2 wird bei der derzeit bevorzugten Ausführungsform mit ausreichender Genauigkeit aus der jeweils anliegenden Steuerspannung des Galvoscanners errechnet.

Unter der Voraussetzung einer guten Auflösung der eingesetzten CCD Kamera und hinreichender Kapazität der nachgeschalteten Bildverarbeitungshard-und software lassen sich so die SPR Minimumswinkel für mehrere Millionen Pixel mit einer Frequenz von über 10 Hz gleichzeitig bestimmen. Dies ist ausreichend, um eine schnelle Echtzeitdetektion von Bindungsreaktionen an der Sensoroberfläche 5 zu gewährleisten. Durch diese elektronische Korrektur der während des Winkelscans auftretenden Bildverzerrungen und Intensitätsschwankungen ist es möglich, auf aufwendige und teure optische Komponenten weitestgehend zu verzichten.

Es sei an dieser Stelle erwähnt, daß das oben mit SPR beschriebene, erfindungsgemäße Verfahren auch mit anderen, verwandten Techniken durchgeführt werden kann. Hierzu zählen insbesondere Brewsterwinkelspektrometrie und Ellipsometrie. Die von einem Fachmann mit entsprechender Sachkenntnis leicht zu konstruierenden entsprechenden Meßaufbauten sind jedoch apparativ aufwendiger als SPR Geräte, weshalb hier nicht näher auf sie eingegangen wird.

Zur Messung der Wechselwirkung resp. Adsorption von biologischen oder chemischen Molekülen kann das oben beschriebene optische Detektorsystem mit einer Vorrichtung zur Beaufschlagung mit Flüssigkeiten oder Gasen

gekoppelt werden. Diese Vorrichtung wird auf die Oberfläche 5 des Chips 4 aufgesetzt. Je nach Verwendungszweck kann eine Probe mit der gesamten Fläche des Sensorchips 4 oder eine Vielzahl von Proben unabhängig voneinander mit verschiedenen Stellen des Sensorchips in Kontakt gebracht werden. Es ist dann möglich, Tausende von verschiedenen Proben innerhalb kurzer Zeit zu untersuchen.

Für bestimmte Anwendungsfälle ist es sinnvoll, die bei einem Winkel gemessenen Intensitäten von verschiedenen Pixeln in einem sogenannten "binning"zusammenzufassen. Dies ist bevorzugt dann der Fall, wenn diese Pixel alle Licht auffangen, welches von einem einheitlichen Bereich des Trägers reflektiert wird. Binning ist insbesondere dann anzuwenden, wenn der Träger bzw. der Sensorchip eine große Anzahl von diskreten Meßzellen aufweist, in denen ggf. unterschiedliche Proben vorliegen. Das Binning ordnet in diesem Falle für die verschiedenen Winkel die Pixel des Detektorarrays den Meßzellen des Sensorchips zu. Der jeweilige winkelabhängige Intensitätswert für eine Meßzelle ergibt sich dann durch Mittelung über die Intensitäten der zugeordneten Pixel. Die Mittelung kann selbstverständlich auch gewichtet erfolgen, so daß die peripheren Bereiche einer jeden Meßzelle geringer zum Signal beitragen als deren Zentrum. In Anwendungsfällen bei denen ein binning von Bildpunkten, sinnvoll ist, erscheint es vorteilhaft, bereits die Datenenauslese auf die Pixel zu beschränken, die Licht von den relevanten ROI bzw. homogenen Probenbereichen empfangen. Ein selektives Auslesen der Bilddaten von ROI ist insbesondere bei CMOS-Kameras möglich. CCD- Kameras sind für diesen Zweck wenig geeignet.