Область изобретения

Изобретение относится к области медицины и биологии, в частности к устройствам и способам для создания лекарственных форм для различных ферментных препаратов, а также других биологически активных компонентов (БАК) на основе эритроцитов, которые могут быть использованы как в лечении ряда заболеваний, так и в целях диагностики.

Предшествующий уровень техники

Ферменты, включенные в эритроциты, могут быть использованы как в фермент- заместительной и противоопухолевой терапии, так и для удаления из кровотока ряда низкомолекулярных токсичных соединений таких как аммиак, цианид, этиловый и метиловый спирт, ацетальдегид и т.д. [1]. В настоящее время фермент L-аспарагиназа (аспарагиназа) является неотъемлемой частью комплексной терапии острого лимфобластного лейкоза (ОЛЛ) у детей и взрослых [2], а также некоторых других видов онкологических заболеваний [3]. Аспарагиназа - это фермент, гидролизующий аминокислоту аспарагин до аспарагиновой кислоты и аммиака. Механизм ее противоопухолевого действия связан с уменьшением концентрации аспарагина в плазме, так как эта аминокислота необходима для синтеза белка и ее отсутствие приводит к замедлению деления опухолевых клеток из-за невозможности такого синтеза. Особенно эффективное действие аспарагиназа оказывает на клетки некоторых опухолей, которые, в отличие от нормальных клеток, не могут самостоятельно синтезировать аспарагин (например, при ОЛЛ) [4]. Однако внутривенное введение аспарагиназы ограничено существованием многих побочных эффектов, основными из которых являются возникновение сильных аллергических реакций, а также короткое время жизни аспарагиназы в кровотоке [5,6]. Создание новой лекарственной формы аспарагиназы (аспарагиназы, включенной в эритроциты) улучшает ее фармакологические свойства, т.к. сильно увеличивает время жизни аспарагиназы в кровотоке [7,8]. Это происходит потому, что аспарагиназа проводит свою реакцию, находясь внутри эритроцитов, что защищает ее от находящихся в плазме антител и протеаз, способных ее разрушить. Субстрат, с которым работает аспарагиназа - аспарагин, способен проникать из плазмы внутрь эритроцита через эритроцитарную мембрану [9]. Аспарагиназу для терапевтического применения получают из бактерий (Esherichia соН. либо из фитопатогенной Erwinia chryzanlhemi . те. она является для организма человека чужеродным белком. Однако если такая аспарагиназа спрятана внутри собственных клеток организма, это предупреждает развитие аллергических реакций на введенный чужеродный белок. Аналогично обстоит дело и с другими ферментными препаратами, которые включены в эритроциты и могут быть использованы для терапии ряда заболеваний.

Включение в эритроциты других БАК, например, низкомолекулярного антрациклинового антибиотика доксорубицина или терпено-индольных алкалоидов винкристина и винбластина, которые также широко используются в терапии ряда онкологических заболеваний [10-12], позволяет создать в эритроцитах депо этих лекарственных препаратов, которые постепенно выходят из эритроцитов-носителей, поддерживая в кровотоке достаточную терапевтическую концентрацию лекарства в течение долгого времени. Это важно, т.к., несмотря на высокую эффективность этих препаратов при прямом внутривенном введении, дозы препаратов, которые могут быть введены в организм, лимитируются их высокой токсичностью, например, их супрессивным действием на костный мозг [12], кардио- и нефротоксичностью [13]. При введении этих препаратов в эритроциты удается избавиться от их высоких пиковых концентраций в плазме в момент введения, которые и определяют, в большой степени, токсичность препаратов. Таким образом, включение ряда лекарственных ферментов и других биологически активных компонентов в эритроциты может обеспечивать улучшение фармакологических свойств данных БАК (их фармакокинетики и фармакодинамики), а также снижение их токсических эффектов. Несмотря на это, на данный момент существует мало установок, пригодных для рутинного применения для получения подобных эритроцитов-носителей фармакологических препаратов (фармакоцитов) для клинического использования.

В настоящее время наиболее мягкими, эффективными и щадящими способами, которые позволяют получить эритроциты-носители лекарственных препаратов со свойствами близкими к свойствам исходных эритроцитов, являются способы, основанные на обратимом гипоосмотическом воздействии на клетки. Из современного уровня техники известно несколько автоматизированных устройств-аналогов для включения аспарагиназы и других ферментов, а также низкомолекулярных БАК, в эритроциты использующих прием обратимого гипоосмотического воздействия:

1. Ropars С., Nicolau Y.C., Chassaigne М. Apparatus for encapsulating biological active substances into erythrocytes, US Patent 4,752,586, June 21, 1988, C12M 1/00 [14].

2. Pages E., Ropars C., Bailleul C. Apparatus for causing medical products to penetrate into red blood cells. US Patent 5,589,389, December 31, 1996, C12M 1/12, C12M 3/06) [15].

3. Устройство итальянской фирмы EryDel SpA (Societa per azioni) (до января 2010 г фирма Dideco (Sorin Group Italia, Sri): а). Magnani M., Panzani I., Bigi L., Zanella A. Method of encapsulating biologically active agents within erythrocytes and apparatus thereof (Dideco Sri, Italy). Европейский патент ЕР 0 882 448, дата публикации 12.01.2005, бюллетень 2005/02, А61К 9/50) [16]; б). Мамбрини Д., Серафини С. Устройство и набор для инкапсуляции в эритроцитах по меньшей мере одного соединения для терапевтического и диагностического применения (EryDel SpA, Italy). Патент России RU 2 595 844, дата публикации заявки РСТ 03.11.2011, А61К 9/50, А61М 1/36, ВО 1J 4/00) [17]; в). Мамбрини Д., Бенатти Л., Капогросси Д., Мандолини М. Способ получения эритроцитов, нагруженных одним или несколькими веществами, представляющими фармацевтический интерес, и полученные таким образом эритроциты (EryDel SpA, Italy). Патент России RU 2 670 070, дата публикации заявки РСТ 13.11.2014, А61К 9/50) [18].

4. Godfrin Y. Lisis/resealing process and device for incorporating an active ingredient, in particular asparaginase or inositol hexaphosphate, in erythrocytes (EryTech Pharma, France). Устройство французской фирмы EryTech Pharma. US Patent 10,273,444 B2, data of prior publication 5.06.2014, data of patent 30.04.2019, A61K 9/50, C12M 1/00, A61K 35/38, A61K 31/6615 [19].

Все указанные устройства используют для включения ферментов и других БАК в эритроциты различные варианты гипоосмотического способа, принцип которого состоит в том, что эритроциты приводят в контакт с гипоосмотическим раствором (те. раствором, имеющим осмоляльность ниже физиологической, составляющей 300 мОсм/кг). В результате этого возникает разница в осмотическом давлении по обе стороны эритроцитарной мембраны. Для уравновешивания осмотического давления внутри и снаружи эритроцита в него начинает поступать вода. Эритроцит постепенно набухает, в результате чего, после достижения максимально возможного объема (при сохранении постоянной площади поверхности эритроцита), в его мембране появляются разрывные дефекты (поры) диаметром от 8 до 50 нм, через которые из эритроцита может выходить гемоглобин и другие соединения, а внутрь эритроцита могут поступать компоненты (в том числе аспарагиназа или другие ферменты и низкомолекулярные соединения, а также нагруженные БАК наночастицы), присутствующие во внешнем растворе. Диаметр пор был измерен экспериментально и составлял от 8 до 50 нм [20-23], при этом было установлено, что для выхода гемоглобина из эритроцита достаточно образования пор диаметром около 10 нм [23,24].

В устройстве, описанном в патенте US 4,752,586 (Ropars С., et al.) [14], для включения биологически активных веществ в эритроциты могут быть использованы различные частные случаи выполнения устройства, которые позволяют работать с широким диапазоном объемов упакованных эритроцитов (от 200 мл до нескольких мл), которые должны быть сначала выделены из соответствующего объема исходной крови (от 450 мл до 10 мл). Общими чертами всех вариантов выполнения устройства является использование диализного элемента (диализатора) для лизиса эритроцитов, состоящего из двух отсеков (компартментов), разделенных диализной мембраной. Устройство диализных элементов может быть различным. Они могут содержать 2 отсека, разделенных только одной плоской полупроницаемой мембраной, или множество полых волокон из полупроницаемой мембраны, окруженных внешним отсеком. В первом отсеке циркулирует суспензия эритроцитов, а во втором - гипоосмотический раствор для обеспечения лизиса эритроцитов. Вещество, которое должно быть включено в эритроциты вводится с помощью насоса в трубку, через которую суспензия эритроцитов подается в диализный элемент (до прохождения этой суспензии через теплообменное устройство, обеспечивающее нужную для диализа клеток температуру). Запечатывание полученных эритроцитов-носителей может быть проведено путем запечатывания пор в мембранах этих эритроцитов, при восстановлении нормальной осмотичности в суспензии лизированных в присутствии включаемого препарата эритроцитов, путем их инкубации при температуре от 20°С до 40°С с гиперосмотическим раствором (те. раствором с осмоляльностью выше физиологической, составляющей 300 мОсм/кг) как в отдельном резервуаре, так и во втором диализном элементе, в первом отсеке которого циркулирует суспензия лизированных эритроцитов, а во втором - гиперосмотический раствор. В отдельных частных случаях выполнения устройства для целей лизиса и запечатывания эритроцитов может быть использован один и тот же диализный элемент, после соответствующей замены буфера во втором отсеке и установления температуры, соответствующей каждому из процессов (примерно от 0°С до 10°С для лизиса и примерно от 20°С до 40°С для запечатывания эритроцитов). Устройство имеет целый ряд стандартных приспособлений для измерения температуры в отдельных его частях, а также давления жидкости (или суспензии эритроцитов) на входе в диализные элементы и осмотического давления жидкости (или суспензии эритроцитов), чтобы обеспечивать оптимальные условия прохождения всех процессов.

В качестве недостатков данного устройства следует отметить, что оно работает только с суспензией отмытых эритроцитов, а наиболее простым и реально используемым его воплощением является то, которое работает с большими объемами этой суспензии (полученными из объемов крови от 200 до 450 мл), тогда как работа с малыми объемами суспензии эритроцитов (в несколько мл) осложнена. Примеры такого использования устройства отсутствуют. Устройство не предусматривает концентрирования клеток после лизиса, а кинетика процесса изменяется при существенном разбавлении исходной суспензии эритроцитов, которое происходит в этом случае. Требуется строгий подбор параметров диализаторов (площади диализной мембраны и пропускной способности диализатора, которая определяется, в том числе, скоростью протекания суспензии эритроцитов и лизирующего раствора через отдельные компартменты диализного элемента), а также строгий выбор отношений площадей мембран диализных элементов для лизиса клеток и для их запечатывания, которые не всегда могут быть обеспечены существующими на сегодняшний день моделями диализных элементов. Устройство не включает приспособления для отмывания клеток и не является полностью автоматическим.

В устройстве, раскрытом в патенте US 5,589,389 (Pages Е., Ropars С. и Bailleul С., 1996), которое фактически является вариантом выполнения устройства по патенту US 4,752,586, для включения БАК (инозитолгексафосфата, ИГФ) используют большой объем исходной крови (1 трансфузионная единица, те. ~ 450 мл крови) [15]. Указанное устройство включает дополнительно блок отмывания, который позволяет получить суспензию отмытых эритроцитов, исходя из цельной крови или эритромассы. В данном варианте выполнения устройства для включения БАК в эритроциты используется тот же принцип обратимого гипоосмотического лизиса исходных эритроцитов, отмытых при 4° С, инкубация их с включаемым веществом (при 4° С) и последующее запечатывание полученных эритроцитов-носителей путем возвращения эритроцитарной суспензии нормальной осмоляльности при инкубации с гиперосмотическим раствором (при 37°С).

В данном осуществлении изобретения в качестве примера описано включение в эритроциты инозитолгексафосфата, который добавляют в среду уже на второй и третьей ступени отмывания исходных эритроцитов. Устройство состоит также из модуля лизиса эритроцитов, в котором поддерживается температура ниже 10°С (оптимально 4°С), и модуля запечатывания полученных эритроцитов-носителей, в котором поддерживается температура выше 20°С (оптимально 37°С). Все элементы модулей лизиса и запечатывания, которые контактируют с эритроцитами, являются одноразовыми (легко заменяемыми и имеющими низкую стоимость).

В качестве элемента для отмывания эритроцитов в данном устройстве могут быть использованы любые известные устройства для отмывания эритроцитов, например, устройства фирмы Haemonetics V50®, PCS или Cell Saver®. Кроме того, в данном способе добавление включаемого вещества в суспензию эритроцитов предложено проводить еще на стадии отмывания исходных эритроцитов. Это отмывание состоит из трех последовательных ступеней, первую из которых проводят физиологическим раствором, а две следующих тем же раствором, содержащим добавленный ИГФ. Блоки для лизиса эритроцитов и запечатывания полученных эритроцитов-носителей, имеют принципиально схожее строение. В каждом из них присутствует емкость для доведения суспензии эритроцитов до нужной температуры (4° С или 37° С, соответственно), а также емкость, в которой проходит диализ в присутствии ИГФ термостатированных эритроцитов с добавлением гипоосмотического раствора или инкубация суспензии лизированных эритроцитов с гиперосмотическим раствором. Блок лизиса содержит также отдельную емкость, в которой уже лизированные в присутствии БАК эритроциты дополнительно инкубируются при 4°С, прежде, чем перейти в блок запечатывания. Емкость для диализа эритроцитов (диализный картридж) состоит из 2 отсеков, разделенных полупроницаемой мембраной, через один из которых прокачивается суспензия отмытых эритроцитов в присутствии БАК (снизу вверх), а через другой - лизирующий гипоосмотический буфер (сверху вниз). Теплообменные блоки для термостатирования суспензии эритроцитов смонтированы на терморегулируемых пластинах из нержавеющей стали, с обратной стороны которых имеются электрические катушки для обеспечения необходимой температуры. Устройство в целом содержит несколько перистальтических насосов для обеспечения прокачки по системе магистралей (те. трубок, соединяющих отдельные элементы устройства) суспензии эритроцитов, лизирующего и гиперосмотического буферов, а также оптические или вакуумные устройства для определения наличия жидкости в магистралях, и устройство для определения трансмембранного давления в диализном картридже. Все перистальтические насосы управляются автоматически с помощью контролирующего процесс электронного блока с учетом данных, получаемых с различных датчиков. Трансмембранное давление в диализном картридже поддерживается на уровне 300 мм рт. ст.

В качестве недостатка данного устройства можно отметить то, что оно работает только с большим объемом исходной крови (примерно 450 мл). Это связано с тем, что устройство не имеет приспособления для концентрирования разбавленной суспензии эритроцитов, которая всегда получается при отмывании эритроцитов из малых объемов исходной крови на стандартных отмывающих эритроциты устройствах. Данные об эффективности включения БАК в эритроциты в данном патенте не представлены. Кроме того, добавление включаемого вещества (ИГФ) в раствор для отмывания эритроцитов сильно увеличивает расход этого вещества. Однако авторы пишут о том, что добавление включаемого вещества можно делать в суспензию и после отмывания эритроцитов (до подачи их в термостатирующий блок).

В патентах ЕР 0 882 448 (Dideco Sri, Italy), а также RU 2 595 844 и RU 2 670 070 С2 (EryDel SpA, Italy) раскрываются варианты устройства для включения БАК в эритроциты, выделенные из небольших объемов (обычно 50 мл, реже до 100 мл) цельной аутологичной крови пациента [16,17,18]. Исходную кровь центрифугируют, чтобы отделить эритроциты от плазмы, и отмывают эритроциты изоосмотическим (те. имеющим физиологическую осмоляльность равную 300 мОсм/кг) солевым раствором с помощью центрифужного колокола для отмывания эритроцитов, являющегося частью устройства. Для достижения открытия пор в эритроцитарной мембране используют способ предварительного постепенного набухания (pre-swelling), когда эритроциты помещают последовательно в два гипоосмотических раствора (причем осмоляльность второго раствора ниже осмоляльности первого из них). В патентах [16,17] осмоляльности гипоосмотических растворов выбраны так, что после контакта с первым раствором эритроциты набухают и сферулируются, а после добавления второго гипоосмотического раствора эритроциты лизируются (или частично лизируются), с образованием в эритроцитарной мембране временных пор. При этом суспензия эритроцитов каждый раз сильно разбавляется гипоосмотическим раствором (до финального гематокрита около 4%- 2.5%), поэтому после этапа инкубации с гипоосмотическими растворами суспензию лизированных эритроцитов концентрируют. Для этого используют диализное устройство (например, картридж с полыми волокнами из полупроницаемой мембраны), в котором суспензия лизированных (или частично лизированных) эритроцитов прокачивается по внутреннему контуру диализатора, а из внешнего контура осуществляется частичная откачка лизирующего раствора во внешнее приемное устройство. Затем в сконцентрированную суспензию лизированных клеток добавляют водный раствор включаемого БАК, который начинает поступать внутрь эритроцитов через образовавшиеся в мембране эритроцита поры. После окончания процесса инкубации осмоляльность внешней среды восстанавливают до нормальной величины, добавляя в суспензию клеток гиперосмотический раствор, в результате чего поры в мембране эритроцита закрываются и часть включаемого компонента остается внутри эритроцитов-носителей. Большинство стадий процесса регулируется автоматически с помощью специального электронного блока.

В качестве недостатков устройства можно отметить, что оно не является полностью автоматическим. В данном устройстве отмывание исходных эритроцитов и полученных эритроцитов-носителей осуществляется с помощью устройства автоматически, однако ввод включаемого компонента и гиперосмотического раствора в суспензию эритроцитов производится оператором вручную. Недостатком устройства является относительно большая потеря внутриклеточного содержимого эритроцитов, обусловленная сильным разбавлением эритроцитов при инкубации и лизисе в присутствии гипоосмотических растворов, что в свою очередь приводит к снижению содержания внутриклеточных веществ в эритроцитах после того, как их мембрана становится частично лизированной. И хотя макромолекулы не могут уйти из гемофильтра (диализатора), в котором затем проводят концентрирование, содержание низкомолекулярных метаболитов гликолиза (с молекулярным весом меньше 10000 дальтон) должно снижаться при откачке водного раствора из внешнего контура диализатора, т.к. эти метаболиты сначала выходят в большой объем гипоосмотических растворов на стадии лизиса, а затем легко проходят через диализную мембрану на стадии концентрирования эритроцитов. В устройстве имеется качающаяся платформа с подогревом до определенной температуры для мешка, в котором происходит запечатывание лизированных эритроцитов с включенным препаратом, однако все стадии набухания и лизиса эритроцитов идут при комнатной температуре без охлаждения растворов и суспензии до примерно 4°С, что вызывает снижение выхода включения препарата, т.к. известно, что время жизни образующихся в мембране пор уменьшается при повышении температуры до комнатной. В устройстве отсутствуют датчики давления в диализаторе при концентрировании и датчики гематокрита.

В патенте RU 670 070 [18], устройство для включения БАК в эритроциты не отличается от устройства, ранее описанного в патентах [16,17], однако в нем описан вариант способа получения БАК, при котором потеря внутриклеточного содержимого снижена, а эффективность включения БАК увеличена относительно ранее описанного в патентах [16,17] способа за счет того, что осмотичность второго гипоосмотического раствора выбрана такой, что лизиса набухших эритроцитов при контакте со вторым гипоосмотическим раствором не происходит. Эритроциты, набухшие после двух последовательных ступеней обработки гипоосмотическими растворами, где осмоляльность второго раствора ниже, чем осмоляльность первого гипоосмотического раствора, сначала концентрируются, а потом к ним добавляется водный раствор включаемого вещества, что и приводит к лизису набухших эритроцитов (уже в присутствии БАК). При этом осмотичность суспензии набухших эритроцитов после добавления первого гипоосмотического раствора составляет 250-200 мОсм/кг, осмотичность суспензии набухших эритроцитов после добавления второго гипоосмотического раствора составляет 200-170 мОсм/кг, а осмотичность суспензии эритроцитов после двух ступеней набухания и добавления включаемого биологически активного компонента составляет примерно 150-110 мОсм/кг.

Еще в одном известном устройстве, раскрытом в патенте US 10,273,444 (фирмы EryTech Pharma, France) [19], выбранном нами в качестве ближайшего аналога, для снижения осмоляльности среды снаружи эритроцитов используют процесс диализа суспензии эритроцитов против гипоосмотического раствора с помощью диализатора, в котором суспензия эритроцитов протекает по внутреннему контуру, а гипоосмотический раствор протекает противотоком по его внешнему контуру. БАК, который должен быть включен в эритроциты, при этом помещают либо в исходную суспензию отмытых эритроцитов (т.е. во внутренний контур), либо в суспензию уже лизированных эритроцитов после их выхода из диализатора. Затем загруженные БАК эритроциты запечатывают, восстанавливая, как и в других методах, осмоляльность внешней среды. В качестве недостатков устройства надо отметить отсутствие полной автоматизации процесса и невозможность проведения на одном устройстве всех стадий способа. Данное устройство не включает приспособлений для отмывания эритроцитов (исходных и полученных после включения препарата) и работает только с предварительно отмытой на каком-либо внешнем устройстве эритромассой. При этом объем этой эритромассы может быть от 10 мл до 250 мл упакованных эритроцитов.

Параметры процесса лизиса в диализаторе (скорость протекания суспензии эритроцитов по внутреннему контуру диализатора и/или осмоляльность лизирующего раствора) устанавливаются оператором вручную, в соответствии с предварительно измеренной осмотической хрупкостью используемых для включения лекарственного препарата эритроцитов. Измерение осмотической хрупкости эритроцитов также производится во внешнем устройстве. Это не позволяет полностью автоматизировать процесс включения БАК в эритроциты, т.к. коэффициенты в уравнениях, связывающих различные параметры проведения лизиса с отдельными показателями осмотической хрупкости исходных эритроцитов должны быть установлены для каждого вида используемых диализаторов отдельно, т.к. зависят от параметров самого диализатора.

В качестве ближайшего аналога способа по изобретению выбран способ, раскрытый в патенте US 8,617,840 (фирмы EryTech Pharma, France) [19], в котором для снижения осмоляльности среды снаружи эритроцитов используют процесс диализа суспензии эритроцитов против гипоосмотического раствора с помощью диализатора, в котором суспензия эритроцитов протекает по внутреннему контуру, а гипоосмотический раствор протекает противотоком по его внешнему контуру. БАК, который должен быть включен в эритроциты, при этом помещают либо в исходную суспензию отмытых эритроцитов (т.е. во внутренний контур), либо в суспензию уже лизированных эритроцитов после их выхода из диализатора. Затем загруженные БАК эритроциты запечатывают, восстанавливая, как и в других методах, осмоляльность внешней среды.

Особенности данного способа таковы, что в качестве исходного компонента может быть использована только отмытая эритромасса, работа с цельной кровью не предусматривается. При этом объем этой эритромассы может быть от 10 мл до 250 мл упакованных эритроцитов.

Стадии способа также разнесены по разным устройствам: незадолго до стадии лизиса проводят измерение осмотической хрупкости эритроцитов, на основании результатов которого выбирают условия лизиса (осмолярность лизирующего раствора и/ или скорость протекания суспензии клеток через диализатор), измерение хрупкости клеток проводят на внешнем устройстве на образце, начальная температура которого составляет от +1 до +8°С. Процесс занимает 20-30 минут.

На основании полученных данных рассчитывают скорость потока клеток в диализаторе или осмолярность диализующего раствора с применением следующих формул:

Скорость потока эритроцитов = [ А х ( Н so )] + [ х ( И)] + ^ (1), где Нзо - осмолярность, при которой лизировано 50% эритроцитов, V - объем суспензии эритроцитов, А и В - переменные, которые регулируются в зависимости от параметров диализатора и осмолярности лизирующего раствора; К - регулируемая константа.

Осмолярность лизирующего раствора = [ С х ( Я ₅₀ )] + [ D ^х ( И)] + К (2), где С и D - переменные, которые регулируются в зависимости от параметров диализатора и скорости потока эритроцитов в диализаторе; К - регулируемая константа.

Рассчитанные параметры процесса лизиса в диализаторе (скорость протекания суспензии эритроцитов по внутреннему контуру диализатора и/или осмолярность лизирующего раствора) устанавливаются оператором вручную, т.к. коэффициенты в уравнениях, связывающих различные параметры проведения лизиса с отдельными показателями осмотической хрупкости исходных эритроцитов должны быть установлены для каждого вида используемых диализаторов отдельно, т.к. зависят от параметров самого диализатора.

Такой способ корректировки и установления параметров процесса лизиса является длительным и трудоемким, и не может быть легко использован в любой лаборатории. Кроме того, его использование повышает вероятность установления некорректных значений ввиду вероятности ошибки оператора.

На основании анализа известного уровня техники можно сделать вывод, что проблема создания устройств и способов, позволяющих с высокой эффективностью, быстротой, точностью и воспроизводимостью включать в эритроциты необходимые биологически активные компоненты, остается нерешенной.

Существо заявляемого изобретения

Техническая задача, которую решает настоящее изобретение, заключается в устранении недостатков известных устройств. Технической задачей, решаемой настоящим изобретением, является создание устройства и способа, направленных на обеспечение высокой и воспроизводимой эффективности (степени) включения различных БАК в эритроциты и снижение потери внутриклеточного содержимого.

Техническим результатом настоящего изобретения является получение высокой и воспроизводимой степени включения различных БАК в эритроциты, что обеспечивается использованием одинакового объема раствора, поданного на вход и откачиваемого на выходе из внешнего контура диализатора на этапе диализа, достижением нужной величины гематокрита суспензии эритроцитов, поддержанием стерильных условий, поддержанием трансмембранного давления и давления во внутреннем контуре диализатора в заданных для каждой стадии процесса диапазонах, поддержанием заданного температурного режима и возможностью работы с необходимым объемом крови или предварительно отмытой эритромассы без потери качества получаемых БАК.

Степень включения различных БАК в эритроциты превосходит степень включения БАК в эритроциты для известных устройств и способов.

Технический результат достигается посредством создания настоящего изобретения.

В одном из аспектов изобретение относится к созданию полностью автоматизированного устройства для включения БАК путем проведения в стерильных условиях гипоосмотического проточного диализа эритроцитов в присутствии биологически активного компонента (или компонентов) с последующим запечатыванием полученных эритроцитов-носителей, являющегося предметом настоящей заявки.

Устройство для включения в эритроциты, по меньшей мере, одного биологически активного компонента, включает блок отмывания эритроцитов, блок лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов, блок запечатывания эритроцитов-носителей и блок управления, при этом блок отмывания эритроцитов содержит'. устройство для отмывания эритроцитов; блок лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов содержит'. по меньшей мере одну емкость для физиологического раствора, по меньшей мере один диализатор, внешний и внутренний контуры которого соединены с по меньшей мере одной емкостью для физиологического раствора, по меньшей мере три насоса, один из которых предназначен для перемещения растворов и эритроцитов через внутренний контур диализатора, а два других предназначены для перемещения растворов по внешнему контуру диализатора, по меньшей мере один насос для БАК, по меньшей мере один насос для гиперосмотического раствора, по меньшей мере один датчик измерения гематокрита, по меньшей мере два датчика давления, по меньшей мере один из которых установлен на входе во внутренний контур диализатора и по меньшей мере один из которых установлен на выходе из внешнего контура диализатора, по меньшей мере три датчика наличия жидкости, оборудование для термостатирования, по меньшей мере две емкости для эритроцитов, соединенные с внутренним контуром диализатора и устройством для отмывания эритроцитов, по меньшей мере одну емкость для гипоосматического раствора, соединенную с внешним контуром диализатора, блок запечатывания эритроцитов-носителеи содержит'. оборудование для термостатирования, а также по меньшей мере одну емкость для эритроцитов, соединенную с внутренним контуром диализатора и с устройством для отмывания эритроцитов; элементы устройства соединены между собой магистралями, а блок управления выполнен с возможностью синхронизации работы элементов устройства, посредством приема сигналов с датчиков и передачи сигналов управления на клапаны, расположенные на магистралях, и насосы устройства.

Элементы заявляемого устройства являются существенными признаками, и их совокупность оказывает влияние на достижение заявленного результата.

Согласно изобретению емкость, заполненная кровью пациента или донора, соединенная с устройством для отмывания эритроцитов посредством магистрали с клапанами и служащая на последующих этапах для сбора и инкубации с гиперосмотическим раствором эритроцитов, лизированных в присутствии биологически активного компонента, размещена в блоке запечатывания эритроцитов- носителей.

В блоке отмывания эритроцитов размещено устройство для отмывания эритроцитов. Данное устройство характеризуется наличием центрифуги, сменной центрифугируемой емкости, в частном случае, например, сменного центрифужного конуса для отмывания эритроцитов, необходимых насосов и емкостей с исходным и отработанным раствором для отмывания эритроцитов. Для работы устройства по изобретению могут быть использованы как любые известные устройства для отмывания эритроцитов, например, устройства фирмы Haemonetics V50®, Cell Saver®, АРС 215 и др., так и специально сконструированные и включенные в состав заявляемого устройства узлы для отмывания эритроцитов. При этом все применяемые устройства позволяют наполнять и опорожнять центрифугируемую емкость, без извлечения из центрифуги, что обеспечивается наличием соответствующего сочленения вращающейся и неподвижной частей устройства для отмывания.

Диализатор, емкость для сбора суспензии отмытых из цельной крови эритроцитов, или предварительно отмытых эритроцитов в случае работы с эритроцитарной массой, емкость для сбора отмытых запечатанных эритроцитов- носителей, емкости для физиологического раствора, емкость для гипоосмотического раствора, соединенные между собой и с диализатором посредством магистралей с клапанами, а также насосы, установленные на разных входах диализатора, шприцевые насосы, датчики давления и наличия жидкости в магистралях и датчики измерения гематокрита размещены в блоке лизиса и концентрирования.

Емкость с цельной кровью пациента или донора, являющаяся также емкостью для сбора и запечатывания лизированных в присутствии биологически активных компонентов эритроцитов, емкости с суспензией отмытых эритроцитов и с суспензией запечатанных эритроцитов-носителей установлены на шейкерах, обеспечивающих перемешивание в указанных емкостях их содержимого при требуемой температуре.

При этом в блоке отмывания эритроцитов осуществляют этапы при комнатной температуре, а в блоке лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов поддерживается температура от +2°С до +10°С, предпочтительно, от +4°С до +6°С.

В блоке запечатывания полученных эритроцитов-носителей цельную кровь пациента или донора в начале процедуры и суспензию лизированных в присутствии биологически активного компонента эритроцитов на этапе ее сбора в данной емкости содержат при комнатной температуре, а последующий этап запечатывания лизированных в присутствии биологически активного компонента эритроцитов осуществляют при температуре от +25°С до +40°С. На магистралях, отходящих от шприцевых насосов, от емкостей с физиологическим и гипоосмотическим растворами могут быть установлены бактериальные фильтры. В блоке лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов, на этапе концентрирования, насосы, установленные на внешнем контуре диализатора, выполнены с возможностью прокачивания по внешнему контуру диализатора физиологического раствора, причем один из указанных насосов выполнен с возможностью прокачивания физиологического раствора с постоянной скоростью, а другой насос выполнен с возможностью прокачивания физиологического раствора с переменной скоростью, поддерживая постоянное трансмембранное давление в диализаторе при концентрировании на уровне 90-120 мм рт. ст.

В блоке лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов, на этапе диализа, насосы, установленные на внешнем контуре диализатора, выполнены с возможностью прокачивания по внешнему контуру гипоосмотического раствора с одинаковой скоростью.

Насос, установленный на входе во внутренний контур диализатора, выполнен с возможностью прокачивания по внутреннему контуру диализатора суспензии эритроцитов с переменной скоростью, причем на этапе концентрирования скорость указанного насоса постепенно уменьшается, когда давление на входе во внутренний контур диализатора превышает атмосферное на 120 мм рт. ст., а на этапе диализа указанный насос функционирует с переменной скоростью для поддержания трансмембранного давления в диализаторе на уровне 160-180 мм. рт. ст.

Все емкости присоединены к системе магистралей стерильно и удаляются из нее только после остановки работы устройства.

Датчики наличия жидкости в магистралях обеспечивают контроль за окончанием одной стадии процесса за счет передачи сигнала на блок управления, который принимает решение о необходимости переключения соответствующих клапанов в устройстве для перехода на следующую стадию. Это способствует полной автоматизации всего процесса без необходимости вмешательства оператора. Блок управления, получая сигналы с датчиков давления, регулирует трансмембранное давление в диализаторе и давление на входе во внутренний контур диализатора, путем изменения скоростей работающих насосов, не допуская повышения величины этого давления свыше допустимой, что может привести к разрушению эритроцитов, проходящих через диализатор в данных условиях. Датчики давления способствуют получению высокого выхода эритроцитов- носителей, а также улучшению их свойств, которые приближены к свойствам исходных нативных эритроцитов.

Наличие двух насосов, работающих на внешнем контуре диализатора, один из которых расположен на входе во внешний контур диализатора и подает в него на стадии диализа эритроцитов в присутствии БАК гипоосмотический раствор, а второй расположен на выходе из внешнего контура диализатора и откачивает прошедший через внешний контур диализатора гипоосмотический раствор, причем объем откачиваемого раствора точно соответствует объему раствора, поданного во внешний контур диализатора, не позволяет избыточной воде входить во внутренний контур диализатора, что снижает разбавление суспензии во внутреннем контуре диализатора в ходе диализа и способствует увеличению эффективности включения БАК в эритроциты.

В устройстве используются датчики гематокрита. Наличие указанных датчиков позволяет контролировать достижение нужной величины гематокрита суспензии, получаемой в процессе концентрирования разбавленных после процесса отмывания суспензий эритроцитов (исходных или запечатанных после лизиса в присутствии БАК).

Устройство по изобретению характеризуется простотой монтажа и мобильностью.

В следующем аспекте изобретение относится к созданию способа включения в эритроциты, по меньшей мере, одного биологически активного компонента методом проточного гипоосмотического диализа, содержащего следующие стадии: добавление, по меньшей мере, одного биологически активного компонента к суспензии сконцентрированных отмытых из цельной крови эритроцитов или к предварительно полученной эритромассе; лизис эритроцитов в присутствии, по меньшей мере, одного биологически активного компонента с помощью гипоосмотического проточного диализа; инкубация суспензии эритроцитов, лизированных в присутствии, по меньшей мере, одного биологически активного компонента, с гиперосмотическим раствором с образованием запечатанных эритроцитов-носителей, содержащих, по меньшей мере, один биологически активный компонент; отмывание запечатанных эритроцитов-носителей, содержащих, по меньшей мере, один биологически активный компонент; концентрирование с помощью диализатора запечатанных эритроцитов- носителей, содержащих, по меньшей мере, один биологически активный компонент; вымывание из диализатора оставшихся там запечатанных эритроцитов- носителей и добавление их к ранее полученным запечатанным эритроцитам- носителям, содержащим, по меньшей мере, один биологически активный компонент; при этом, стадию лизиса эритроцитов в присутствии, по меньшей мере, одного биологически активного компонента, проводят при поддержании постоянного трансмембранного давления в диализаторе 160-180 мм рт. ст. и давлении на входе во внутренний контур диализатора, не превышающем атмосферное более, чем на 120 мм рт. ст, а концентрирование эритроцитов осуществляют при поддержании постоянного трансмембранного давления в диализаторе 90-120 мм рт. ст. с учетом измеряемых показателей давления во внешнем и внутреннем контурах диализатора.

Концентрирование суспензии эритроцитов позволяет откачать из суспензии лишнюю жидкость, максимально сохранив число целых клеток в образце. Для выбора трансмембранного давления на стадии концентрирования суспензии эритроцитов было исследовано, как повышение этого давления влияет на гемолиз эритроцитов, находящихся в диализаторе. На фиг. 4 представлены результаты экспериментов на эритроцитах из двух различных образцов крови. Как видно на представленной фигуре, при трансмембранном давлении выше 120 мм рт. ст. уже наблюдается увеличение содержания гемоглобина в сливаемой из диализатора жидкости, что соответствует увеличению гемолиза в ходе процесса концентрирования. С другой стороны, трансмембранное давление ниже 90 мм рт. ст. допустимо, но сильно увеличивает длительность процедуры концентрирования. Таким образом, оптимальным для стадии концентрирования суспензии эритроцитов был выбран интервал трансмембранного давления 90-120 мм рт. ст. По той же причине, чтобы не терять эритроциты в результате их гемолиза, давление на входе во внутренний контур диализатора, по которому проходит суспензия эритроцитов, не должно превышать атмосферное более, чем на 120 мм. рт. ст.

Так как лизированные в результате гипоосмотического диализа эритроциты имеют в своей мембране временные поры, они способны выдержать более высокие трансмембранные давления без полного разрушения клеток. Чтобы выбрать оптимальный интервал трансмембранного давления в диализаторе на стадии лизиса, были проведены опыты, в которых был определен процент инкапсуляции аспарагиназы при различном трансмембранном давлении (фиг. 5). На основании проведенных экспериментов было установлено, что поддержание во время диализа трансмембранного давления в диализаторе 160-180 мм рт. ст. обеспечивает стабильно высокий процент включения вещества в эритроциты. Более низкое давление недостаточно для эффективного включения, а слишком высокое давление приводит к уменьшению эффективности включения, по-видимому, в результате более сильного гемолиза клеток. Таким образом, как оптимальный интервал трансмембранного давления в ходе гипоосмотического диализа эритроцитов был выбран диапазон 160-180 мм рт. ст.

Биологически активный компонент (или компоненты) добавляется в исходную эритромассу или, в случае, когда в качестве исходного материала использовали цельную кровь, в отмытые из исходной цельной крови и затем сконцентрированные эритроциты.

Если в качестве исходного материала использована цельная кровь, стадии добавления, по меньшей мере, одного биологически активного компонента к суспензии сконцентрированных отмытых из цельной крови эритроцитов предшествуют стадия отмывания эритроцитов из исходной цельной крови и стадия их последующего концентрирования. В частности, концентрирование суспензии эритроцитов, отмытых из цельной крови, позволяет избежать их сильного разбавления перед добавлением БАК и, таким образом, проводить процесс последующего гипоосмотического лизиса при более высоком гематокрите и концентрации БАК, что дополнительно повышает эффективность включения БАК и снижает потерю внутриклеточного содержимого в ходе диализа.

Дополнительным преимуществом заявленного способа является возможность работать не только с отмытой эритроцитарной массой, но и цельной кровью пациента или донора.

Для способа по изобретению предпочтительны представленные ниже температурные режимы.

Стадию отмывания эритроцитов осуществляют при комнатной температуре.

Стадию лизиса и концентрирования суспензии эритроцитов осуществляют при поддержании температуры от +2°С до +10°С, предпочтительно, от +4°С до +6°С.

Стадию запечатывания лизированных в присутствии биологически активного компонента или компонентов эритроцитов осуществляют при температуре от +25°С до +40°С. Такие диапазоны температур стандартны для большинства способов включения БАК в эритроциты, и продиктованы физиологическими особенностями мембраны эритроцита. Известно, что деформируемость эритроцита меняется с температурой [25]. Для создания стабильных пор в мембране на стадии диализа необходимо обеспечить минимальную текучесть мембраны эритроцита, чему способствует низкая температура. Однако, слишком низкая температура может приводить к агрегации эритроцитов [26], поэтому оптимальным считается диапазон, приведенный выше. На стадии запечатывания лизированных эритроцитов необходимо обеспечить оптимальную текучесть мембраны эритроцита для быстрого закрытия пор в мембране. Так как текучесть мембраны эритроцитов повышается с повышением температуры, для восстановления формы эритроцита логично создавать температуру близкую к физиологической. Температура выше 40°С может приводить к денатурации белков в мембране клетки и, как следствие, к гемолизу эритроцитов.

Предпочтительными, но не ограничивающими, являются следующие варианты реализации способа.

В частном варианте реализации способа на стадии лизиса эритроцитов с помощью гипоосмотического диализа поддерживают постоянное трансмембранное давление в диализаторе 170 мм рт. ст, а на стадии концентрирования поддерживают постоянное трансмембранное давление 100 мм рт. ст.

В частном варианте реализации способа стадию концентрирования отмытых эритроцитов проводят до достижения величины гематокрита суспензии эритроцитов 75%- 80%.

Способ проводят в стерильных условиях.

В качестве раствора для отмывания эритроцитов можно использовать физиологический раствор, раствор Bio-Wash или другие изоосмотические растворы для отмывания эритроцитов. Для лизиса эритроцитов и последующего их запечатывания используют гипоосмотический и гиперосмотический растворы, соответственно.

Краткое описание фигур

Заявляемое изобретение может быть проиллюстрировано следующими фигурами:

На фиг. 1 представлено схематическое изображение варианта заявляемого устройства. На фиг. 2 представлена диаграмма потоков суспензии эритроцитов в заявляемом устройстве.

На фиг. 3 представлен алгоритм работы блока управления.

На фиг. 4 представлена зависимость концентрации гемоглобина в суспензии эритроцитов, прошедших через внутренний контур диализатора в ходе стадии концентрирования суспензии эритроцитов, от уровня трансмембранного давления во внешнем и внутреннем контурах диализатора. Показаны результаты экспериментов на эритроцитах из двух различных образцов крови, в которых концентрирование 10% суспензии эритроцитов проводили в течение 8 мин при различных трансмембранных давлениях в диализаторе.

На фиг. 5 представлена зависимость степени инкапсуляции аспарагиназы от уровня трансмембранного давления в диализаторе на стадии гипоосмотического диализа эритроцитов в присутствии аспарагиназы.

На фиг. 6 представлены электронные микрофотографии исходных эритроцитов, а также полученных из них с помощью предлагаемого способа эритроцитов-носителей, содержащих либо аспарагиназу, либо совместно включенные глутаматдегидрогеназу и аланинаминотрансферазу.

На фиг. 7 представлены гематологические показатели (эритроцитарные индексы) исходных эритроцитов и эритроцитов-носителей, нагруженных различными БАК, полученных с помощью заявляемого способа.

На фиг. 8 представлена осмотическая резистентность исходных эритроцитов и эритроцитов-носителей, нагруженных различными БАК, полученных с помощью заявляемого способа.

На фиг. 9 представлены параметры, характеризующие фильтруемость исходных эритроцитов и эритроцитов-носителей различных БАК, полученных с помощью заявляемого способа.

Термины и определения

Для лучшего понимания заявляемой сущности изобретения ниже приведены основные термины и определения, используемые в дальнейшем описании.

БАК - биологически активный компонент.

В качестве биологически активного компонента для включения в эритроциты может быть использован целый ряд веществ, обладающих какой-либо лекарственной или биологической активностью. В эритроциты могут быть включены самые разнообразные соединения, относящиеся к различным классам веществ, и микрочастицы, обладающие биологической активностью и способные быть удержанными внутри эритроцита. Приведенные здесь конкретные примеры молекул не являются ограничивающими способ по изобретению, а лишь демонстрируют возможности конкретных вариантов реализации. Ряд используемых БАК включает (но не ограничивается) следующие вещества и классы соединений: различные белки, в том числе ферменты (например, аспарагиназа, глутаматдегидрогиназа, аланинаминотрансфераза или их комбинации); пептиды, олигопептиды и полипептиды, аминокислоты; нуклеиновые кислоты, нуклеотиды, олигонуклеотиды, фосфаты нуклеотидов, в том числе ди- и трифосфаты; аналоги нуклеозидов, используемые как терапевтические агенты (иммуносупрессанты и ингибиторы роста опухолевых клеток), такие как 6-меркаптопурин, азатиопурин, флударабинфосфат; противовирусные агенты, такие как фосфорилированный азидотимидин, (AZT), дидезоксицитозин (ddC), природные и синтетические иммуномодуляторы (активаторы и супрессоры), например, производные мурамилдипептида (MDP); вещества с антикарциногенной активностью (метатрексат, винкристин, винбластин, доксорубицин и т.п.); гормоны (например, кортикостероиды и глюкокортикостероиды); нестероидные противовоспалительные агенты; аллостерические регуляторы гемоглобина (например, инозитолгексафосфат или пиридоксальфосфат); вещества, защищающие гемоглобин или эритроциты (например, криопротекторы); простагландины; лейкотриены (например, лейкотриен II); цитокины; антитела; а-, Р- и у- интерфероны; глутатион; токсины; и другие вещества, имеющие фармакологическую активность.

Кроме того, в качестве биологически активного компонента в эритроциты могут быть включены различные искусственные наночастицы, с включенными биологически активными препаратами или соединениями. Это позволяет, например, использовать эритроцит-носитель как депо-форму в случае наночастиц, которые из-за состава своей поверхности обладают коротким временем циркуляции в кровотоке. Кроме того, такие наночастицы могут обладать, например, сильной флюоресценцией или магнитными свойствами, которые могут быть использованы для создания биосенсоров, концентрирования лекарственного компонента в нужном органе с использованием магнитов или для усиления контрастности при создании биологических изображений, например, при магнитно-резонансной томографии (МРТ) и т.п. Комнатная температура - температура от 20°С до 25°С;

Рабочие растворы - растворы, используемые на разных этапах работы заявляемого устройства для включения биологически активных компонентов в эритроциты, к которым относятся физиологический раствор, раствор Bio-Wash или другие изоосмотические растворы для отмывания эритроцитов, гипоосмотический и гиперосмотический растворы и т.п.;

Исходный материал - цельная кровь пациента или соответствующая по группе цельная кровь донора (исходная кровь), или предварительно отмытые эритроциты (исходные эритроциты);

Эритроциты - красные клетки крови;

Эритроцитарная масса (эритромасса, упакованные эритроциты) - концентрированная суспензия отмытых эритроцитов с высоким гематокритом (60-80%);

Эритроциты-носители (ЭН) - эритроциты, содержащие включенный биологически активный компонент (или компоненты);

Лизированные эритроциты - эритроциты, полученные в результате обратимого гипоосмотического лизиса, например, путем диализа суспензии эритроцитов против гипоосмотического буфера с помощью диализного устройства (диализатора), в мембране которых образовались временные поры;

Лизированные эритроциты-носители - эритроциты, лизированные в присутствии БАК, например, путем диализа против гипоосмотического буфера, содержащего БАК, в мембране которых образовались временные поры и часть БАК поступила внутрь эритроцитов;

Эритроциты-биореакторы - частный случай эритроцитов, нагруженных БАК. Эритроциты, нагруженные ферментным препаратом, способным проводить свою реакцию внутри клеток, в которые он включен;

Запечатанные эритроциты-носители - эритроциты, загруженные БАК, с восстановленной целостностью мембраны клетки, получаемые путем восстановления осмотичности в суспензии лизированных эритроцитов-носителей при добавлении к ней гиперосмотического раствора;

Эффективность (степень или выход) включения БАК (Е) - процент от общего количества, введенного в систему БАК, оказавшийся запечатанным внутри эритроцитов- носителей в результате проведения процедуры включения БАК в эритроциты (процент или выход инкапсуляции); Относительная эффективность включения БАК (R) - процент, который составляет реально полученная в эритроцитах-носителях концентрация (или, в случае включения ферментов, активность) БАК от максимально возможной в данных условиях, за которую принимают концентрацию (или активность) БАК в суспензии отмытых из цельной крови или исходных предварительно отмытых эритроцитов;

Фармакоциты - эритроциты с включенным фармакологическим компонентом;

Магистрали - пластиковые или силиконовые гибкие трубки, соединяющие различные узлы устройства;

PBS - физиологический раствор, содержащий 10 мМ фосфатного буфера, имеющий pH 7.4.

На приведенных выше фигурах использованы следующие обозначения.

ПН1 - перистальтический насос, посредством которого на разных стадиях процесса во внутренний контур диализатора поступает суспензия эритроцитов или физиологический раствор;

ПН2 и ПНЗ - перистальтические насосы, посредством которых физиологический раствор или гипоосмотический раствор из соответствующих мешков поступают во внешний контур диализатора и откачиваются из этого контура, соответственно;

ШН1 и ШН2 - шприцевые насосы для подачи включаемого биологически активного компонента (или компонентов) и гиперосмотического раствора, соответственно; ЭН - полученные эритроциты-носители, содержащие БАК.

Каждый этап обозначен отдельным индексом. В различных частных случаях выполнения изобретения в качестве исходного материала используется либо цельная кровь, либо предварительно отмытая эритромасса (указано, как этапы al или а2 на фиг. 2, соответственно, которые соответствуют введению в систему исходного материала). Перемещения суспензии эритроцитов по магистралям устройства на каждом этапе осуществления способа обозначены следующим образом: al и а2 - введение исходного материала (исходной крови или исходных отмытых эритроцитов, соответственно) в систему; b - подача цельной крови из исходного мешка на отмывание; с - сбор отмытых эритроцитов в мешок для суспензии отмытых эритроцитов; d - концентрирование отмытых эритроцитов; е - гипоосмотический диализ и сбор лизированных в присутствии БАК эритроцитов в мешок, находящийся в блоке для запечатывания, с последующей инкубацией суспензии лизированных ЭН в этом мешке с гиперосмотическим раствором для из запечатывания; f - подача запечатанных ЭН на отмывание; g - сбор запечатанных эритроцитов-носителей после их отмывания в мешок для суспензии ЭН; h - концентрирование полученных ЭН после их отмывания.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Представленные ниже сведения приведены для лучшего понимания принципа работы заявленного изобретения. Эти сведения не являются ограничивающими, а лишь иллюстрируют общие принципы работы устройства.

Для получения эритроцитов-носителей биологически активного компонента (компонентов) в качестве исходного материала может быть использована как цельная кровь пациента или донора с аналогичной группой крови, так и предварительно отмытые упакованные эритроциты (эритроцитарная масса, эритромасса).

На фиг. 1 представлено схематическое изображение варианта заявляемого устройства, которое можно условно разбить на блоки, выполняющие следующие функции:

- блок I - блок отмывания эритроцитов из исходной крови и отмывания полученных запечатанных эритроцитов-носителей, содержащих включенный БАК, работающий при комнатной температуре;

- блок II - блок лизиса эритроцитов и концентрирования суспензии отмытых из исходной крови эритроцитов, а также суспензии запечатанных эритроцитов-носителей, содержащих включенный БАК, температура внутри которого поддерживается постоянной в пределах от +2°С до +10°С (предпочтительно +4°С до +6°С);

- блок III - блок запечатывания, в котором в одном из частных случаев воплощения устройства, при использовании в качестве исходного материала цельной крови, помещается сначала мешок с этой кровью, а затем в ходе выполнения последующих стадий, в любом из частных случаев воплощения устройства, в этот же мешок собирается суспензия лизированных в присутствии БАК эритроцитов, причем от начального этапа работы устройства до полного окончания сбора этих эритроцитов в данном мешке он находится при комнатной температуре, а после завершения сбора, выполняется стадия запечатывания лизированных в присутствии БАК эритроцитов при температуре от +25°С до + 40°С.

Блоки II и III, для поддержания заданной температуры, могут находиться, например, в термостатируемых камерах, где возможно поддержание необходимой температуры (на схеме не показаны). Поддержание необходимой температуры в блоках II и III также может осуществляться за счет других средств. В каждом указанном блоке размещаются емкости, предпочтительно, стандартные пластиковые мешки (контейнеры): так мешок 1 в одном из частных случаев воплощения устройства, предназначен для размещения в нем исходного материала - цельной крови пациента или крови донора с соответствующей группой крови, а затем, после осуществления стадии диализа, в любом из частных случаев воплощения устройства, мешок 1 служит для сбора и последующего запечатывания лизированных эритроцитов- носителей, содержащих БАК; мешок 2 - мешок, в который в одном из частных случаев воплощения устройства помещают исходный материал - предварительно отмытые эритроциты, либо, в другом частном случае воплощения устройства, в него собирается суспензия эритроцитов, полученных из исходной цельной крови на стадии отмывания; мешок 3 - для полученных запечатанных и отмытых эритроцитов-носителей, мешки 4.1, 4.2 и 5 - для физиологического раствора; мешок 6 - для гипоосмотического раствора; мешки 7.1 и 7.2 - для растворов, используемых на стадии исходного и финального отмывания эритроцитов; а также мешки 8, 9 и 10 - для сбора отработанных растворов. В качестве емкостей для раствора включаемого биологически активного компонента (компонентов) и гипертонического раствора используются шприцы, являющиеся сменным элементом шприцевых насосов 11 и 12, соответственно.

Элементы заявляемого устройства соединены магистралями, представляющими собой трубки, например, гибкие пластиковые или силиконовые трубки. На магистралях, отходящих от шприцевых насосов 11 и 12, а также от мешков 4.1, 4.2, 5 и 6 (с физиологическим и гипоосмотическим растворами), могут быть установлены бактериальные фильтры (на фиг. 1 номерами не обозначены).

Устройство включает диализатор 13, внутренний контур которого заключен внутри полых волокон из полупроницаемой мембраны и окружен внешним контуром, и устройство 21 для отмывания эритроцитов, включающее центрифужный конус, являющийся сменным элементом заявляемого устройства.

Диализатор 13, шприцы в шприцевых насосах, подводящие магистрали и центрифужный конус в устройстве 21, а также бактериальные фильтры, составляют одноразовый набор, используемый для работы заявляемого устройства.

Устройство для отмывания эритроцитов, насосы, в том числе и шприцевые, датчики давления, датчики наличия жидкости в магистралях и датчики гематокрита составляют набор многоразового использования, применяемый для работы данного устройства. Устройство включает ряд датчиков. Датчики 14 и 15 - для измерения давления, на выходе из внешнего и входе во внутренний контур диализатора 13, соответственно, в качестве которых могут быть использованы любые известные датчики давления, например, манометр дифференциальный цифровой DT-8890 производства СЕМ (Shenzhen Everbest Machinery Industry Co., Everett, WA, USA), датчик давления Honeywell 26PCDFA6D (Honeywell International Inc., Charlotte, NC, USA) и т.п.; датчики 16 и 17 - для измерения гематокрита, например, оптические; датчики 18, 19 и 20, которые фиксируют наличие жидкости (растворов и суспензии эритроцитов) в соответствующих магистралях, в качестве которых могут быть использованы, например, ультразвуковой датчик компании Dongguan Lidit Electronics Со., Ltd (Dongguan, China), датчики Sonocheck® ADB Air Bubble Sensors (например, ADB05) (SONOTEC Ultraschallsensorik Halle (Saale) GmbH, Germany) и т.п.

При необходимости количество датчиков может быть увеличено.

В качестве устройства 21 для отмывания эритроцитов может быть использовано любое известное устройство для такого отмывания, например, устройство фирмы Haemonetics АРС-215 (Haemonetics SA, Швейцария), или специально сконструированный встроенный в установку узел для отмывания, содержащий центрифугу, сменную центрифугируемую емкость, необходимые насосы и мешки с исходным и отработанным раствором для отмывания эритроцитов.

Для мягкого перемешивания суспензии эритроцитов в мешках 1, 2 и 3 используются шейкеры 22, 23 и 24, соответственно. Шейкер 22 размещен в блоке III, в котором поддерживается требуемая температура, или шейкер 22 может быть объединен с устройством, способным поддерживать различную температуру. Перемешивание в мешке 1 цельной крови на стадии отмывания из нее эритроцитов или сбор в данный мешок 1 суспензии лизированных в присутствии БАК эритроцитов осуществляется в условиях комнатной температуры. На стадии инкубации для запечатывания эритроцитов-носителей температура в блоке III поддерживается в пределах от +25°С до +40°С. Шейкеры 23 и 24, обеспечивающие перемешивание суспензии в мешках 2 и 3, расположены в термостатируемом блоке II, где поддерживается температура от +2°С до +10°С, предпочтительно от +4° С до +6° С.

Перемещение растворов и суспензии эритроцитов по системе магистралей обеспечивается работой насосов 25, 26 и 27, например, перистальтических, а направление, по которому перемещаются растворы и суспензия эритроцитов на каждом из этапов работы заявляемого устройства, обеспечивается открытием или перекрыванием соответствующих клапанов: 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 и клапанов 39, 40 устройства 21 для отмывания эритроцитов. В термостатируемых блоках II и III, расположены датчики температуры (на фиг. 1 не показаны).

Схема последовательных этапов перемещения суспензии эритроцитов в ходе работы устройства представлена на фиг. 2, где используются следующие обозначения:

ПН1 - перистальтический насос 25, посредством которого суспензия эритроцитов поступает во внутренний контур диализатора 13, ПН2 и ПНЗ - перистальтические насосы 26 и 27, посредством которых физиологический раствор из мешка 5 или гипоосмотический раствор из мешка 6 поступают во внешний контур диализатора 13 и откачиваются из этого контура, соответственно; ШН1 и ТТГН2 - шприцевой насос 11 для подачи включаемого биологически активного компонента (или компонентов) и шприцевой насос 12 для гиперосмотического раствора, соответственно; ЭН - полученные эритроциты-носители, содержащие БАК.

Каждый этап работы устройства обозначен отдельным индексом. В различных частных случаях выполнения устройства в качестве исходного материала используется либо цельная кровь, либо предварительно отмытая эритромасса (указано, как этапы al или а2 на фиг. 2, соответственно, которые соответствуют введению в систему исходного материала). Перемещения суспензии эритроцитов по магистралям устройства на каждом этапе работы устройства обозначены следующим образом: al и а2 - введение исходного материала (исходной крови или исходных отмытых эритроцитов, соответственно) в систему; b - подача цельной крови из мешка 1 на отмывание; с - сбор отмытых эритроцитов в мешок 2 для суспензии отмытых эритроцитов; d -концентрирование отмытых эритроцитов; е - диализ и сбор лизированных в присутствии БАК эритроцитов в блок III для запечатывания; f - подача запечатанных ЭН на отмывание; g - сбор запечатанных эритроцитов-носителей после их отмывания в мешок 3 для суспензии ЭН; h - концентрирование полученных ЭН после их отмывания.

Если в качестве исходного материала используют цельную кровь, то после этапа al последовательно осуществляются этапы b-h; если в качестве исходного материала используют предварительно отмытую эритромассу, то после этапа а2 осуществляются этапы e-h.

Все указанные элементы заявляемого устройства работают в автоматическом режиме и регулируются посредством блока управления, который выполнен с возможностью синхронизации работы элементов устройства, посредством приема и передачи сигналов управления на все элементы устройства. Указанный блок управления соединен с компьютером, на котором установлено разработанное для заявляемого устройства программное обеспечение. Компьютер может быть соединен с заявленным устройством или встроен в устройство.

Устройство может быть выполнено в едином корпусе.

Описание этапов работы устройства

Дополнительно для понимания работы устройства представлены этапы его работы.

Этап 1. Промывка диализатора, магистралей и заполнение мешка с исходной кровью дополнительным физиологическим раствором

Перед началом работы устройства с помощью сканера, соединенного с устройством, производится считывание штрих-кода исходного материала (исходной цельной крови или исходной эритромассы), который загружается в устройство.

Для осуществления включения биологически активных компонентов в эритроциты способом проточного диализа, блок управления сначала открывает все клапаны устройства и ожидает команды об успешной загрузке сменного одноразового набора, после чего закрывает все клапаны кроме 28, 36, 38. Проводится промывка диализатора и всей системы магистралей, чтобы избежать возможности образования в них воздушных пузырей.

Блок управления включает насос 25 и, для промывки системы магистралей, физиологический раствор из мешков 4.1 и 4.2 посредством насоса 25 подается во внутренний контур диализатора 13, при этом клапаны 28 и 38 открыты. Отработанный физиологический раствор удаляется в мешок 10. Одновременно, блок управления включает насосы 26 и 27 и физиологический раствор из мешка 5 посредством насоса 26 подается во внешний контур диализатора 13. Отработанный физиологический раствор посредством насоса 27 удаляется в мешок 9. Промывка диализатора 13 осуществляется в течение 2-5 мин при максимальной скорости работы насосов 25, 26 и 27 (100 мл/мин).

В одном из частных случаев воплощения заявляемого устройства, когда в качестве исходного материала используют цельную кровь пациента или донора с соответствующей группой крови (от 50 до 400 мл), ее помещают в мешок 1, который стерильно присоединяют в блоке III, например, посредством припаивания, к каналу одноразовой системы магистралей, ведущему к клапану 39. В качестве отмывающего эритроциты устройства 21 может использоваться любое известное устройство, содержащее сменную центрифугируемую емкость, например, центрифужный конус. Предпочтительно иметь конус с объемом близким к объему крови, находящейся в мешке 1. Многие известные отмывающие устройства имеют достаточно большой объем конуса. В частности, устройство фирмы Haemonetics АСР-215, может иметь объем конуса 275 мл, поэтому если объем исходной цельной крови, находящейся в мешке 1, меньше этого объема, например, от 50 до 200 мл, перед началом отмывания эритроцитов, мешок необходимо дозаполнить дополнительным физиологическим раствором до указанного объема конуса. По окончании промывки диализатора 13 блок управления перекрывает клапаны 36, 38, выключает насосы 26 и 27, открывает клапан 31, и физиологический раствор из мешков 4.1 и 4.2 посредством насоса 25 закачивается в мешок 1 со скоростью 100 мл/мин в течение 1-2 мин. После достижения в мешке 1 общего объема 275 мл, блок управления отключает насос 25, и перекрывает клапаны 28 и 31.

Количество добавляемого в мешок 1 физиологического раствора определяется объемом крови в мешке 1 и объемом выбранного конуса устройства 21 для отмывания эритроцитов.

В другом частном случае воплощения устройства, при использовании в качестве исходного материала предварительно отмытых упакованных эритроцитов (эритроцитарной массы), перед началом работы устройства ее помещают в мешок 2, который стерильно присоединяют, например, посредством припаивания, к трем каналам одноразовой системы магистралей устройства в блоке II, один из которых ведет к клапану 29 и датчику 16 для определения гематокрита, второй ведет к клапану 32 и датчику 18 наличия жидкости в магистрали и третий ведет к клапану 30 и датчику 17 для определения гематокрита, а мешок 1 остается незаполненным и на данном этапе не используется (см. фиг. 1 и фиг. 2).

Этап 2. Отмывание эритроцитов из исходной цельной крови

В частном случае выполнения устройства, когда в качестве исходного материала используют цельную кровь пациента (или донора с соответствующей группой крови), которую помещают в мешок 1 в блоке III, необходимо сначала получить из этой крови суспензию эритроцитов для дальнейшего включения в них биологически активных компонентов. Для этого осуществляют этап отмывания эритроцитов из крови, помещенной в мешок 1. Блок управления открывает клапан 39 и включает насос устройства 21. Кровь из мешка 1 при открытом клапане 39 посредством насоса, являющегося частью устройства 21 для отмывания эритроцитов (на фиг. 1 не показан), поступает в данное устройство 21. Из мешков 7.1 и 7.2 в конус устройства 21 для отмывания эритроцитов поступает раствор для отмывания эритроцитов, в качестве которого может быть использован физиологический раствор, раствор Bio-Wash, представляющий собой физиологический раствор с добавленной глюкозой (0.2%), или другие солевые растворы с нормальной осмотичностью. Отработанный отмывающий раствор затем удаляется в мешок 8. После завершения отмывания эритроцитов блок управления перекрывает клапан 39 открывает клапаны 40 и 32, и отмытые эритроциты посредством работы упомянутого насоса устройства 21 поступают в мешок 2 для отмытых эритроцитов через открытый клапан 32. Поступление отмытых эритроцитов в мешок 2 фиксируется датчиком 18 наличия жидкости в магистрали, ведущей в мешок 2.

Для установления наличия жидкости в магистралях могут быть использованы любые датчики наличия жидкости в магистралях, например, фиксирующие это наличие оптически, по вакуумному разряжению в магистрали, либо по электрическому сопротивлению и т.д.

По окончанию поступления отмытых эритроцитов в мешок 2, блок управления выключает насос устройства 21 и перекрывает клапаны 32, 40.

В другом частном случае воплощения устройства, когда в качестве исходного материала используют предварительно отмытую эритроцитарную массу (от 25 до 250 мл), которую перед началом работы устройства помещают в мешок 2 и стерильно присоединяют к системе соответствующих магистралей, этап отмывания эритроцитов не проводят, а мешок 1, размещенный в блоке III, остается на этом этапе незаполненным.

Этап 3. Концентрирование отмытых эритроцитов

В частном случае выполнения устройства, когда в качестве исходного материала используют цельную кровь пациента или донора с соответствующей группой крови, которую помещают в мешок 1 в блоке III, суспензия отмытых эритроцитов после этапа отмывания поступает в мешок 2.

Объем и гематокрит полученной суспензии отмытых эритроцитов определяются объемом исходной крови, находящейся в мешке 1, а также объемом конуса устройства 21 для отмывания эритроцитов. Если объем исходной крови небольшой (например, 50-100 мл), а объем конуса устройства 21 такого, как устройство АРС-215, составляет, например, 275 мл, то после этапа отмывания получают достаточно разбавленную суспензию эритроцитов. Чтобы предотвратить большую потерю внутриклеточного содержимого в ходе последующего диализа эритроцитов, отмытые эритроциты необходимо предварительно сконцентрировать. Концентрирование отмытых эритроцитов осуществляется посредством диализатора 13. Блок управления открывает клапаны 29, 30, 36 и включает насосы 25, 26, 27. При мягком перемешивании суспензии эритроцитов в мешке 2 для поддержания ее однородности посредством работы шейкера 23, суспензия отмытых эритроцитов из мешка 2 через открытый клапан 29 посредством насоса 25 закачивается во внутренний контур диализатора 13 со скоростью 10-30 мл/мин, после чего прошедшая диализатор 13 суспензия отмытых эритроцитов возвращается в мешок 2 через открытый клапан 30. Одновременно, во внешнем контуре диализатора 13 из мешка 5 в мешок 9 посредством насоса 26 (работает с постоянной скоростью 20 мл/мин) и насоса 27 прокачивается физиологический раствор. Исходная скорость работы насоса 27, который работает с переменной скоростью, выше, чем у насоса 26, но посредством работы блока управления она снижается так, чтобы поддерживать в диализаторе 13 постоянное трансмембранное давление 90-120 мм. рт. ст. (предпочтительно 100 мм рт. ст.). Указанное трансмембранное давление определяется разностью показаний датчиков давления 14 и 15, сигнал с которых позволяет блоку управления контролировать давление в контурах диализатора 13 и определять режим работы насоса 27. Одновременно блок управления не позволяет абсолютному давлению на входе во внутренний контур диализатора (датчик давления 15) превышать атмосферное более, чем на 120 мм рт. ст, для чего блок управления постепенно снижает скорость работы насоса 25.. Концентрирование суспензии происходит за счет более высокой скорости работы насоса 27, откачивающего из внешнего контура диализатора больший объем раствора, чем тот, что был закачан в этот контур насосом 26. Таким образом, в ходе концентрирования суспензия отмытых эритроцитов прокачивается «по кольцу» до тех пор, пока скорости работы насосов 26 и 27 не станут одинаковыми. После этого процесс концентрирования прекращается, т.к. при равных скоростях подачи и выкачивания раствора из внешнего контура диализатора дальнейшего концентрирования суспензии во внутреннем контуре диализатора уже не происходит. Гематокрит суспензии отмытых эритроцитов в ходе концентрирования контролируется на выходе из мешка 2, а также после выхода из внутреннего контура диализатора 13 посредством датчиков 16 и 17 (например, оптических) для измерения гематокрита, соответственно. Показания этих датчиков фиксируются в протоколе эксперимента. Если уровень полученного гематокрита гораздо ниже необходимого (65-80%), блок управления сигнализирует о нарушенных условиях и включается лампочка, которая сигнализирует о нарушении условий, необходимых для проведения процедуры включения БАК в эритроциты (т.е. о том, что данный эксперимент неудачен). После окончания процедуры концентрирования блок управления выключает насосы 26 и 27 и перекрывает клапан 36. Далее блок управления перекрывает клапан 29 и открывает клапан 28, при этом через клапан 28 посредством насоса 25 через внутренний контур диализатора 13 физиологический раствор из мешков 4.1 и 4.2 (примерно 30-40 мл) продолжает прокачиваться в мешок 2 с максимально возможной скоростью, при которой давление на входе во внутренний контур диализатора не превышает атмосферное более, чем на 120 мм рт. ст, чтобы в мешок 2 были собраны оставшиеся в диализаторе 13 отмытые эритроциты. Одновременно блок управления включает насос 11, и посредством шприцевого насоса 11 в магистраль, ведущую в мешок 2, добавляется включаемый биологически активный компонент (или смесь нескольких компонентов). Затем блок управления перекрывает клапаны 28 и 30. Величина гематокрита суспензии в мешке 2 после окончания концентрирования и смыва туда оставшихся в диализаторе клеток составляет от 65 до 80%. Она фиксируется датчиком гематокрита 16 сразу после начала процедуры диализа.

В частном случае воплощения устройства, когда исходным материалом является предварительно отмытая эритроцитарная масса (от 25 до 250 мл), которую помещают в мешок 2 и стерильно присоединяют его к системе магистралей, блок управления включает насос 11 и в магистраль, ведущую в мешок 2, посредством шприцевого насоса 11 сразу после окончания промывки диализатора (см. этап 1) добавляется включаемый биологически активный компонент, после чего блок управления включает насос 25, который прокачивает 5 мл физиологического раствора из мешков 4.1 и 4.2 в мешок 2, чтобы полностью смыть в этот мешок добавленный раствор БАК. Если для включения в эритроциты используют несколько БАК, все они могут быть либо предварительно смешаны и одновременно введены в систему с помощью одного шприцевого насоса 11, либо для введения могут быть использованы несколько отдельных шприцевых насосов 11.

Все последующие этапы работы устройства осуществляются одинаково при использовании в качестве исходного материала, как цельной крови пациента или донора с соответствующей группой крови, так и предварительно отмытых упакованных эритроцитов.

Этап 4. Диализ Величина гематокрита суспензии отмытых эритроцитов из мешка 2, которая поступает в диализатор 13 для прохождения процесса диализа, отличается от величины гематокрита, использованной исходной предварительно отмытой эритромассы или величины гематокрита, фиксированной датчиком гематокрита 17 на выходе из диализатора 13, при которой было закончено концентрирование суспензии эритроцитов, отмытых из исходной цельной крови (65-80%). Если в качестве исходного материала используется предварительно отмытая эритромасса, то в мешок 2 добавляется 5 мл физиологического раствора для полного смыва из магистрали, ведущей в мешок 2, БАК, добавленного в эту эритромассу. В случае отмывания эритроцитов из исходной цельной крови, после завершения этапа их концентрирования производится смыв в мешок 2 оставшихся в диализаторе 13 клеток дополнительными 30-40 мл физиологического раствора, а также добавление определенного объема раствора включаемого БАК. Реальная величина гематокрита суспензии эритроцитов, поступающей на диализ, фиксируется датчиком 16 для измерения гематокрита, установленным на выходе из мешка 2.

Перед началом диализа блок управления включает насосы 26, 27, открывает клапан 37 и через внешний контур диализатора посредством насосов 26 и 27 из мешка 6 в течение 1 минуты прокачивается гипоосмотический раствор (со скоростью 30 мл/мин), который сливается в мешок 9. Затем на этапе диализа блок управления включает насос 25, открывает клапаны 29 и 31, и из мешка 2 суспензия эритроцитов, содержащая включаемый биологически активный компонент (БАК), мягко перемешиваемая шейкером 23, посредством насоса 25 прокачивается через внутренний контур диализатора 13 и собирается в мешке 1. Одновременно, во внешнем контуре диализатора 13 в противоток суспензии эритроцитов, содержащей БАК, посредством насосов 26 и 27 прокачивается гипоосмотический раствор из мешка 6, который собирается в мешок 9. При этом насос 27 выкачивает раствор из диализатора 13 с той же скоростью, с которой насос 26 подает гипоосмотический раствор во внешний контур диализатора (20-30 мл/мин), что препятствует сильному разбавлению суспензии эритроцитов во внутреннем контуре диализатора 13. Во время диализа блок управления поддерживает постоянное трансмембранное давление 160-180 мм рт. ст. Это достигается регулированием скорости насоса 25, которая сначала устанавливается в пределах 1.5-10 мл/мин (оптимально 6-7 мл/ мин), но затем, используя показания датчиков давления 14 и 15, блок управления, при необходимости, меняет скорость насоса 25, чтобы поддерживать трансмембранное давление в диализаторе 13 на выбранном уровне 160-180 мм рт. ст. Блок управления фиксирует завершение откачивания из мешка 2 суспензии эритроцитов, содержащей включаемый биологически активный компонент, посредством датчика 20 наличия жидкости в магистрали. Блок управления перекрывает клапан 29 и останавливает работу шейкера 23 с мешком 2. Блок управления открывает клапан 28 и посредством насоса 25 физиологический раствор (30-40 мл) из мешков 4.1 и 4.2 продолжает прокачиваться по внутреннему контуру диализатора 13 в течение 3-15 мин (в зависимости от скорости потока суспензии эритроцитов через внутренний контур диализатора 13, которую выбирает блок управления таким образом, чтобы давление на входе во внутренний контур диализатора 13 не превышало атмосферное более, чем на 120 мм рт. ст.), оставшиеся в диализаторе 13 эритроциты собираются в мешок 1, размещенный в блоке III при комнатной температуре. По окончании сбора в мешке 1 лизированных эритроцитов-носителей, содержащих включаемый биологически активный компонент (компоненты), блок управления выключает насосы 25, 26 и 27 и перекрывает клапаны 28, 31 и 37. Этапы, осуществляемые в блоке II, а именно диализ и концентрирование, проводятся при температуре от +2° С до +10° С, предпочтительно от +2° С до +6° С.

Этап 5. Инкубация суспензии лизированных эритроцитов-носителей для их запечатывания

Блок управления включает шприцевой насос 12 и посредством этого насоса 12 в магистраль, ведущую в мешок 1, содержащий лизированные в присутствии БАК эритроциты, добавляется рассчитанное количество гиперосмотического раствора. После окончания сбора лизированных в присутствии БАК эритроцитов в мешке 1, температура в блоке III повышается (или осуществляется подогрев шейкера 22), что обеспечивает в блоке III выбранную температуру в пределах от +25°С до +40°С. Запечатывание эритроцитов, содержащих БАК (эритроцитов-носителей) осуществляется посредством инкубации лизированных в присутствии БАК эритроцитов, находящихся в мешке 1, в течение 20-40 мин (предпочтительно 30 мин) при температуре от +25°С до +40°С (предпочтительно 37° С) при плавном перемешивании содержимого мешка 1 шейкером 22.

Этап 6. Отмывание запечатанных эритроцитов-носителей, содержащих БАК, и промывка диализатора и его магистралей

Перед последующим использованием диализатора 13 для концентрирования полученных запечатанных эритроцитов-носителей проводится повторная промывка диализатора 13, а полученные и собранные в мешке 1 запечатанные эритроциты-носители, содержащие БАК, отмываются посредством устройства 21 для отмывания эритроцитов путем повторения описанных ранее этапов 1 и 2.

Сбор отмытых запечатанных эритроцитов-носителей осуществляется в свободный чистый мешок 3, для чего блок управления открывает клапаны 33 и 40 и перекрывает клапан 32. Заполнение мешка 3 отмытыми эритроцитами-носителями фиксируется датчиком 19 наличия жидкости в магистрали, ведущей в мешок 3. После заполнения мешка 3 блок управления перекрывает клапан 33.

Этап 7. Концентрирование запечатанных эритроцитов-носителей

Чтобы обеспечить в полученной суспензии эритроцитов-носителей после их отмывания гематокрит приемлемый для непосредственного введения этой суспензии пациенту без ее дополнительной обработки (те. гематокрит от 45 до 70%), запечатанные эритроциты-носители, собранные в мешке 3, концентрируются в нем аналогично тому, как описано ранее на этапе 3. Для этого блок управления открывает клапаны 34, 35 и 36 и включает насосы 25, 26 и 27. Суспензия отмытых запечатанных эритроцитов-носителей, находящаяся в мешке 3, при мягком встряхивании шейкером 24, посредством работы насоса 25 прокачивается через внутренний контур диализатора 13, после чего она снова возвращается в мешок 3. При этом насосы 26 и 27 прокачивают через внешний контур диализатора 13 физиологический раствор из мешка 5 в мешок 9. По достижении одинаковой скорости работы насосов 26 и 27 блок управления останавливает работу этих насосов и перекрывает клапаны 34 и 36. Блок управления открывает клапан 28 и посредством работы насоса 25 на максимальной возможной скорости, при которой давление на входе во внутренний контур диализатора 13 не превышает атмосферное более чем на 120 мм рт. ст, через внутренний контур диализатора 13 прокачивается примерно 30-40 мл физиологического раствора из мешков 4.1 и 4.2, чтобы оставшиеся в диализаторе запечатанные эритроциты-носители собрать в мешок 3. После сбора оставшихся в диализаторе запечатанных эритроцитов-носителей в мешке 3 блок управления выключает насос 25 и перекрывает клапаны 28 и 35. Устройство прекращает свою работу и мешок 3, содержащий полученные эритроциты-носители, стерильно отсоединяется от системы одноразовых магистралей.

Ниже приведены примеры включения биологически активных компонентов в эритроциты способом проточного диализа с помощью заявленного устройства.

Примеры Пример 1. Включение аспарагиназы в эритроциты с помощью заявляемого устройства

Аспарагиназа (L-аспарагин-амидогидролаза, АСП) - фермент класса гидролаз, катализирующий гидролиз L-аспарагина с образованием L-аспарагиновой кислоты и иона аммония согласно реакции (1):

АСП: аспарагин+ Н2О <-> аспарагиновая к-та + NHC (1)

Аспарагиназа является неотъемлемой частью комплексного курса терапии при ряде онкологических заболеваний, например, ОЛЛ у взрослых и детей. Так как прямое внутривенное введение свободного фермента имеет серьезные недостатки (главные из которых, сильные аллергические реакции, короткое время жизни фермента в кровотоке, снижение эффективности лекарства при повторных введениях из-за образования в плазме антител к данному ферменту, влияние высоких пиковых концентраций фермента в момент введения на систему свертывания крови, поджелудочную железу, печень и ряд других систем организма, и т.п.), в качестве лекарственной формы аспарагиназы, имеющей улучшенные фармакологические свойства, используют аспарагиназу, включенную в эритроциты [7].

Включение аспарагиназы в эритроциты было проведено с помощью заявляемого устройства заявляемым способом, строго следуя описанному выше алгоритму. Для включения аспарагиназы в эритроциты в качестве исходного материала была использована цельная кровь доноров, которую забирали с помощью пункции локтевой вены в стандартный раствор дигидрата трехосновного цитрата натрия (3.2%, 0.109 М), при соотношении цитратжровь составляющем 1 :9, а также лиофилизованная L-аспарагиназа из Е. coli Веро-аспарагиназа (ВероФарм ООО, Россия) по 10000 МЕ/флакон, в состав субстанции которой входят дополнительно маннитол 50 мг и глицин 50 мг (на 10000 ME). Для проведения проточного диализа были использованы стандартные педиатрические диализаторы фирмы Fresenius (FX Paed) объемом 18 мл. Раствор аспарагиназы готовили путем разведения лиофилизата ферментного препарата буфером (0.015 М Трис-НС1, 0.015% бычьего сывороточного альбумина (BSA), pH 7.3) до конечной активности 4000 МЕ/мл.

В проведенных экспериментах (n=l 1) объем исходной крови составлял 100 мл, а объем добавляемого раствора аспарагиназы - 0.4 мл (с активностью 4000 МЕ/мл).

В каждом эксперименте 100 мл исходной цельной крови донора (с гематокритом от 39.4% до 45.2%) было помещено в находящийся при комнатной температуре мешок, который стерильно соединяли (припаивали) с устройством для отмывания эритроцитов. В качестве устройства для отмывания эритроцитов было использовано устройство АСР-215 (Haemonetics, SA, Швейцария) с объемом центрифужного колокола 275 мл.

Для удаления из системы магистралей воздуха сначала была проведена промывка диализатора. Промывка проводилась в течение 2 мин, путем прокачивания посредством работы насосов через внутренний и внешний контур диализатора со скоростью 100 мл/ мин по 200 мл физиологического раствора из мешков для физиологического раствора в мешки для сбора отработанных растворов. Для проведения отмывания эритроцитов объем суспензии эритроцитов в мешке с исходным материалом должен быть равен объему центрифужного колокола устройства, используемого для отмывания эритроцитов (примерно 275 мл). Чтобы увеличить объем материала в мешке с исходной кровью до этого объема, после окончания промывки диализатора, когда клапаны и насосы на внешнем контуре диализатора прекращали работу, открывался клапан, через который физиологический раствор из мешков для физиологического раствора посредством насоса на внутреннем контуре диализатора прокачивался в мешок с исходной кровью со скоростью 100 мл/мин в течение 2 мин.

Далее для осуществления стадии отмывания эритроцитов из исходной цельной крови, кровь из мешка с исходным материалом посредством работы внутреннего насоса устройства для отмывания эритроцитов поступала в центрифужный колокол, куда посредством работы другого внутреннего насоса этого устройства поступал также раствор для отмывания эритроцитов из мешков для растворов, используемых для отмывания эритроцитов. В качестве раствора для отмывания был использован стандартный раствор Bio-Wash, который представляет собой физиологический раствор с добавкой глюкозы (0.2%). Отработанный раствор для отмывания поступал в мешок для отходов, а отмытые из крови эритроциты поступали в мешок для суспензии отмытых эритроцитов, находящийся при температуре +4° С. Стадия отмывания эритроцитов продолжалась до тех пор, пока датчик наличия жидкости в магистрали не зафиксировал окончание перемещения суспензии из отмывающего устройства в мешок для отмытых эритроцитов.

Так как объем полученной суспензии отмытых эритроцитов равен объему центрифужного колокола устройства для отмывания эритроцитов, т.е. полученная суспензия отмытых эритроцитов была достаточно сильно разбавлена, перед началом стадии диализа проводилась стадия концентрирования отмытых эритроцитов. Для этого суспензия эритроцитов из мешка для отмытых эритроцитов, находящегося на шейкере и постоянно перемешиваемая, посредством работы насоса, через открытый клапан перемещалась по внутреннему контуру диализатора со скоростью 20 мл/мин и собиралась вновь в том же мешке. Одновременно, посредством работы двух насосов, по внешнему контуру диализатора, прокачивали физиологический раствор из мешка для физиологического раствора в мешок для сбора отработанных растворов. Насос, подающий физиологический раствор во внешний контур диализатора, работал с постоянной скоростью 20 мл/мин, а скорость второго насоса, выкачивающего раствор из внешнего контура диализатора, была исходно выше, но менялась таким образом, чтобы в диализаторе поддерживалось постоянное трансмембранное давление 100 мм рт. ст, которое определялось по разности давлений, зафиксированных датчиками давления на внутреннем и внешнем контуре диализатора. При приближении величины гематокрита, фиксируемой датчиком гематокрита, к величине порядка 70%-75%, снижение скорости насоса на внешнем контуре диализатора уже не могло поддерживать постоянное трансмембранное давление в диализаторе на уровне 100 мм рт. ст. При этом давление на входе во внутренний контур диализатора начинало расти. Когда разность давлений на входе во внутренний контур диализатора и выходе из него (где давление равно атмосферному) становилась выше 120 мм рт. ст, насос на внутреннем контуре диализатора начинал снижать скорость, чтобы сохранить уровень трансмембранного давления 100 мм рт. ст. Суспензию отмытых эритроцитов прокачивали через диализатор до тех пор, пока скорости работы насосов на внешнем контуре диализатора не становились равными. При этом датчик измерения гематокрита фиксировал на выходе из внутреннего контура диализатора величину гематокрита суспензии эритроцитов равную 75%-80%. После выравнивания скоростей работы насосов на внешнем контуре диализатора стадия концентрирования завершалась, насосы на внешнем контуре диализатора прекращали работу, а через внутренний контур диализатора посредством работы насоса на внутреннем контуре диализатора, в мешок с суспензией эритроцитов из мешков для физиологического раствора поступало еще 35 мл физиологического раствора, чтобы собрать в нем оставшиеся в диализаторе эритроциты. Скорость работы насоса на внутреннем контуре диализатора при этом автоматически поддерживалась максимально возможной, при которой давление на входе во внутренний контур диализатора не превышало атмосферное более, чем на 120 мм рт. ст. Одновременно посредством шприцевого насоса в магистраль, ведущую в мешок с суспензией отмытых эритроцитов, поступал раствор аспарагиназы (0.4 мл, 4000 МЕ/мл). Затем клапаны перекрывались.

Далее осуществлялась стадия лизиса, при этом сначала через внешний контур диализатора посредством работы насосов на внешнем контуре диализатора в течение 1 мин прогоняли гипоосмотический раствор (5 мМ КН2РО4/К2НРО4, 2 мМ MgCh, 5 мМ глюкозы, 37 мМ NaCl, 60 мОсм/кг, pH 7.4) со скоростью 30 мл/мин из мешка для гипоосмотического раствора в мешок для сбора отработанных растворов. Затем из мешка с отмытыми эритроцитами (постоянно мягко перемешиваемого шейкером) суспензия эритроцитов с аспарагиназой посредством работы насоса прокачивалась через внутренний контур диализатора и собиралась в мешке для сбора и последующего запечатывания лизированных эритроцитов-носителей, содержащих БАК (примерно за 10-20 мин). Одновременно, во внешнем контуре диализатора в противоток суспензии эритроцитов с аспарагиназой, поступающей из мешка с эритроцитами, посредством работы насосов на внешнем контуре диализатора прокачивали гипоосмотический раствор из мешка для гипоосмотического раствора в мешок для сбора отработанных растворов. Величина скорости работы насосов на внешнем контуре диализатора была одинаковой и составляла 30 мл/мин. Во время диализа поддерживалось постоянное трансмембранное давление 170 мм рт. ст. Это достигалось в автоматическом режиме регулировкой скорости насоса на внутреннем контуре диализатора, которая сначала была установлена как 6.4 мл/мин, но потом насос на внутреннем контуре диализатора изменял скорость, с учетом показаний датчиков давления, чтобы поддерживать трансмембранное давление в диализаторе на выбранном уровне 170 мм рт. ст. при максимальной возможной скорости работы насоса на внутреннем контуре диализатора, при которой давление на входе во внутренний контур диализатора не превышало атмосферное более, чем на 120 мм рт. ст.

Предпочтительно чтобы скорость подачи гипоосмотического раствора во внешний контур диализатора была близкой или равной скорости откачки этого раствора из данного контура, что не позволяет избыточной жидкости входить во внутренний контур диализатора и разбавлять находящуюся там суспензию эритроцитов. Как следствие достигается дополнительное увеличение эффективности включения БАК и снижение потери внутриклеточного содержимого за счет снижения разбавления суспензии эритроцитов в ходе диализа. Близость скоростей подразумевает расхождение в пределах 1 отн. %, предпочтительно в пределах 0.5 отн. %. После полного прохождения суспензии эритроцитов через диализатор, остатки эритроцитов из диализатора были собраны в мешок для сбора и последующего запечатывания лизированных эритроцитов-носителей путем прокачивания через внутренний контур диализатора с помощью насоса еще 30 мл физиологического раствора. Насос на внутреннем контуре диализатора при этом работал со скоростью 30 мл/мин примерно 1 мин. Посредством шприцевого насоса в магистраль, ведущую в мешок для сбора и последующего запечатывания лизированных эритроцитов-носителей, было введено 9 мл гиперосмотического раствора (1 М NaCl, 50 мМ КН2РО4/К2НРО4, 5 мМ АТФ, 50 мМ глюкозы, 50 мМ натриевой соли пирувата, pH 7.4, 2240 мОсм/кг). Расчет необходимого объема гиперосмотического раствора был сделан заранее в соответствии с формулой (4):

Vzunep (мл Vcycn * (ОсМцелев ~ ОсМдиализ сусп)АОсМгипер ОсМцелев) (4), где Угитр - объем гиперосмотического раствора, который необходимо добавить, Усусп - объем диализированной суспензии эритроцитов, Осмдиализ сусп - исходная осмоляльность диализированной суспензии, Осм _цеЛ ев - конечная осмоляльность суспензии, которой требуется достичь (равная примерно 300 мОсм/кг) и Осмотр. - осмоляльность гиперосмотического раствора (2240 мОсм/кг).

Чтобы рассчитать объем необходимой добавки гиперосмотического раствора, в проведенных экспериментах, где объем исходной цельной крови составлял 100 мл, предварительно были измерены получаемые в аналогичных условиях объемы суспензии эритроцитов после диализа (Усусп) и осмоляльность этой суспензии (Осмдшишз сусп) при осмоляльности гипоосмотического раствора 60 мОсм/кг, которые составляли в среднем 92.8±14.5 мл, и 112.11±5.64 мОсм/кг, соответственно (п=9). На основании этих измерений было рассчитано, что для восстановления нормальной осмоляльности в суспензии лизированных в присутствии аспарагиназы клеток необходимо использовать добавку гиперосмотического раствора (с осмоляльностью 2240 мОсм/кг) равную 9 мл на каждые 100 мл объема исходной крови.

Только после того, как вся суспензия лизированных эритроцитов-носителей была собрана в мешке для сбора и последующего запечатывания лизированных эритроцитов- носителей, был включен термостат, который обеспечил температуру равную 37°С, и мешок с суспензией лизированных в присутствии аспарагиназы эритроцитов был проинкубирован при 37° С и постоянном перемешивании с помощью шейкера в течение 30 мин, чтобы обеспечить запечатывание полученных эритроцитов-носителей. Далее полученные запечатанные эритроциты-носители, содержащие аспарагиназу, были отмыты с помощью устройства для отмывания эритроцитов раствором Bio-Wash и собраны в чистый мешок для полученных запечатанных и отмытых эритроцитов- носителей. Для этого сначала они посредством работы внутреннего насоса АСР-215 поступали в центрифужный колокол устройства для отмывания эритроцитов (АСР-215). Одновременно посредством работы насоса на внутреннем контуре диализатора из мешков для физиологического раствора через внутренний контур диализатора в мешок для сбора и последующего запечатывания лизированных эритроцитов-носителей поступили дополнительные 200 мл физиологического раствора (скорость работы насоса на внутреннем контуре диализатора составляла 100 мл/мин). Запечатанные эритроциты- носители были отмыты, и собраны в чистый мешок для полученных запечатанных и отмытых эритроцитов-носителей. Полученная сильно разбавленная суспензия отмытых запечатанных эритроцитов-носителей была затем сконцентрирована с помощью повторения стадии, описанной выше для концентрирования эритроцитов, отмытых из исходной крови, за исключением того, что сконцентрированные эритроциты-носители были собраны в мешок для полученных запечатанных и отмытых эритроцитов-носителей. Насос прокачивал суспензию через внутренний контур диализатора со скоростью 20 мл/ мин, а насосы на внешнем контуре диализатора прокачивали физиологический раствор из мешка для физиологического раствора в мешок для сбора отработанных растворов (скорость работы одного насоса на внешнем контуре диализатора была постоянна и составляла 20 мл/мин, а скорость другого насоса на внешнем контуре диализатора была переменная и устанавливалась на уровне, который обеспечивал постоянное трансмембранное давление 100 мм рт. ст).

Во всех проведенных экспериментах были рассчитаны выходы инкапсуляции фермента (Е) и выход клеток после проведения процедуры включения ферментов (С), согласно формулам (5) и (6), соответственно:

Е (в %) А сусп. ЭН ^Х Vcycn. ЭН ^Х 100/ (Аисх. сусп. ЭР ^х Vucx. сусп. ЭР) (^),

С (в %) Vcycn. 3H ^x EItcycn. ЭН ^Х 100/(V tex. сусп. 3P ^x EItucx. сусп. ЭР) б), где Аисх. сусп. ЭР и Асусп. эн - активности фермента в исходной суспензии отмытых эритроцитов и в конечной суспензии эритроцитов-носителей с включенным ферментом, соответственно, V cx. сусп. ЭР И V _cy cn. эн - объемы, a Ht _UC x. сусп. ЭР И Ht _cyC n. эн — гематокриты этих суспензий соответственно. Кроме того, еще один показатель эффективности включения - относительная эффективность включения (R), был оценен как процент, который полученная в эритроцитах удельная активность фермента составляет от максимально возможной удельной активности фермента, которая может быть получена в данных условиях (формула (7)). Под удельной активностью понимается величина активности фермента в расчете на мл клеток-носителей (при гематокрите 100%). При этом за максимально возможную включенную удельную активность принимали активность включаемого вещества в суспензии исходных эритроцитов сразу после внесения аспарагиназы в суспензию отмытых из исходной крови эритроцитов (до начала процедуры включения), т.к. именно такая активность должна установиться в клетках и окружающей среде, если вещество полностью уравновешивается между этими фазами.

R (в %) — Асусп. ЭН ^Х 100/(Аисх. сусп. 3P Ht _C ycn. Эн)

Активность аспарагиназы измеряли индооксиновым методом, используя в качестве субстрата аспарагиназы аспартат-Р-гидроксамат (АНА) и определяя образовавшийся при этом гидроксиламин спектрофотометрически на длине волны 705 нм после его превращения в индооксин в присутствии 8-гидроксихинолина [27]. Для измерения активности аспарагиназы, включенной в эритроциты, клетки сначала лизировали, разбавляя водой в 200 раз, а затем определяли активность фермента в лизатах (для удобного измерения, активность аспарагиназы в растворе должна составлять примерно 100 МЕ/л). Полученные результаты представлены в Таблице 1.

Пример 2. Совместное включение в эритроциты глутаматдегидрогеназы и аланинаминотрансферазы

Состояние гипераммониемии (повышение концентрации аммония в крови) является опасным осложнением многих патологических состояний, связанных с дефицитами ферментов цикла мочевины, хроническими и острыми патологиями печени (рак, цирроз и т.д.), а также некоторыми инфекциями желудочно-кишечного тракта.

Избыточный аммоний обладает сильным нейротоксическим действием, что может вызывать ряд когнитивных расстройств и даже летальный исход [28]. Поскольку избыточный аммоний очень токсичен, его необходимо быстро убирать из кровотока, однако существующие медикаментозные средства недостаточно эффективны. Чтобы вернуть концентрацию аммония к нормальному уровню (<60 цМ), требуется от 2 до 7 дней. Ранее было установлено [29], что совместное включение в эритроциты двух ферментов - глутаматдегидрогеназы (ГДГ) и аланинаминотрансферазы (ААТ), позволяет создать эритроциты-биореакторы, достаточно эффективно убирающие из кровотока избыточный аммоний, согласно реакциям (8) и (9):

ГДГ: АКГ + NH ₄ ⁺ +Н+ + НАДФН ГЛУ + НАДФ + Н ₂ О (8),

ААТ: ГЛУ + ПИР АКГ + АЛА (9), где АКГ - а-кетоглутарат, ГЛУ - глутамат, ПИР - пируват, АЛА - аланин, NH ₄ - ион аммония, а НАДФ и НАДФН - окисленная и восстановленная формы никотинамидадениндинуклеотидфо сфата, соответственно.

Для получения эритроцитов-носителей, нагруженных совместно ГДГ и ААТ, в качестве исходного материала были использованы предварительно отмытые упакованные эритроциты, полученные стандартным образом на станции переливания крови, а также растворы с различными активностями бактериальной ГДГ из Proteus, sp. (Toyobo Со. Ltd., Osaka, Japan) и ААТ из сердца свиньи (Sigma-Aldrich, St. Louis, МО, USA). Исходный водный раствор ГДГ имел активность 1945 МЕ/мл (при pH 7.4). Объем его добавки составлял от 0.065 до 0.784 мл. Исходная ААТ была лиофильно высушена и имела активность примерно 75 МЕ/мг белка. Для добавления в систему этот фермент был предварительно разбавлен буфером (0.1 М Трис-НС1, pH 7.4) для получения раствора с активностью 250 МЕ/мл. Объем добавки этого фермента в суспензию эритроцитов в разных экспериментах составлял от 0.319 до 14.84 мл. Таким образом, суммарный объем добавки смеси ферментов варьировал в разных экспериментах, в результате чего варьировал и суммарный объем суспензии эритроцитов с добавками ферментов.

Во всех экспериментах (п=17) для включения ферментов в эритроциты использовали способ проточного гипоосмотического диализа, описанный в Примере 1 для аспарагиназы, за исключением первых стадий способа, т.к. в качестве исходного материала в данном примере использовали предварительно отмытую эритроцитарную массу, описанную выше.

В мешок помещали от 52.5 до 60 мл суспензии эритроцитов в физиологическом растворе с гематокритом 80%, предварительно отмытых путем стандартного центрифугирования. Мешок затем был стерильно присоединен (припаян) к магистралям, ведущим к трем каналам одноразовой системы магистралей устройства в блоке запечатывания, ведущим к датчику для определения гематокрита, датчику наличия жидкости в магистрали и клапану, открывающему доступ в мешок из внутреннего контура диализатора. В течение 2 мин была проведена промывка диализатора, для этого посредством работы насосов через внутренний и внешний контуры диализатора пропустили по 200 мл физиологического раствора со скоростью 100 мл/мин. В конце промывки посредством шприцевого насоса в магистраль, ведущую в мешок с эритромассой была введена смесь растворов включаемых ферментов (в разных экспериментах от 0.384 мл до 15.624 мл), а после этого, посредством работы насоса, в течение 15 сек со скоростью 20 мл/мин через внутренний контур диализатора в мешок пропустили еще 5.0 мл физиологического раствора, чтобы полностью смыть в мешок введенную смесь ферментов. После этого клапаны были перекрыты. Расчетный гематокрит полученной после этого в мешке суспензии эритроцитов с добавленными ферментами колебался от 59.0 до 70% (в среднем 66.6±4.6%, п=17). Активности ферментов, добавленных в исходную суспензию эритроцитов, тоже были различны и составляли от 2.11 до 18.74 МЕ/мл суспензии для ГДГ и от 1.33 до 45.6 МЕ/мл суспензии для ААТ.

Все последующие стадии способа (гипоосмотический диализ эритроцитов в присутствии добавленных ферментов, запечатывание полученной суспензии лизированных в присутствии ферментов эритроцитов, отмывание запечатанных эритроцитов-носителей и их последующее концентрирование) были проведены строго по протоколу, описанному в Примере 1 и при тех же условиях.

Как и в Примере 1 , были определены эффективности включения Е и /? (раздельно для каждого фермента) по формулам (5) и (7), а также выход клеток в результате процедуры включения ферментов (по формуле (6)). Полученные результаты также представлены в Таблице 1.

Таблица 1. Эффективность включения различных ферментов в эритроциты с помощью заявляемого способа проточного гипоосмотического диализа*. * - Представлены средние величины и стандартные отклонения (Mean ± SD).

Сравнение результатов, полученных в Примерах 1 и 2, показало, что выход клеток при использовании в качестве исходного материала отмытой эритромассы оказался выше. Это можно объяснить тем, что все старые и хрупкие клетки, присутствующие в исходной крови, в этом случае были отмыты еще на стадии приготовления эритромассы. Второй факт, который можно наблюдать в Примере 2, состоит в том, что процент включения двух использованных ферментов различен. ГДГ из Proteus sp. похожа на хорошо изученную ГДГ из печени быка, про которую известно, что ее эллипсоидальная по форме молекула имеет молекулярный вес 340 кДа, длину 13.6 нм и диаметр 4.3 нм [30,31]. Молекула ГДГ из Proteus sp. также имеет вытянутую форму, но немного меньший молекулярный вес (300 кДа) [32]. В тоже время глобулярная молекула ААТ имеет молекулярный вес только 150 кДа и диаметр около 4 нм [33]. Таким образом размер молекулы ГДГ гораздо больше, чем у ААТ, что снижает скорость проникновения этого фермента внутрь клетки через поры эритроцитарной мембраны, имеющие диаметр около 8-10 нм.

Эффективность включения БАК в эритроциты способом проточного гипоосмотического диализа по настоящему изобретению была также сравнена с эффективностью включения БАК в эритроциты с помощью обратимого гипоосмотического воздействия в соответствие с другими существующими способами. В Таблице 2 представлены такие показатели, приведенные в опубликованных работах или рассчитанные нами самостоятельно из опубликованных данных по включению БАК, с помощью каждого из известных способов.

В качестве показателя включения в разных работах авторы рассчитывали либо относительную эффективность включения (А) (те. какой процент включенная в клетки удельная активность составляет от максимально возможной в данных условиях), либо суммарный процент инкапсуляции вещества (Е) (те. суммарный процент вещества, включенный в эритроциты с помощью использованного способа), рассчитанные по формулам (7) и (5).

Представленные в Таблице 2 данные демонстрируют, что эффективность включения БАК с помощью заявляемого способа превосходит аналогичные эффективности, получаемые в других способах. Чтобы оценить качество эритроцитов-носителей, полученных заявляемым способом, были исследованы их свойства, которые были сравнены с аналогичными свойствами исходных эритроцитов.

Свойства эритроцитов-носителей, полученных согласно изобретению

Кроме эффективности включения БАК в эритроциты, для проверки качества эритроцитов-носителей БАК по сравнению со свойствами исходных эритроцитов, были исследованы такие свойства, как: форма клеток после включения БАК, эритроцитарные индексы клеток, их осмотическая резистентность и способность деформироваться.

Таблица 2. Эффективность включения БАК в эритроциты с помощью различных способов*).

*) Для способов 1, 4 и 5 приведены данные по включению L-аспарагиназы. Для способа 3 приведены данные по включению дексаметазон-21 -фосфата, и данные по включению фермента гексокиназы, который по размеру похож на аспарагиназу. Данных об эффективности включения БАК с помощью способа 2 найти не удалось. Необходимо отметить, что выходы при включении низкомолекулярных веществ, как правило, должны быть выше, чем для высокомолекулярных ферментов.

А. Форма клеток после проведения процедуры включения фермента в эритроциты

О физическом состоянии клеток после включения фермента может говорить форма полученных эритроцитов-носителей. В настоящей работе эта форма была исследована методом дифференциальной интерференционно-контрастной (конфокальной) микроскопии. Для получения микрофотографий эритроциты сначала фиксировали. Для этого их инкубировали в PBS с альбумином (10 мг/мл) и глутаровым альдегидом (2.5%) 1 час при комнатной температуре. Гематокрит суспензии клеток при фиксации составлял 25%. Затем данную суспензию разводили до гематокрита около 0.1%. Фотографии были получены с помощью микроскопа Zeiss Axio Observer Z. l (Carl Zeiss, Иена, Германия), иммерсионный объектив 100х, 1,3 NA, камера QuantEm 512sc.

На фиг. 6 представлены микрофотографии исходных эритроцитов (А), а также эритроцитов-носителей с включенной аспарагиназой (Б) или совместно включенными ГДГ из Proteus sp. и ААТ из сердца свиньи (В).

Из анализа фотографий можно сделать вывод, что для обоих видов эритроцитов- носителей, содержащих различные БАК, большинство полученных клеток возвращает после восстановления осмоляльности среды свою двояковогнутую форму, которая благоприятствует способности эритроцитов деформироваться и проходить сквозь узкие капиллярные сосуды в организме. Размер большей части эритроцитов с включенными ГДГ и ААТ практически не отличался от размера исходных эритроцитов, тогда как для эритроцитов, нагруженных аспарагиназой, он очень незначительно уменьшился.

Б. Гематологические показатели эритроцитов-носителей, полученных заявленным способом Основные стандартные гематологические показатели клеток (эритроцитарные индексы) были исследованы для исходных эритроцитов (п=9), а также эритроцитов- носителей, нагруженных глутаматдегидрогеназой из Proteus sp. совместно с аланинаминотрансферазой из сердца свиньи (ГДГ + ААТ) (п=6) или аспарагиназой (п=9). В качестве основных показателей были исследованы: средний объем эритроцита (MCV, в фл), среднее содержание гемоглобина в эритроците (МСН, в иг) и средняя концентрация гемоглобина в эритроците (МСНС, в г/дл). Измерение гематологических показателей проводили на гематологическом анализаторе Micros ОТ (ABX-France, Франция).

Полученные результаты представлены на фиг. 7. После включения различных ферментов в эритроциты наблюдалось умеренное изменение эритроцитарных индексов. Средний объем клеток, среднее содержание и средняя концентрация в них гемоглобина всегда достоверно снижались (ANOVA, р <0.05). Это полностью согласуется с данными, полученными ранее в других работах [35]. Несмотря на то, что концентрация и содержание гемоглобина в эритроцитах-носителях снижены по сравнению с исходными эритроцитами, а, следовательно, снижена и их способность переносить кислород, это не влияет критически на выполнение функции газообмена эритроцитами в целом, т.к. вводимый объем эритроцитов-носителей не будет превышать 10% от общего объема эритроцитов в крови человека. Поэтому, даже если концентрация гемоглобина в них будет снижена на 50%, суммарное содержание гемоглобина в организме снизится несущественно (примерно на 5%).

Поскольку размер молекул гликолитических ферментов близок к размеру молекул гемоглобина, можно предполагать, что концентрация этих ферментов в ходе гипоосмотического диализа и открытия пор в клеточной мембране снизится также, как и для НЬ не более чем на 30%. Такое снижение не может повлиять на скорость гликолитических реакций в эритроците, т.к. все необходимые ферменты присутствуют в нем в существенном избытке. В результате, можно полагать, что уровень энергообеспечения клетки существенно не изменится, что позволит эритроцитам- носителям выживать в кровотоке достаточно долго [36].

В. Осмотическая резистентность эритроцитов-носителей

Для измерения осмотической резистентности различных эритроцитов, суспензии исходных эритроцитов или полученных эритроцитов-носителей разводили в PBS до гематокрита 5%. Измерения проводили в растворах с разной осмоляльностью по методике, описанной в [37]. Кривую осмотической резистентности строили как зависимость процента нелизированных эритроцитов от осмоляльности использованных растворов. Кривые осмотической резистентности исходных эритроцитов (п=13) и эритроцитов- носителей, полученных методом проточного гипоосмотического диализа, с включенными совместно ГДГ из Proteus sp. и ААТ из сердца свиньи (п=9), а также с включенной аспарагиназой (п=13) представлены на фиг. 8 (для каждой точки представлены средние величины ± средняя ошибка среднего, Mean ± SEM).

Вид кривой осмотической резистентности для эритроцитов-носителей обоих видов достаточно сильно отличался от вида кривой для исходных эритроцитов, что согласуется с результатами, полученными в других работах по измерению осмотической резистентности эритроцитов-носителей [35,38]. Кривые осмотической резистентности для эритроцитов-носителей стали более пологими и сместились в сторону низких осмоляльностей. Таким образом, эритроциты-носители более устойчивы чем исходные эритроциты к изменениям осмоляльности среды в области осмоляльностей ниже 150 мОсм/кг. Лизис 50% исходных (нативных) клеток происходит уже при осмоляльности 135 мОсм/кг, тогда как у эритроцитов-носителей при этой осмоляльности наблюдается только 25-30% лизированных клеток. Это можно объяснить тем, что во время процедуры включения БАК на стадии отмывания клеток были удалены неустойчивые к осмотическому стрессу эритроциты, а также тем, что эритроциты-носители имеют сниженное содержание гемоглобина, что и повлияло на общую кривую осмотической резистентности. С другой стороны, в области осмоляльностей близких к физиологическим, осмотическая резистентность эритроцитов-носителей почти не отличается от осмотической резистентности исходных эритроцитов.

Г. Деформируемость полученных эритроцитов-носителей БАК

Жизнеспособность эритроцитов-носителей БАК (фармакоцитов) в кровотоке во многом определяется их способностью деформироваться и легко проходить через узкие капиллярные сосуды. Деформируемость эритроцитов можно определить с помощью фильтрационных методов, т.к. скорость фильтрации суспензии эритроцитов или эритроцитов-носителей через искусственный мембранный фильтр с порами диаметром 3-5 мкм, близкими к диаметру эритроцитов (~ 3-5 мкм), и длиной 10 мкм, прямо зависит от этой способности клеток. Фильтруемость клеток была оценена по следующим параметрам: процентное содержание нефильтрующихся эритроцитов в суспензии (Z) и индекс фильтруемости (F), которые определяли методом последовательного пропускания через искусственный полиэтилентерфталатный фильтр (Объединенный Институт ядерных исследований, Дубна, РФ) с порами диаметром 3.5 мкм фиксированного объема (250 мкл) сначала буфера PBS, а затем суспензии клеток с гематокритом 0.1%. Затем, отмыв фильтр после пропускания суспензии, через него повторно пропускали тот же объем PBS. Расчет проводили по формулам (10,11) в соответствии с работой [39]:

F=tb/t _s (10),

Z N* 100 т (11), где tb - время протекания через фильтр 250 мкл буфера (PBS), t _s - время протекания через тот же фильтр 250 мкл 0.1% суспензии клеток (исходных эритроцитов или эритроцитов-носителей, содержащих БАК), т - общее число клеток, помещенных на фильтр, а N - число пор, которые были блокированы нефильтрующимися клетками при пропускании суспензии через фильтр.

Величина N была определена согласно формуле (12):

N = No ^x (tbi-tb)/tbi (12), где No - известное общее число пор на фильтре, a tbi - время повторного протекания 250 мкл буфера через фильтр, который был отмыт после пропускания через него суспензии эритроцитов.

Параметры фильтруемости исходных эритроцитов и эритроцитов-носителей представлены на фиг. 9, где представлено процентное содержание нефильтрующихся эритроцитов (Z) и индекс фильтруемости (F) для исходных эритроцитов (1) (п=8), свежеполученных эритроцитов-носителей, нагруженных совместно ГДГ из Proteus sp. и ААТ (2) (п=5), свежеполученных эритроцитов-носителей, нагруженных L-аспарагиназой (3) (п=3), и эритроцитов-носителей, нагруженных L-аспарагиназой, после их инкубации в буфере для хранения в течение 2 часов при комнатной температуре (4) (п=3). Во всех случаях приведены средние величины ± SD.

Процентное содержание нефильтрующихся клеток в суспензии свежеполученных эритроцитов-носителей обоих типов было достоверно выше по сравнению с данным параметром нативных (исходных) эритроцитов (ANOVA, /?<0.05). Чтобы понять, насколько необратимы эти изменения, для нагруженных аспарагиназой эритроцитов была измерена фильтруемость не только свежеприготовленных эритроцитов-носителей, но и их фильтруемость после 2 часовой инкубации при комнатной температуре в буфере для хранения клеток (137 мМ NaCl, 2.7 мМ КС1, 10 мМ Na2HPO4, 2 мМ КН2РО4, 1.3 мМ СаСЬ, 5 мМ MgCb, 10 мМ глюкозы, 5% (по массе) BSA, 30 мМ HEPES, 0.28 мМ аденина и 0.02 мг/мл ампициллина (pH 7.4)). Было показано, что после инкубации процентное содержание нефильтрующихся клеток в суспензии эритроцитов-носителей понижается (относительно суспензии свежеполученных эритроцитов-носителей) и не отличается достоверно от значений данного параметра для исходных эритроцитов (ANOVA, <0.05).

Литература Koleva L.D., Bovt E.A., Ataullakhanov F.I., Sinauridze E.I. Erythrocytes as carriers: from drug delivery to biosensors. Pharmaceutics 2020, 12(3), No 276 (44 pp.). DOE 10.3390/ pharmaceuticsl2030276. Halfon-Domenech C., Thomas X., Chabaud S., Baruchel A., Gueyffier F., Mazingue F., Auvrignon A., Corm S., Dombret H., Chevallier P, et al. L-asparaginase loaded red blood cells in refractory or relapsing acute lymphoblastic leukaemia in children and adults: results of the GRASPALL 2005-01 randomized trial. Br. J. Haematol. 2011, 153(1), 58-65. DOI: 10.1111/j.1365-2141.2011.08588.x. Hammel P, Berardi R., Van Cutsem E., Feliu J., Greil R., Wasan H.S., Metges J.-P, Nygren P, Osterlund P.J., Parner V, et al. Trybeca-1 : a randomized, phase 3 study of eryaspase in combination with chemotherapy versus chemotherapy alone as second-line treatment in patients with pancreatic adenocarcinoma (NCT03665441). J. Clin. Oncol. 2019, 37(4), suppl. TPS471. DOI: 10.1200/JC0.2019.37.4_suppl.TPS471. Batool T., Макку E.A., Jalal M., Yusoff M.M. A Comprehensive review on L-asparaginase and its applications. Appl. Biochem. Biotechnol. 2016, 178(5), 900-923. DOI: 10.1007/ S12010-015-1917-3. Van Den Berg H. Asparaginase revisited. Leuk. Lymphoma 2011, 52(2), 168-178. DOI: 10.3109/10428194.2010.537796. Muller H., Boos J. Use of L-asparaginase in childhood ALL. Crit. Rev. Oncol .Hematol. 1998; 28(2), 97-113. DOI: 10.1016/sl040-8428(98)00015-8. Борсакова Д.В., Синауридзе Е.И. L-аспарагиназа: новые подходы к улучшению фармакологических свойств. Вопросы гематол., онкол. и иммунопатол. в педиатрии. 2018, 17(4), 80-97. DOI: 10.24287/1726-1708-2018-17-4-80-97. Kravtzoff R., Desbois I., Lamagnere J.P, Muh J.P, Valat C., Chassaigne M., Colombat P, Ropars, C. Improved pharmacodynamics of L-asparaginase loaded in human red blood cells. Eur. J. Clin. Pharmacol. 1996, 49(6), 465-470. DOI: 10.1007/BF00195932. Атауллаханов Ф.И., Витвицкий B.M., Жаботинский A.M., Пичугин А. В. Проницаемость эритроцитов человека для аспарагина. Биохимия 1985, 50(10), 1733-1737. Booser, D.J.; Hortobagyi, G.N. Anthracycline antibiotics in cancer therapy. Focus on drug resistance. Drugs 1994, 47(2), 223-258. DOI: 10.2165/00003495-199447020-00002. Moudi M., Go R., Yong C., Nazre M. Vinca alkaloids. Int. J. Prev. Med. 2013, 4(11), 1231-1235. DOI: 10.2165/00128415-200711380-00080. Arora R., Malhotra P, Mathur A., Mathur A., Govil C.M., Ahuja PS. Anticancer alkaloids of Catharanthus roseus: transition from traditional to modern medicine. In: Herbal Medicine: A Cancer Chemopreventive and Therapeutic Perspective, 1st ed., Arora, R. Ed., Jaypee Brothers Medical Publishers: New Delhi, India, 2010, Chapter: 21, pp. 292-309. ISBN 9788184488418. Sawyer D.B., Peng X., Chen B., Pentassuglia L., Lim C.C. Mechanisms of anthracycline cardiac injury: can we identify strategies for cardioprotection? Prog. Cardiovasc. Dis. 2010, 53(2), 105-113. DOI: 10.1016/j.pcad.2010.06.007. Ropars C., Nicolau Y.C., Chassaigne M. Apparatus for encapsulating biological active substances into erythrocytes. US Patent 4,752,586, June 21, 1988, C12M 1/00. Pages E., Ropars C., Bailleul C. Apparatus for causing medical products to penetrate into red blood cells. US Patent 5,589,389, December 31, 1996, C12M 1/12, C12M3/06. Magnani M., Panzani I., Bigi L., Zanella A. Method of encapsulating biologically active agents within erythrocytes and apparatus thereof (Dideco Sri, Italy). EP 0 882 448 Bl, data of publication 12.01.2005, bulletin 2005/02, A61K 9/50. Мамбрини Д., Серафини С. Устройство и набор для инкапсуляции в эритроцитах по меньшей мере одного соединения для терапевтического и диагностического применения (EryDel SpA, Italy). Патент России RU 2 595 844, дата публикации заявки РСТ 03.11.2011 , А 61 К 9/50, А61М 1/36, B01J 4/00. Мамбрини Д., Бенатти Л., Капогросси Д., Мандолини М. Способ получения эритроцитов, нагруженных одним или несколькими веществами, представляющими фармацевтический интерес, и полученные таким образом эритроциты (EryDel SpA, Italy). Патент России RU 2 670 070, дата публикации заявки РСТ 13.11.2014, А61К 9/50. Godfrin Y. Lisis/resealing process and device for incorporating an active ingredient, in particular asparaginase or inositol hexaphosphate, in erythrocytes (EryTech Pharma, France). US Patent 10,273,444 B2, data of prior publication 5.06.2014, data of patent 30.04.2019, A61K 9/50, C12M 1/00, A61K 35/38, A61K 31/6615. Linderkamp O., Meiselman H.J. Geometric, osmotic, and membrane mechanical properties of density-separated human red cells. Blood 1982, 59(6), 1121-1127. Ponder E. Diffractometric measurements of the tonicity volume relations of human red cells in hypotonic systems. J. Gen. Physiol. 1951, 34 (5), 567-571. DOI: 10.1085/ jgp.34.5.567. Evans J., Gratzer W., Mohandas N., Parker K., Sleep J. Fluctuations of the red blood cell membrane: Relation to mechanical properties and lack of ATP dependence. Biophys. J. 2008, 94(10), 4134-4144. DOI: 10.1529/biophysj.l07.117952. Seeman P. Transient holes in the erythrocyte membrane during hypotonic hemolysis and stable holes in the membrane after lysis by saponin and lysolecithin. J. Cell Biol. 1967, 32(1), 55-70. DOI: 10.1083/jcb.32.1.55. Borsakova D.V, Protasov E.S., Nazarenko S.V., Alexandrovich Y.G., Butylin A.A., Ataullakhanov F.I., Sinauridze E.I. Ways to increase the activity of glutamate dehydrogenase in erythrocyte-bioreactors for the ammonium removal. Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology, 2019, 13(3), 212-224. DOI: 10.1134/S0233475519030046. Lanvers C., Pinheiro J., Hempel G. et al. Analytical validation of a microplate reader-based method for the therapeutic drug monitoring of L-asparaginase in human serum. Anal. Biochem. 2002; 309(1): 117-126. DOI: 10.1016/80003-2697(02)00232-4. Mangani M., Rossi L., D’ascenzo M., Panzani I., Bigi L., Zanella A. Erythrocyte engineering for drug delivery and targeting. Biotechnol. Appl. Biochem. 1998; 28(1): 1-6. DOI: 10.1111/j .1470-8744.1998.tb00505.x