Eine Reihe von immunologischen Tests setzt voraus, daß entweder das Antigen oder der Antikörper an eine Fest- körperoberfläche gekoppelt werden. Dazu werden Festkör- perträger wie Latexkugeln, Plastikröhrchen etc. verwen- det. Der bei weitem erfolgreichste und am weitesten verbreitete Träger ist allerdings die Mikrotiterplatte.

Techniken wie der ELISA- (enzyme-linked immunosorbent assay) Test oder radiologische Immun-Tests werden stan- dardmäßig in wegwerfbaren Mikrotiterplatten durchge- führt. Mikrotiterplatten sind Plastiktabletts aus transparenten Kunststoffen (Polystyrol, Polypropylene etc.) mit einer Anzahl (typischerweise 96) kleiner Reak- tionstöpfchen Proteine, wie beispielsweise Antikörper, können in den hydrophoben Behältern durch Physisorption gebundenen werden. Die Zugabe der zu testenden Lösungen und die folgenden Waschzyklen werden häufig durch auto- matisierte F_ ? oettierautomaten ausgeführt. Auch das Auslesen der Platten kann automatisiert werden. Für ELISA-Tests wird dabei die Farbreaktion anhand der opti- schen Absorption der Lösung gemessen, bei radiologischen Tests die Menge radioaktiv markierter Substanzen. Al- lerdings sind für diese Art Tests erstens Fluoreszenz- oder radioaktive Markierungen notwendig und zweitens insbesondere ELISA-Tests nicht immer quantitativ, d. h. weisen lediglich das Vorhandensein, nicht aber die exak- te Menge einer Substanz nach.

Im Gegensatz dazu stehen Biosensoren, welche exakte Wer- te, beispielsweise der optischen Schichtdicke eines Ad- sorbates oder der Massenbelegung einer Oberfläche lie- fern. Biosensoren sind reversibel und kontinuierlich arbeitende Meßaufnehmer zum Nachweis von Proteinen, Nu- kleinsäuren oder Polyzuckern. Solche hochempfindlichen Meßwandler spielen dann eine große Rolle, wenn außer dem Vorhandensein eines Liganden auch noch dessen Konzentra- tion bestimmt werden soll. Quantitative Meßaufnehmer können insbesondere dazu dienen, die Bindungskonstante eines Liganden zu bestimmen. Neben der Entwicklung ge- eigneter Substrate und chemischer Ankopplungsverfahren ist die Automatisierung der quantitativen Bestimmung der Rezeptor-Ligand Bindung nach wie vor zu optimieren.

Zu den bekanntesten quantitativen Oberflächentechniken, welche optische Schichtdicken bestimmen, gehören die Oberflächen-Plasmonen-Resonanz (Liedberg, et al. 1983 ; Surface Plasmon Resonance for Gas Detection and Biosen- sing, Sensors and Actuators, 4 : 299-304), die reflektome- trische Interferenz-Spektroskopie (Brecht et al. 1993 ; Interferometric immunoasay in a FIA-system : a sensitive <BR> <BR> <BR> <BR> and rapid approach in lable-free immunosensing. Biosen-<BR> <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> sors & Bioelectronics. 8 : 387-392), sowie Quarzwaagen.

Die ersten beiden Techniken messen optische Schichtdik- ken mit einer Auflösung im Angström-Bereich, während die Quarzwaage Massenbelegungen mit einer Nachweisgrenze im , ug-Bereich miß_.

In Rädler, et al. 1993, Imaging optical thicknesses and separation distances of phospholipid vesicles at solid surfaces, J. Physics II France 3 : 727-748, wird gezeigt, daß die Reflexions-Interferenz-Contrast-Mikroskopie (RICM) für einfache Schichtsysteme quantitativ auswert- bare Interferenzintensitäten abbildet. Es werden insbe- sondere planare Systeme von aufgedampften Magnesiumflu- orit mit adhärierenden Vesikeln, gespreiteten Membranen oder durch Langmuir-Blodgett Technik übertragenen Lipid- Monolagen abgebildet. Es wird gezeigt, daß die (bei- spielsweise in Fig. lb dargestellte) Intensitätsänderung bei Proteinadsoprtion an eine Interferenzschicht von konstanter Dicke D (in diesem Fall 48nm) meßbar bzw. mit RICM auf eine CCD Kamera abbildbar ist. Bei der Messung von Schichtdickenänderungen liefert eine planare Inter- ferenzschicht jedoch lediglich ein Signal, welches zahl- reichen Störungen unterworfen ist.

Demgegenüber-iegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung, ein Verfahren und ein Verfahren zum Herstellen de--Vorrichtung bereitzustellen, welche (s) erlaubt, die Änderung der optischen Dicke einer Schicht, vorzugsweise einer Adsorbatschicht in Mikrotiterplatten zu bestimmen. Diese Aufgabe wird mit den Merkmalen der Ansprüche gelöst.

Bei der Lösung geht die Erfindung von dem Grundgedanken aus, daß sich aufgrund von Variationen im Abstand von Oberseite und Unterseite einer Schicht, beispielsweise einer Adsorbatschicht, bei einer Bestrahlung mit Licht variierende Interferenzmuster ergeben, wenn sich die op- tische Dicke der Schicht ändert. Dazu werden in oder auf einen Träger einer biofunktionalisierten Mikrotiterplat- te mikrostrukturierte Interferenzschichten ein-bzw. aufgebracht.

Die optische Reflexions-Interferenz der Platte wird ab- gebildet und mit Hilfe von Bildverarbeitung ausgewertet.

Dabei wird die mittlere quadratische Differenz der no- mierten Intensitäten der Interferenzmuster vor und nach Adsorption zum Bestimmen der Änderung der optischen Schichtdicke des Adsorbats genutzt. Die erfindungsgemäße Vorrichtung/das erfindungsgemäße Verfahren basiert auf optischer Interferenz, wobei die Dicke der interferenz- fähigen Beschichtung variiert. Diese wird durch opti- sche Abbildung aufgelöst und durch ein einfaches Bild- verarbeitungsverfahren ausgewertet.

Die Vorteile der Erfindung sind vielfältig : 1. Die nachzuweisenden Liganden müssen nicht vorbehan- delt oder markiert werden.

2. Die Auswertung einer Platte mit einer großen Anzahl Tests ist in einem Schritt möglich und mit Hilfe eines schnellen Rechners in Sekunden zu bewerkstel- ligen.

3. Die Bestimmung der Änderung der optischen Schicht- dicke des Adsorbats aus der mittleren quadratischen Differenz der nomierten Intensitäten hat eine hohe Empfindlichkeit mit einer Schichtdickenauflösung von einem Angström (1 A).

4. Das Verfahren ist robust gegen äußere Schwankungen der Beleuchtungsintensität, als auch gegen Unregel- mäßigkeiten in der genauen Mikrostrukturierung der Platte.

5. Da der beschriebene Mikrotitertest auf einem bild- gebendem Verfahren beruht, können durch weitere in- telligente Bildverarbeitung oder durch visuelle Kontrolle offensichtliche Störungen, wie das Aus- fällen von Reagenzien oder die Anlagerung eines Staubkorns, leicht bemerkt werden.

6. Das bildgebende Verfahren läßt sich leicht mit Fluoreszenztechniken kombinieren.

Das Verfahren sollte daher Anwendung als interferometri- scher Immunoassay finden, wobei die Vorteile insbesonde- re in automatisierten Anlagen mit hohem Durchsatz von Mikrotiterplatten zum Tragen kommen. Es wird daher im folgenden auch erläutert, wie strukturierte Mikrotiter- platten kostengünstig auf Kunststoffbasis hergestellt werden können.

Die Erfindung wird nachstehend mit Bezug auf die beige- fügten Zeichnungen näher erläutert. Es zeigen : Fig. la eine Darstellung einer integrierten Interferenz- schicht mit lateral variierender Schichtdicke D, wobei die Adsorbatschicht 8 Rezeptoren trägt und eine optische Schichtdickenänderung A8 gemessen wird ; Fig. lb eine Simulation der Reflektivität als Funktion der ortsabhängigen Schichtdicke D der Interferenz- schicht ; die Kurven entsprechen Adsorbatschichtdik- ken von 8 = 10,20 und 30 A ; Fig. lc eine Darstellung der mittleren quadratischen Differenz der normierten Intensitäten S als Funkti- on der optischen Schichtdickenänderung A5 ; Fig. 2a eine Darstellung einer Mikrotiterplatte mit 12 Reaktionstöpfchen ; Fig. 2b eine in jedes Töpfchen integrierte (und mit dem Kunststoff 2 aufgefüllte) interferierende Vertie- fung ; Fig. 2c eine Darstellung eines Interferenzmusters einer Vertiefung, wie es in der abbildenden Reflexions- Interferenz-Mikroskopie sichtbar wird ; Fig. 3 einen Aufbau zur optischen Abbildung der Reflek- tivität der Mikrotiterplatte mittels Reflexions- Interferenz-Kontrast-Mikroskopie ; und Fig. 4 einen Aufbau zur optischen Abbildung der Reflek- tivität der Mikrotiterplatte mittels Laser- Abtastung.

Die Grundlage des erfindungsgemäßen Verfahrens besteht darin, eine biofunktionalisierte Schicht unmittelbar auf ein interferenzfähiges Substrat aufzutragen. Im einfach- sten Fall wird auf einen Abschnitt eines Trägers 1 (z. B.

Glas oder Kunststoff) mit Brechungsindex nl (beispiels- weise nl=1,5) eine erste dünne (vorzugsweise heterogene) Schicht 2 mit einem zu nl unterschiedlichem Brechungsin- dex n2 aufgetragen (siehe Fig. la), mit n2 vorzugsweise im Bereich von 1,3 bis 1,4. Diese erste Schicht ist mit einer biokompatiblen Adsorbatschicht 3 mit Berechnungs- index n3, vorzugsweise einer Polymerschicht versehen, welche Antikörper oder Rezeptoren enthält. Die optische <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> Schichtdicke 8 dieser biokompatiblen Schicht 3 nimmt bei der Bindung von Liganden 4 aus einer wäßrigen Lösung 17 mit Berechnungsindex n4 zu. Zur Detektion der Schicht- dickenzunahme wird das Substrat von unten, d. h. von der der biofunktionalisierten Schicht 3 abgewandten Seite, mit vorzugsweise monochromatischem Licht beleuchtet und das entstehende Interferenzmuster auf eine Kamera abge- bildet. Die Intensität des reflektierten Lichts be- stimmt sich aus der Überlagerung aller reflektierter Teilstrahlen (siehe : Azzam, R. et al. 1975 ; Ellipsome- trie and polarized light, Amsterdam, North Holland).

Dabei geht sowohl die Dicke D der Interferenzschicht 2, als auch die Dicke 5 des Adsorbatfilms 3 ein. Zur ge- nauen Bestimmung einer Schichtdickenänderung A5 wird nun ausgenutzt, daß die Dicke D der Interferenzschicht 2 la- teral variiert, so daß eine Vielzahl von Interferenz- Maxima und-Minima entsteht.

Fig. la zeigt eine erste Ausführungsform. Darin ist bei- spielsweise eine dreiecksförmige Vertiefung und damit eine lineare Veränderung der Dicke D entsprechend dem schrägen Verlauf der Dreiecksflächen vom Ort darge- stellt. Das Verhältnis der entsprechenden Interferenzin- tensitäten Irefl/IO ist in Fig. lb gezeigt. Hier ist zu erkennen, daß sich die Lage der Maxima mit einer Zunahme <BR> <BR> <BR> <BR> der Dicke 8 der Adsorbatschicht verschiebt. Die Inter- ferenzbilder werden nun auf eine Weise verarbeitet, daß <BR> <BR> <BR> <BR> <BR> die Schichtdickenänderung AS lediglich aus der mittleren quadratischen Phasenverschiebung bestimmt wird. Dies entspricht der Verschiebung der in Fig. lb dargestellten Reflektivitätskurven. Durch diese Verarbeitung wird die Bestimmung der Dickenänderung der Adsorbatschicht 3 un- abhängig sowohl von Schwankungen des einfallenden Lichts, als auch von der genauen Form und Güte der mi- krostrukturierten Interferenzschicht. Zur Auswertung werden vorzugsweise eine Anzahl von Maxima und gleich vielen Minima verwendet.

Der Darstellung in Fig. lb liegen folgende Brechungsin- dizes zugrunde : Träger 1 = Glas, n1 = 1,51 ; erste Schicht 2 = Interferenzschicht, n2 1,38 ; zweite Schicht 3 = Adsorbat (Protein), nés = 1,55 ; wässrige Lö- sung 17, n4 = 1,33.

In einer weiteren Ausführungsform wird auf dem Träger 1 nur die erste Schicht 2 aufgebracht, so daß eine Anlage- rung an die Schicht 2 stattfindet.

Als weitere Ausführungsform weist die erste Schicht 2 bzw. zweite Schicht 3 nicht die Rezeptoren auf, an die sich Liganden binden, sondern umgekehrt die Liganden, an die sich die Rezeptoren binden. Es wird hierbei die wechselseitige Bindungswirkung von Rezeptoren und Ligan- den genutzt.

In einer weiteren Ausführungsform wird anstelle eines Trägers mit Ausnehmungen ein ebener bzw. glatter Träger verwendet, auf den die Schicht 2 derart aufgebracht wird, daß der Abstand zwischen Ober-und Unterseite va- riiert. Auf diese Weise wird in dieser Ausführungsform erreicht, daß die Dicke D der Schicht 2 variiert. Vor- zugsweise wird die Schicht 2 in Form von Tropfen oder Tröpfchen aufgebracht (beispielsweise aufgespritzt oder mit einer Pipette aufgetragen). Diese läßt man eintrock- nen oder polymerisieren. Alternativ wird eine ebene Schicht 2 aufgetragen, der anschließend eine Struktur aufgedruckt wird.

Für die zweite Schicht 3 wird vorzugsweise ein quellfä- higes Material verwendet, das im trockenen Zustand eine Dicke von etwa 5 bis 200 A, vorzugsweise etwa 10 bis 20 A hat, während sie im gequollenen Zustand Dicken zwi- schen 10 und 100000 A, vorzugsweise 10000 A aufweist. In diesem gequollenen Zustand weist diese Schicht vorzugs- weise einen Brechungsindex n3 von 1,31 auf.

Die zu bestimmende Änderung der optischen Dicke der Schicht kann beispielsweise auf folgende Arten erfolgen.

Zum einen ändert sich aufgrund von Anlagerungen die phy- sikalische Dicke und somit auch die optische Dicke der Schicht, zum anderen kann eine Änderung der optischen Dicke auf einer Änderung des Brechungsindexes beruhen, die sich aufgrund von Einlagerungen in die Schicht er- gibt.

Es wird jeweils ein Interferenzbild vor und nach (bzw. während) der Zugabe des Liganden aufgenommen und folgen- de Operationen über der Fläche des Interferenzmusters ausgeführt. (Im Falle eines Vielfachtest, wie der wei- ter unten gezeigten Mikrotiterplatte, werden diese Ope- rationen natürlich für jede Bindungsfläche getrennt durchgeführt.) Zunächst werden die Intensitäten nor- miert : Wobei die <> die Mittelung über alle NxM Bildpunkte be- deutet. Dann wird die Differenz der normierten Intensi- täten IV, N der Bilder vor und nach der Bindung gebildet und quadratisch gemittelt : wobei die Mittelung über alle NxM Bildpunkte eines Bild- ausschnitts durchgeführt wird, welcher vorzugsweise gleich groß oder aber kleiner als das Interferenzmuster am Boden eines Mikrotiter-Töpfchens ist. Vorzugsweise wird über eine quadratische Fläche gemittelt. S wird bezeichnet als die"mittlere quadratische Differenz der normierten Intensitäten"zweier Interferenzmuster (I, IN) vor bzw. nach der Adsorption. Für den auf diese Weise erhaltenen Wert S gilt : wobei k die verwendete Lichtwellenlänge bezeichnet und ni die jeweiligen Brechungsindizes, wie oben definiert.

Gleichung (3)-wirdinvielenpraktischenFallen,inde- nen die Adsorbatschicht klein gegenüber k/4 ist genügen, um die optische Schichtdickenzunahme AS aus dem gemes- senen Wert für S direkt zu bestimmen. Die jeweilige Ge- nauigkeit der Gleichung (3) läßt sich durch Vergleich mit den numerischen Werten für gegebene Brechungsindizes <BR> <BR> <BR> <BR> und Schichtdicken 5 bestimmen. Somit ist für kleine Schichtdickenänderungen S proportional zur Schichtdik- kenanderung AS. Die exakte Beziehung kann numerisch be- stimmt und tabellarisch abgelegt werden. Für den Grenz- fall, daß die Adsorbatschicht vor der Adsorption exakt Null ist, läßt sich obige Beziehung (3) unter Vernach- lässigung von Vielfachreflexion herleiten. Fig. lc zeigt die Größe S einer simulierten Probe, welche nach Gleichung (1) und (2) berechnet wurde als Funktion der Schichtdicken=-derung AS. Dabei wurde angenommen, daß <BR> <BR> <BR> <BR> die Adsorbatschicht 8 homogen, also nicht vom Ort abhän- gig ist.

Herstellung irterferometrischer Mikrotiterplatten Optisch hochwertige, lateral strukturierte Interferenz- schichten können durch standardmäßiges Aufdampfen die- lektrischer Schichten auf Glas hergestellt werden. Die Strukturierung wurde in diesem Fall durch Masken, welche zwischen den einzelnen Aufdampfzyklen entweder verscho- ben oder ausgetauscht werden, erfolgen.

Erfindungsgemäß werden gemäß der ersten Ausführungsform Plastikplatter bzw. die Tragersubstanz strukturiert.

Dies ist einfach und kostengünstig. Ein optisch niedrig oder nicht-dcppelbrechendes Polymer (Polycarbonat, zy- klische Olefi e) kann beispielsweise im Spritzgußverfah- ren auf eine Yikrotiterplattenform gebracht werden (Fig.

2a). Diese aus einer Anordnung kleiner Pla- stiktöpfchen nit flachem Boden. In einem zweiten Schritt wird mit Hilfe eines Stempels in jedem Töpfchen eine Vertiefung 5 von einigen wenigen Mikrometern Tiefe gepreßt (Fig. 2b). Beispielsweise ist die Vertiefung zwischen 5 und 2000 Nanometer tief. Für die exakte Form der Vertiefung 5 sind mehrere Möglichkeiten denkbar.

Beispielsweise monoton ansteigende, vorzugsweise stetige Formen, wie konkave, konvexe, konische oder dachförmige Vertiefungen stellen einfache Lösungen dar. Im letzten Schritt wird ein zweites Polymer (Schicht 2) mit unter- schiedlichem Brechungsindex im Gießverfahren aus der Lö- sung auf die Vertiefung 5 aufgetragen, kann aber-wie in Fig. la gezeigt-über die Vertiefung 5 hinaus ver- laufen. Da der Durchmesser des Stempels konstant ist, läßt sich durch Auftragen einer definierten Menge Lö- sungsmittel die Schichtdicke D sehr reproduzierbar her- stellen. Der zweite Kunststoff 2 soll in einem Lösungs- mittel lösbar sein, welches den Kunststoff 1 nicht an- greift. Durch Eintrocknen der Schicht 2 kann sich an der Oberfläche ein Meniskus ausbilden.

Auslesen des Reflexions-Interferenz-Signals Die Reflektivität der Mikrotiterplatte kann mit Hilfe von Reflexions-Mikroskopie unter Auflichtbeleuchtung ab- gebildet werden (siehe Fig. 3). Wird mit Hilfe eines schmalbandigen Interferenzfilters monochromatisches Licht erzeugt, werden die Interferenzen in den oben be- schriebenen lateral strukturierten Vertiefungen 5 sicht- bar. In der Praxis läßt sich weiterhin das Verhältnis von Interferenzsignal zu Hintergrundhelligkeit verbes- sern, indem die Antiflex-Technik nach Pluta (Pluta, M ; Advanced Light Microscopy, Elsevier, Amsterdam 1989) be- nutzt wird. Fig. 3 zeigt den Strahlengang eines solchen Reflexions-Interferenz-Kontrast-Mikroskops nach Pluta.

Wird die Probenkammer durch Immersionsöl direkt auf die X/4-Platte 7 aufgebracht, so ist die erste reflektieren- de Grenzfläche die Glas-Magnesiumfluorid 2 Grenzschicht (Fig. la).

Fig. 3 zeigt einen Aufbau zur optischen Abbildung der Reflektivität der Mikrotiterplatte mittels Reflexions- Interferenz-Kontrast-Mikroskopie. Der Träger 1 mit der eingebrachten Interferenzschicht 2 wird über einer B/4- Platte 7 (optional) angeordnet. Dazwischen befindet sich ein Medium 6 mit gleichem Brechungsindex wie der Träger 1 und die X/4-Platte 7 zur reflexionsfreien Ankopplung.

Dieses Medium ist vorzugsweise ein Immersionsöl oder Si- likon. Das von einer Quecksilberdampflampe 14 ausge- strahlte Licht wird über ein Bandpass-Filter 13, das mo- nochromatisches Licht erzeugt, über einen Polarisator 12 (optional), einen halbdurchlässigen Spiegel 9 und ein Objektiv 8 auf die zu messende Schicht gerichtet. Das reflektierte Licht durchdringt den halbdurchlässigen Spiegel 9 und gelangt über einen Analysator 10 (optio- nal) zu einer Kamera 11. Diese kann eine CCD-Kamera sein.

Ein zweites mögliches Ausleseverfahren (Auslesevorrich- tung) besteht in der Abtastung der Mikrotiterplatte mit einem Laser bzw. einer Laserdiode. Das reflektierte Licht wird mit einem eindimensionalen Detektor aufgenom- men. Wird die Platte abgerastert, entsteht wiederum ein Interferenzsignal, wie in Fig. lb dargestellt, und die Auswertung erfolgt analog zur abbildenden Reflexions- Interferenz.

Fig. 4 zeigt eine Ausführungsform mit Laserabtastung.

Eine Abtastung der Mikrotiterplatte mit einem Laser 19 ist vorteilhart in Anwendungen, bei denen die Geschwin- digkeit des A sleseprozeßes kritisch ist. In dieser Aus- führungsform wird auf abbildende Optik verzichtet und die Mikrotiterplatte von einem Laserstrahl abgetastet, wobei die Intensität des reflektierten Strahls gemessen wird. In Fig. 4 wird der Laserstrahl durch einen drehba- ren Spiegel 20 so umgelenkt, daß er die Probe über- streicht und auf einen eindimensionalen Detektor 21 (vorzugsweise CCD) reflektiert wird. Die Vertiefungen der Mikrotiterplatte in dieser Ausführung der Abtastung sind vorzugsweise dach-oder keilförmige Vertiefungen, also lediglich in einer, der Abtastrichtung entsprechen- den, Richtung variiert. Die Mittelungen nach Formel (1) und (2) entsprechen in diesem Fall der Mittelung entlang einer Linie. Bezugszeichen 18 bezeichnet einen Glasblock mit Antireflexbeschichtung.