Einrichtung und Verfahren zur reproduzierbaren Einstellung der Pinholeöffnung und Pinholelage in Laserscanmikroskopen

Es wurde bereits ein Pinhole für die Laserscanmikroskopie vorgeschlagen (DE ), das die

Einstellung der Pinholegröße ab 2μm und die Einstellung der Pinholelage mit einer Reproduzierbarkeit von 2μm gestatten soll. Damit soll eine Verbesserung der Pinholeeinstellwerte gegenüber derzeit üblicher LSM-Pinhole um den Faktor 5 erzielt werden. Der Reproduzierbarkeitsfehler von 2μm wird durch den beschriebenen Schrittmotor- Spindelantrieb und das erfindungsgemäße Referenzierungsverfahren verursacht. Die Auflösung des Schrittmotorantriebes beträgt 0,3 μm (Differenzgewinde mit 50μm Steigung und Schrittmotor im 1/8-Mikroschrittbetrieb).

Ein Pinhole von 2μm Größe kann dann sinnvoll genutzt werden, wenn sich die Pinholelage mit einer Reproduzierbarkeit von etwa 0,5 μm einstellen läßt.

Weist die Einstellung der Pinholelage einen Reproduzierbarkeitsfehler von nur 2μm auf, kann das auf die kleine Pinholeöffnung treffende Licht erheblich vignettiert werden.

Der Erfindung liegt deshalb die Aufgabe zu Grunde, die Reproduzierbarkeit der Pinholelage erheblich, vorteilhaft auf unter 0,5 μm, zu verbessern.

Um Reproduzierbarkeiten einer Linearbewegung von 0,5 μm durch herkömmliche Spindelantriebe erzielen zu können, werden im allgemeinen hochauflösende Wegmeßsysteme benötigt, die aber zu teuer und deren Meßköpfe für eine Pinholeeinrichtung zu groß sind. Es ist deshalb eine Lösung gesucht, die es gestattet, ohne Meßsysteme eine auf 0,5 μm reproduzierbare Einstellung der Pinholelage zu erzielen.

Die Erfindung besteht darin, signifikante Lagen der Pinholeöffnung durch virtuelle „xy- Zeiger" genau zu markieren.

Die Ermittlung der virtuellen Zeiger erfolgt vorteilhaft durch eine am Laserscanmikroskop anzubringende CCD-Kamera. Der virtuelle Zeiger, bezogen auf ein Koordinatensystem, das beispielsweise einen Nullpunkt für eine X- und Y-Achse an einer Ecke des CCD Chips aufweist, wird in einem elektronischen Speicher abgelegt und dient dazu, jede markierte Pinholelage jederzeit und beliebig oft mit einer Reproduzierbarkeit von 0,5 μm wiederzufinden. Hierzu werden die Schrittmotorantriebe, die eine Auflösung von 0,3 μm

aufweisen, in einem Regelkreis betrieben, der die von der CCD-Kamera ermittelte aktuelle Lage der Pinholeöffhung mit dem virtuellen Zeiger vergleicht und Abweichungen korrigiert. Die vorgeschlagene Lösung besteht weiterhin darin, die Pinholeöffhung optisch vergrößert auf einen hochauflösenden Chip einer CCD-Kamera abzubilden, die Lage und Größe der Pinholeöffhung durch Bildauswertung zu ermitteln, die aktuellen Werte mit der abgespeicherten Ursprungslage und Ursprungsgröße des Pinholes zu vergleichen und Abweichungen durch eine hochauflösende Schrittmotorsteuerung bis auf eine Restabweichung von 0,5 μm zu korrigieren.

Eine weitere Lösung besteht darin, analog zu dem auf das Pinhole fokussiertem Laserstrahl einen oder mehrere Lichtzeiger zu erzeugen und vom Pinhole unter Nutzung der Schrittmotorantriebe und des Photomulitpliers oder einem Lichtempfänger einzufangen. Dann befindet sich die Pinholeöffhung an der Stelle maximaler Lichtintensität des Lichtzeigers und damit auch des Laserfokus.

Da der Photomultiplier oder Lichtempfänger ein Flächendetektor ohne Ortsauflösung ist, muß bei dieser Lösung auf die Ermittlung und Steuerung der Größe der Pinholeöffhung verzichtet werden. Das bewirkt aber keinen entscheidenden Nachteil, weil die reproduzierbare Einstellung kleiner Pinholeöffhungen von 2μm bis 50μm Größe durch ein Referenzierungsverfahren (Referenzierung erfolgt dann, wenn sich das Pinhole gerade öffnet und Licht auf den Photomultiplier fällt) und die reproduzierbare Einstellung großer Pinholeöffhungen von 50μm bis lOOOμm durch einen hochauflösenden Schrittmotorantrieb gesichert sind.

Ein wesentlicher Vorteil der Lösungen mit zusätzlicher Lichtquelle besteht darin, dass die Probe P während der Pinholejustage keiner Lichtbelastung ausgesetzt werden braucht, da der Laser L abgeschaltet werden kann.

1. Erfindungsgemäße Einrichtung und erfindungsgemäßes Verfahren

1.1 optische Anordnung (Bilder 1, 2 und 3)

Für den Markierungsvorgang wird das Pinhole mit einer zehnfach vergrößernden Optik VO auf die ca. 1Ox 10mm ² großen Fläche des CCD-Chips abgebildet.

Ein PC oder μ-Controller berechnet den optischen Schwerpunkt der Pinholeöffnung auf der CCD-Empfängerfiäche, dessen xy-Koordinaten als virtueller Pfeil abgespeichert werden. Als Nullpunkt des X/Y-Koordinatensystems dient beispielsweise die linke untere Ecke der CCD Fläche. Für den Markierungsvorgang ist eine geeignete Ausleuchtung der Pinholeöffhung zu realisieren. Vorteilhaft erfolgt eine Beleuchtung über eine Weißlicht LED, die aus drei farbigen Dioden (rot, grün, blau) besteht, so dass eine Beleuchtung unabhängig von der Art des verwendeten dichrioitischen Spiegels gewährleistet ist. Vorteilhaft kann für den Markierungsvorgang auch eine IR-LED (900nm) eingesetzt werden. Die dichroitischen Spiegel und Filter sollten dann IR durchlässig ausgebildet sein. Alle im folgenden beschriebenen optischen Anordnungsbeispiele mit CCD Empfänger beeinflussen nicht den Laserscanvorgang und verursachen dabei keinen Verlust an dem von der Probe austretendem Licht.

Für jeden eingeschwenkten dichroitischen Teilerspiegel oder andere auswechselbare optische

Komponenten wird einmalig die optimale Pinholelage erfasst und abgespeichert und beim

Einschwenken des betreffenden Bauelementes während des normalen LSM Betriebes wieder hergestellt.

Die optimale Pinholelage wird jeweils durch Intensitätsmessung am PMT beim

Markierungsvorgang ermittelt.

Vorderseitige Ausleuchtung der Pinholeöffhung durch eine LED (Bild 1)

Ein Laser Scanning Mikroskop ist schematisch durch einen eine Probe P beleuchtenden

Beleuchtungslaser L, ein Objektiv O, eine Pinholeoptik PO, ein senkrecht zur optischen

Achse verstellbares Pinhole PH, dem ein Photomultiplier PMT nachgeordnet ist, einen dichroitischen Spiegel SP zur Trennung von Anregungs- und Detektionsstrahlengang dargestellt. Ein Nebenfarbteiler ermöglicht die simultane Beleuchtung einer zweiten

Wellenlänge des Fluoreszenzlichtes.

Eine in einem zusätzlichem optischen Arm des Laserscanmikroskopes angeordnete LED oder

Halogenlampe beleuchtet über einen Kollimator KO und den dichroitischen Spiegel SP

vorderseitig die Pinholeöffhung. Der Photomultiplier PMT wird vorteilhaft aus Platzgründen beim Markierungsvorgang aus dem Strahlengang des Laserscanmikroskopes ausgeschwenkt und hinter dem Pinhole PH eine Vergrößerungsoptik VO und eine CCD Fläche angeordnet. Beim Laserscanvorgang wird dann die LED abgeschaltet.

Rückseitige Ausleuchtung der Pinholeöffhung durch eine LED (Bild 2) Eine zwischen Photomultiplier PMT und Pinhole PH angeordnete LED oder Hologenlampe beleuchtet über einen Kondensor KO das Pinhole PH rückseitig ebenfalls dreifarbig oder im LR. Die Pinholeöffhung wird über mindestens einen zusätzlichen Spiegel SPl (hier zwei Spiegel SPl und SP2 über einen im Laserscanmikroskop angeordneten optischen Arm (Optik POl und VO) auf die CCD abgebildet. Der oder die im Strahlengang des Laserscanmikroskopes angeordnete Zusatzspiegel sind für den Laserscanvorgang ausschwenkbar und für den Markierungsvorgang präzise einschwenkbar ausgebildet. Beim Laserscanvorgang wird die LED abgeschaltet und aus dem Strahlengang ausgeschwenkt. Der Photomultiplier braucht nicht ausgeschwenkt zu werden. Für die Einstellung der Pinholelage nach Bild 1, 2 ist statt der LED auch der Laser und die CCD einsetzbar, allerdings unter Belastung der Probe.

Der Vorteil der Anordnung besteht darin, daß die Fehler des dichroitischen Spiegels beim Markierungsvorgang erfaßt werden.

Ausleuchtung des Detektorpinholes durch den Laser und einen Ringspiegel (Bild 3) Die Ausleuchtung des Pinholes erfolgt vorderseitig durch den Laser und einen im Laserscanmikroskop im telezentrischen Strahlbereich, hier zwischen Objektiv O und Spiegel SP, angeordneten Ringspiegel RS, der in einem unbeschichteten Randbereich des dichroitischen Spiegels SP das Laserlicht in Richtung des Pinholes PH reflektiert. Der Photomultiplier wird beim Markierungsvorgang aus dem Strahlengang des Laserscanmikroskopes ausgeschwenkt. Der Ringspiegel RS braucht beim Laserscanvorgang nicht aus dem Strahlengang ausgeschwenkt zu werden, weil das Laserlicht durch einschwenkbare Filter (nicht dargestellt) abgeblockt wird und nicht auf den Photomultiplier gelangen kann.

Auch bei dieser Anordnung werden die Fehler des dichroitischen . Spiegels beim Markierungsvorgang mit erfaßt.

Lagemarkierung und Steuerung der Pinholeöffhung (Bild 4 und 5)

Ein PC oder μ-Controller wertet die CCD-Signale aus, ermittelt den optischen Schwerpunkt der Pinholeöffhung und speichert die xy-Koordinaten der zu markierenden Lage der

Pinholeöffhung ab. Die Pixelgröße der CCD beträgt ca. 6μm. Wegen der hier zehnfachen optischen Vergrößerung der CCD Kamera entschärft sich die Reproduzierbarkeitsforderung von 0,5μm auf 5μm.

Auch die Größe der Pinholeöffhung kann nach diesem Verfahren ermittelt und gesteuert werden. Statt des Schwerpunktes der Pinholeöffhung wird die Lage der auf dem CCD-Chip abgebildeten Pinholekanten ausgewertet.

Die Pinholeöffhung ist hier schematisch als Kreis dargestellt. Ist sie quadratisch oder rechteckig, lässt sich die jeweilige b Kantenlage auf der CCD leicht ermitteln.

Um eine markierte Lage der Pinholeöffhung wieder reproduzierbar auffinden zu können, wird das Laserscanmikroskop wie bei der Markierung der Pinholelage eingestellt (LED oder Spiegel eingeschwenkt, Photomultiplier eventuell ausgeschwenkt). Der μ-Controller steuert die beiden Schrittmotorantriebe M _x und M _y so, daß die aktuelle Lage der Pinholeöffhung auf dem CCD-Chip und der abgespeicherte virtuelle Zeiger die selben xy-Koordinaten aufweisen. Die Pinholeöffhung befindet sich nun mit einer Abweichung von höchstens 0,5 μm über dem auf dem CCD-Chip markierten Punkt.

Die Größe der Pinholeöffhung läßt sich analog zu diesem Verfahren ebenfalls mit einer Reproduzierbarkeit von 0,5 μm erfassen und einstellen.

öffnung und Lage des Pinholes können mit der erfindungsgemäßen Anordnung und dem erfindungsgemäßen Verfahren beliebig oft und an jeder Stelle mit einer Reproduzierbarkeit von 0,5 μm ermittelt und eingestellt werden. Die als Normal dienende CCD darf allerdings auch langzeitig keine Lageänderungen zum Strahlengang des Laserscanmikroskopes erfahren.

Ausführungsbeispiel LSM (Bild 6)

In Bild 6 ist ein Ausfuhrungsbeispiel der erfindungsgemäßen Anordnung nach Bild 2 für ein ZEISS LSM 510 dargestellt. Die vier Pinholes werden rückseitig durch einschwenkbare und seriell einzuschaltende LED's und je einen Kondensor beleuchtet. Ein präzis einschwenkbarer Zusatzspiegel SP3 lenkt das vom Pinhole kommende Licht auf den CCD-Chip um, dessen Signale ausgewertet werden. Vorteilhaft ist, daß für die Markierung und die Einstellung aller

vier Pinholes nur eine CCD-Kamera am Laserscanmikroskop benötigt wird und das auch die vom dichroitischen Hauptspiegel verursachten Markierungsfehler erfaßt werden.

In den Bildern 7, 8, 9 und 10 sind Lösungsvarianten zu einem weiteren vorteilhaften Einstellverfahren der Pinholelage dargestellt.

In Bild 7 wird ein axialer Lichtzeiger, der die gleiche Lage wie der Laserstrahl haben soll, durch zusätzliche optische Elemente erzeugt.

Das Pinhole wird mittels der Schrittmotoren so in seiner Lage gesteuert, daß der

Photomultiplier ein maximales Lichtsignal detektiert. Dann trifft der Lichtzeiger genau auf die Pinholeöfmung. Die Pinholelage ist somit optimal für den Laserscanvorgang eingestellt.

Eine von der LED beleuchtete Lochblende LB wird in die Pinholeebene abgebildet. Das Bild der Lochblende dient als optischer Zeiger, der mittels Pinhole, Photomultiplier und

Schrittmotorantrieben eingefangen wird.

Die erstmalige Kalibrierung der Pinholelagen und Speicherung der x- und y-Koordinaten erfolgt durch Suchalgorithmen mit dem Laser. Die Lochblende wird so justiert dass der LED

Fokus mit dem Laserfokus übereinstimmt.

Nach der Kalibrierung erfolgt beim Messen mit dem LSM die Einstellung der Pinholelagen anhand der abgespeicherten Pinholelagen. Eine sich anschließende Feinkorrektur erfolgt nach dem LED Fokus, wobei vorteilhaft die Probe nicht mit dem Licht belastet wird, weil der Laser abgeschaltet wird.

In Bild 8 wird durch zusätzliche Elemente ein zum Laserstrahl schräger Lichtzeiger erzeugt, der auf ein zusätzliches Referenzpinhole RPH trifft.

Die Schräglage wird bei der erstmaligen Kalibrierung des LSM eingestellt, indem das Pinhole durch Suchalgorithmen auf den Laserfokus eingestellt wird und anschließend die Lochblende so justiert wird, dass der LED— Fokus durch das Referenzpinhole tritt und der dahinter befindliche Fotoempfänger PE maximale Intensität aufweist.

Nach der Kalibrierung erfolgt beim Messen mit dem LSM die Einstellung der Pinholelagen anhand der abgespeicherten Pinholelagen und Feinkorrekturen mit dem Laserfokus wie anhand Bild 7 beschrieben. Vorteilhaft kann für das Referenzpinhole eine LED mit 900nm

Wellenlänge verwendet werden.

Weil bei dieser Wellenlänge der PMT unempfindlich ist, kann vor — oder auch während der

Messungen mit dem LSM die Steuerung der Pinholelage mit der IR LED bei hoher

Quanteneffizienz am Pfotoempfänger erfolgen.

Die Einstellung der Pinholelage erfolgt über das Referenzpinhole. Pinhole und Referenzpinhole sind mechanisch miteinander gekoppelt. Vorteilhaft wird statt des Photomultipliers ein separater Photoempfänger PE als Detektor verwendet. Die Lochblende wird in die Ebene des Referenzpinholes abgebildet. Der PMT und der Laser werden nicht für die Einstellung benötigt.

In Bild 9 wird durch die optische Abbildung eines Diaphragmas DP in die Pinholeebene ein aus 10OxIOO=IO ⁴ Lichtzeigern bestehender Flächenmaßstab im Pinholeeinstellbereich von Ix lmm erzeugt. Pinhole und Photomultip lier können mittels der hochauflösenden Schrittmotorantriebe jeden beliebigen Lichtzeiger mit hoher Reproduzierbarkeit einfangen und hiervon ausgehend beliebige Pinholelagen in einem Quadrat von lOxlOμm einstellen. Das Diaphragma ist eine matrixförmig von Löchern (5μm Durchmesser, lOμm Abstand) durchsetzte Chrommaske oder ein Kreuzgitter von Ix lmm Größe.

Die Lade der Diaphragmafoki in der Pinholeebene wird bei der erstmaligen Kalibrierung des LSM durch Suchalgorithmen bestimmt , indem das Diaphragma so justiert wird, dass sowohl der Laserfokus als auch ein Foki des Diaphragmas (z.B. der mittlere) durch das Pinhole treten (Koordinatenursprung). Alle weiteren Pinholedlagen werden bezogen auf diesen Koordinatenursprung und die anderen optischen Pixel der Fokimatrix ermittelt und abgespeichert.

Beim Messen mit dem LSM erfolgt die Einstellung der Pinholelage durch Einstellung auf den abgespeicherten Diaphragmafokus und motorischer Interpolation zwischen den Foki. Der Laser ist hierbei vorteilhaft abgeschaltet.

Anstelle des Diaphragmas in Bild 9 kann auch ein Mikrolinsenarray verwendet werden. üblich sind Mikrolinsen von 50μm Durchmesser. Ein Array von 5x5mm Größe würde dann ebenfalls 10OxIOO=IO ⁴ Lichtzeiger erzeugen, die aber um den Maßstab 1:10 optisch verkleinert in die Pinholeebene abgebildet werden müssen.

In Bild 10 entsteht in der Pinholeebene das Beugungsbild eines aus Mikrolinsen bestehenden Quadrupolelementes QP, das ebenfalls eine Matrix optischer Zeiger darstellt. Eine Wabenpupille PW verhindert störende Fresnelbeugung.

Prinzip: Das Quadrupolelement besteht aus 4 Mikrolinsen, in deren Brennpunkten zur

Vermeidung der Fresnelbeugung sich die Wabenpupille befindet. Das

Beugungsbild des Quadrupolelementes in der Pinholebene ist eine Matrix optischer Zeiger, die als Flächenmaßstab dient. Das Pinhole kann mittels der hochauflösenden Schrittmotorantriebe und des Photomultiplier auf jeden beliebigen optischen Zeiger reproduzierbar eingestellt werden.

Mit den Parametern

f = 150 mm Brennweite der Abbildungslinse L d = 10 mm Abstand der Mikrolinsen des Quadrupolelementes λ = 630 nm rote Laserdiode

und der Beugungsgleichung

g = λ * f/ d

ergibt sich ein Abstand der matrixfδrmigen Lichtzeiger in der Pinholeebene von

g = 9,5 μm.

Pinhole und Photomultiplier können mittels der hochauflösenden Schrittmotorantriebe jeden beliebigen Lichtzeiger mit hoher Reproduzierbarkeit einfangen und hiervon ausgehend beliebige Pinholelagen in einem Quadrat von 9,5x9,5μm einstellen.

Ein weiteres besonders einfaches Verfahren zur Pinholejustierung soll hinzugefügt werden. Der Vorschlag besteht darin, in den parallelen Strahlengang des Laserscanmikroskopes eine Retrofolie (Bild 11) oder ein Tripelprisma (Bild 12) in und aus dem Strahlengang schiebbar anzuordnen. Durch das in den Strahlengang geschobene optische Element wird der Laserfokus in die Pinholeebene abgebildet und zusätzlich verhindert, daß die Probe beim Justieren durch Laserlicht belastet und ausgeblichen wird. Durch das aus den Strahlengang geschobene optische Element wird die Probe für die Beobachtung frei geschaltet. An den Schiebemechanismus werden auf Grund der Winkelinvarianz von Retrofolie oder Tripelprisma keine besonderen Anforderungen gestellt. Die nur minimal geöffnete Pinholeöffhung kann nun so justiert werden, bis das Laserlicht genau hindurch tritt und vom Photoempfänger maximal empfangen wird. Der Photoempfänger wird wegen der nur minimal

geöffneten Pinholeöffhung nicht geblendet. Eine motorische Voreinstellung der Pinholeöffhung in die Nähe des Laserfokus (max. 2μm Ablage), deren Werte in einen einmaligen Justiervorgang zu finden sind, erleichtert die automatische Suche nach dem Fokus durch kleine Scanbewegungen der xy- Antriebe des Pinholesystems in einem Gebiet von etwa 5μmx5μm.

1. Vorteile

Die Pinholeöffhung kann nach diesem Verfahren besser als 0, 3μm zum Laserfokus ausgerichtet werden.

Die Pinholejustierung kann auch während einer Probenuntersuchung vorgenommen werden, weil die Probe durch die eingeschobenen optischen Elemente (Retrofolie oder Tripelprisam) keine Laserbelastung erfährt und nicht verbleichen kann. - Die kleinen Pinholeöffhungen von z. B. 3μm Größe können auch ohne Wegmeßsysteme auf 0,3μm genau justiert werden.

2. Hinweise

Um die volle Intensität des Laserlichtes für diese Justierung am Pinhole zur Verfugung zu haben, sollten sich möglichst keine Farbfilter im Strahlengang befinden.

In einem weiteren Erfindungsvorschlag wird beschrieben, wie Winkelfehler des

Laserstrahles beim Schalten der Teilerspiegel und Farbfilter vermieden werden können

( 3 Punktanlage der Spiegel).

Dieses Verfahren ähnelt dem Ringspiegelverfahren nach Bild 3, bei dem jedoch die Probe durch Laserlicht beim Justieren belastet wird und das eine genaue Ausrichtung des

Ringspiegels senkrecht zur optischen Achse voraussetzt.