Die Erfindung betrifft eine eine Steuereinheit aufweisende Vorrichtung und ein zur Durchführung bestimmtes Verfahren zur Untersuchung und/oder Behandlung einer insbesondere biologischen oder medizinischen Probe, beispielsweise Zellen, einschließlich Lebendzellen und/oder Partikel, wobei die Vorrichtung innerhalb eines gemeinsamen Behandlungsraums zumindest eine Abgabeeinheit zum Abgeben der Probe in zumindest einen eine Vielzahl von Vertiefungen mit einer jeweiligen Öffnung und einer Bodenfläche aufweisenden Probenträger, eine optische Untersuchungseinheit, insbesondere mit einem Bildsensor, einem Mikroskop und/oder einem Objektiv, sowie eine Entnahmeeinheit zur Entnahme zumindest einer Probe aus dem Probenträger und zur Ablage oder Ausgabe der zuvor isolierten Probe aufweist.

Die Analyse einer Zellkultur oder sogar einer einzelnen Zelle ist derzeit aufgrund maschineller sowie verfahrenstechnischer Beschränkungen nur mit erheblichem Aufwand zu erreichen. Insbesondere die Isolierung einzelner Zellen aus winzigen Proben stellt sich als sehr schwierig dar, da einzelne Zellen vom Laborpersonal unter einem Mikroskop erfasst und die erfasste Zelle dann mithilfe von Kapillaren manipuliert werden muss.

Insbesondere in den Bereichen der Zellbiologie und Medizin werden Probenträger zur Untersuchung von biologischen oder medizinischen Proben verwendet. In den meisten Experimenten ist es dabei von Vorteil, wenn die Probe genau positioniert werden kann. Dies ermöglicht eine effiziente Durchführung der Experimente, eine erhöhte Vergleichbarkeit mehrerer Experimente und eine Erleichterung der Auswertung. Häufig stellt sich beim Befüllen eines Probenträgers eine zufällige Anordnung der Probe ein. Derartige Proben, insbesondere Zellpopulationen, sind typischerweise heterogen nach der Art der Zelle, dem Stadium der Zelle oder auch hinsichtlich der individuellen Unterschiede, z. B. genetisch, und möglicher Kombination daraus. Untersuchungen von heterogenen Zellpopulationen decken naturgemäß lediglich durchschnittliche Charakteristika auf. Dies kann die grundsätzliche Fähigkeit sein, ein bestimmtes Protein herzustellen oder die Reaktion auf einen Wirkstoff oder ein Medikament zu untersuchen. Beispielsweise kann auch untersucht werden, ob oder in welchem Umfang die Zellen nach dem Einschleusen von genetischem Material durch Transfektion oder Transduktion ein Gen aufgenommen und integriert haben.

Sollen Charakteristika einzelner oder weniger Zellen und/oder deren Interaktion aufgedeckt werden, müssen die Zellen individuell behandelt und untersucht werden. Hierzu eignen sich vorzugsweise solche Verfahren, durch welche die Zellen räumlich von anderen Zellen separiert werden können (Kompartmentalisierung).

Die zur Verfügung stehenden Verfahren haben jeweils wesentliche Nachteile. So erweist sich beispielsweise die Vereinzelung von Zellen auf Nährböden aufgrund der erforderlichen großen Grundfläche als nachteilig. Außerdem können die Zellen nur sehr eingeschränkt unterschiedlichen Bedingungen oder Substanzen ausgesetzt werden.

Die US 10 101 276 B2 beschreibt bereits das Ansaugen und Sammeln von Zellen auf der Basis optischer Informationen bestimmter Zellen, wobei der Messchip aus einem lichtdurchlässigen Material mit einer darin ausgebildeten Vertiefung besteht, die eine Flüssigkeit mit mindestens einer Zelle enthält. Die Zelle wird durch eine Saug-Ausstoß- Kapillare an einer vorbestimmten Position auf dem Probenträger ausgestoßen.

Es sind auch Einzelzell-Drucker mit einem Dreiachs- Laborroboter, einem Druckkopf mit Druckkartusche für die Zellsuspension und einer Mikroskop-Optik bekannt. Die Funktionsweise ähnelt der eines Tintenstrahldruckers.

Mittels einer Mikroskop-Optik und einer schnellen Kamera wird die Probe im Inneren des Druckkopfs analysiert. Dadurch können die in der Probe befindlichen Zellen detektiert und nach optischen Kriterien wie Größe und Morphologie klassifiziert werden. Falls der erfasste Inhalt des zu druckenden Tropfens nicht den Anforderungen entspricht, wird dieser abgesaugt, sodass nur Tropfen mit einer einzigen Zelle, die den Kriterien entspricht, auf dem Probenträger, beispielsweise einer mit einer Vielzahl getrennter Wells ausgestatteten Mikrotiterplatte (bis zu 1536 Wells), in der vorgesehenen Position abgelegt werden. Durch die optische Detektion mittels der Kamera kann der Nachweis der Einzelzelle direkt während des Druckvorgangs erfolgen.

Die Behandlung der Zellen durch die beispielsweise in der EP 2 411 134 A1 beschriebenen Droplet-Technologie zur Erzeugung emulgierter Tröpfchen, bei dem eine Tröpfchenfluidphase in einer Trägerfluidphase erzeugt wird, benötigt demgegenüber zwar wenig Grundfläche und erlaubt die Erzeugung größerer Mengen an „verkapselten“ Zellen, die auch unterschiedlichen Bedingungen ausgesetzt werden können. Als nachteilig erweist es sich allerdings, dass sich die Zellen innerhalb der Trägerfluidphase nicht optimal optisch analysieren lassen, z. B. aufgrund der schwierigen Fixierbarkeit der Tröpfchen und deren optischen Eigenschaften. Zudem eignet sich dieses Verfahren im Allgemeinen nur für kurzfristige (untertägige) Versuche, da sich frische Nährstoffe schwer zuführen und Stoffwechselprodukte kaum entfernen lassen. Weiterhin kann auch der häufig erforderliche Sauerstoff nicht optimal zugeführt werden. Aber auch die Verwendung der Trägerfluidphase, in der Praxis häufig ein Öl, kann direkt einen Einfluss auf die Versuchsergebnisse haben, wenn die Trägerfluidphase nicht inert ist, Medikamente nach außen diffundieren lässt etc. Eine Übertragbarkeit auf in vivo Verhältnisse wird daher oftmals als unbefriedigend bewertet, was den Einsatz dieser Technologie zumeist auf mehrstündige oder kürzere Versuche begrenzt.

Die US 2010 / 0 182 419 A1 offenbart einen mit einem Vakuumbett ausgestatteten Halter für Behälter für biologische Proben, wie beispielsweise Mikrotiterplatten, der in Bezug auf einen Lichtstrahl, der die Probe in einem Well beleuchtet, kontinuierlich bewegt wird, während eine Kamera ein Bild der Probe in dem Well aufzeichnet. Zum Beleuchten einer Probe ist der Lichtstrahl entweder so konfiguriert, dass er die gesamte Probe oder nur einen Teil der Probe direkt beleuchtet. In diesem Fall wird der Strahl zu anderen Teilen umgeleitet, sodass die gesamte Probe unter Verwendung einer Reihe von Bildern verschiedener Teile der Probe abgebildet werden kann.

Eine Verbesserung bei Langzeitversuchen und der Übertragbarkeit auf in vivo Verhältnisse ist die Nutzung von biologisch inerten Materialien des Probenträgers. Hier kommen insbesondere Glas, Silizium und einige Kunststoffe wie PDMS, COP/COC, PS, PC zum Einsatz. Hierbei werden zwei unterschiedliche Ansätze unterschieden.

Bei den mikrofluidischen Ansätzen werden die Zellen, meist als vereinzelte Suspension, in ein Kanalsystem gegeben, welches durch die räumliche Ausgestaltung des Kanalsystems und einer Art von Taschen, Hinterschneidungen oder Kammern die räumliche Trennung der Zellen ermöglicht. Zur physischen Manipulation, d. h. zum Bewegen, Ein- und Aussortieren der Zellen, können dabei beispielsweise Strömungsdynamik, elektrische, magnetische oder akustische Felder verwendet werden. Vorteil dieses Ansatzes ist die Möglichkeit, bei geringem Raum- und Reagenzienbedarf viele Zellen in einer inerten Umgebung testen zu können.

Als nachteilig erweist sich, dass die Zellen im Allgemeinen nur übereinstimmenden Bedingungen ausgesetzt werden können, was oftmals nachteilig für die Untersuchung verschiedener Wirkstoffe ist. Zudem erfordert auch die Konstruktion, die Herstellung und auch die Nutzung solcher mikrofluidischen Systeme eine fundierte Expertise, sodass sich solche Systeme nur in wenigen Fällen aus ökonomischer Sicht als zweckmäßig erweisen.

Zur einfachen Handhabung von Proben werden vielfach Mikrotiterplatten verwendet. Diese weisen eine Vielzahl (bis zu 3456) von entsprechend kleinen, auch als Well bezeichneten Vertiefungen oder Kavitäten zum Aufnehmen der Proben auf. Um die Handhabung von Mikrotiterplatten zu vereinfachen, sind die Abmessungen der Mikrotiterplatten genormt.

Die Nutzung von Multiwell-Platten oder Mikrotiterplatten als Probenträger ist ein in der Praxis etabliertes Verfahren. Insbesondere die Vielseitigkeit für deren Verwendung, die Verfügbarkeit umfangreichen Equipments zum Beladen, Analysieren oder auch zur Isolierung der Proben aus diesen Platten, die massentaugliche Herstellung der Multiwell- Platten oder Mikrotiterplatten zu ökonomisch attraktiven Kosten und die Offensichtlichkeit ihrer Funktionsweise, die wenig spezielle Expertise für die Nutzung benötigt, sind Vorteile, um diese für Zellversuche unter biologisch inerten Bedingungen zu nutzen.

Als nachteilig erweisen sich oftmals die in der Praxis verfügbaren Formate in den Dimensionen der Vertiefungen, beispielsweise zwischen 1 ,1 und 2 mm Durchmesser, die um ein Vielfaches größer sind als die zu untersuchenden Einzelzellen mit einer typischen Größe von 10-20 pm. Bakterien, wie z. B. E. coli, haben sogar typische Durchmesser von 1-2 pm und Längen von 2-6 pm.

Medikamente auf Basis rekombinanter Proteine, welche von Zellen hergestellt werden, müssen laut Zulassungsbehörden auf eine einzelne Zelle zurückzuführen sein („Monoklonalität“). Der Nachweis, dass sich nur eine einzige Zelle in einer Vertiefung befindet, entsprechend der strengen Anforderungen für solche Medikamente, erfordert, dass ein großes Volumen der Vertiefung langwierig gescannt werden muss, um schließlich die Zelle optisch zu erfassen und insbesondere die Anwesenheit weiterer Zellen auszuschließen. Dies verursacht gerade bei einer großen Anzahl an vereinzelten Zellen, z. B. 10.000 bis mehr als 1.000.000 Zellen, eine riesige Zahl an Mikroskopbildern, die ausgewertet und auch gespeichert werden müssen. Dies macht die Datenspeicherung/- verarbeitung zu einem erheblichen Kostenfaktor und die Scandauer zu einem wesentlichen Zeitfaktor.

Weiterhin ist das benötigte Füllvolumen der Vertiefungen gerade bei großen Zellpopulationen ein wesentlicher Kostenfaktor, da im Allgemeinen teure Reagenzien zum Einsatz kommen. In der Praxis ist es von Nachteil, dass bei großen Populationen schnell hunderte oder gar tausende von Mikrotiterplatten gehandhabt und inkubiert werden müssen, was logistische Anstrengungen nach sich zieht, einen großen Raumbedarf verursacht und fehleranfällig ist, da die Mikrotiterplatten vertauscht werden können.

Weiterhin führt die Untersuchung einer sehr großen Zahl von Zellen zu der Notwendigkeit, verschiedene Anlagen zum Positionieren, Mikroskopieren, Isolieren und Inkubieren der Probe einzusetzen und zu koordinieren bzw. zu synchronisieren, die jeweils mit hohen Anschaffungskosten verbunden sind. In der Praxis erweist sich dabei auch die gemeinsame Steuerung der verschiedenen Anlagen als problematisch, sodass solche Strategien eine entsprechende Unternehmensgröße voraussetzen und dennoch Kompatibilitätsnachteile entstehen und Fehlerwahrscheinlichkeiten steigen.

Aus der US 10 032 615 B2 ist eine Analysevorrichtung für isolierte Zellen mit einem eine Vielzahl von Vertiefungen aufweisenden Substrat bekannt, die eine Tiefe zwischen 1 pm und 250 pm, eine Öffnung mit einem Durchmesser zwischen 10 pm und 100 pm und ein Volumen zwischen 1 pL und 10 nL haben sowie eine Suspension mit einer Zellkonzentration zwischen 1.000 Zellen/ml und 500.000 Zellen/ml aufnehmen. Die Wells sind so konfiguriert, dass mindestens 25 % der Wells nur eine einzige Zelle enthalten und die isolierte Zelle optisch untersucht werden kann.

Zum Stand der Technik zählen auch bereits Mikrotiterplatten, wie sie beispielsweise aus der DE 197 12 484 A1, DE 10 2019 003 135 A1 oder der DE 102019 109207 B3 bekannt sind.

Außerdem beschreibt die EP 0 706646 B1 einen Probenträger, der eine Vielzahl von zu untersuchenden Proben mit einem Volumen von insbesondere weniger als 10 pl aufnehmen kann. Die Böden der Ausnehmungen sind vorzugsweise porös, sodass mittels eines Unterdrucks an der Unterseite des Probenträgers die Proben aus den Ausnehmungen über deren poröse Böden abgesaugt werden können. Die US 2019 / 0 113457 A1 beschreibt ein Verfahren zum Verarbeiten von Zellen enthaltenden Wells eines Multiwell-Chips, wobei ein Volumen an Zellsuspension zwischen 30 nL und 50 nL in die Wells abgegeben wird. Es werden mehrere Bilder der Wells auf mehreren z-Ebenen erfasst und eine Karte basierend auf der aufgenommenen Vielzahl von Bildern in mindestens drei z-Ebenen erstellt, die leere Wells und Zellen enthaltende Wells des Multiwell-Chips identifiziert. Die Bilderfassung kann gleichzeitig mehrere Wells umfassen, indem diese einzeln nacheinander oder innerhalb eines einzigen Mikroskopbilds so abgebildet werden, dass mehrere Vertiefungen gleichzeitig abgebildet werden können.

Die EP 0648 536 A1 geht von dem Problem aus, dass bei der Durchführung von Verfahren mit fotometrischer Auswertung wässriger Proben bei der Verwendung von Mikrotiterplatten die Resultate durch den gebildeten Meniskus gestört und verfälscht werden. Die Meniskusbildung resultiert aus Oberflächen- und Grenzflächenspannungen, sodass sich je nach Flüssigkeit eine konvexe oder konkave Oberfläche ausbildet. Zur Lösung des Problems wird der Einsatz von Materialien unterschiedlicher physikalischer Eigenschaften für die Gefäßwände und für die Gefäßböden vorgeschlagen, um zu erreichen, dass die zu analysierende Probe zur Gefäßwand einen Randwinkel von zirka 90° aufweist und dadurch die Strahlung bei der Analyse nicht wesentlich absorbiert und der Strahlengang nicht beeinflusst wird.

Die DE 199 16 749 B4 betrifft ein Verfahren zur Untersuchung von in Probengefäßen einer Mikrotiterplatte enthaltenen Proben durch Abbildung mindestens eines Teils des Probenvolumens durch den Boden des Probengefäßes hindurch mittels einer CCD-Kamera und einer Auswerteeinheit. Dabei werden Reflexe von der Oberseite oder der Unterseite des Bodens des Probengefäßes erfasst und mittels eines Regelalgorithmus ein Korrekturwert zur Fokussierung auf die Probe im Inneren des Probengefäßes bestimmt.

In der US 10 101 276 B2 wird eine Vorrichtung zum Ansaugen einer Zelle beschrieben, wobei auf der Basis optischer Informationen, die durch einen Sensor erfasst werden, nach vorbestimmten Zellen gesucht wird, die in einem Messchip aus einem lichtdurchlässigen Material mit einer darin ausgebildeten Vertiefung enthalten sind.

Außerdem wird in der DE 10 2005 053 669 B4 eine Probenmanipulationsvorrichtung beschrieben, bei der mithilfe einer als Mikroskop ausgestalteten Positionsmesseinheit die Ist- Position bestimmt wird. Die räumliche Position des Zellobjekts in einem Probenträger wird gemäß der DE 102007 046 267 A1 mittels einer Bildaufnahmeeinheit und einer Bildauswerteeinheit erfasst und eine Kapillare zuerst in eine Kalibrierposition und dann in eine Position über dem Zellobjekt verfahren.

Bei Untersuchungen ist es generell wünschenswert, den Verbrauch von Probenmaterial und weiterer bei der Untersuchung verwendeter Substanzen möglichst niedrig zu halten, was durch eine Miniaturisierung der Mikrotiterplatte grundsätzlich erreicht werden kann.

Allerdings steigen die Kapillarkräfte infolge der Miniaturisierung aufgrund des reduzierten Innendurchmessers der Vertiefungen und der zum Ansaugen verwendeten Kapillare in unerwünschter Weise an, sofern die Kapillare in die Vertiefung eintauchen soll, also geringere äußere Abmessungen als die lichte Weite der Vertiefung oder Kavität aufweist. Gemäß der US 10 101 276 B2 kann dieses Problem umgangen werden, indem die Kapillare nicht in die Vertiefung eingetaucht wird, sondern Zellen durch Verwirbelungen aufsteigen und dann angesaugt werden.

Zur Begrenzung der Steighöhe hat eine Kapillare gemäß der DE 100 39 195 A1 eine ringförmige hydrophobe Beschichtung an der Innenwandung, um die Flüssigkeit exakt zu dosieren und das aufsaugbare Volumen zu begrenzen, insbesondere selbsteinstellend ausführen zu können. Die hydrophobe Beschichtung kann aus verschiedenen geeigneten hydrophoben Materialien, beispielsweise auf Basis von Silikon und/oder Bienenwachs, bestehen.

Ferner weist eine Glaskapillare gemäß der DE 103 34 164 A1 sowohl einen Innendurchmesser im Spitzenbereich von weniger als 10 pm auf als auch an der Spitze eine Polymerbeschichtung mit Biomoleküle abweisenden Eigenschaften.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Vorrichtung und ein Verfahren zu schaffen, um in einem integrierten, weitgehend automatisierten Prozess eine Vielzahl insbesondere isolierter Proben, insbesondere auch Einzelzellen, innerhalb eines Probenträgers bereitzustellen, zu manipulieren, zu untersuchen und aus dem Probenträger gezielt einzelne Proben zu entnehmen, wobei der zeitliche Aufwand zur Durchführung des Prozesses, der mit der Untersuchung verbundene Datenerfassungs-, Datenverarbeitungs- und Steuerungsaufwand, sowie der Verbrauch von Reagenzien, Chemikalien und anderen Verbrauchsmaterialien im Vergleich zu den bisherigen eingesetzten Vorrichtungen und Verfahren wesentlich reduziert ist. Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß mit einer Vorrichtung und einem Verfahren gemäß den Merkmalen der Ansprüche 1 und 2 gelöst. Die weitere Ausgestaltung der Erfindung ist den Unteransprüchen zu entnehmen.

Erfindungsgemäß sind also eine Vorrichtung und ein Verfahren vorgesehen, bei denen innerhalb des Behandlungsraums zumindest ein Probenträger durch zumindest eine in einer insbesondere horizontalen Ebene bewegliche Aufnahme in unterschiedliche Arbeitspositionen beweglich ist, die sich innerhalb eines durch eine jeweilige Vertiefung des Probenträgers begrenzten Arbeitsbereichs befinden, und dass in der jeweiligen Arbeitsposition die optische Untersuchungseinheit einerseits und die Abgabeeinheit, die Entnahmeeinheit und/oder eine auswählbare weitere Einheit (Werkzeug) andererseits koaxial an gegenüberliegenden Seiten des Probenträgers positioniert sind, sodass sich die optische Achse der optischen Untersuchungseinheit innerhalb des Arbeitsbereichs befindet, wobei zumindest einzelne der Vertiefungen eine zumindest abschnittsweise transparente Bodenfläche aufweisen, sodass die optische Erfassung der Probe durch die Bodenfläche erfolgt, wobei zumindest ein wesentlicher Anteil der Vertiefungen des Probenträgers ein Aspektverhältnis der Höhe der Vertiefung gegenüber Durchmesser bzw. Kantenlänge der Öffnung größer als 1 aufweist, und dass die Referenzierung zur Positionierung mittels der Steuereinheit aufgrund des mittels der optischen Untersuchungseinheit erfassten Probenträgers und/oder der jeweiligen Probe erfolgt.

Im Gegensatz zum Stand der Technik, bei dem der Probenträger unbeweglich angeordnet ist und die die Werkzeuge bildenden Einheiten in einer zeitlichen Abfolge nacheinander in die jeweilige Arbeitsposition bewegt werden, um nacheinander verschiedene Prozessschritte auszuführen, wird erfindungsgemäß der Probenträger beispielsweise mittels eines Kreuztischs der Aufnahme bewegt, wobei in der so eingestellten Arbeitsposition eine ständige, ununterbrochene Beobachtung der Probe erreicht, gegebenenfalls ein Korrekturwert hinsichtlich des erfassten Aufenthaltsorts der Probe innerhalb der Vertiefung oder auch des Probenträgers innerhalb der Aufnahme ermittelt und daraus bedarfsweise eine Korrektur der Arbeitsposition vorgenommen wird. Erfindungsgemäß ist eine Beweglichkeit des Werkzeugs nach Abschluss des Arbeitszyklus insbesondere zum Werkzeugwechsel möglich und sinnvoll.

Entgegen dem Vorurteil in der Fachwelt, dass aufgrund der Beschleunigung bei der Bewegung des Probenträgers die in der jeweiligen Vertiefung enthaltene Probe ebenfalls in Bewegung gerät und daher nur mit erhöhtem Aufwand erfasst bzw. untersucht werden kann, hat sich gezeigt, dass unter Beachtung des erfindungsgemäßen Aspektverhältnisses (Tiefe zu Weite) der Vertiefungen größer als 1 in Verbindung mit der Verwendung von sogenannten Wellplatten als Probenträger aufgrund des geringen Volumens innerhalb der Vertiefung in der Praxis nicht zu einer unerwünschten durch die Positionierung des Probenträgers verursachten Bewegung der enthaltenen Probe führt. Mehr noch hat sich gezeigt, dass die Probe mit sehr hoher Wahrscheinlichkeit trotz der wirkenden dynamischen Kräfte die Vertiefung nicht verlässt.

Als Probenträger wird bevorzugt eine Wellplatte verwendet, die bevorzugt aus Glas besteht oder die aus Kunststoff, bevorzugt transparenter Kunststoff (Polycarbonat, Polystyrol, Cyclic- Olefin-Polymer, Cyclic-Olefin-Copolymer, Polydimethylsiloxan), oder Silizium oder Metall oder eine Kombination davon besteht. Die Wellplatte weist Vertiefungen auf, die bevorzugt ein Aspektverhältnis (Tiefe zu Weite) von größer 1 oder größer 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 oder mehr haben.

Die Vertiefungen stellen die erfindungsgemäßen Arbeitspositionen dar.

Die Vertiefungen können bevorzugt einen kreisförmigen Querschnitt oder einen rechteckigen Querschnitt aufweisen. Der Durchmesser von kreisförmigen Vertiefungen beträgt bevorzugt zwischen 10 und 1000 pm oder mehr, bevorzugt 50 pm, 100 pm, 200 pm, 300 pm, 400 pm, 500 pm, 600 pm, 700 pm, 800 pm, 900 pm oder 1000 pm. Die Tiefe der Vertiefungen beträgt bevorzugt zwischen 20 und 1100 pm oder mehr, bevorzugt 50 pm, 100 pm, 200 pm, 300 pm, 400 pm, 500 pm, 600 pm, 700 pm, 800 pm, 900 pm, 1000 pm oder 1100 pm.

Die Vertiefungen weisen bevorzugt einen Abstand von Mittelpunkt zu Mittelpunkt von 105 %, 110 %, 120 %, 130 %, 140 %, 150 %, 160 %, 170 %, 180 %, 190 %, 200 %, 300 %, 400 % oder 500 % oder mehr des Durchmessers bzw. der Kantenlänge auf. Der Abstand von der Kante einer Vertiefung zur nächstliegenden Kante einer benachbarten Vertiefung beträgt bevorzugt 2 pm, 5 pm, 10 pm, 20 pm, 30 pm, 40 pm, 50 pm, 60 pm, 70 pm, 80 pm, 90 pm, 100 pm, 200 pm, 300 pm, 400 pm, 500 pm, 600 pm, 700 pm, 800 pm, 900 pm oder 1000 pm oder mehr. Die Dichte der Vertiefungen beträgt bevorzugt zwischen 0,25 pro mm ² und 6.944 pro mm ² , bevorzugt 0,5 pro mm ² , 1 pro mm ² , 5 pro mm ² , 10 pro mm ² , 20 pro mm ² , 30 pro mm ² , 40 pro mm ² , 50 pro mm ² , 60 pro mm ² , 70 pro mm ² , 80 pro mm ² , 90 pro mm ² , 100 pro mm ² , 200 pro mm ² , 300 pro mm ² , 400 pro mm ² , 500 pro mm ² , 600 pro mm ² , 700 pro mm ² , 800 pro mm ² , 900 pro mm ² , 1.000 pro mm ² , 2.000 pro mm ² , 3.000 pro mm ² , 4.000 pro mm ² , 5.000 pro mm ² , 6.000 pro mm ² . Dabei hat die Wellplatte aus Glas, insbesondere hergestellt durch das an sich bekannte LIDE-Verfahren (Laser Induced Deep Etching), optimale optische und inerte Eigenschaften, sodass die Untersuchung, insbesondere mittels optischer Verfahren wesentlich verbessert wird. Dadurch wird die Möglichkeit einer fehlerfreien Erfassung der Proben durch die Bodenfläche der Vertiefung geschaffen. Die Wellplatte aus Glas kann auch durch Laserbohren, Nass- oder Trockenätzen, beispielsweise Plasmaätzen, Ultraschallbohren, Sandstrahlen, lithographische Verfahren usw. hergestellt werden.

Die Bearbeitungsverfahren können mit Bondverfahren wie dem anodischen Bonding, dem Fusionbonding, dem Verbinden mittels PDMS oder anderer Klebeverfahren kombiniert werden.

Ein Ausführungsbeispiel einer Wellplatte ist eine Glasplatte aus Borosilikatglas mit einer Dicke von 450 pm mit Durchgangslöchern mit einem Durchmesser von 200 pm, die mittels Fusionbonding mit einer zweiten Glasplatte aus einem Borosilikatglas verbunden wird. Die zweite Glasplatte dient als Boden der Vertiefungen. Die zweite Glasplatte weist beispielsweise eine Dicke von 300 pm auf und wird nach dem Bonding auf eine Dicke von 175 pm geschliffen und poliert. Alternativ kann die zweite Glasplatte mit einer Siliziumschicht bedampft werden, beispielsweise mittels CVD-Verfahren. Die Glasplatten können anschließend mittels anodischem Bonding verbunden werden.

Ein weiteres Ausführungsbeispiel einer Wellplatte besteht aus einer Siliziumplatte mit einer Ausgangsdicke von 500 pm, in die mittels Bosch-Verfahren (reaktives lonentiefenätzen) Durchgangslöcher eingebracht wurden und die mit einer Glasplatte aus Borosilikatglas mittels anodischem Bonding verbunden ist. Die Durchgangslöcher haben beispielsweise einen Durchmesser von 300 pm. Die Glasplatte weist beispielsweise eine Dicke von 175 pm auf.

Alternativ können die Platten mittels Kleben oder einer PDMS-Schicht verbunden werden.

Ein weiteres Ausführungsbeispiel einer Wellplatte besteht aus einer Glasplatte mit einer Dicke von 550 pm mit Durchgangslöchern als Vertiefungen, die mit einer zweiten Glasplatte mit 175 pm Dicke verbunden ist, wobei beide Glasplatten mit einem Kunststoffkörper mittels Kleben verbunden sind, wobei der Kunststoffkörper eine Öffnung aufweist, die die Durchgangslöcher in der ersten Glasplatte freilässt. Die Glasplatten mit den Vertiefungen bilden den Boden des Kunststoffkörpers. Der Durchmesser der Vertiefungen beträgt beispielsweise ungefähr 100 pm. Der Kunststoffkörper kann statt einer Öffnung mehrere Öffnungen aufweisen. Der Kunststoffkörper kann beispielsweise eine Mikrotiterplatte ohne Boden sein, die bevorzugt 6, 12, 24, 48, 96, 384, 1536, 3456 Öffnungen aufweist.

Die Wellplatten können eine Grundfläche in der Größe eines Mikroskopobjektträgers aufweisen mit einer Breite von 25 mm und einer Länge von 75 mm. Eine solche Wellplatte besteht beispielsweise aus einer Glasplatte mit Vertiefungen oder zwei oder mehr verbundenen Glasplatten mit Vertiefungen. Alternativ besteht eine solche Wellplatte aus einem Kunststoffkörper, an den eine Glasplatte oder ein Verbund von mehreren Glasplatten mit Vertiefungen als Boden angebunden ist.

Ein weiteres Ausführungsbeispiel einer Wellplatte besteht aus einem Kunststoff körper mit kreisförmiger Grundfläche mit 35 mm Durchmesser aus zwei miteinander verklebten Kunststoffteilen. Das obere Teil weist vier Öffnungen auf, die das zweite Kunststoffteil freilassen. Das zweite Kunststoffteil weist Vertiefungen mit einen Durchmesser von 100 pm und eine Tiefe von 250 pm auf. Die Kunststoffteile werden einzeln mittels Spritzguss gefertigt.

Ein weiteres Ausführungsbeispiel einer Wellplatte besteht aus zwei Glasplatten, die miteinander verbunden sind. Die obere Glasplatte weist Durchgangslöcher als Vertiefungen mit einem Durchmesser von 300 pm auf. Die obere Glasplatte weist eine Dicke von 450 pm auf. Die untere Glasplatte weist Kanäle auf, die paarweise Mittelpunkte der Vertiefungen verbinden. Die Kanäle weisen eine Breite von 10 pm und einen dreieckigen Querschnitt mit einem Öffnungswinkel von 60° auf.

Die Erfindung geht davon aus, die eingesetzten Probenträger, insbesondere Mikrotiterplatten, zu miniaturisieren und damit die bekannten Nachteile zu überwinden. Erfindungsgemäß werden so ein geringer Verbrauch der Trägerflüssigkeit bzw.

Chemikalienbedarf, eine insgesamt reduzierte Grundfläche des Behandlungsraums bzw. der Vorrichtung und Abmessungen der Vertiefung mit Dimensionen im Bereich der Größenordnung von Mikroorganismen erreicht. Durch den so bereits konstruktiv reduzierten Aufenthaltsraum der Probe in Verbindung mit der jederzeit möglichen Beobachtung der Probe durch die Bodenfläche der Vertiefung können so eine unnötige Bilderfassung und Datenverarbeitung von solchen Bilddaten, die ohne Relevanz für die Untersuchung sind, insbesondere also von Bereichen ohne die Probe, drastisch reduziert werden, um so die oben genannten wirtschaftlichen und technischen Nachteile bei Untersuchungen und Behandlungen von Einzelzellen zu vermeiden. Somit vereint die Erfindung die notwendige hohe Qualität, die biologische Inertheit und die für die Massenuntersuchungen wichtigen ökonomischen Aspekte.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung gestattet im Gegensatz zum Stand der Technik die Abgabe, insbesondere das Drucken von Zellen oder Reagenzien mit bisher unerreichbarer Präzision, die zudem infolge der jederzeit möglichen visuellen Überwachung lückenlos dokumentierbar ist. Während bei bekannten Anlagen die Anlage-zu-Anlage-Kompatibilität oft nicht gegeben ist, schaffen das erfindungsgemäße Verfahren und die Vorrichtungen die Voraussetzungen, um mit ausreichender Geschwindigkeit und automatisiert die Proben in die vorgesehenen Vertiefungen abzugeben, die optische Erfassung und Untersuchung durchzuführen und die Probe, insbesondere lebende Zellen, mit deutlich verringerter Beeinflussung zu isolieren.

Somit ist die Vorrichtung als integriertes System zur Vereinzelung und Untersuchung der auf dem Probenträger isolierten Einzelzellen, zur optionalen Manipulation und anschließenden Isolierung der Zellen, insbesondere durch Aufnahme aus der Vertiefung und Ablage auf demselben oder einem anderen Probenträger zu verstehen.

Die Vorrichtung wird bevorzugt angewendet für Zelllinien-Entwicklung, synthetische Biologie, Untersuchung von immunologisch relevanten Zellen (z. B. Screening von antikörperproduzierenden Zellen, Untersuchung von natürlichen Killerzellen in Interaktion mit Tumorzellen), Screening der Wirkung von Medikamenten auf Zellen (Drug screening, drug repurposing), Transkriptom-Analyse, Produktion von DNS-Bibliotheken, Transfektions- und Transduktionsversuche, Untersuchung der Interaktion verschiedener Zelltypen miteinander mit und ohne direkten physischen Kontakt (Co-Kultivierung) und andere biologische und medizinische Anwendungen.

Dabei eröffnet die Erfindung vor allem durch die selektive Abgabe die Möglichkeit der Variation der Zelltypen, Nährlösungen, Reagenzien und Wirkstoffe bei verschiedenen Vertiefungen.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung geht dabei insbesondere einher mit der Verwendung einer Wellplatte und einem oder mehrerer Bearbeitungsköpfe zum Beleuchten und/oder Drucken und/oder Aspirieren der Probe, indem die Wellplatte mit höchster Genauigkeit und sehr geringen Toleranzen hergestellt wird und so deren Position mittels eines optischen Sensors der Vorrichtung zuverlässig erkannt wird. Bevorzugt wird ein Bearbeitungskopf verwendet, der alle Funktionen beinhaltet. Darüber hinaus eröffnen die durch die Wellplatte erzielbaren geringen Toleranzen die Voraussetzung für eine weitergehende Miniaturisierung zur weiteren Reduzierung des möglichen Aufenthaltsraums der Probe ebenso wie der erforderlichen Volumina einer Trägersubstanz.

Die Probe besteht typischerweise aus Zellen, z. B. Bakterien, Hefen, tierischen Zellen, pflanzlichen Zellen, und/oder aus biologisch relevanten Molekülen, z. B. Proteinen, Antikörpern, DNS, RNS, und/oder aus Biomarkern, z. B. Fluoreszenzfarbstoffen, Antikörpern, Antigenen, die in einer Flüssigkeit suspendiert sind. Die Flüssigkeit besteht typischerweise hauptsächlich aus Wasser und kann zusätzlich Nährstoffe, z. B. Zucker, Aminosäuren, und/oder Wachstumsfaktoren, und/oder Antibiotika enthalten.

Die Probe kann außer biologischen oder medizinischen Proben auch aus Partikeln, beispielsweise auch aus Aufwuchskörpern, bestehen oder solche Partikel aufweisen. Diese Partikel sind in einem flüssigen Medium, meist Wasser und anderen Inhaltsstoffen, suspendiert und können aus Kunststoff oder Glas bestehen, einen Durchmesser von 1 pm bis 50 pm und optional eine Beschichtung aufweisen, die Biomoleküle bindet, wie beispielsweise Silane, Antikörper oder andere Proteinstrukturen.

Die Probe kann Lebendzellen enthalten. Säugetierzellen sind beispielsweise CHO-, HEK-, Immunzellen, wie B-Zellen, T- oder NK-Zellen; weiterhin Bakterien und Hefen. Solche Zellarten können natürlich, gentechnisch verändert oder entartet (Krebszellen) sein. Weiterhin können es auch hybride Formen verschiedener Zellarten sein, beispielsweise durch somatische Fusion oder auch Zellen, welche antikörperproduzierende B-Zellen mit Krebszellen, beispielsweise nach der Hybridom-Technik, enthalten. Diese Zellen sind in einem Medium suspendiert, das als wesentliche Bestandteile Wasser und/oder Zellnährmedium und/oder Pufferlösungen und/oder Reagenzlösungen enthalten kann. Bevorzugt enthält die Suspension mindestens 70 % lebende Zellen. Die Zellkonzentration beträgt mindestens 1.000 Zellen/mL und maximal 2.000.000 Zellen/mL oder mehr. Der Anteil an Zellclustern ist maximal 10 %, 20 %, 30 %, 40 % oder 50 %. Keine enthaltene Zelle ist im Durchmesser größer als das 2-fache, 3-fache, 4-fache, 5-fache, 6-fache, 7-fache, 8-fache, 9- fache oder 10-fache oder größer als der Durchmesser der kleinsten Zelle.

Bevorzugt können unterschiedliche Zellen in Vertiefungen gedruckt werden, beispielsweise

Tumorzellen kombiniert mit NK-Zellen in denselben Vertiefungen, oder bei Co-Culturing verschiedene Zelltypen in benachbarte Vertiefungen, die beispielsweise über Kanäle verbunden sind.

Die Vorrichtung ist gemäß einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung mit einem Bearbeitungskopf ausgestattet, der an einer von der beweglichen Aufnahme für den Probenträger, insbesondere dem Kreuztisch, unabhängigen Bewegungsachse oberhalb des Probenträgers angebracht ist. Der Bearbeitungskopf kann dadurch die Bearbeitungsposition sowie die Position einer Tropfenkalibrierstation und eine Ein-/Ausgabeposition erreichen. Die Vorrichtung kann weitere Positionen für den Bearbeitungskopf aufweisen, beispielsweise eine Reinigungsstation, eine Desinfektionsstation, eine Temperierstation, eine Werkzeugwechselstation, eine Pipettenwechselstation, eine Kanülenwechselstation, eine Beschichtungsstation, eine Trockenstation, eine Inspektionsstation, eine Messstation. Dabei ist die Aufnahme für den Probenträger in einer Ebene in Richtung von zwei Achsen mittels zugeordneter Antriebe vorzugsweise unabhängig beweglich. Diese Ebene kann entlang einer weiteren, zur Ebene orthogonalen Achse bewegt werden.

Die Achsen sind alle oder teilweise auf einem Granit montiert, dessen Eigenschaften (frei von inneren Spannungen, gute Dämpfungseigenschaften, bei wechselnden Temperaturen sehr stabil) eine konstante Präzession der Achsen erlauben.

Die Abgabeeinheit kann eine Druckvorrichtung zur insbesondere tropfenweisen Abgabe der Proben in den Probenträger aufweisen. Vorzugsweise kann der Druckvorgang durch ein Piezoelement oder Solenoidelement ausgelöst werden, wobei entweder zumindest ein Piezoelement direkt auf das Volumen der die Probe enthaltenden oder diese bildenden Drucklösung einwirkt oder ein Piezoelement oder Solenoidelement einen Stempel bewegt, der auf das Volumen der Drucklösung einwirkt und damit zur Tropfenbildung und Ablösung führt.

Der Bearbeitungskopf kann eine Kapillare zur Aspiration von Flüssigkeiten, beispielsweise aus Vertiefungen des Probenträgers oder anderen Behältnissen, aufweisen.

Nachdem der Druckprozess abgeschlossen ist, kann der Benutzer auswählen, mit welchen Vertiefungen weitergearbeitet werden soll. Dies können beispielsweise ausschließlich Proben aus solchen Vertiefungen sein, die genau eine Zelle oder eine Spannbreite mehrerer, beispielsweise 2 bis 5 Zellen oder andere gewünschte Zusammensetzungen, z. B. eine bestimmte Anzahl eines Zelltyps in Kombination mit einer zweiten Anzahl eines anderen Zelltyps, enthalten. Dieses Kriterium wird bevorzugt von 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % oder 100 % der auf der Wellplatte insgesamt vorhandenen Vertiefungen erfüllt.

Gemäß einer anderen Ausführungsform wird nur mit Zellen einer bestimmten mittels der optischen Untersuchungseinheit erfassten Minimal- oder Maximalgröße, Form und/oder Struktur oder einer Spannbreite dieser Werte die Untersuchung oder Behandlung fortgesetzt.

Weiterhin kann die Untersuchung oder Behandlung auf Zellen beschränkt werden, die sich angehaftet haben oder nicht angehaftet haben. Dabei kann eine Reaktionsdauer gewählt werden, in welcher sich die Zellen angehaftet haben müssen oder nicht, beispielsweise mindestens 12 oder 24 Stunden.

Anders als bisher üblich können vorteilhafterweise Proben aus solchen Vertiefungen in einem der Abgabe nachgelagerten Prozessschritt genutzt werden, die abweichende Mengen der Zellen enthalten oder deren Rundheit, Größe oder andere Eigenschaften nicht dem gewünschten Profil entsprechen. Auf diese Weise können beispielsweise auch Vergleichsproben geschaffen werden, die dabei helfen können, Veränderungen bei den Reagenzien aufzudecken, die nicht durch Zellen verursacht sind oder durch unbemerkte Verunreinigungen eingetragen werden.

Wenn nach dem Verdünnungsprinzip gedruckt wird (Poisson-Verteilung) und Zellen bei jedem Druckzyklus statistisch in Vertiefungen verteilt werden oder Vertiefungen frei bleiben, kann es vorteilhaft sein, nicht so oft wie möglich leere Vertiefungen nachzufüllen, sondern eine bestimmte Anzahl freizulassen, beispielsweise 1 % oder 5 % oder 10 % oder mehr der Vertiefungen oder in Summe 10 oder 100 oder 1000 oder 10.000 oder mehr Vertiefungen. Auf diesem Wege können beispielsweise zu Vergleichszwecken Experimente durchgeführt werden, die Veränderungen ohne Zellen oder Verunreinigungen aufzeigen. Außerdem kann auch die Genauigkeit erfasst werden, mit welcher Zellen erkannt oder nicht erkannt werden, indem z. B. nach einer festgelegten Zeit die Wells erneut analysiert werden und Abweichungen ausgewertet werden. Diese falsch-negativen Vertiefungen zeigen eventuell bei einem nachfolgenden Scan Zellen, da diese die Position geändert haben, größer geworden sind oder sich geteilt haben und damit in der Anzahl mehr werden und leichter erkannt werden. Weiterhin zeigt dieses Vorgehen beispielsweise auch technische Probleme auf, wie etwa Verwirbelungen, die bewirken, dass Zellen ungewollt in leere Vertiefungen gelangen, oder Konvektion durch Erwärmung, die Zellen aufschwimmen lässt. In einer Ausführungsform wird diese Überprüfung genutzt, um die Aussagekraft eines durchgeführten Experiments zu kontrollieren. Dafür werden zuvor als leer identifizierte Wells im Anschluss an das Experiment analysiert. Sollten Zellen in solchen Wells gefunden werden, deutet dies daraufhin, dass in der Durchführung des Experiments Fehler aufgetreten sind. Diese können in einer fehlerhaften Erstanalyse (Zellen übersehen) oder Handhabung der Proben (Zellen wandern von Well zu Well) begründet sein. Die Schwelle zur Beurteilung der Qualität des Experiments (z. B. 0,1 % der ursprünglichen leeren Wells enthalten nach dem Experiment Zellen) kann vom Benutzer festgelegt werden.

Die insbesondere mit Druckköpfen ausgestattete Abgabeeinheit kann eine austauschbare Kartusche oder einen Behälter für Proben, Reagenzien, Zellsuspensionen, Nährmedien, Wasser oder Pufferlösungen aufweisen.

Eine Variante solcher Druckköpfe kann mittels Kapillarkraft oder durch Unterdrück die Flüssigkeiten aus einem Reservoir aufnehmen. Außerdem kann der Druckkopf durch ein Schlauchsystem mit einem Vorratsbehälter verbunden sein, sodass die Abgabeeinheit mittels eines Pumpsystems mit Flüssigkeit versorgt werden kann. Der Druckkopf kann eine austauschbare Kartusche aufweisen, die Reagenzien, Zellsuspension, Nährmedium, Wasser oder Pufferlösung enthält.

In der Praxis hat sich bereits ein Tropfenvolumen zwischen 20 pL bis zu 70 nL als sinnvoll erwiesen. Das Tropfenvolumen kann aber auch bis 10 pL oder mehr sein. Das Tropfenvolumen kann beispielsweise durch Betrachtung der Tropfendurchmesser optisch bestimmt werden.

Der optische Sensor zur Erfassung des Tropfenvolumens kann weiterhin dazu genutzt werden, die Parameter der Abgabeeinheit, insbesondere der Piezoansteuerung, in der Weise zu regeln, dass Satellitentropfen, Versprühen, Nichtablösen des Tropfens oder andere unerwünschte Effekte weitgehend vermieden werden. Der optische Sensor ist Teil der Tropfenkalibrierstation. Als optische Methoden können Abbilden des Tropfens, Fraunhofer- Beugungsmethode, Laser- Doppler-Methode oder andere interferometrische Methoden, Mie- Theorie-basierte Methoden, Lorenz-Mie-Theorie-basierte Methoden verwendet werden. Das Tropfenvolumen kann mit einem kapazitiven oder einem Durchfluss-Sensor bestimmt werden. Alternativ können die optischen Verfahren mit Gewichtungsverfahren kombiniert werden. Wichtige Einflussgrößen der Piezoauslenkung auf den Druckprozess der Abgabeeinheit sind die absolute Auslenkung, die Geschwindigkeit der Auslenkung sowie der zeitliche Verlauf der am Piezo angelegten Spannung. Die Einflussgrößen können geregelt werden, wenn Satellitentropfen oder ähnliche Effekte detektiert werden und/oder keine Tropfenablösung detektiert wird.

Dabei hat es sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die Abgabeeinheit, insbesondere der Druckkopf, in unterschiedlichen vertikalen Positionen relativ zu dem Probenträger positionierbar ist, wobei eine Änderung der Position auch während der Behandlung der Probe nicht ausgeschlossen ist. Vor dem Druckprozess können die nicht genutzten Druckköpfe oder ausgewählte Druckköpfe hochgefahren werden, um den Abstand zum Probenträger zu erhöhen. Alternativ können die für den Druckprozess benötigten Druckköpfe herausgefahren werden, um den Abstand zum Probenträger zu verringern. Zusätzlich können ausgewählte Druckköpfe vor dem Druckprozess parallel zur Ebene des Probenträger verfahren werden. Bevorzugt sind alle Druckköpfe an einer Vorrichtung montiert, deren Abstand zum Probenträger verstellt werden kann.

Obwohl die Abgabeeinheit mit ihrer beispielsweise als Düse ausgeführten Austrittsöffnung und die insbesondere mit einem Objektiv ausgestattete optische Untersuchungseinheit koaxial bzw. im Lot zueinander ausgerichtet sind, können Tropfen mit einem gewissen Offset gedruckt werden. Dieser kann vernachlässigbar klein sein oder muss korrigiert werden. Dazu kann ein Tropfen auf eine Oberfläche, die in einer mit der Öffnung der Vertiefung gemeinsamen Ebene liegt, oder in eine Vertiefung abgegeben werden. Durch die optische Untersuchungseinheit, insbesondere ein Mikroskop, wird der Offset in x- und y-Richtung optisch erfasst und ein Korrekturwert für die Positionierung des Probenträgers gemessen. Die Messung kann außerhalb der Anlage durchgeführt werden. Der Probenträger wird anschließend an die korrigierte Position verfahren. Alternativ kann der Druckkopf für die Korrektur in eine Richtung und der Kreuztisch zur Korrektur in die orthogonale Richtung genutzt werden.

Zur Korrektur des Offsets kann ein Tropfen in eine Vertiefung des Probenträgers abgesetzt werden und eine Änderung der optischen Eigenschaften, z. B. Lichtdurchlässigkeit, dieser Vertiefung detektiert werden. Sollte die optische Veränderung nicht eintreten, wird eine Korrektur in x und/oder y vorgenommen und der Prozess wiederholt. Typische Schrittweiten in x und/oder y sind beispielsweise 10 pm, 20 pm, 30 pm, 40 pm, 50 pm, 100 pm oder größer. Alternativ kann zur Korrektur des Offsets ein Tropfen an die Position einer Vertiefung abgesetzt werden. Wird der Tropfen nicht in der Vertiefung detektiert, kann eine Routine abgefahren werden, wobei der Offset zunächst um einen Anteil des Durchmessers bzw. der Kantenlänge der Vertiefung verändert wird (z. B. 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 % oder 150 % des Durchmessers bzw. der Kantenlänge), und zwar in beliebiger Reihenfolge entlang der x-Achse, der y-Achse und/oder diagonal, wobei die Schrittweiten in Richtung der x-Achse und der y-Achse unterschiedlich sein können, und nach jeder Positionsveränderung ein Tropfen abgesetzt wird. Sollte der Tropfen nach einer Positionsänderung nicht in der Vertiefung detektiert werden, kann die Schrittweite der Positionsveränderung erhöht werden (Erhöhung der Schrittweite beispielsweise 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 150 % oder 200 % des Durchmessers bzw. der Kantenlänge). Anschließend kann erneut geprüft werden, ob der Tropfen in der Vertiefung detektiert wird und das Verfahren wiederholt, bis ein Abbruchkriterium erfüllt ist (z. B. Tropfen in Vertiefung detektiert oder vorgegebene Anzahl Positionsänderungen überschritten).

Zusätzlich kann nach jeder Positionsveränderung die Position der abgesetzten Tropfen mit der Position des Mittelpunkts der Vertiefung oder der Kante der Vertiefung verglichen werden. Abbruchkriterium der beschriebenen Routine kann dann der geringste Abstand zwischen einer Tropfenposition und der Position der Vertiefung oder der größte Abstand zwischen Tropfenposition und der Position der Kante der Vertiefung sein. Weiterhin können andere geometrische Merkmale auf dem Probenträger als Kriterium für die Korrektur des Offsets verwendet werden.

Alternativ kann ein Tropfen in eine Vertiefung abgesetzt werden. Das Mikroskop misst auf der Ebene des Bodens der Vertiefung den Offset in x und y und korrigiert die Position des Probenträgers um diesen Wert.

Alternativ können auf der Oberfläche des Substrats oder am Boden der Vertiefungen Kreuzstrukturen oder Linien eingebracht sein, deren Dimensionen bekannt sind. Nach Absetzen eines Tropfens kann der Offset zwischen Tropfen und diesen Strukturen bestimmt werden. Die Kreuzstrukturen können einen Abstand von 10 bis 50 pm voneinander aufweisen, beispielsweise 10 pm, 15 pm, 20 pm, 25 pm, 30 pm, 35 pm, 40 pm, 45 pm oder 50 pm.

Die oben beschriebenen Strukturen zur Bestimmung des Offsets, insbesondere

Vertiefungen, Kreuzstrukturen und/oder Linien, können zwischen 100 pm und 1 mm Kantenlänge oder mehr aufweisen, bevorzugt 100 pm, 200 pm, 300 pm, 400 pm, 500 pm, 600 pm, 700 pm, 800 pm, 900 pm oder 1000 pm oder größer.

Bevorzugt ist der Durchmesser der Tropfen, die durch die Abgabeeinheit abgegeben werden, mindestens 2 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 % oder 50 % kleiner als der Durchmesser der Vertiefungen bzw. die kleinste Kantenlänger der Vertiefungen.

Alternativ kann zur Korrektur auch eine Kombination verschiedener Bewegungen der Abgabeeinheit und der Aufnahme des Probenträgers vorgesehen sein.

Die optische Untersuchungseinheit kann zur Durchführung verschiedener Mikroskopiertechniken, umfassend Hellfeld-, Dunkelfeld-, Phasenkontrast- und (Epi-) Fluoreszenzmikroskopie, dienen. Die optische Untersuchungseinheit weist bevorzugt eine digitale Kamera auf, die im Wellenlängenbereich 380 nm bis 780 nm detektiert. Weiterhin weist sie ein Objektiv auf, bevorzugt mit Vergrößerungen 5x, 10x, 20x, 40x. Die optische Untersuchungseinheit weist weiterhin eine Beleuchtungseinheit auf, die bevorzugt weiße LEDs und/oder LEDs mit Emission im UV- und sichtbaren Spektrum aufweist. Für Fluoreszenz-Mikroskopie werden bevorzugt Anregungswellenlängen bei 375 nm, 490 nm und/oder 590 nm verwendet.

Der Bearbeitungskopf weist bevorzugt eine Beleuchtung als ein Werkzeug auf. Diese Beleuchtung kann bevorzugt für Hellfeld-Mikroskopie verwendet werden.

Zur optischen Untersuchung der Proben in der jeweiligen Vertiefung durch ihre Bodenfläche hindurch kann die beispielsweise mit einem Kreuztisch ausgestattete Aufnahme eine Öffnung oder eine optisch transparente Auflagefläche für den Probenträger aufweisen.

Für die optische Untersuchung bzw. den Mikroskopierschritt und Scannen der Vertiefungen kann der Abstand zwischen Objektiv und Probenträger verändert werden, um verschiedene Ebenen der Vertiefungen abzubilden. Dabei kann die Abstandsänderung in 15 nm bis 100 pm Schritten durchgeführt werden. Alternativ kann eine Electrically Tuneable Liquid Lense (ETL) verwendet werden, um die Brennweite der optischen Untersuchungseinheit zu verändern und so verschiedene Ebenen der Vertiefung abzubilden.

Das Mikroskop kann bevorzugt ein rechteckiges Sichtfeld von 0,21 mm * 0,18 mm oder 2,8 mm * 2 mm abbilden oder ein kleineres oder ein größeres Sichtfeld. Sichtfelder können eine quadratische Fläche oder andere Verhältnisse der Kantenlängen aufweisen. Im Sichtfeld kann, je nach eingestellter Vergrößerung, bevorzugt eine Ebene einer Vertiefung vollständig abgebildet werden. Alternativ können mehrere Vertiefungen abgebildet werden, bevorzugt mindestens 4, 12, 20, 35, 54, 140, 560, 2240 oder 10.000 oder mehr.

Die Vorrichtung kann eine Ein-/Ausgabeposition aufweisen, an der ein Reservoir positioniert wird. Das Reservoir weist Behältnisse auf, in denen Flüssigkeiten bereitgestellt werden können. Das Reservoir kann eine übliche Mikrotiterplatte sein oder andere Formate haben, beispielsweise die Grundfläche eines Mikroskopobjektträgers oder runde Formate mit beispielsweise Durchmessern von 35 mm. Die Behältnisse können Proben, wie Reagenzien oder Zellsuspensionen, enthalten, die von Druckköpfen der Vorrichtung aufgenommen werden können. Mit der Kapillare kann der Inhalt aus den Vertiefungen des Probenträgers entnommen und in die Behältnisse abgegeben werden.

Bei einer besonders praxisgerechten Variante der Erfindung weisen die Probenträger zumindest als einen wesentlichen Materialanteil Kunststoff, beispielsweise COP, COC, PS, PMMA, POM, PC, Glas, Silizium oder eine Kombination dieser Materialien auf.

Glas hat ideale Eigenschaften: Es ist optisch transparent, chemisch inert, aber kann mit bekannten Verfahren oberflächenbehandelt werden (Plasmabehandlung, Silanisierung, Beschichtungen), ist flüssigkeitsdicht und elektrisch nicht leitfähig, was zur Nutzung von Sensoren vorteilhaft ist. Es kann aber (selektiv) beschichtet werden und damit (selektiv) leitfähig gemacht werden. Bekannte Verfahren sind die Metallisierung durch Bedampfen (bei Nutzung von Masken, dann (teil-)selektiv) mit dem physical vapor deposition (PVD) Verfahren. Chemische Metallisierung durch Bekeimung mit z. B. Palladium und anschließender außenstromloser Metallabscheidung oder durch das Bedrucken mit metallhaltigen Flüssigkeiten oder Pasten kommen ebenfalls infrage. Halbleiter können z. B. mit dem chemical vapor deposition (CVD) Verfahren (selektiv) abgeschieden werden. Hier kommen insbesondere Silizium und deren Verbindungen zum Einsatz.

Die Probenträger, insbesondere deren Oberflächen, können optional mittels Plasmabehandlung, vorzugsweise mit hohem Sauerstoffanteil im Gas, oder einem nasschemischen Verfahren, wie dem Ätzen mit NaOH, KOH, oder starken Säuren wie HNO3, Schwefelsäure, Phosphorsäure behandelt werden, um diese hydrophiler und damit besser benetzbar zu machen. Dies wird insbesondere durch Kontakt mit den Chemikalien bei Temperaturen größer 40 °C, größer 50 °C, größer 60 °C, größer 70 °C, größer 80 °C oder größer 90 °C erreicht. Die Dauer beträgt dabei zwischen einer Minute und mehreren Stunden. Zur Manipulation der Oberflächeneigenschaften sind bzgl. Benetzbarkeit oder zur Förderung/Entgegenwirkung der Anhaftung von Zellen an die Oberfläche verschiedene Verfahren bekannt. Eine Plasmabehandlung macht Oberflächen typischerweise hydrophiler, eine Silanisierung mit beispielsweise Alkyl- oder Fluoroalkylsilanen hydrophobisiert die Oberfläche. Diese Behandlungen können genutzt werden, um die Oberflächen besser oder schlechter mit polaren Lösungsmitteln wie Wasser benetzbar zu machen. Zur Steuerung der Anhaftung von Zellen haben sich insbesondere Beschichtungen mit Poly-L-Lysin, Poly-D- Lysin, Poly-Ornithin, Gelatine, Collagen, Fibronektin, Laminin, Vitronektin, Osteopontin. Typischerweise sind die Zelloberflächen negativ geladen, weshalb negativ geladene oder hydrophobe Beschichtungen ein Anhaften von Zellen erschweren oder sogar unterbinden.

Die Größe der Probenträger kann variieren und beispielsweise zwischen 1 cm ² und 0,1 m ² oder größer in der Grundfläche liegen.

Die Vertiefungen können zylindrisch oder gemäß einer bevorzugten Variante konisch ausgeführt sein, mit einem Neigungswinkel (Taperwinkel) der Wandfläche gegenüber der Normalen zur Querschnittsebene zwischen 1° bis 30°.

Weiterhin können die Vertiefungen eine ebene Bodenfläche haben oder eine regelmäßige oder unregelmäßige Strukturierung mit konischen oder kugelförmigen Substrukturen aufweisen.

Über der zellhaltigen Flüssigkeit oder Probe in den Vertiefungen kann sich ein Flüssigkeitsfilm oder Überstand befinden, der mindestes 10 pm bis 100 pm, vorzugsweise 100 pm bis 1 mm, bis 2 mm, bis 3 mm, bis 4 mm, bis 5 mm, bis 6 mm, bis 7 mm, bis 8 mm, bis 9 mm, bis 10 mm oder mehr hoch ist. Die optische Untersuchung durch die transparente Bodenfläche hindurch wird dabei auf die Probe beschränkt, sodass die Untersuchung nicht den sich ausbildenden Meniskus beeinträchtigt. Insbesondere kann die Untersuchung beim vertikalen Scannen der Vertiefungen vor Erreichen des Meniskus abgeschlossen werden.

Optional haben alle Vertiefungen oder Gruppen von Vertiefungen einen solchen Überstand von Flüssigkeit. Dieser Überstand kann durch einen Glas-, Silizium-, Metall- oder Kunststoffrahmen gebildet werden. Der Rahmen kann geklebt oder mittels Fusionbonding (Glas-Glas) oder mittels anodischen Bondings (Glas-Silizium) verbunden oder mittels Gummirahmen geklemmt sein. Dadurch kann sich der Meniskus mit größerem Abstand zur oberen Kante der Vertiefung bilden und/oder einen größeren Radius aufweisen (da der Durchmesser des Rahmens immer größer ist als der Durchmesser Vertiefung) und/oder konvex geformt sein, beispielsweise wenn das Begrenzungsmaterial hydrophob ist (Kunststoff, Gummi, Beschichtung). Dies führt zu deutlich weniger Beeinflussung der mikroskopischen Abbildung der Probe durch den Meniskus.

Die Kapillare ist ein länglicher Hohlkörper aus Glas, Kunststoff oder Edelstahl. Dieser ist bevorzugt an eine einen Unterdrück erzeugende Einheit angeschlossen. Eine Unterdrück erzeugende Einheit kann eine Pumpe sein oder ein verfahrbarer Stempel, der durch ein motorisiertes Herausfahren einen Unterdrück erzeugt. Alternativ kann auch über Lageenergie oder Volumenausdehnung durch Temperaturänderung ein Unterdrück erzeugt werden.

Der Außendurchmesser der Kapillare im Bereich der Öffnung ist kleiner als der Innendurchmesser der Vertiefungen, aus welchen der Inhalt isoliert werden soll, sodass die Kapillare in die Vertiefung eintauchen kann.

Da die Proben in den Vertiefungen aufgrund des erfindungsgemäßen Aspektverhältnisses (Tiefe zu Weite) von mehr als 1 immobilisiert sind, besteht keine Gefahr, dass die Bewegung der Kapillare in dem Medium innerhalb der Vertiefung die zu isolierende Zelle oder eine später zu isolierende Zelle unerwünscht verlagert. Aus diesem Grund können auch nicht anhaftende Zellen auf Basis einer Datenbank, die beim Mikroskopieren und der anschließenden Analyse der Bilder entstanden ist, isoliert werden.

Es hat sich bereits gezeigt, dass eine Kontrolle bzw. Positionierung der Kapillare mittels der optischen Untersuchungseinheit entbehrlich sein kann, weil durch die Vertiefung der Aufenthaltsort der Zelle hinreichend bekannt ist. Der Entnahmevorgang des Inhalts aus der vorbestimmten Vertiefung mittels der Kapillare kann dadurch wesentlich schneller durchgeführt werden.

Die relative Positionierung der Entnahmeeinheit, insbesondere also der Kapillare, ist bereits hinreichend, wenn diese innerhalb des Sichtfelds der optischen Untersuchungseinheit liegt. Die Feinpositionierung wird erreicht, indem die Entnahmeeinheit und die Vertiefung durch optische Kontrolle zueinander positioniert, also die Vertiefungen selbst als intrinsische Referenzpunkte genutzt werden.

Besonders bevorzugt kann die Position der Entnahmeeinheit relativ zum Probenträger, beispielsweise durch Eingaben an der Software, mittels eines Bedienelements manuell verfahren oder automatisch auf eine Startposition über der Vertiefung positioniert werden. Die weitere Positionierung gegenüber der Vertiefung erfolgt dann wiederum manuell oder vollautomatisch.

Eine andere, ebenfalls besonders Erfolg versprechende Ausgestaltungsform der Erfindung wird auch dadurch erreicht, dass die Kapillare vollständig oder teilweise mit einer hydrophoben Beschichtung, wie einem Alkyl- oder Fluoralkylsilan, beschichtet ist.

Außerdem ist es von Vorteil, wenn die Kapillare in einem der Öffnung zugewandten Abschnitt eine geringere Querschnittsfläche als in einem der Öffnung abgewandten Abschnitt aufweist. Die Veränderung der Querschnittsfläche entlang der Haupterstreckung erfolgt dabei vorzugsweise stetig mit einem linearen oder progressiven Verlauf. Alternativ weist die Kapillare einen Teil mit großem und einen mit kleinem Durchmesser auf.

Vorzugsweise ist die Kapillare so bemessen, dass diese mindestens 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % oder mehr des Volumens der Vertiefung aufnehmen kann.

Eine andere, ebenfalls besonders praxisnahe Variante der Erfindung wird dadurch erreicht, dass die Kapillare mit einer Flüssigkeit teilweise gefüllt wird, die eine höhere Dichte aufweist als die Trägerflüssigkeit, aus welcher der Inhalt isoliert werden soll. Beispielsweise kann beim Eintauchen der Kapillare etwas Flüssigkeit in die Vertiefung abgegeben werden. Durch die Flüssigkeit heben sich die in der Vertiefung enthaltenen Partikel von der Bodenfläche. Der Inhalt der Vertiefung kann dadurch leichter aspiriert werden.

Die Kapillare taucht in den Überstand der Flüssigkeit mit einem Abstand von der Bodenfläche so weit ein, dass die Probe in der Vertiefung nicht durch Flüssigkeitsbewegungen gestört wird. Bei einer geschlossenen Kapillare kann die Kapillare in dieser Position bleiben, bis die Saugwirkung durch den Kapillareffekt durch den sich aufbauenden Gegendruck durch die Kompression der Luft kompensiert wird, sich also ein Gleichgewicht einstellt (Priming der Kapillare). Bei einer offenen Kapillare steigt die Flüssigkeit zunächst, bis Gravitation und Kapillarkraft sich ausgleichen. Diese Steighöhe wird durch die Kapillargleichung beschrieben. Danach wird die Vertiefung ggf. so positioniert, dass die Kapillare in die Probe eintauchen kann. Zum Aspirieren wird entweder ein Ventil geöffnet, damit sich die Kapillare mit dem Inhalt der Vertiefung weiter füllt, oder es wird beispielsweise durch die Bewegung eines Stempels oder einer anderen Einrichtung ein Unterdrück zum Aspirieren erzeugt. Eine offene Kapillare muss zunächst geschlossen werden, um den Unterdrück zu erzeugen, z. B. durch einen Stempel. Dieses Vorgehen mit einer geprimeten Kapillare gewährleistet die vollständige Kontrolle über die Sauggeschwindigkeit und die herrschenden Kräfte beim Aufsaugen von beispielsweise lebenden Zellen.

Aufgrund der kleinen Dimensionen der Vertiefungen wird das Aufsaugen signifikant durch Kapillarkräfte innerhalb der Vertiefung beeinflusst. Um den Effekt zu verringern, können die Wände der Vertiefungen hydrophob, z. B. mit einem Alkyl- oder Fluoroalkylsilan, beschichtet sein.

Die Wellplatte kann mindestens eine Position für das „Primen“ der Kapillare enthalten. Dies kann beispielsweise eine Vertiefung, die keine Zellen enthält, oder eine Stelle im Randbereich gegebenenfalls ohne Vertiefungen sein oder bei einem ausreichend großen Flüssigkeitsüberstand über den Vertiefungen jegliche andere Position, die die Bedingung erfüllt, die Probe nicht unkontrolliert aus den Vertiefungen zu bewegen.

Der Inhalt der Kapillare kann durch die Abgabe der Flüssigkeit beispielsweise in eine vorbereitete Mikrotiterplatte an der Ein-/Ausgabeposition abgegeben werden. Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn die Kapillare im Priming-Schritt einen wesentlich größeren Volumenanteil aufgenommen hat als beim Aufsaugen aus der Vertiefung. Das Volumen beim Primen ist bevorzugt mindestens 10 mal, 100 mal, 1000 mal oder mehr größer. Dadurch wird sichergestellt, dass die enthaltene Probe, die sich im unteren Bereich befindet, zuverlässig herausgespült wird und nicht beispielsweise am Meniskus des Flüssigkeitsspiegels mit der Kapillarwand in Kontakt kommen kann und dort anhaftet und lediglich durch mehrmaliges Spülen sicher aus der Kapillare isoliert werden kann.

Alternativ kann auch eine weitere Zuleitung am oberen Teil der Kapillare angebracht sein, die es erlaubt, die Kapillare in Richtung der Öffnung zu spülen und damit enthaltene Partikel sicher auszutragen.

Die Kapillare kann beispielsweise durch einen Luer-Lock oder anderen Mechanismus abnehmbar von der unterdruckerzeugenden Einheit sein. Eine solche unterdruckerzeugende Einheit kann eine Pumpe, ein Stempel, ein Kolben oder dergleichen sein, der beweglich antreibbar ist, um einen Unterdrück zu erzeugen.

Gemäß einer weiteren besonders Erfolg versprechenden Ausführungsform der Erfindung können an dem Probenträger, insbesondere auf dessen Oberfläche oder im Bereich einer Bodenfläche der Vertiefungen Markierungen oder Strukturen, insbesondere Kreuzstrukturen oder Linien, angebracht oder vorgesehen sein, deren Dimensionen und relative Positionen zueinander bekannt sind, um so die Position des Probenträgers optisch erfassen zu können. Auch ein möglicher Offset bei der Probenabgabe kann mittels dieser Strukturen bestimmt werden.

Besonders vorteilhaft ist es, wenn die Aufnahme und der Probenträger zueinander komplementäre Geometrien aufweisen, die das Einsetzen in nur einer einzigen Position und/oder Orientierung erlauben. Die Orientierung kann beispielsweise durch Markierungen auf dem Probenträger und/oder der Aufnahme eindeutig gekennzeichnet sein. Der Probenträger kann an einen Anschlag angelegt und durch eine Klammer oder einen anderen Mechanismus in seiner Position arretiert werden.

Das Gehäuse der Maschine hat einen gekapselten Behandlungsraum, der von HEPA- und/oder ULPA-gefilterter und somit steriler Luft durchspült wird. Weiterhin kann UV- Strahlung zum Sterilisieren genutzt werden. Dabei kann der gekapselte Behandlungsraum entweder durch ein separates Raumvolumen oder das Volumen der gesamten Vorrichtung begrenzt sein.

Alternativ kann das Gehäuse oder ein separates Raumvolumen gegenüber der Umgebung mittels einer Dichtung abgedichtet sein. In beiden Fällen hat der abgeschlossene Behandlungsraum vorzugsweise eine Öffnung zur Ableitung des eingeschlossenen Gasvolumens, beispielsweise durch einen weiteren HEPA- und/oder ULPA-Filter, um Partikel wie Mikroorganismen zurückzuhalten und/oder abzusaugen.

Weiterhin kann ein steriles oder gereinigtes Gas, beispielsweise Luft, von einer externen Gasversorgungseinheit mittels einer Leitungsverbindung eingeleitet werden oder als Bestandteil der Vorrichtung durch entsprechende Filter und Lüfter erzeugt werden.

Beispielsweise kann die Gasversorgungseinheit mit einem Gehäuse der Vorrichtung verbunden sein.

Der Druckunterschied zwischen dem sterilen gekapselten Behandlungsraum und der Umgebung kann geregelt werden. Beim Drucken, Mikroskopieren, Isolieren der Zellen oder im „Ruhemodus“ beträgt der Überdruck bis zu 1 bar gegenüber dem Umgebungsdruck, bzw. der Überdruck ist durch den eingesetzten Filter begrenzt.

In besonders vorteilhafter Weise ist der Behandlungsraum durch zumindest einen verschließbaren Zugang, insbesondere eine Tür oder eine Klappe gegenüber der Umgebung gasdicht getrennt, wobei bei geöffnetem Zugang vorzugsweise der zugeführte Volumenstrom der sterilen Luft erhöht werden kann, um das Eindringen von nicht steriler Umgebungsluft zu unterdrücken.

Die Tür oder eine Klappe ist im geschlossenen Zustand mittels einer Dichtung, beispielsweise einer Gummidichtung, Teflondichtung, einem Schaumstoff und/oder einer aufblasbaren Schlauchdichtung druckdicht verschlossen.

Um Verwirbelungen beim Öffnen des Zugangs weitgehend zu vermeiden und den Zustrom unsteriler Luft aus der Umgebung in den Arbeitsbereich wirksam zu verringern, wird die Tür oder eine Klappe vorzugsweise nicht geschwenkt, sondern translatorisch entlang einer ebenen oder gekrümmten Bahn bewegt, beispielsweise parallel zu einer Gehäuseoberfläche verschoben.

Die Tür oder eine Klappe kann dabei entweder aus einem einzigen beweglichen Element, welches komplett verschoben wird, oder aus mehreren translatorisch beweglichen Elementen bestehen. Die beweglichen Elemente können insbesondere in mehreren parallelen Ebenen in dieselbe Richtung bewegt werden oder teilweise oder vollständig in unterschiedliche Richtungen. In der Praxis kann die Durchlassöffnung vorteilhaft an den Probenträger angepasst werden, indem alle Elemente oder nur einzelne Elemente verschoben werden und so bedarfsweise die Größe der Durchlassöffnung angepasst wird.

Die Elemente der Tür oder der Klappe können über einen hydraulischen, einen magnetischen oder mechanischen Mechanismus bewegt werden. Dabei sind insbesondere Linearachsen, Linearführungen, Spindelachsen vorteilhaft. Die Geschwindigkeit, mit der die Tür zum Öffnen oder Schließen bewegt wird, ist vorzugsweise auf 33 mm/s begrenzt. Bei höheren Geschwindigkeiten werden bevorzugt Sicherheitsmechanismen zum Schutz des Benutzers verwendet.

Weiterhin können Sensoren, beispielsweise Magnetsensoren, elektrische Kontakte, Wegmesssensoren, Lichtschranken oder dergleichen, vorgesehen sein, um zu detektieren, ob die Tür oder Klappe geschlossen, teilweise geöffnet oder vollständig geöffnet ist, sodass in Abhängigkeit des erfassten Zustands ein Steuersignal für den Volumenstrom der zugeführten sterilen Luft ausgelöst wird.

Um für Zellen geeignete Bedingungen zu schaffen, kann eine weitere, insbesondere klimakontrollierte Einheit in den Behandlungsraum eingebracht werden, die ein demgegenüber reduziertes Arbeitsvolumen einschließt und einen den Probenträger einschließenden sterilen Bereich begrenzt. Diese Einheit kann mit eigenen Zuführungen für ein steriles oder aufbereitetes Gasvolumen ausgestattet sein. Die benötigten Zuführungen können durch das Gehäuse geführt werden und beispielsweise lediglich bei Bedarf direkt oder mittels Adapterstücken mit der Einheit verbunden werden.

Diese klimakontrollierte Einheit ist zumindest abschnittsweise transparent, um die optische Untersuchung durch den transparenten Bereich hindurch zu ermöglichen. Weiterhin kann auch die gegebenenfalls erforderliche Beleuchtung durch einen transparenten Bereich erfolgen.

Die klimakontrollierte Einheit besteht vorzugsweise aus Glas, Saphir, COP, COC, PC, PS, POM, PMMA oder einem anderen transparenten Material. Weiterhin kann die Einheit aus dem Arbeitsraum entfernt werden, wenn sie nicht benötigt wird.

Ein alternativer Anschluss der Zuführungen kann durch die geöffnete Tür geschehen. Dabei ist es besonders vorteilhaft, wenn diese durch eine Abdeckung geführt werden, welche die Türöffnung überdecken und im Inneren der Anlage für Dunkelheit sorgen, damit die Mikroskopie, insbesondere bei der Fluoreszenzmikroskopie, nicht durch Fremdlicht gestört wird, welches anderenfalls schlechtere Kontrastwerte liefert.

Ein weiterer Vorteil einer solchen Abdeckung ist, dass der Volumenstrom an steriler Luft geringer sein kann als bei vollständig geöffneter Tür.

Bei geöffneter Tür werden die verschiedenen Einheiten zur Behandlung nicht verwendet und sind vorzugsweise durch die Steuereinheit gesperrt. Das Anbringen der Abdeckung führt zu einer Freigabe der Nutzung der Einheiten, insbesondere der optischen Untersuchungseinheit, und Aufnahme des Probenträgers. Hierzu werden beispielsweise durch magnetische Kontakte sowohl die Position der Türen oder Klappen als auch das Vorhandensein der Abdeckung erfasst und entsprechende Steuersignale von der Steuerung ausgelöst.

Das Gasvolumen kann auf eine vorbestimmte Temperatur erwärmt werden. In der Praxis hat sich bereits eine Gaszusammensetzung von 1 % bis 10 % CO2 und/oder 5 % bis 30 % Sauerstoff und/oder 90-98 % Wasserdampf als zweckmäßig erwiesen. Bevorzugt wird das Sichtfeld erst dann verändert, also in x- oder y-Position verfahren, wenn die optische Untersuchung über einen wesentlichen Teil, insbesondere die vollständige Höhe der Vertiefung, oder mindestens 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % oder 90 % der Höhe der Vertiefung, abgeschlossen ist. Die so erfassten Bilddaten werden mit einer Information zur Position (x,y,z) und/oder einer Zeit (absolut oder relativ zu bestimmten Ereignis) gespeichert. Der alternative Ablauf, nämlich zunächst in einer Ebene alle Vertiefungen zu scannen und dann den Fokus zu verschieben, birgt den Nachteil, dass sich während des Scans entlang der Ebene Zellen in ihren Vertiefungen bewegen können und fehlerhafte Messungen entstehen.

Der Kreuztisch der Aufnahme des Probenträgers hat eine endliche Genauigkeit, sodass eine Toleranz gegenüber dem Probenträger unvermeidlich ist. Dabei kann als ein Problem erkannt werden, wenn die Kanten und/oder Mittelpunkte der Vertiefungen einen Toleranzbereich verlassen.

Weiterhin kann der Probenträger bestimmte Positionen ohne Vertiefungen aufweisen bzw. Positionen mit veränderten Vertiefungen (beispielsweise im Durchmesser verändert) bzw. Positionen mit in der Ebene der Oberfläche des Probenträger versetzten Vertiefungen. Diese Abweichungen können gezielt genutzt werden, um beispielsweise eine fehlerhafte Orientierung und/oder Position oder das Einlegen des falschen Probenträgers zu erkennen. Hierzu wird die genaue Position des Sichtfelds durch einen Abgleich der Bilddaten mit Sollwerten des Layouts des Probenträgers überprüft bzw. korrigiert oder kalibriert.

Die Bilder der optischen Untersuchungseinheit werden zumindest teilweise automatisch durch Methoden der künstlichen Intelligenz bzw. des maschinellen Lernens auf das Vorhandensein von Zellen, die Form der Zellen, die Größe der Zellen, Intensität oder Farbe von Fluoreszenzsignalen, Clusterbildung, Beweglichkeit der Zellen, Wachstumsraten der Zellen, Reaktionen auf externe Stimuli sowie Reaktionszeiten und andere Merkmale und/oder ihre Kombination geprüft und diese Information abgespeichert und/oder weiterverarbeitet. Aufgrund dieser Informationen kann ein weiteres Vorgehen abgeleitet werden, entweder automatisiert, vom Nutzer vorgegeben oder manuell durch den Nutzer.

Für Langzeitversuche kann die optische Untersuchungseinheit in vorgegebenen Intervallen nach vorgegebenen Mustern bestimmte Vertiefungen mehrfach untersuchen und Bilddaten erfassen. Typischerweise sind Zellen in der Flüssigkeit, die das Volumen der Vertiefungen teilweise oder vollständig füllt, verteilt, beispielsweise an den Seitenwänden, am Boden oder freischwebend in der Flüssigkeit. Zur Detektion der Zellen ist daher ein Abbilden in drei Dimensionen notwendig. Die optische Untersuchungseinheit kann daher in Richtung der Tiefenerstreckung der Vertiefung bewegt werden, um unterschiedliche Ebenen innerhalb der Zelle scharf abzubilden.

Aus der dreidimensionalen Abbildung der Vertiefung kann die Information ausgewertet werden, in welcher dreidimensionalen Position sich eine Zelle oder ein Partikel befindet. Beim Aufnehmen der Probe durch die Kapillare kann diese Information genutzt werden, um die Zelle oder das Partikel aufzunehmen.

Die Abbildung des Inhalts der Vertiefung kann genutzt werden, um automatisiert Zelltypen zu identifizieren und zu katalogisieren. Anhand dieser Information können bestimmte Vertiefungen automatisiert ausgewählt und ausgesuchte Zellen gezielt entnommen werden.

Vertiefungen können mit hochviskoser Flüssigkeit gefüllt sein, um Zellbewegung zu unterdrücken.

Optional kann die Vorrichtung auf eine Datenbank zugreifen, um Informationen über den Inhalt von Vertiefungen aus früheren Messungen zu erhalten. Aus diesen Informationen kann abgeleitet werden, welcher Inhalt zu welchem Zeitpunkt aufgenommen und aus der Vorrichtung ausgegeben werden soll. Solche Informationen können beispielsweise die Anwesenheit bestimmter Zelltypen, Antikörper, Proteine sein, oder Wachstumsraten von Zellen oder andere Ergebnisse von früheren Auswertungen.

Vor dem Aufnehmen von Proben kann durch die Kapillare Flüssigkeit in die Vertiefung abgegeben werden, beispielsweise Kontrastmittel, Flüssigkeiten mit höherer Dichte zum Aufschwimmenlassen der Zelle. Die Kapillare kann optional auch oszillierend abgeben und ansaugen, um Zellen oder Partikel aufzuwirbeln oder die Haftung an Wänden bzw. Boden der Vertiefung zu lösen.

Beim Aufnehmen von Proben aus Vertiefungen kann die Kapillare in die Vertiefung eintauchen. Dabei kann die Position innerhalb der Vertiefung durch die optische Untersuchungseinheit detektiert werden. Auf der Basis dieser Detektion können manuelle Schritte durch den Benutzer durchgeführt werden, beispielsweise eine Korrektur der Position der Kapillare in der Vertiefung. Die Kapillare ist optional am oberen Ende des Druckkopfs angebracht.

Vor, während und nach dem Aufnehmen von Proben kann der Inhalt der Kapillare überprüft werden, beispielsweise durch die optische Untersuchungseinheit oder durch eine weitere optische Einheit. Daraufhin können weitere Arbeitsschritte ausgelöst werden.

Optional kann der Probenträger während der Behandlung in der Vorrichtung aus der Anlage entnommen werden, um weitere Arbeitsschritte durchzuführen, beispielsweise Zentrifugieren, und wieder eingesetzt werden.

Alle beschriebenen Arbeitsschritte können nach Wahl des Nutzers automatisiert oder manuell ausgeführt werden.

Der Benutzer hat zu jedem Zeitpunkt die Möglichkeit, manuell Vertiefungen auszuwählen, aus denen Zellen entnommen werden sollen. Alternativ kann dies automatisiert durch eine vom Benutzer vorgegebene Routine, anhand welcher Zellen mit bestimmten Charakteristika ausgewählt werden, durchgeführt werden.

Zur Reinigung der Kapillare kann optional eine Spül- und/oder Reinigungslösung durch eine Öffnung oberhalb der Spitze der Kapillare zugeführt werden. Auf diese Weise ist der Spülprozess sehr viel effizienter und effektiver. Alternativ kann eine Spül- und/oder Reinigungslösung durch Aspiration aufgenommen und wieder abgegeben werden. Beide Spülmethoden können auch miteinander kombiniert werden.

Optional kann die Temperatur innerhalb des Volumens Vorrichtung in einem Bereich von 4 °C bis 37 °C geregelt werden und die relative Luftfeuchtigkeit auf Werte größer 90 %, z. B. 95 %, eingestellt werden, um Verdunstung zu minimieren.

Einzelzellversuche können in einer einzigen Anlage automatisiert mit hohem Durchsatz und großer Anzahl von einzelnen Versuchen (1.000 bis > 1.000.000) in ökonomischer weise durchgeführt werden. Durch die sehr geringen Volumina der Vertiefungen, beispielsweise im Vergleich zu Mikrotiterplatten, spart man teure Reagenzien ein und hat durch die kleinen Abmessungen der Vertiefungen bei einer großen Anzahl eine deutlich kleinere Grundfläche des Probenträgers. Durch die Vereinzelung (Kompartmentalisierung) können nach vorgegebenen Kriterien einzelne Zellen aus großen Populationen von mehr als 10.000 Zellen ausgesucht und verglichen werden.

Die Erfindung lässt verschiedene Ausführungsformen zu. Zur weiteren Verdeutlichung ihres Grundprinzips ist eine davon in der Zeichnung dargestellt und wird nachfolgend beschrieben. Diese zeigt jeweils in einer Prinzipdarstellung in

Fig. 1 eine geschnittene Seitenansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung in einer Druckposition;

Fig. 2 eine geschnittene Seitenansicht der Vorrichtung in einer weiteren Druckposition;

Fig. 3 eine geschnittene Seitenansicht der Vorrichtung in einer Beleuchtungsposition;

Fig. 4 eine geschnittene Seitenansicht der Vorrichtung in einer Entnahmeposition;

Fig. 5 eine geschnittene Seitenansicht der Vorrichtung in einer Kalibrierposition;

Fig. 6 eine perspektivische Darstellung der Vorrichtung mit einem Probenträger;

Fig. 7 eine geschnittene Seitenansicht einer Aufnahme des Probenträgers der Vorrichtung;

Fig. 8 eine Seitenansicht einer optischen Untersuchungseinheit der Vorrichtung;

Fig. 9a und 9b eine Seitenansicht einer Ausgabeeinheit der Vorrichtung;

Fig. 10a bis 10c eine Seitenansicht einer Entnahmeeinheit der Vorrichtung;

Fig. 11 und 12 eine Draufsicht auf einen Probenträger der Vorrichtung mit unterschiedlichen Vertiefungen;

Fig. 13a bis 13f einen Schnittdarstellung unterschiedlicher Querschnittsformen der Vertiefungen der Probenträger;

Fig. 14a und 14b eine perspektivische Darstellung verschiedener Probenträger mit mehreren Vertiefungen mit unterschiedlichen Aspektverhältnissen; Fig. 15a und 15b eine Draufsicht auf die Vertiefungen der in der Figur 14a gezeigten

Probenträger;

Fig. 16a einen Querschnitt durch jeweils eine Vertiefung des in der Figur 14b gezeigten Probenträgers;

Fig. 16b und 16c einen Querschnitt durch jeweils eine Vertiefung des in der Figur 14a gezeigten Probenträgers;

Fig. 17a und 17b eine Draufsicht auf Vertiefungen des in der Figur 11 gezeigten

Probenträgers mit Markierungen an der Bodenfläche;

Fig. 18a und 18b einen Querschnitt durch verschiedene, eine Probe enthaltene Probenträger;

Fig. 19 eine Seitenansicht einer in den Behandlungsraum einbringbaren

Einheit zur Aufnahme des Probenträgers.

Eine erfindungsgemäße Vorrichtung 1 sowie das zur Durchführung bestimmte Verfahren zur Untersuchung oder Behandlung biologischer oder medizinischer Proben 2 wird nachstehend anhand der Figuren 1 bis 19 näher erläutert. Innerhalb eines Behandlungsraums der Vorrichtung 1 sind verschiedene, hier als integrale Baueinheit ausgeführte Funktionseinheiten angeordnet, die aus einer mit mehreren Druckköpfen 3 ausgestatteten Abgabeeinheit 5 zur Abgabe der Probe 2, eine Beleuchtungseinheit 16 sowie eine mit einer Kapillare 8 ausgestattete Entnahmeeinheit 9 zur Entnahme der Probe aus einem Probenträger 10 und zur Ablage oder Ausgabe der zuvor isolierten Probe 2 sowie eine von diesen räumlich getrennte, als Mikroskop ausgeführte optische Untersuchungseinheit 6 mit einem Objektiv 7 aufweist.

Der Probenträger 10 hat eine Vielzahl von in den Figuren 11 bis 14 dargestellten Vertiefungen 11 mit einer jeweiligen Öffnung 12 und einer Bodenfläche 13 und ist mittels einer als Kreuztisch ausgeführten Aufnahme 14 in einer horizontalen Ebene in unterschiedliche Arbeitspositionen in Pfeilrichtung 15 translatorisch beweglich. In der jeweiligen Arbeitsposition ist die optische Untersuchungseinheit 6 unterhalb der Aufnahme 14 angeordnet, während die jeweils aktive Einheit auf der gegenüberliegenden Seite oberhalb der Aufnahme 14 positioniert ist. In dieser Arbeitsposition liegen die optische Untersuchungseinheit 6, die jeweils ausgewählte Vertiefung 11 sowie entweder die Abgabeeinheit 5, die Entnahmeeinheit 9 oder die Beleuchtungseinheit 16 koaxial auf einer gemeinsamen Achse 17, entsprechend der optischen Achse der optischen Untersuchungseinheit 6 an den gegenüberliegenden Seiten des Probenträgers 10. Zu diesem Zweck ist die Bodenfläche 13 der Vertiefungen 11 transparent, sodass die optische Erfassung der Probe 2 durch die Bodenfläche 13 erfolgt.

Während der Behandlung oder Untersuchung der Probe 2 ist die optische Untersuchungseinheit 6, zumindest das Objektiv 7 lediglich in Pfeilrichtung 18 in Richtung des Probenträgers 10 zustellbar, um so die Fokuslage anpassen zu können. Zur Untersuchung der Proben 2 in anderen Vertiefungen 11 ist die Bewegung des Probenträgers 10 mittels der Aufnahme 14 bestimmt.

Obwohl im Betrieb die erforderliche Relativbewegung des Probenträgers 10 vornehmlich aufgrund der Bewegung des Probenträgers 10 mittels der Aufnahme 14 erfolgt, ist darüber hinaus zur Auswahl der gewünschten Einheit auch eine Bewegung dieser Einheiten vorgesehen, die bei der dargestellten Variante gemeinsam in Pfeilrichtung 19 translatorisch verfahren werden und so beispielsweise auch eine in der Figur 5 dargestellte Kalibierstation 20 zur Tropfenkalibrierung für die Abgabeeinheit 5 erreichen können.

Wie in der Figur 7 dargestellt, hat die Aufnahme 14 eine Aussparung 21 für den Probenträger 10, sodass die Proben 2 durch die Bodenfläche 13 der Vertiefung 11 mittels der in Figur 8 näher dargestellten optischen Untersuchungseinheit 6 uneingeschränkt erfasst werden können. Korrespondierende Ausnehmungen 24 weisen dementsprechend auch die Kreuztischelemente 22 auf, die jeweils an äußeren Führungsschienen 23 beweglich sind.

Zur Untersuchung der Probe 2 hat die optische Untersuchungseinheit 6 eine Z-Verstellung für die Zustellung des Objektivs 7 in der Pfeilrichtung 18 sowie auch eine nicht weiter dargestellte Beleuchtung, Optiken sowie zumindest eine Kamera.

In den Figuren 9a und 9b sowie 10a bis 10c ist das Funktionsprinzip der Abgabeeinheit 5 einerseits und der Entnahmeeinheit 9 andererseits dargestellt. Dabei dient eine Kapillare 25 aus Kunststoff, Glas, Edelstahl der Abgabe bzw. der Aufnahme von Flüssigkeit, beispielsweise Zellsuspension der Probe 2. Ein Stößel 26 wirkt dabei auf eine flexible Wandfläche 27 einer Kammer 28 ein, wodurch das eingeschlossene Volumen verändert wird und ein Flüssigkeitstropfen der Probe 2 ausgestoßen wird. Bei der Anwendung des Funktionsprinzips bei der Entnahmeeinheit 9 taucht die Kapillare 25 in eine mit der Probe 2 gefüllte Vertiefung 11 des Probenträgers 10 ein, während das Volumen der Kammer 28 durch den Stößel 26 entgegen einer Rückstellkraft reduziert ist. Sobald der Druck des Stößels reduziert wird, dehnt sich die Kammer 28 aus und saugt einen Teil der Füllmenge der Vertiefung an.

In den Figuren 11 bis 18b sind beispielhaft mehrere Bauformen verschiedener Probenträger 10 dargestellt, die als eine Wellplatte, insbesondere Microwellplatte aus Glas, ausgeführt sind, indem die Vertiefungen 11 mittels des an sich bekannten LIDE-Verfahrens in den Probenträger 10 eingebracht werden. Wie in der Draufsicht der Figuren 11 und 12 zu erkennen, können die Vertiefungen 11 eine kreisförmige oder polygonale, beispielsweise rechteckige Querschnittsform aufweisen und entweder übereinstimmende oder verschiedene Querschnittsflächen und Anordnungen in dem Probenträger 10 aufweisen.

Dabei können zugleich auch unterschiedliche Strukturen der Bodenfläche 13 realisiert werden, wie diese ebenfalls beispielhaft in den Querschnittsdarstellungen unterschiedlicher Vertiefungen 11 mit beispielsweise zylindrischen oder konischen Grundformen und unterschiedlichen Öffnungswinkeln a in den Figuren 13a bis 13f zu erkennen sind. Indem beispielsweise in der Bodenfläche 13 eine Topografie oder Strukturierung mit regelmäßigen Erhebungen erzeugt wird, wie in den Figuren 13a, 13c, 14a, 15a, 15b, 16b und 16c zu erkennen, wird mit statistischer Wahrscheinlichkeit der Aufenthaltsort der Proben 2 innerhalb der Vertiefung 11 vorherbestimmbar. Dabei hat sich bereits gezeigt, dass die Probe 2 die einmal eingenommene Position innerhalb der Strukturierung, wie beispielsweise in den Figuren 18a und 18b dargestellt, selbst dann nicht verlässt, wenn der Probenträger 10 bewegt wird. Somit wird die zur Durchführung der Untersuchung und Manipulation erforderliche Zeitdauer verringert.

Mittels der optischen Untersuchungseinheit 6 können diese Strukturen in der Bodenfläche 13 identifiziert werden, sodass die Referenzierung zur Positionierung des Probenträgers 10 aufgrund des mittels der optischen Untersuchungseinheit 6 erfassten Strukturen und/oder der jeweiligen Probe 2 vorgenommen werden kann. Insbesondere wird es dadurch erstmals möglich, aufgrund des erfassten Aufenthaltsorts der Probe 2 den Probenträger 10, wie in den Figuren 18a und 18b gezeigt, so auszurichten, dass nicht nur die Vertiefung 11 auf der optischen Achse 17 liegt, sondern insbesondere auch die Probe 2 selbst. Zusätzlich können, beispielsweise bei einer ebenen Bodenfläche 13 entsprechend der in den Figuren 13d, 13e, 13f, 14b, und 16a dargestellten Vertiefungen 11 Markierungen 34 in die Bodenfläche 13, beispielsweise innerhalb des Glasmaterials oder auch an einer der Vertiefung 11 abgewandten Außenfläche eingebracht werden, die optisch erfasst werden können und somit alternativ oder ergänzend als Positionierungsreferenz nutzbar sind.

Dabei haben die Vertiefungen 11 vorzugsweise ein Aspektverhältnis der Höhe H der Vertiefung gegenüber dem Durchmesser D oder der Kantenlänge L der Öffnung größer als 1.

Um die Beobachtung aber auch die Manipulation des Probenvolumens der Probe 2 weiter zu optimieren, kann der Probenträger 10 in einem der Öffnung 12 zugeordneten Bereich der Vertiefung eine Schicht oder eine Beschichtung 36 aufweisen, um die Ausprägung des sich bildenden Meniskus 35 gezielt einstellen zu können, die durch Oberflächen- und Grenzflächenspannungen je nach Benetzung der Flüssigkeit als konvexe oder konkave Oberfläche entsteht. Die Einstellung einer ebenen Flüssigkeitsoberfläche lässt sich ebenfalls realisieren, wobei sich die Verwendung eines inerten, auf die Schicht oder eine Beschichtung 36 abgestimmten Flüssigkeitsfilm zur Abdeckung der Probe 2 bereits als hilfreich erwiesen hat.

Schließlich weist in der Figur 19 eine in den Behandlungsraum der Vorrichtung 1 einbringbare, abschließbare Einheit 29 auf, die einen den Probenträger 10 einschließenden sterilen Bereich begrenzt. Die Einheit 29 hat eine Einlassöffnung 30 und eine Auslassöffnung 31 für ein Gas und einen zumindest abschnittsweise transparenten Boden 32 sowie eine ebenfalls zumindest abschnittsweise transparente Abdeckung 33, sodass die Untersuchung mittels der optischen Untersuchungseinheit 6 durch die Boden- und Deckelflächen hindurch durchgeführt werden kann, ohne die Einheit 29 öffnen zu müssen.

LPKF Laser & Electronics AG

Osteriede 7 30827 Garbsen

Unser Zeichen: LPK-220-PCT 24. November 2022

BEZUGSZEICH EN LISTE

1 Vorrichtung 21 Aussparung

2 Probe 22 Kreuztischelement

3 Abgabeeinheit 23 Führungsschiene

4 Druckkopf 24 Ausnehmung

5 Abgabeeinheit 25 Kapillare

6 Untersuchungseinheit 26 Stößel

7 Objektiv 27 Wandfläche

8 Kapillare 28 Kammer

9 Entnahmeeinheit 29 Einheit

10 Probenträger 30 Einlassöffnung

11 Vertiefung 31 Auslassöffnung

12 Öffnung 32 Boden

13 Bodenfläche 33 Abdeckung

14 Aufnahme 34 Markierung

15 Pfeilrichtung 35 Meniskus

16 Beleuchtungseinheit 36 Beschichtung

17 Achse a Öffnungswinkel

18 Pfeilrichtung D Durchmesser

19 Pfeilrichtung H Höhe

20 Kalibierstation L Kantenlänge