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Title:
DEVICE AND METHODS FOR DETECTING PROTOZOA
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2018/134452
Kind Code:
A1
Abstract:
Device and method for detecting protozoa, comprising a sampling device (1) and a protozoa detection kit (2) preferably housed in a portable enclosing box (23), the sampling device having two variants (1a, 1b), one of which is more complex and takes samples over a longer period of time, in the order of days or weeks, while the other, simpler, is indicated for taking samples over a short period of time, in the order of hours at most. The protozoa detection kit includes reagent test strips (13) together with the portable devices and reagents to allow DNA (deoxyribonucleic acid) extraction, PCR (polymerase chain reaction) amplification and hybridization/development processes to be carried out in-situ. These test strips (13) present the result of the analysis by means of specific markers for the amplified DNA.

Inventors:
ORÓS MONGE, Javier (OX-COMPAÑIA DE TRATAMIENTO DE AGUAS, S.L.Parque Tecnológico WALQA,Ctra. de Zaragoz, Km. 566 Cuarte, 22197, ES)
DOMINGUEZ UBIETO, Ignacio (OX-COMPAÑIA DE TRATAMIENTO DE AGUAS, S.L.Parque Tecnológico WALQA,Ctra. de Zaragoz, Km. 566 Cuarte, 22197, ES)
Application Number:
ES2017/070625
Publication Date:
July 26, 2018
Filing Date:
September 21, 2017
Export Citation:
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Assignee:
OX-COMPAÑIA DE TRATAMIENTO DE AGUAS, S.L. (Parque Tecnológico WALQA, Ctra. de Zaragoza Km. 566, Cuarte, 22197, ES)
International Classes:
C12Q1/68
Domestic Patent References:
WO2015015027A12015-02-05
Foreign References:
DE102010017396A12011-12-22
ES2177380A12002-12-01
ES2158854T32001-09-16
ES2331645T32010-01-12
ES2346630A12010-10-18
Other References:
OMAR A. SALDARRIAGA ET AL: "An Innovative Field-Applicable Molecular Test to Diagnose Cutaneous Leishmania Viannia spp. Infections", PLOS NEGLECTED TROPICAL DISEASES, vol. 10, no. 4, 26 April 2016 (2016-04-26), pages e0004638, XP055437260, DOI: 10.1371/journal.pntd.0004638
VIVIEN MARX: "PCR heads into the field", NATURE, vol. 12, no. 5, 1 May 2015 (2015-05-01), pages 393 - 397, XP055437202
J. BONILLA ET AL: "Quantification of Protozoa and Viruses from Small Water Volumes", INTERNATIONAL JOURNAL OF ENVIRONMENTAL RESEARCH AND PUBLIC HEALTH, vol. 12, no. 7, 24 June 2015 (2015-06-24), pages 7118 - 7132, XP055437182, DOI: 10.3390/ijerph120707118
DINESH MONDAL ET AL: "Mobile suitcase laboratory for rapid detection of Leishmania donovani using recombinase polymerase amplification assay", PARASITES & VECTORS, vol. 9, no. 1, 13 May 2016 (2016-05-13), XP055437126, DOI: 10.1186/s13071-016-1572-8
ANDREW ST JOHN ET AL: "Existing and Emerging Technologies for Point-of-Care Testing", THE CLINICAL BIOCHEMIST. REVIEWS / AUSTRALIAN ASSOCIATION OF CLINICAL BIOCHEMISTS, 1 August 2014 (2014-08-01), Australia, pages 155, XP055436914, Retrieved from the Internet
Attorney, Agent or Firm:
ISERN JARA, Jorge (Avda. Diagonal, 463 Bis 2°, Barcelona, 28010, ES)
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Claims:
REIVINDICACIONES

1 . - Equipo de detección de protozoos, del tipo de los utilizados de forma discontinua y portable para el análisis de agua mediante el análisis de una muestra, caracterizado por que comprende:

- un dispositivo de muestreo (1 ) que comprende al menos una entrada de agua (3, 4) y un filtro principal (8) dispuesto tras la entrada de agua (3, 4} y que está configurado para retener una muestra con protozoos presentes en el agua, y

-un kit de detección de protozoos (2), que comprende una pluralidad de tiras reactivas (13) con anticuerpos para la detección de los protozoos atrapados en la muestra, unos reactivos de ampliación de ADN (14), unos reactivos de hibridación y revelado (15), un termociclador portátil (18) configurado para realizar la ampliación de ADN de los protozoos de la muestra alimentado con una batería del termociclador (19), y un termobloque portátil (16) configurado para controlar la temperatura de la muestra y una batería del termobloque (17), y estando el dispositivo de muestreo (1 ) y el kit de detección de protozoos (2) dispuestos dentro de una o dos cajas envolventes (23) portátiles.

2. - Equipo de detección de protozoos, según la reivindicación 1 , caracterizado por que el dispositivo de muestreo (1 ) comprende una bomba (5) y una válvula de seguridad (6), dispuestos tras la entrada de agua (4) configurados para impulsar agua a través del filtro principal (8).

3. - Equipo de detección de protozoos, según la reivindicación 1 , caracterizado por que el dispositivo de muestreo (1 ) comprende adicionalmente una salida de agua (1 1 ) y un contador de caudal (10) asociado a dicha salida de agua (1 1 ),

4. - Equipo de detección de protozoos, según la reivindicación 1 , caracterizado por que el dispositivo de muestreo (1 ) comprende adicionalmente un prefiltro (7) dispuesto antes del filtro principal (8),

5. - Equipo de detección de protozoos, según la reivindicación 1 caracterizado por que comprende adicionalmente un filtro de muestra (9) dispuesto tras el filtro principal (8).

6.- Equipo de detección de protozoos, según la reivindicación 1 , caracterizado por que comprende adicionalmente un programador de control (12) configurado para controlar el periodo de funcionamiento del dispositivo de muestreo (1 ). 7. - Equipo de detección de protozoos, según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que las tiras reactivas (13) son unas tiras de nitrocelulosa, que comprenden un área de absorción (24), que corresponde a la parte inferior de la tira reactiva (13), y que está destinada a entrar en contacto con la muestra, un área de test (25) conformada por una membrana cromatográfica, y un área de manipulación (26) correspondiente a la parte superior de la tira, conformada de un material absorbente.

8. - Equipo de detección de protozoos, según la reivindicación 7, caracterizado por que el área de test (25) de las tiras reactivas (13) presenta tres bandas diferentes, una primera banda (22), una segunda banda (21 ) y una tercera banda (20), y son tres bandas inmunocromatográficas.

9. - Procedimiento de detección de protozoos en el agua utilizando un equipo como el descrito en las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que comprende:

- una primera fase de muestreo del agua mediante el dispositivo de muestreo (1 ) que comprende hacer pasar al agua a través del filtro principal (8) y recoger una muestra retenida en el filtro principal (8),

- una segunda fase de detección de protozoos en las muestras mediante el kit de detección de protozoos (2) que comprende:

- un primer paso de extracción de ADN de la muestra retenida,

- un segundo paso de amplificación de ADN, y

- un tercer paso de hibridación en el que se produce la unión específica de los fragmentos de ADN amplificados a sondas ancladas a partículas de látex coloreadas dando lugar a un complejo ADN+coloide,

- un cuarto paso de migración en el que se produce la movilidad del complejo de ADN + coloide sobre el área de test (25) de las tiras reactivas (13),

- un quinto paso de revelado que comprende la determinación de la presencia o ausencia de protozoos.

10. - Procedimiento de detección de protozoos en el agua, según la reivindicación 9, caracterizado por que el paso de extracción de ADN está basado en la unión del ADN a partículas magnéticas recubiertas de sílice, realizando la extracción del ADN directamente de las muestras de filtro.

1 1 . - Procedimiento de detección de protozoos en el agua, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, caracterizado por que el paso de amplificación de ADN se lleva a cabo mediante PCR para obtención de ADN amplificado. 12. - Procedimiento de detección de protozoos en el agua, según la reivindicación 1 1 , caracterizado por que en el paso de amplificación mediante PCR se realiza la amplificación simultánea de un fragmento del gen de la DNA polimerasa de la especie o especies objetivo y de un fragmento de un gen control humano. 13.- Procedimiento de detección de protozoos en el agua, según la reivindicación 12 caracterizado por que el gen control humano es beta-globina, que se utiliza como indicador de la ausencia de inhibidores de la PCR en la muestra de ADN amplificada.

14. - Procedimiento de detección de protozoos en el agua, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 13, caracterizado por que en el paso de migración, las tiras reactivas (13) comprenden anticuerpos a los que se une el complejo ADN+coioide.

15. - Procedimiento de detección de protozoos en el agua, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 14, caracterizado por que en el paso de revelado, el complejo ADN+coioide da lugar a tres bandas (20, 21 , 22) a lo largo del área de test (25) de las tiras reactivas (13), que permiten determinar la presencia o ausencia de protozoos en la muestra.

16. - Procedimiento de detección de protozoos en el agua, según la reivindicación 15, caracterizado por que la primera banda (22) determina la presencia o ausencia de protozoos, la segunda banda (21 ) actúa como control de los pasos de extracción y amplificación, y la tercera banda (20) actúa como control del paso de revelado.

1 7. - Procedimiento de detección de protozoos en el agua, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 1 6, caracterizado por que comprende una etapa de rearmado que comprende desinfectar el dispositivo de muestreo (1 ) mediante el paso de biocida.

1 8. - Procedimiento de detección de protozoos en el agua, según cualquiera de las reivindicaciones 9 a 17, caracterizado por que comprende una etapa de contraiavado que se realiza en un dispositivo de muestreo ( 1 ) que comprende un filtro de muestra (9), y el procedimiento comprende mover los protozoos retenidos en el filtro principal (8) al filtro de muestra (9).

1 9. - Procedimiento de detección de protozoos en el agua, según la reivindicación 18, caracterizado porque la etapa de contralavado se realiza una vez transcurrido un tiempo predeterminado, controlado por el programador (1 2) de control, y comprende:

- un primer paso de inversión, que comprende introducir agua en el dispositivo de muestreo (1 ) hacia el filtro principal (8) en dirección opuesta a la de la entrada de agua (3, 4), provocando que los protozoos adheridos al filtro principal (8) se despeguen y queden atrapadas en el filtro de muestra (9), y

- un segundo paso de retirada de muestras que comprende desmontar el filtro de muestra (9).

Description:
EQUIPO Y PROCEDIMIENTO DE DETECCIÓN DE PROTOZOOS

La presente memoria descriptiva se refiere, como su título indica, a un equipo y procedimiento de detección de protozoos del tipo de los utilizados de forma discontinua y portable para el análisis de agua.

Campo de la invención

La invención se refiere al campo de los equipamientos y procedimientos de análisis y medida para el aprovechamiento óptimo de ios recursos hídricos, especialmente agua de consumo humano/animal, acuicultura, agua de refrigeración, así como en agua de otros usos industriales. El equipo se integra en un procedimiento biocida eficaz, ecológico y económicamente viable que permita garantizar la higienización completa del agua, es decir, eliminación de bacterias, hongos, virus, algas y también protozoos y las bacterias que éstos puedan albergar en su interior.

Estado actual de la técnica

El agua es esencial para nuestra vida diaria. La calidad del agua, tanto si se utiliza para beber, usos domésticos, la producción de alimentos o fines recreativos tiene un impacto importante en la salud. El agua de mala calidad puede causar brotes de enfermedades en diferentes escalas: el 80% de las enfermedades infecciosas y parasitarias gastrointestinales y un tercio de las muertes causadas por estas infecciones se deben ai uso y consumo de agua contaminada.

En la actualidad, la legislación europea establece límites microbiológicos para el consumo de agua con respecto a algunas bacterias. Sin embargo, el control de las bacterias no es suficiente para asegurar la calidad del agua.

Los estudios han demostrado que no sólo las bacterias pueden causar enfermedades; en efecto, también se pueden encontrar en el agua amebas de vida libre (protozoos capaces de coionizar las redes de agua que representan un grave riesgo para la salud). La Acanthamoeba es la ameba más frecuente, (representando más del 90% del iota! de las amebas presentes en el agua) teniendo una gran capacidad para albergar una importante variedad de microorganismos patógenos, como virus (adenovirus, virus de la polio, enterovirus, etc.), bacterias (Campylobacter, E. cois, Legionella, Listeria, Staphylococcus, Salmonella, etc.) y hongos (Cryptococcus, Blastomyces, Sporothrix, Histoplasma, etc.).

Ello hace que exista una elevada necesidad de equipos para la detección de protozoos, con vista a su posterior eliminación. Existen varias patentes y documentos científicos publicados, relacionados con este tipo de problemática. La mayor parte de las soluciones, como las recogidas en las patentes ES2177380 ''Procedimiento para ¡a eliminación de contaminantes biológicos de! agua" y WO2015015027 "Method for eüminating micro-organisms in water by filtratiori" , se limitan a un filtrado general, tratando de eliminar microorganismos, pero sin ser capaces de detectar específicamente protozoos.

Son conocidos algunos procedimientos para detectar organismos como los protozoos en el agua, tai y como encontramos reivindicado en las patentes ES2158854 "Oiigonucleóotidos derivados de ia familia de genes SQD" y ES2331645 "Procedimiento para controlar el crecimiento de plantas acuáticas y de organismos zoológicos", pero son procesos complicados, que requieren de equipamientos muy específicos y delicados que únicamente pueden realizarse en laboratorio, no siendo susceptibles de realizarse in-situ ni de forma portátil. Asimismo se conocen algunos equipos muestreadores, como el descrito en ES2348630 "Dispositivo de monitorización en continuo de especies en suspensión en el agua", pero están previstos para una utilización fija en una ubicación y para el muestreado continuo, no discontinuo, no incorporando ningún tipo de elemento de detección específica de protozoos.

Descripción de la invención

Para solventar ia problemática existente en la actualidad en la detección de protozoos en el agua de una manera discontinua y portable se ha ideado el equipo y procedimiento de detección de protozoos objeto de ia presente invención, el cual integra en un único conjunto, un dispositivo de muestreo y un kit de detección de protozoos, que va atojado bien en una única caja envolvente portátil, bien en dos cajas envolventes portátiles, una para el dispositivo de muestreo y otra para el kit de detección de protozoos.

El dispositivo de muestreo está previsto en dos variantes, una de ellas, más completa, para toma de muestras durante un tiempo más largo, del orden de días o semanas, mientras que la otra, más sencilla, está indicada para la toma de muestras en poco tiempo, del orden de minutos u horas,

El kit de detección de protozoos incluye unas tiras reactivas junto con los equipos portátiles y reactivos para poder realizar in-situ ¡os procesos de extracción de ADN (ácido desoxirribonucleico), amplificación mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa), e hibridación/revelado. Estas tiras reactivas presentan el resultado del análisis mediante unos mareajes específicos de ios productos amplificados, en forma de bandas de color que reaccionan ante la presencia de los protozoos buscados.

En ambos casos el equipo dispone de un filtro principal por el que pasa el agua, con una luz de paso elegida para que queden en el mismo los quistes de los protozoos o ios propios individuos que se encuentren libres en el agua. Filtrada el agua, queda en el filtro el material de filtrado con los protozoos, si ios hubiera. Este material, resultado del filtrado, es el que se utiliza posteriormente para hacer la PCR y estudiar la presencia de la especie o especies a través de su ADN. Ventajas de la invención

Este equipo y procedimiento de detección de protozoos que se presenta aporta múltiples ventajas sobre ios sistemas disponibles en la actualidad siendo la más importante que permite integrarse en un procedimiento biocida eficaz, ecológico y económicamente viable que permita garantizar la higienización completa del agua, es decir, eliminación de bacterias, hongos, virus, algas y también protozoos y las bacterias que éstos puedan albergar en su interior.

Otra importante ventaja es que es un sistema portátil, que se puede utilizar en cualquier sitio, incluida la instalación del cliente, y en tiempo muy inferior al requerido por los procesos de laboratorio. Es importante destacar que este equipo está específicamente concebido para un uso discontinuo, permitiendo obtener resultados con muéstreos de días o semanas en e! caso de la realización preferente, o con muéstreos de minutos u horas en el caso de la realización alternativa, propiciando que el personal técnico pueda realizar medidas en una gran variedad de sitios con el mismo equipo.

Otra de las más importantes ventajas a destacar es que se basa en la amplificación mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de una región determinada del ADN correspondiente a la especie o especies de protozoo objetivo, y su posterior detección por hibridación a una sonda específica y revelado mediante una tira de inmunocromatografía, permitiendo de esta manera la detección e identificación del protozoo con una gran sensibilidad y especificidad, superior a otros sistemas.

Es importante destacar asimismo que es un sistema de extracción de ADN rápido y fácil, y no hay mucha dependencia de los equipos instrumentales, lo cual propicia un equipo de detección completa de Acanthamoeba en el agua que puede aplicarse fuera del laboratorio, in situ donde lo requiera el cliente final, con una sensibilidad extraordinaria.

Descripción de las figuras

Para comprender mejor el objeto de la presente invención, en el piano anexo se ha representado una realización práctica preferencia! de un equipo de detección de protozoos.

En dicho plano la figura -1 - muestra un diagrama general de bloques del equipo.

La figura -2- muestra un diagrama general de bloques del dispositivo de muestreo en su realización preferente.

La figura -3- muestra un diagrama general de bloques del dispositivo de muestreo en su realización alternativa. La figura -4- muestra un diagrama general de bloques del kit de detección de protozoos

La figura -5- muestra una tira reactiva y sus principales zonas.

Realización preferente de ia invención

El equipo de defección de protozoos objeto de la presente invención permite detectar ia presencia de protozoos en una muestra que se obtiene haciendo pasar agua al menos a través de un filtro principal en el que quedan retenidos ios protozoos, si ios hay. El equipo comprende básicamente, como puede apreciarse en el piano anexo, un dispositivo de muestreo (1 ) y un kit de defección de protozoos (2), integrados preferentemente dentro de una única caja envolvente (23) portátil, aunque está previsto que de forma alternativa pueden ir alojado en dos cajas envolventes portátiles, una para el dispositivo de muestreo (1 ) y otra para el kit de detección de protozoos (2).

En una realización preferente, el dispositivo de muestreo (1 a) comprende a su vez una entrada de agua proveniente de la línea de distribución (3), una entrada de agua sin presión (4), asociada con una bomba (5) y una válvula de seguridad (6), un prefiltro (7) seguido de un filtro principal (8), con un filtro de muestra (9) dispuesto tras el filtro principal (8), un contador de caudal (10) asociado a una salida de agua (1 1 ), y un programador (12) de control. El prefiltro (7) limpia el agua de las impurezas más grandes y evita que se cólmate el filtro principal (8).

El programador (12) de control controla el periodo de toma de muestra, que puede ser de días a semanas, y regula con la bomba los parámetros de filtrado: caudal y frecuencia, comandando la puesta en marcha y parada del equipo.

Está prevista una realización alternativa de la invención, más simplificada, en la que el dispositivo de muestreo (1 b) comprende una entrada de agua proveniente de ia línea de distribución (3), una entrada de agua sin presión (4), asociada con una bomba (5) y una válvula de seguridad (6), un filtro principal (8), y un contador de caudal (10) asociado a una salida de agua (1 1 ).

En ambos casos el equipo dispone de un filtro principal (8) por el que pasa el agua, con una luz de paso mínima, elegida para que queden en el filtro los quistes de los protozoos o los propios individuos que se encuentren libres en el agua. Filtrada el agua, queda en el filtro el material de filtrado con los protozoos, si los hubiera. Esto es lo que se denomina "muestra" a lo largo de la memoria y reivindicaciones. Este material, resultado del filtrado, es el que se utiliza posteriormente para hacer la extracción y amplificación de ADN mediante PCR para estudiar la presencia de la especie o especies a través de su ADN.

La entrada de la muestra en el equipo puede ser por conexión directa a la entrada de agua proveniente de la línea de distribución (3) o sin esa conexión, a una entrada de agua sin presión (4). En el primer caso es la misma instalación la que impulsa el agua a través del equipo (incluyéndose para evitar posibles problemas de sobrepresión una válvula reguladora). La bomba (5) es la responsable de impulsar el flujo de agua para permitir procesar el agua cuando el equipo no se ha podido conectar directamente a la línea de abastecimiento del cliente. Al final del equipo existe un contador de caudal (10) que permite comprobar el volumen de agua procesado.

El kit de detección de protozoos (2) comprende una pluralidad de tiras reactivas (13), unos reactivos de PCR (14), unos reactivos de hibridación/revelado (15), un termobloque portátil (16) alimentado con una batería del termobloque (17) y un termociciador portátil (18) alimentado con una batería del termociclador (19).

El termobloque portátil (16) está configurado para mantener una temperatura constante para aquellas etapas del procedimiento en las que se requiere una temperatura exacta a lo largo de un determinado periodo de tiempo. El termobloque portátil (16) controla la temperatura de la muestra en los pasos de la extracción de ADN de la muestra y de revelado, que requieren unas condiciones de temperatura controlada. El termociclador portátil (18) es un equipo configurado para realizar la ampliación de ADN de la muestra, que en una realización preferente se realiza mediante técnica de PCR. Las tiras reactivas (13) son unas tiras de nitrocelulosa, de forma preferentemente rectangular, sobre la que se han anclado los anticuerpos que detectan los mareajes específicos del ADN amplificado, estando divididas cada una de las tiras en tres bandas (20, 21 ,22) que reconocen ios diferentes mareajes empleados.

Las tiras reactivas (13) comprenden un área de absorción (24), que corresponde a la parte inferior de la tira, y que está destinada a entrar en contacto con la muestra, un área de test (25) conformada por una membrana cromatográfica protegida con un plástico transparente, y un área de manipulación (26) correspondiente a la parte final de la tira, conformada de un material absorbente protegido por un plástico de color rotulabie.

El área de test (25) de las tiras reactivas (13) presenta hasta tres bandas diferentes. Son tres bandas inmunocromatograficas. Una primera banda (22), dispuesta en la parte inferior, indica la presencia o no de protozoos, una segunda banda (21 ) que actúa como control durante los pasos de extracción y amplificación de ADN de la muestra, y una tercera banda (20) que actúa como control del paso de revelado para determinación de la presencia o no de protozoos en el agua analizada. El equipo de detección de protozoos objeto de la presente invención está dirigido a llevar a cabo un procedimiento de detección de protozoos en agua que comprende:

- una primera fase de muestreo mediante el dispositivo de muestreo (1 ),

- y una segunda fase de detección de protozoos en las muestras obtenidas mediante el kit de detección de protozoos (2).

La primera fase de muestreo presenta ligeras diferencias dependiendo de si el dispositivo de muestreo (1 ) del equipo empleado es el descrito como realización preferente (1 a) o el descrito como realización simplificada (1 b). Esta primera fase de muestreo del agua comprende hacer pasar al agua a través del filtro principal (8) y recoger una muestra retenida en el filtro principal (8).

La fase de detección de protozoos en las muestras obtenidas se realiza mediante el kit de detección de protozoos (2), y se basa en la amplificación de ADN, previamente extraído de la muestra, mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de una región determinada de! ADN correspondiente a la especie o especies de protozoo objetivo. Posteriormente comprende una detección por hibridación a una sonda específica y por revelado mediante una tira reactiva (13) de inmunocromatografía. De esta manera, el kit (2) permite la detección e identificación de! protozoo con una gran sensibilidad y especificidad.

La fase de detección de protozoos en las muestras comprende:

- un primer paso de extracción de ADN (ácido desoxirribonucleico) de la muestra obtenida,

- un segundo paso de amplificación de ADN, que preferentemente se realiza mediante PCR (reacción en cadena de la polimerasa);

- un tercer paso de hibridación en el que se produce la unión específica de ios fragmentos de ADN amplificados a sondas ancladas a partículas de látex coloreadas dando lugar a un complejo ADN+coloide,

- un cuarto paso de migración en el que se produce la movilidad del complejo de ADN + coloide sobre el área de test (25) de las tiras reactivas (13),

- un quinto paso de revelado que comprende la determinación de la presencia o ausencia de protozoos, Ai final del procedimiento, las bandas (20, 21 , 22) se muestran o no, de diferentes colores, a lo largo del área de test (25) (la membrana de las tiras reactivas (13)), dependiendo de la presencia o ausencia de protozoos en la muestra el color y si se han realizado correctamente ios pasos de extracción y ampliación y de revelado. El paso de extracción de ADN está basado en la unión del ADN a partículas magnéticas recubiertas de sílice, realizando la extracción del ADN directamente de la muestra retenida en el filtro.

El paso de amplificación se lleva a cabo mediante PCR. Se realiza la amplificación simultánea de un fragmento del gen de la DNA polimerasa de la especie o especies objetivo y de un fragmento de un gen control humano (beta-globina preferentemente), que se utiliza como indicador de la ausencia de inhibidores de la PCR en la muestra de ADN amplificada. Las tiras reactivas (13) comprenden anticuerpos y en el paso de migración el complejo ADN+coioide se une a dichos anticuerpos. En el paso de revelado, el complejo ADN+coioide da lugar a tres bandas (20, 21 , 22) a lo largo del área de test (25) de ¡as tiras reactivas (13), que permiten determinar la presencia o ausencia de protozoos en la muestra.

Es decir, en el procedimiento se produce ¡a unión específica de los fragmentos de ADN amplificados a una serie de sondas ancladas a partículas de látex coloreadas, migrando este complejo de ADN + coloide a lo largo de una membrana sobre ¡a que se han depositado anticuerpos específicos, reconociendo los anticuerpos unas marcas añadidas a los productos de la amplificación durante la PCR, de modo que el complejo PCR+coioide se une a la membrana dando lugar a la aparición de una banda coloreada. Cada uno de ios productos generados durante la PCR (amplificado del gen control, amplificado de la especie o especies objetivo) lleva un mareaje específico por lo que, al final del proceso, se visualizarán las bandas (20, 21 , 22) de diferentes colores a lo largo del área de test (25) de las tiras reactivas (13). El color y número de bandas (20, 21 , 22) que se ven dependerá de la presencia o ausencia de protozoos en la muestra. Así, todas las tiras reactivas (13) incluyen una tercera banda (20) o línea de control de revelado preferentemente verde, cuya aparición (siempre está presente pero solo se visualiza bajo ciertas condiciones) es indicativa de que la inmunocromatografia se ha desarrollado correctamente, una segunda banda o línea de control de proceso (21 ) (que permite determinar si se han realizado correctamente los pasos de extracción y amplificación), preferentemente azul, que se visualiza si el proceso de extracción y amplificación del ADN se ha desarrollado correctamente, y una tercera banda (22) o línea asociada a la presencia de protozoos, preferentemente roja.

En un ejemplo de realización en la que se emplea un equipo con el dispositivo de muestreo en su realización preferente (1 a), comprende:

- un etapa de filtrado, en el que el anaiito queda retenido en el filtro principal (8), y

una etapa de confraiavado, en el que los organismos buscados son movidos del filtro principal (8) al filtro de muestra (9). Cuando el equipo ya ha sido empleado pero quiere volver a utilizarse, el procedimiento de detección de protozoos puede comprender una etapa de rearmado en ¡a que se dejan las conexiones como estaban inicialmente, y que comprende desinfectar el dispositivo de muestreo (1 ) mediante el paso de biocida. Asimismo se vacían ios conductos del equipo por los que circula el agua. En este caso el procedimiento puede comprender un paso de homogeneización, en el que se deja pasar una determinada cantidad de agua por el equipo para eliminar restos de biocida de la última operación.

En los casos en los que se quiere reutilizar el equipo, el procedimiento puede comprender también una etapa de contralavado. Dicha etapa se realiza, en este caso, una vez transcurrido el tiempo necesario, controlado por el programador (12) de control. Esta etapa se realiza cuando el equipo empleado comprende un dispositivo de muestreo (1 ) con filtro de muestra (9) y comprende un paso de mover ios protozoos retenidos en el filtro principal (8) al filtro de muestra (9).

En este caso, el contralavado se realiza una vez transcurrido un tiempo predeterminado, controlado por el programador (12) de control, y comprende:

- un primer paso de inversión, que comprende introducir agua en el dispositivo de muestreo ( 1 ) hacia el filtro principal (8) en dirección opuesta a la de la entrada de agua (3, 4), provocando que los protozoos adheridos al filtro principal (8) se despeguen y queden atrapadas en el filtro de muestra (9), y

- un segundo paso de retirada de muestras que comprende desmontar el filtro de muestra (9). En otro ejemplo de realización en el que el procedimiento se realiza en un equipo con un dispositivo de muestreo en su realización más simplificada (1 b), la fase de muestreo se realiza mediante dicho dispositivo de muestreo (1 b) y puede comprender: un primer paso de homogeneización, en el que se dejan pasar unos litros de agua para eliminar restos de biocida de la última operación,

- un segundo paso de filtrado, en el que se deja pasar el agua, procedente de la entrada de agua proveniente de la línea de distribución (3) o de la entrada de agua sin presión (4), a través del filtro principal (8), controlando mediante el contador de caudal (10) que el flujo de agua es el adecuado, finalizando con un tercer paso de separación del filtro para su examen siguiente.

La persona experta en la técnica comprenderá fácilmente que puede combinar características de diferentes realizaciones con características de otras posibles realizaciones, siempre que esa combinación sea técnicamente posible.

Toda la información referida a ejemplos o modos de realización forma parte de la descripción de la invención.