1. Domaine de l'invention

L'invention se rapporte au domaine de la mesure de motilité. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à un dispositif de mesure de motilité.

2. Art antérieur

La qualité du sperme est un critère important dans la fertilité humaine et animale. L'étape de prélèvement est beaucoup plus aisée, et moins coûteuse que l'étape d'insémination. Ainsi La qualité d'un prélèvement de sperme est un élément majeur pour la réussite des centres d'insémination. Savoir évaluer la qualité de la semence est donc un prérequis pour optimiser les inséminations infructueuses et coûteuses. Selon l'organisation mondiale de la santé un des attributs les plus importants pour évaluer la qualité d'une semence est sa mobilité. Lorsqu'elle est effectuée manuellement par l'intermédiaire d'un opérateur, l'évaluation de la mobilité de la semence est sujette à des variations intra et interindividuelles.

Dans le monde animal, par exemple, des centres de prélèvements de semences animales (ovins, bovins) effectuent une mesure de motilité massale à partir d'observations sur des gouttes de sperme. La motilité massale est un indicateur de mobilité collective des spermatozoïdes. Les enjeux concernant cette mesure sont importants car ils permettent de mieux apprécier la qualité des échantillons et donc de mieux anticiper la réussite de l'insémination. Cette mesure est une note (généralement entre 0 et 5) attribuée par un opérateur à la dynamique des volutes que l'on peut voir à l'intérieur de la goutte de sperme déposée sur une lame de verre et observée en microscopie à contraste de phase. Ces volutes présentent en effet une turbidité dont l'intensité est corrélée avec la fertilité des échantillons. L'origine physique et mécanique de ces volutes est encore mal comprise, mais l'on sait qu'elles sont liées d'une part à l'interaction collective des spermatozoïdes, et d'autre part à la densité du sperme prélevé. Un des problèmes liés à cette méthode de mesure manuelle est son caractère arbitraire. Le score attribué à un échantillon dépend en effet de l'opérateur qui le propose.

C'est pourquoi des systèmes automatiques d'évaluation de mobilité ont vu le jour. Les industriels du domaine ont depuis des décennies mis au point des dispositifs de quantification de mobilité individuelle de spermatozoïdes. Les technologies les plus avancées concernant l'analyse de la fertilité sont liées à l'analyse du mouvement individuel. Dans cette perspective des outils informatiques pour l'analyse de mobilité du sperme par suivi individuel des têtes des spermatozoïdes ont été développés, et ont permis une quantification rapide, objective de la mobilité individuelle. Ils permettent d'extraire des quantificateurs statistiques que les estimations visuelles ne savent pas produire. Les algorithmes associés au suivi de la tête des spermatozoïdes sont par exemple du « matching de gabarit », du filtrage particulaire, ou suivi de mouvement de gabarit. Des méthodes pour le suivi et la reconstruction quantitative du battement flagellaire individuel ont également été proposées. La plupart des dispositifs commerciaux de trajectographie individuelle de spermes et les systèmes d'analyse d'image associés sont restreints à des trajectoires et des battements flagellaires confinés en deux dimensions entre deux plaques de verres distantes de quelques dizaines de microns. Cependant, des travaux ont par exemple permis de mettre en évidence les trajectoires 3D non confinées des spermatozoïdes individuels et ouvrent des perspectives pour l'analyse et la discrimination des mouvements hélicoïdaux 3D individuels.

Cependant, il n'y a pas de démonstration probante du lien entre les propriétés de motilité individuelles (aussi fines soient-elles) et la fertilité. Ce lien fait encore l'objet de discussions dans la littérature et les pratiques ainsi que les critères de sélection de qualité dépendent beaucoup de l'espèce considérée. Pour certaines espèces (comme l'ovin, le bovin), la mobilité collective ou mobilité massale reste le critère de sélection privilégié pour la qualité de la semence. Cependant, ces critères dépendent de la note arbitraire d'un opérateur, avec une forte disparité inter-opérateur et inter-centres.

La difficulté associée à la quantification de la motilité massale est liée au caractère turbulent du champ de vitesse généré par les nageurs actifs. Par exemple, dans le cas du sperme, la quantification de la motilité massale par la note arbitraire d'un opérateur qui quantifie la turbidité collective est le critère aujourd'hui retenu dans les centres de prélèvements comme paramètre pertinent pour la fertilité potentielle des échantillons prélevés. Or, la mesure effectuée sur les prélèvements de gouttes posées sur lame de microscope reste dépendante de l'opérateur humain qui effectue la mesure. Il existe une forte disparité entre les notes effectuées par ces opérateurs dans différents centres. Ainsi, il y a un avantage à développer une méthode de caractérisation objective de la mobilité collective car il n'existe pas de matériel qui permet une telle quantification.

Il existe donc un besoin de fournir une méthode et un dispositif qui permettent une mesure de la mobilité massale d'un échantillon de sperme tout en s'affranchissant de la problématique d'évaluation manuelle. Cette méthode et ce dispositif peuvent bien entendu être appliqués à d'autres échantillons de cellules mobiles concentrées comme des suspensions de bactéries, d'algues, de plankton, etc..

3. Résumé de l'invention

L'invention ne présente pas au moins certains des inconvénients de l'art antérieur. Plus particulièrement, l'invention se rapporte à un dispositif de traitement d'un échantillon d'un fluide biologique actif. Selon l'invention, un tel dispositif comprend un support plan comprenant un sillon de canalisation d'au moins une partie dudit échantillon d'un fluide biologique actif, ledit sillon décrivant sur ledit support une forme continue et fermée, dite forme de canalisation.

Ainsi, un tel dispositif permet d'effectuer une mesure de motilité massale d'un échantillon de fluide biologique actif. En effet, le dispositif de traitement permet, de par l'emploi d'un sillon de canalisation, de mettre en mouvement, de manière synchronisée, des organismes pluricellulaires ou monocellulaires contenus dans le fluide biologique. Selon la technique décrite, cette mise en mouvement est dite « massale », ce qui signifie que cette mise en mouvement concerne un ensemble d'organismes compris dans le fluide biologique. Le dispositif est plus particulièrement adapté à la mesure d'une vitesse d'un déplacement autonome d'une composante d'un échantillon d'un fluide biologique actif quel qu'il soit.

Selon un mode de réalisation particulier, ladite forme de canalisation appartient au groupe comprenant :

un cercle ;

un carré à bord arrondi ;

un toroïde.

Ainsi, le dispositif de traitement permet, par l'emploi de diverses formes de canalisation, de mettre en mouvement des compositions différentes de fluides biologiques actifs. Selon une caractéristique particulière, ledit dispositif comprend en outre un réceptacle de trop plein.

Ainsi, la quantité surnuméraire de fluide biologique actif est en sus captée par ce réceptacle de trop plein.

Selon une caractéristique particulière, ledit échantillon de fluide biologique actif est un échantillon de sperme.

Selon un mode de réalisation particulier, la surface dudit support plan, qui ne comprend pas le sillon, est recouverte d'un matériau hydrophobe et cette surface dudit sillon est recouverte d'un matériau hydrophile.

Ainsi, l'échantillon n'est pas dispersé sur le support plan lors de sa dépose, mais est conduit, à l'aide de la surface hydrophobe, vers le sillon. Lorsque le dispositif comprend en outre un « réceptacle de trop plein », la surface de ce réceptacle est également en matériau hydrophile.

Selon un mode de réalisation particulier, la hauteur « e » du sillon est comprise entre 10 et 400 microns.

Selon un mode de réalisation particulier, la largeur « w » du sillon est comprise entre 40 et 500 microns.

Selon un mode de réalisation particulier, lorsque la forme cde canalisation est un cercle, le rayon moyen « r » de ce cercle est compris entre 500 et 5000 microns.

Selon un mode de réalisation particulier, ledit dispositif comprend en outre un couvercle.

Ainsi, l'échantillon est moins susceptible de subir des variations de ses propriétés dues à une exposition trop prolongée à un environnement extérieur agressif pouvant dégrader l'échantillon.

Selon un mode de réalisation particulier, le couvercle est disposé à une hauteur

« h » de la surface dudit support, hauteur « h » comprise entre 5 et 30 microns.

L'invention se rapporte également à l'utilisation du dispositif de traitement d'un échantillon d'un fluide biologique actif préalablement présenté pour effectuer une mesure de motilité massale d'un échantillon de sperme.

Selon un mode de réalisation particulier, lorsque la forme de canalisation est un cercle le sillon de canalisation est construit selon les caractéristiques suivantes :

la hauteur « e » du sillon est sensiblement égale à 25 microns ; la largeur « w » du sillon est sensiblement égale à 50 microns ;

le rayon moyen « r » de ce cercle est sensiblement égal à 1000 microns. Selon un mode de réalisation particulier, lorsque la forme de canalisation est un cercle le sillon de canalisation est construit selon les caractéristiques suivantes :

- la hauteur « e » du sillon est sensiblement égale à 100 microns ;

la largeur « w » du sillon est sensiblement égale à 200 microns ;

le rayon moyen « r » de ce cercle est sensiblement égal à 200 microns. Selon un mode de réalisation particulier, lorsque la forme de canalisation est un cercle le sillon de canalisation est construit selon les caractéristiques suivantes :

- la hauteur « e » du sillon est sensiblement égale à 100 microns ;

la largeur « w » du sillon est sensiblement égale à 500 microns ;

le rayon moyen « r » de ce cercle est sensiblement égal à 3000 microns. Selon un mode de réalisation particulier, lorsque la forme de canalisation est un cercle le sillon de canalisation est construit selon les caractéristiques suivantes :

- la hauteur « e » du sillon est sensiblement égale à 60 microns ;

la largeur « w » du sillon est sensiblement égale à 100 microns ;

le rayon moyen « r » de ce cercle est sensiblement égal à 2000 microns.

4. Liste des figures

D'autres caractéristiques et avantages de la technique décrite apparaîtront plus clairement à la lecture de la description suivante d'un mode de réalisation préférentiel, donné à titre de simple exemple illustratif et non limitatif, et des dessins annexés, parmi lesquels :

la figure la illustre un premier mode de réalisation du dispositif

la figure lb illustre un deuxième mode de réalisation du dispositif ;

- les figures 2, 3 et 4 exposent des formes différentes du dispositif ;

la figure 5a est une vue de dessus d'un mode de réalisation ;

La figure 5b est une vue de coupe d'un mode de réalisation ;

La figure 6 est un schéma de principe d'un dispositif système de mesure de vitesse.

5. Description

5.1. Principe

Le principe général de la présente technique est de fournir un dispositif permettant d'imprimer un mouvement directionnel d'ensemble à un fluide biologique actif, comprenant des micro-nageurs, tel que du sperme ou encore un ensemble de bactéries. Le dispositif permet la quantification de la mobilité des nageurs actifs. Il permet donc de mettre en évidence le bon fonctionnement de leur appareil cellulaire locomoteur. Il donne une mesure indirecte de leur « santé » et de leur fonctionnalité biologique en quelques secondes, sur un prélèvement de très faible volume.

À ce titre, ce dispositif peut trouver des applications différentes que la quantification de la fertilité de la semence. Il pourrait qualifier de manière simple, efficace et à faible coût toute suspension de cellules ou de bactéries mobiles. On peut par exemple penser aux bactéries productrices de bio-carburants, des algues unicellulaires pour la production de médicaments, etc..

Comme l'objet du dispositif est de permettre une mesure de la vitesse moyenne de l'écoulement, le dispositif est conformé pour que le fluide biologique actif soit maintenu à l'intérieur du dispositif. Ainsi, le dispositif de traitement d'un échantillon de fluide biologique actif, comprend un support plan comprenant un sillon de canalisation d'une partie (ou de la totalité) dudit échantillon d'un fluide biologique actif. Ce sillon décrit sur le support une forme continue et fermée, dite forme de canalisation. En d'autres termes, le dispositif comprend un support plan sur lequel une enceinte annulaire est réalisée (cette réalisation est fonction de la méthode de fabrication du dispositif). Dans un mode de réalisation l'enceinte annulaire est creusée au sein du support plan et forme un sillon (par exemple par micro fraisage). Dans un autre mode de réalisation, l'enceinte annulaire est déposée sur le support plan (dans ce cas, une enceinte est définie dans un autre support), appelé par exemple support de dépose, (qui peut être un film polymérique d'épaisseur prédéfinie), le support de dépose étant assemblé (par exemple par collage ou par électro-dépose) avec le support plan pour former le dispositif de traitement : le sillon est donc constitué de la face supérieur du support plan et de l'ouverture ménagée dans le support de dépose. En fonction des modes de réalisation, la forme de canalisation peut varier. Par exemple, dans un premier mode de réalisation, la forme de canalisation est un cercle. Dans un autre mode de réalisation, la forme de canalisation peut être une ellipse, un parallélogramme à bords arrondis, etc. Ouel que soit le mode de réalisation, la forme de canalisation a pour caractéristique de délimiter une courbe plane continue et fermée. Ainsi, un tel dispositif permet d'effectuer une mesure de motilité massale d'un échantillon de fluide biologique actif. La nouveauté du dispositif est de modifier les caractéristiques de la nage collective du fluide actif. En effet, on canalisant et en confinant le fluide, on parvient à induire un mouvement coordonné et une mise en rotation uniforme de l'ensemble du fluide. La mesure de la mobilité collective devient donc simple car elle ne nécessite la quantification d'une seule quantité scalaire, à savoir, la vitesse de rotation d'ensemble du fluide. Cette rotation d'ensemble peut être ensuite facilement quantifiée à l'aide d'une technique de post-traitement d'image comme la PIV ou le flow optique.

Deux exemples de bases sont présentés en relations avec les figures la et lb. Le dispositif de traitement (DM) comprend un support plan (SB). Un sillon (SI) est creusé sur ce support plan. En fonction des modes de réalisation (figure lb), le dispositif de traitement comprend également un réceptacle de trop plein (RTP) destiné à recueillir le trop plein d'échantillon (c'est-à-dire la quantité d'échantillon qui est trop importante par rapport à la capacité du sillon).

Les figures 2, 3 et 4 présentent des formes de canalisation et de réceptacle de trop plein (RTP) alternatives. Notamment, le réceptacle de trop plein (RTP) n'est pas nécessairement positionné au centre du sillon de canalisation. Dans ces schémas explicatifs, les proportions ne sont pas respectées. Typiquement, le support plan est un support en verre ou en polymère transparent d'une épaisseur de l'ordre du millimètre alors que les tailles se rapportant au sillon (hauteur, largeur, rayon) sont plutôt de l'ordre du dixième de millimètre ou du centième de millimètre.

Le dispositif de traitement permet de développer des méthodes plus objectives de quantification de la mobilité collective. Par exemple, dans le cas du sperme, la quantification de la motilité massale est le critère aujourd'hui retenu dans les centres de prélèvements comme paramètre pertinent pour la fertilité potentielle des échantillons prélevés. Or, la mesure effectuée sur les prélèvements de gouttes posées sur lame de microscope reste dépendante de l'opérateur humain qui effectue la mesure. Il existe une forte disparité entre les notes effectuées par ces opérateurs dans différents centres. Ainsi, il y a un avantage à développer une méthode de caractérisation objective de la mobilité collective car il n'existe pas de matériel qui permet une telle quantification. Il n'existe pas d'appareil pour la quantification du mouvement collectif de fluide biologique actif à ce jour. Le dispositif de traitement permet de réaliser une telle quantification en imprimant un mouvement d'ensemble à la suspension active dans le sillon de canalisation (c'est-à-dire à la portion d'échantillon qui se trouve dans le sillon).

Ainsi, le dispositif de traitement permet de réaliser une quantification simple de la mobilité collective (c'est-à-dire de la motilité massale) de sperme pur ou dilué. Plus particulièrement, le dispositif proposé permet de mettre en évidence une caractéristique simple de la mobilité collective, sans avoir besoin d'en quantifier individuellement des mouvements fluctuants. Ainsi, comparé aux techniques existantes, le dispositif de l'invention offre d'une part l'avantage de ne pas requérir une qualification unitaire des mouvements des spermatozoïdes composant l'échantillon de sperme et d'autre part d'être simple à mettre en œuvre.

5.2. Description d'un premier mode de réalisation

Dans ce mode de réalisation de l'invention, le dispositif de traitement permet de mesurer un mouvement d'ensemble d'un échantillon de sperme, c'est à dire une vitesse moyenne d'entraînement de la suspension fluide (i.e. le sperme si les nageurs sont des spermatozoïdes) liée à la coordination des mouvements individuels des nageurs actifs.

Le lien entre vitesse de rotation et qualité de la semence provient de la capacité de celle-ci à produire un mouvement coordonné et rapide. Une semence de qualité est en effet une semence fortement concentrée et très mobile. Comme il est attendu que la vitesse de rotation augmente avec la concentration des spermatozoïdes et la vitesse individuelle des nageurs, il y a théoriquement un lien direct entre la qualité de la semence et la vitesse de rotation de l'échantillon. L'explication physique de l'augmentation de la coordination des mouvements entre les nageurs actifs provient de l'augmentation des interactions entre ces derniers, qui non seulement vont entraîner le plasma fluide qui les entoure, mais aussi les nageurs actifs voisins, de sorte à imprimer une vitesse d'ensemble moyenne à la suspension active. Lorsqu'ils sont plus proches les uns des autres, ils s'influencent plus les uns les autres, par interactions stériques et hydrodynamique.

Dans ce mode de réalisation, un tel dispositif de mesure comprend, un support plan, de forme carrée ou rectangulaire. Un support de dépose est adjoint sur le support plan. Ce support de dépose comprend au moins une ouverture permettant de former un sillon lorsque le support plan et le support de dépose sont assemblés. Dans ce mode de réalisation, le support de dépose comprend deux parties afin de définir un anneau circulaire. Dans ce mode de réalisation, le dispositif permet une estimation simple de la qualité de la semence. Il permet de faire exprimer les propriétés collectives des spermatozoïdes confinés dans un anneau. En effet, lorsque l'on confine un échantillon de sperme dans un anneau, après quelques dizaines de secondes, le sperme présente un mouvement d'ensemble de rotation dans l'anneau. Il n'y a alors plus de volutes dont la visualisation est complexe, mais seulement une mise en rotation d'ensemble. La mesure de cette vitesse de rotation est un paramètre simple, robuste et facile d'accès pour une mesure objective et reproductible de la motilité massale. Ceci permet une automatisation industrielle de cette mesure : il n'est donc plus nécessaire de faire appel à des opérateurs humains pour réaliser de telles mesures.

Plus particulièrement, dans ce mode de réalisation, toute cavité dont les dimensions transverses sont petites par rapport à la direction longitudinale à pour conséquence de conduire à un mouvement directionnel de la semence.

On décrit, en relation avec la figure 5a et la figure 5b, un premier mode de réalisation du dispositif selon l'invention. Dans ce mode de réalisation, le dispositif (DM) comprend un support plan (SB) fabriqué à partir d'un matériau mouillant (MM) comme du verre ou un polymère hydrophile. Dans ce mode de réalisation, le support plan (SB) en matériau mouillant est recouvert d'un support de dépose (SD) fabriquée à partir d'un polymère non mouillant (PNM) (polymère hydrophobe ou téflon™) comprenant deux parties (PI, P2) qui permettent de définir l'anneau. Le support de dépose se présente sous la forme d'un film, par exemple un film déposé par procédé chimique ou par électrodépose.

Lorsque la semence est posée sur le dispositif, elle transite sur le support non mouillant (hydrophobe) pour venir prendre place dans l'enceinte annulaire (EA). En effet, une des propriétés du polymère non mouillant est de « repousser » les liquides composés d'eau, comme le sperme. Celui-ci ne stagne donc pas sur la surface de dépose comprenant le matériau non mouillant. Grâce à cette surface de dépose non mouillante (hydrophobe), l'échantillon est ainsi dirigé au sein de l'enceinte annulaire. Comme représentée en figure 5b, la coupe A-A permet de visualiser la forme de la coupe du canal de l'enceinte. Dans ce mode de réalisation, la forme de cette coupe (représentée par le cercle en pointillé référencé FC) est rectangulaire. Compte tenu du mode de réalisation décrit, la base de la forme de ce canal B _c (c'est-à-dire la paroi horizontale) est constituée de matériau mouillant (hydrophile) tandis que les parois latérales du canal B _L sont constituées de matériau non mouillant (hydrophobe).

Dans au moins un mode de réalisation complémentaire, le dispositif peut optionnellement être surmonté d'un couvercle (C), couvrant au moins partiellement la surface du dispositif. Ce couvercle (C) a plusieurs fonctions : il permet de conserver l'échantillon à l'intérieur du dispositif; il permet aussi, dans des conditions de mesure de vitesse particulières, d'éviter une évaporation de l'eau contenue dans l'échantillon. En effet, lorsque la mesure de vitesse est effectuée sous éclairage, l'échantillon peut s'échauffer. Afin d'éviter que la mesure ne soit perturbée par cet échauffement, il est nécessaire de conserver l'échantillon dans un état le plus stable possible, notamment en évitant l'évaporation du liquide qu'il contient. L'utilisation d'un couvercle permet d'éviter une telle évaporation.

Par ailleurs, toujours en relation avec les figures 5a et 5b, les lettres en minuscule ont les significations suivantes :

h : représente la distance entre le support de dépose et le couvercle ;

e : représente l'épaisseur du support de dépose (et des anneaux) et par conséquent des anneaux dans ce mode de réalisation ;

- w : représente la largeur des anneaux ;

r : représente le rayon moyen des anneaux.

Selon des caractéristiques particulières, dans ce mode de réalisation, les valeurs suivantes ont été retenues pour le dispositif :

h : est compris entre 5 et 30 microns ;

- e : est compris entre 10 et 400 microns ;

w : est compris entre 40 et 500 microns ;

r : est compris entre 500 et 5000 microns.

Naturellement, ces valeurs sont interdépendantes. Les contraintes suivantes sont préconisées pour une mise en œuvre plus efficace du dispositif : h « e « w « r. Dans cette inégalité, l'opérateur « « » signifie « environ deux fois plus petit ».

Les inventeurs ont ainsi sélectionné des dimensions transverses petites par rapport à la dimension longitudinale. Dans la gamme « w » compris entre 50 et 200 microns, « e » compris entre 20 et 100 microns et le rayon de l'anneau compris entre 0,5 et 3 millimètres, le dispositif fonctionne correctement. Cette gamme de dimensions se justifie par le fait de choisir une largeur w de l'ordre de 5 à 20 fois la taille des nageurs actifs, et une épaisseur e du même ordre de grandeur, alors que le rayon r est de l'ordre de cinq à dix fois plus grand.

Il est important de veiller à ce que la hauteur h soit ajustée de sorte à éviter la présence de bulle lors de l'entrée de la semence à l'intérieur de la cellule. Le piégeage des bulles lors de l'imbibition du fluide est en effet possible, ce qui est préjudiciable à la mise en mouvement des spermatozoïdes. Par ailleurs, la qualité de la surface des supports non mouillants est un enjeu lorsque la valeur de « e » est petite (inférieure à 5 microns). Sinon, tant que la valeur de « e » est grande ce n'est pas un point sensible.

Plus précisément, en fonction des types de spermes, un dispositif selon ce mode de réalisation offre des performances satisfaisantes avec les valeurs suivantes :

h=10 microns, e=25 microns, w=50 microns, r=1000 microns;

h=10 microns, e=100 microns, w=200 microns, r=2000 microns;

h=20 microns, e=100 microns, w=500 microns, r=3000 microns;

h=10 microns, e=60 microns, w=100 microns, r=2000 microns.

5.3. Description d'un deuxième mode de réalisation

Dans ce deuxième mode de réalisation de l'invention, le dispositif comprend, en plus du sillon, un réceptacle de trop plein (RTP) destiné à recueillir le trop plein d'échantillon. Ce réceptacle de trop plein permet de récupérer le trop-plein de l'échantillon afin que ce trop-plein ne soit pas réparti sur la surface de dépose de manière anarchique.

Par exemple, lorsque la forme du sillon est le cercle, un disque est aménagé au centre de ce cercle afin de récupérer le trop plein. Comme dans le cas du sillon, la surface du disque est faite de matériau mouillant (typiquement, le matériau du support, tel que le verre).

5.4. Procédé de fabrication

Le dispositif objet de la présente divulgation peut être fabriqué de plusieurs manières différentes. Cependant, de par sa petite taille certaines méthodes de fabrication peuvent être plus adaptées que d'autres.

Selon un premier mode de réalisation, les dispositifs sont fabriqués par dépôt d'une résine auquel on adjoint une dissolution par photolithographie. Une résine est déposée sur un « wafer » (par exemple un wafer en verre) de forme circulaire qui peut- avoir différents diamètres en fonction de l'appareillage utilisé (une valeur typique d'un diamètre de wafer est d'environ 10 centimètres). Les anneaux sont espacés sur le wafer de sorte à ce que l'on puisse venir découper le verre aux dimensions souhaitées : il s'agit de dimensions qui sont un compromis entre le nombre de dispositif que l'on souhaite obtenir à partir d'un wafer et la facilité d'utilisation et de manipulation. Puisque les anneaux ont un diamètre de un à trois millimètres, la quantité d'anneaux que l'on peut imprimer sur un wafer est de l'ordre de mille.

Selon un deuxième mode de réalisation, le dispositif est réalisé à l'aide de Polydiméthylsiloxane appelé PDMS ou diméthicole. Dans ce mode de réalisation, le PDMS (liquide) mélangé à un agent réticulant est versé sur un moule microstructuré et chauffé afin d'obtenir une réplique du moule en élastomère (PDMS réticulé). Selon les modes de réalisation, la réplique du moule (qui correspond à un dispositif « nu ») est ensuite complétée avec un matériau non mouillant (par exemple du téflon™), afin de terminer la fabrication. Le matériau non mouillant, quand il est nécessaire, peut être déposé sous la forme d'un film à la surface du moule. Le film peut ensuite être brûlé, par exemple à l'aide d'un laser, aux endroits où la présence de matériaux hydrophobe n'est pas souhaitée.

Selon un troisième mode de réalisation, le dispositif est fabriqué par micro usinage. Le matériau non mouillant, quand il est nécessaire, peut être déposé sous la forme d'un film à la surface du moule. Le film peut ensuite être brûlé, par exemple à l'aide d'un laser, aux endroits où la présence de matériaux hydrophobe n'est pas souhaitée.

5.5. technique de mesure et extraction de la vitesse

A ce dispositif permettant de mettre en mouvement spontané des suspensions actives biologiques, on peut ajouter la description de la technique de mesure et une technique d'extraction de la vitesse.

La figure 6 est un schéma de principe du système de mesure selon la présente technique. On effectue un enregistrement des déplacements dans l'anneau (A) de la cellule (B) posée sur une platine de microscope. Un objectif optique de microscope (O) (avec ou sans anneau de phase) est relié à une caméra (C) pour effectuer un enregistrement vidéo rapide (typiquement 50 à 100 hz, soit 50 à 100 images par seconde). Ce flux vidéo est ensuite transmis à un ordinateur (D) pour effectuer le traitement. La qualité du capteur de la caméra, de l'objectif optique et de l'éclairage sont les principaux déterminants de la qualité du signal (avec l'échantillonnage fréquentiel). Il est important que la platine du microscope soit thermostatée afin de permettre le meilleur comportement de l'échantillon biologique (de préférence à une température propice au mouvement autonome des composantes du fluide).

Une fois la séquence vidéo acquise, on effectue une détermination de la vitesse globale du fluide. Ce traitement est basé sur des méthodes de PIV ou l'on cherche à extraire, pour tous les pixels d'une l'image, le déplacement qui permet la meilleure corrélation avec l'image suivante enregistrée un instant (Dt) plus tard. L'endroit où se localise le pic de la corrélation permet de donner le déplacement qui détermine la vitesse comme « vitesse=déplacement/Dt ». Cependant, comme l'on souhaite ici extraire une seule composante azimutale de la vitesse (dans la direction Θ des coordonnées polaires r, Θ ), dans l'anneau, la technique de PIV peut-être très largement accélérée par les techniques décrites par la suite.

A) Pré-traitement/calibration

1) On détermine sur la moyenne de quelques images (pendant 0.15s - soit 7 à 15 images- avant la mesure proprement dite) les bords extérieur et intérieur des anneaux par extractions des contours (filtre médian et seuillage par exemple et/ou transformée de Hough) ;

2) On mesure la valeur moyenne des niveaux de gris dans l'anneau pour l'estimation de la concentration (au préalable calibrée pour le dispositif et l'échantillon biologique) ;

3) On crée une grille de coordonnées polaires Ir, Θ) adaptée aux bords de l'échantillon et dont la discrétisation spatiale est consistante avec le nombre de points par direction d'une grille initiale (de la taille de l'image).

B) Traitement dynamique

1) On interpole les coordonnées Cartésiennes des pixels de l'image prise à l'instant t dans la grille de coordonnées polaires. L'intensité des niveaux de gris de l'image l(x,y) est alors traduite dans des coordonnées polaires l(r, Θ ).

2) On calcule la transformée de Fourier rapide ld \(r,k& ), dans la direction périodique Θ de chaque ligne de l'image interpolée, où kg> est le vecteur d'onde associé à <9dans l'espace de Fourier.

3) La multiplication terme à terme des transformées de Fourier rapide ld, dans la direction périodique Θ :

P(k ₀ )= i(r, k _a ,t).l(r,k _e „t+Dt)

de l'image prise à l'instant t et la suivante prise à t+Dt donne la transformée de Fourier de la corrélation P(/Q¾) (un produit de convolution est un produit direct dans l'espace de Fourier). La détermination du pic de ce produit donne la localisation du pic de la corrélation, et donc le déplacement le long de Θ , donnant la meilleure corrélation d'une image à l'autre.

4) On calcule ensuite pour chaque r, la vitesse azimutale par la relation : vitesse=déplacement/Dt

5) On moyenne ensuite dans la direction r les vitesses azimutales pour avoir une estimation à chaque temps de la vitesse azimutale moyenne

6) Pour déterminer une vitesse moyenne de l'échantillon qui peut variée pendant la mesure on prend le max de la moyenne sur une fenêtre glissante (la taille de la fenêtre glissante peut être sélectionnée entre 5 à 20s).

Les étapes les plus coûteuses en temps de calcul sont A.l et Bl. B.l est l'étape clée car elle est réalisée à tous les pas de temps et elle coûte autant que le nombre de points dans la grille à interpoler. Cependant, cette interpolation peut être facilement parallélisée. Les étapes B2 et B3 sont simples à programmer et très rapides. Mais elles coûtent aussi à peu près autant que le nombre de points de la grille. Comme chaque ligne est indépendante de la suivante, la parallélisassions est là encore possible et souhaitable pour obtenir un traitement accéléré. Les étapes B4, B5, B6 sont des post-traitements sans véritable impact sur le temps total d'obtention d'un résultat.