Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur qualitativen und quantitativen Bestimmung von Analyten.

Die Ermittlung klinischer Parameter in einfacher, zu¬ verlässiger und schneller Weise ist außerhalb der klinischen La¬ bors in den entsprechenden Krankenhausstationen, Arztpraxen oder zu Hause beim Patienten das Ziel von „Near Patient testing" (NPT)-Verfahren und Vorrichtungen. Diese Verfahren bzw. Vorrich¬ tungen schließen somit die Lücke zwischen den Patienten, den be¬ handelnden Ärzten sowie den großen klinischen Laboratorien.

Bereiche, in denen derartige Verfahren eingesetzt werden können, umfassen die Bereiche Blutgerinnung, Notfalldiagnostik, Marker für Herzerkrankungen (Herzinfarkt) , Urinanalyse, Klinische Chemie, Immunologie und Stoffwechselerkrankungen.

Während für die Bereiche der Gerinnung, Blutgasanalyse, Herzinfarktdiagnostik und ürinanalyse die Anforderungen der NPT, wie geringes Probenvolumen, einfache Testung sowie kurze Analy¬ sezeiten, erfüllt werden, sind im Bereich der Immunologie bzw. Notfallmedizin die bekannten Lösungen unbefriedigend.

Die US 6,133,043 betrifft eine Vorrichtung zur Analyse einer Probe umfassend eine Zelle mit einem definierten Volumen und einer Elektrode, welche in der Lage ist eine elektrische Spannung an die Probe anzulegen, eine magnetische Auffangvor¬ richtung mit einem oder mehreren Magneten, einer Spannungsquelle zum Generieren einer Spannung an der Elektrode, die ausreichend ist, um Luminiszenz eines in der Probe befindlichen elektro- chemoluminiszenten Stoffes zu induzieren, und einen Lichtdetek¬ tor.

Die Vorrichtung umfasst unter anderem eine Detektionsein- richtung gekoppelt an eine Messzelle, einen Verteiler und eine Pumpe. Der Verteiler weist mehrere Eingangsöffnungen und eine Ausgangsöffnung zum Verteilen verschiedener Lösungen (darunter auch das Probengemisch selbst) in die am Verteiler ange¬ schlossenen tubulären Hohlkörper auf, welche mit der Pumpe über die magnetische Vorrichtung und die Detektionsvorrichtung ver¬ bunden sind. Eine derartige Anordnung führt zu einer hohen me¬ chanischen Belastung von etwaig eingesetzten magnetischen Partikeln.

In der US 2003/0127396 wird eine Vorrichtung zum Mischen und Trennen von magnetischen Partikeln geoffenbart. Diese Vorrich¬ tung umfasst unter anderem einen Behälter, der zur Aufnahme von Flüssigkeiten und magnetischen Partikeln dient, und eine magne¬ tische Einrichtung in unmittelbarer Nähe des Behälters. In diesem Behälter können durch eine Öffnung am oberen Ende ein oder mehrere Röhrchen eingesetzt werden, mit deren Hilfe Waschflüssigkeiten in und aus dem Behälter transportiert werden.

In der US 5,660,990 wird ein allgemeines Verfahren zur qualitativen bzw. quantitativen Bestimmung eines Analyten in einer Probe geoffenbart, welches die Verwendung von magnetischen Partikeln zur Immobilisierung dieses Analyten vorsieht.

Die WO 2004/011146 beschreibt eine Vorrichtung zum Mischen, Trennen, Sammeln und Waschen von magnetischen Partikeln, die un¬ ter anderem eine Pipette, dessen oberes Ende an eine Druckvor¬ richtung und einen Magneten angeordnet ist, umfasst.

Die WO 1994/11078 betrifft eine Vorrichtung zur Immo¬ bilisierung und Isolierung von an Magnetpartikel gebundenen Zellen oder Analyten aus einem flüssigen Medium. Diese Vorrich¬ tung umfasst unter anderem magnetische Mittel zur Erzeugung eines Magnetfelds und tubuläre Hohlkörper zum Transport des flüssigen Mediums.

In der EP 0 687 501 Bl wird ein Verfahren und eine Vorrich¬ tung offenbart, in der magnetische Partikel in Pipetten während einer Untersuchung mit Hilfe eines Magneten temporär immo¬ bilisiert werden können.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung eine Vor¬ richtung bzw. ein Verfahren zur Verfügung zu stellen, um den An¬ forderungen der Klinik, speziell im Bereich Intensivmedizin und Notfalllabor, Genüge zu tun und Untersuchungsmöglichkeiten zu schaffen, um möglichst viele Proben, welche zumeist in geringer Menge zur Verfügung stehen, in wenigen Arbeitsschritten zu¬ verlässig und in einfacher Weise zu analysieren, wobei auch eine Vollautomatisierung ermöglicht werden sollte. Dadurch können die Ergebnisse des NPT rasch und direkt im Operationssaal, in In¬ tensivstationen, Ambulanzen, Blutbanken oder direkt in der Arzt¬ praxis angewendet werden. Weiters ist es für die klinische Pra¬ xis auch wichtig, dass mit einer einzigen Vorrichtung eine Viel¬ zahl von Analyten bestimmt werden kann.

Daher betrifft die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung

zur Bestimmung mindestens eines Analyten in einer Probe um¬ fassend einen Verteiler mit mindestens einer Einlassöffnung zum Einbringen von Flüssigkeiten, Suspensionen und/oder Gasen in den Verteiler und mit mindestens einer Auslassöffnung zum Entfernen von Flüssigkeiten, Suspensionen und/oder Gasen aus dem Vertei¬ ler, wobei an mindestens einer Auslassöffnung ein mit dem Ver¬ teiler verbundener tubulärer Hohlkörper angebracht ist, an dem eine magnetische Vorrichtung zur temporären Immobilisierung von durch eine Einlassöffnung in das Innere des Hohlkörpers einge¬ brachte oder im Inneren des Hohlkörpers befindlichen magne¬ tischen analytbindenden Partikeln an eine innere Begrenzung des Hohlkörpers angeordnet ist, wobei am Verteiler ein Verdränger angeordnet ist.

„Flüssigkeiten und/oder Gase" beziehen sich auf all jene Flüssigkeiten, die im Rahmen einer Analyse eingesetzt werden können. Dies sind neben der Probenflüssigkeit in der Regel Salzlösungen, organische Lösungen, Puffer, Wasser, Suspensionen usw. bzw. Luft, Edelgase, inerte Gase usw., die einerseits dazu dienen die Bindung Analyt-Partikel zu verstärken und die Vor¬ richtung zu reinigen und andererseits in der Lage sind jegliche Flüssigkeit aus der Vorrichtung zu verdrängen.

„Tubuläre Hohlkörper" sind schlauchförmige an zumindest zwei Enden offene Hohlkörper, die beispielsweise auch in der Chroma¬ tographie Anwendung finden. Diese wie auch all jene Komponenten, die in Verbindung mit den verwendeten Flüssigkeiten treten, sollten gegenüber den verwendeten Lösungen inert sein. So können die tubulären Hohlkörper beispielsweise aus Metall bestehen, wobei aber entsprechender Kunststoff bevorzugt wird.

„Analytbindende Partikel" sind magnetische Partikel, die in der Lage sind einen Analyten aus einer Probe spezifisch zu binden. Die Partikel können erfindungsgemäß paramagnetische, su- perparamagnetische oder ferromagnetische Eigenschaften auf¬ weisen, wobei vorzugsweise paramagnetische und superparamagne- tische Partikel verwendet werden.

Magnetische Partikel können durch das Anlegen eines magne¬ tischen Feldes an einer Oberfläche immobilisiert und gegebenen¬ falls konzentriert werden, wodurch die Handhabung derartiger Partikel innerhalb der Vorrichtung erleichtert wird. Partikel, die sich besonders gut für den erfindungsgemäßen Einsatz eignen, sind beispielsweise in „Biomagnetic Techniques in Molecular Bio-

logy", Dynal, Technical Handbook 3 ^rd Edition ©1998 offenbart.

Aufgrund des apparativen Aufbaus der erfindungsgemäßen Vor¬ richtung ist eine Automatisierung durchwegs machbar, da alle Komponenten (Verteiler, magnetische Einrichtung und Detektor) ansteuerbar sind. Auch eine Miniaturisierung der Vorrichtung ist in einfacher Weise möglich, da die einzelnen Vorrichtungsteile ebenfalls miniaturisiert werden können. Beide Faktoren sind besonders für die praktische Verwendung entscheidend, da vom Be¬ nutzer der erfindungsgemäßen Vorrichtung kleine automatisierte Vorrichtungen besonders bevorzugt werden, da diese leicht transportierbar sind, geringe Probenvolumina benötigen und gege¬ benenfalls in Kombination mit anderen Vorrichtungen eingesetzt werden können (z.B. Blutgasautomaten) .

Erfindungsgemäß kann eine Auslassöffnung auch dazu dienen Abfallflüssigkeit aus der Vorrichtung zu entfernen und die Leitungen vor dem Verwenden der Vorrichtung ausreichend zu spü¬ len.

Die Einlass- bzw. Auslassöffnungen sind vorzugsweise derart gestaltet, dass diese gegebenenfalls verschließbar sind, um bei Nicht-Benutzung einer Öffnung das Austreten von Flüssigkeit bzw. Gas aus der Vorrichtung beim Umstellen des Verteilers zu verhindern. Das Verschließen könnte beispielsweise durch das An¬ bringen eines Ventils durchgeführt werden.

Eine erfindungsgemäße Vorrichtung weist in vielerlei Hin¬ sicht Vorteile gegenüber bisher bekannten Vorrichtungen zur Be¬ stimmung von Analyten auf die ebenfalls magnetische Partikel zum Binden der zu untersuchenden Analyten verwenden. So werden in der Vorrichtung „Pathfast" der Firma Mitsubishi, der die soge¬ nannte „Magtration" (EP 0 687 501 Bl) -Technologie zugrunde liegt, die magnetischen Partikel in Pipetten während der Wasch¬ schritte temporär immobilisiert, wobei die Inkubation der Partikel mit der Probe, mit einem zweiten Marker-konjugierten Analyt-Bindungspartner und die anschließende Detektionsreaktion in Behältern durchgeführt. Diese Vorrichtung weist vor allem den Nachteil auf, dass ein entsprechend großes Probenvolumen und viele Pipettierschritte benötigt werden, für die jeweils neue Behälter mit den entsprechenden Flüssigkeiten (z.B. Waschlö¬ sungen) zur Verfügung gestellt werden müssen. Im Gegensatz dazu können mit der erfindungsgemäßen Vorrichtung geringe Probenvolu- mina in ein und demselben Hohlkörper durchgeführt werden.

Erfindungsgemäß ist am Verteiler ein Verdränger angeordnet. Dieser kann über eine eigene Verdrängereingangsöffnung an den Verteiler angeschlossen werden.

Ein Verdränger dient dazu eine Flüssigkeit bzw. ein Gas in die Vorrichtung einzubringen bzw. zu entfernen. Dabei ist der Verdränger an einer Eingangsöffnung (sog. Verdrängereingangsöff¬ nung) vorzugsweise über einen weiteren tubulären Hohlkörper an den Verteiler angebracht. Der Verdränger sollte in der Lage sein die zu transportierenden Stoffe in den tubulären Hohlkörpern so¬ wohl vorwärts als auch rückwärts zu bewegen, um gegebenenfalls eine Durchmischung der magnetischen Partikel in den tubulären Hohlkörpern, die an einer Öffnung angeordnet sind, zu ermögli¬ chen. Die Anordnung des Verdrängers direkt am Verteiler über eine eigene Verdrängereingangsöffnung weist eine Reihe von wei¬ teren Vorteilen auf. Vor allem wird es ermöglicht während dem Vor- und Zurückbewegen der Suspensionen/Lösungen in der Vorrich¬ tung das Kontaminationsrisiko der Lösungsbehälter bzw. Probenbe¬ hälter drastisch zu reduzieren, ohne beispielsweise auch Luft in die Vorrichtung einzubringen. Ferner wird es durch eine der¬ artige Ausführungsform ermöglicht mehrere Messbereiche bzw. Messkammern seriell zu verbinden und die an den magnetischen Partikeln gebundenen Analyten auch außerhalb der Vorrichtung weiter zu verarbeiten bzw. zu untersuchen, da die übrigen Strö¬ mungsbewegungen unbeeinflusst belassen werden können. Weiters werden durch eine derartige Ausführungsform, die magnetischen Partikel mechanisch nicht wesentlich belastet. Dadurch können die magnetischen Partikel nach etwaigen Regenerations- und Waschschritten wieder verwendet werden, wodurch sich vor allem die Produkt-Lebenszeit signifikant verlängern kann.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der Verdränger als Pumpe oder Spritze ausgebildet.

Es hat sich herausgestellt, dass sich vor allem Pumpen und Spritzen besonders gut eignen, um Flüssigkeiten in die er¬ findungsgemäße Vorrichtung zu bringen und innerhalb dieser zu bewegen, wobei vor allem handelsübliche Spritzen und Pumpen, die auch in der Chromatographie Anwendung finden, eingesetzt werden können.

Vorzugsweise ist der Verteiler als Dreh- oder Mehrwegventil ausgebildet.

Dreh- und Mehrwegventile zeichnen sich neben den vielsei-

tigen Verteilungsmöglichkeiten aufgrund der Mehrzahl an Öff¬ nungen vor allem aufgrund ihres hohen Automatisierungsgrades aus. Daher eignen sich derartige Ventile besonders gut Flüssig¬ keiten und Gase in der Vorrichtung zu verteilen.

Erfindungsgemäß sind auch Kombinationen mehrerer Verteiler möglich, wodurch eine gegenseitige Kontamination von verschie¬ denen Flüssigkeiten gänzlich ausgeschlossen werden kann. Weiters ist es dadurch auch möglich einzelne Arbeitsschritte parallel durchzuführen.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst der Verteiler eine Mischkammer.

Durch das Vorsehen einer Mischkammer am oder im Verteiler ist es möglich mehrere verschiedene Flüssigkeiten und Lösungen vor dem Füllen des an der Auslassöffnung befindlichen Hohlkör¬ pers zu mischen und zu homogenisieren. Dies ist vor allem dann interessant, wenn z.B. - vergleichbar mit einer Flüssigkeits¬ chromatographie - ein Gradient zur Erhöhung der Spezifität der Analyt-Partikel-Bindung beim Waschen angewendet wird.

Vorzugsweise weist die Mischkammer eine Rührvorrichtung auf. Dadurch wird die Erzeugung eines homogenen Gemisches im oder am Verteiler wesentlich erleichtert. Derartige Mischvorrichtungen sind bereits für den Einsatz in der Chromatographie bekannt und können somit direkt für den erfindungsgemäßen Zweck verwendet werden. Dennoch ist es aber durchwegs möglich auf eine Rührvor¬ richtung zu verzichten, wenn die Durchmischung der Flüssigkeiten mittels Strömungseffekte erfolgt.

An der mindestens einen Einlassöffnung sind vorzugsweise tu¬ buläre Hohlkörper angebracht.

Diese tubulären Hohlkörper dienen dazu, Flüssigkeiten und Gase über größere Distanzen in den Verteiler zu leiten, wobei sich z.B. Schläuche, die üblicherweise in der Chromatographie verwendet werden, besonders gut eignen.

Besonders bevorzugt ist der tubuläre Hohlkörper als Kapilla¬ re ausgebildet.

Die Verwendung von Kapillaren erlaubt es geringe Proben- und Flüssigkeitsvolumina einzusetzen, wodurch einerseits geringe Probenmengen ausreichen, um Untersuchungen durchzuführen, und andererseits eine Miniaturisierung der erfindungsgemäßen Vor¬ richtung ermöglicht wird. Der innere Durchmesser der eingesetz¬ ten Kapillaren beträgt maximal 3mm, vorzugsweise maximal 2mm,

maximal lmm, maximal 0,5mm, maximal 0,3mm, maximal 0,2mm, ma¬ ximal 0,1mm, maximal 500μm. Ferner richtet sich der minimale in¬ nere Durchmesser nach der Größe bzw. dem Durchmesser der verwendeten funktionalisierten magnetischen Partikel, wobei der innere Durchmesser mindestens zweimal oder mindestens dreimal so groß sein sollte wie der Durchmesser der Partikel.

Vorzugsweise weist der mit der Auslassöffnung verbundene Hohlkörper mindestens eine Querschnittserweiterung, insbesondere mindestens eine Kammer, auf.

Eine Querschnittserweiterung des tubulären Hohlkörpers dient dazu beispielsweise eine Art Kammer zu bilden, in der aufgrund der durch die Strömung erzeugten Strömungen und den daraus resultierenden Turbulenzen die Durchmischung der Partikel mit in die Vorrichtung eingebrachten Lösungen gefördert wird. Die Kammern können dabei gegebenenfalls an einer Seite auch mit einer flüssigkeitsdurchlässigen Barriere abgegrenzt sein.

Erfindungsgemäß weist ein an einer Auslassöffnung angebrach¬ ter tubulärer Hohlkörper mehrere hintereinander auftretende Querschnittserweiterungen auf, wobei der Hohlkörper dabei ein- oder mehrstückig, d.h. mehrere Hohlkörper werden miteinander verbunden, ausgebildet ist. Eine mehrstückige Anordnung mehrerer Querschnittserweiterungen würde es beispielsweise erlauben, ver¬ schiedene Kammern mit unterschiedlich funktionalisierten Partikeln zur Verfügung zu stellen und somit die Analyse mehre¬ rer Analyten gleichzeitig ermöglichen. Zur parallelen Analyse mehrerer Proben oder mehrerer unterschiedlicher Analyten in einer Probe können alternativ dazu mehrere Auslassöffnungen mit erfindungsgemäßen tubulären Hohlkörpern versehen werden. Dadurch können durch die Umstellung des Verteilers mehrere Hohlkörper einzeln angesprochen werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist der mit der Auslassöffnung verbundene tubuläre Hohlkörper zumindest teil¬ weise transparente Bereiche auf.

Transparente Bereiche sind vor allem dann von Vorteil, wenn ein Ereignis, z.B. eine Farbreaktion, innerhalb des Hohlkörpers sichtbar gemacht werden sollte. Auch eine Positionskontrolle der im Hohlkörper befindlichen Partikel wäre bei entsprechender Partikelgröße bzw. -dichte möglich. Diese Bereiche sollten, soferne z.B. photometrische Messungen direkt an den Hohlkörpern durchgeführt werden, das Licht möglichst ungehindert durch-

lassen. Daher können die transparenten Bereiche auch aus vom Hohlkörper verschiedenen Materialien bestehen (z.B. Glas) .

Vorzugsweise sind die transparenten Bereiche als Messzellen ausgebildet. Messzellen, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, sind bereits in der Photometrie, Chromatographie usw. als Durchflusszellen bekannt und können entsprechend in den Fluss der Vorrichtung eingebracht werden.

Vorzugsweise ist das Mittel zur Immobolisierung eine magne¬ tische Vorrichtung, die zum mit der Auslassöffnung des Vertei¬ lers verbundenen Hohlkörper relativ bewegbar angeordnet ist.

Um die analytbindenden Partikel, die vorzugsweise super-, para- oder ferromagnetischer Natur sind, an einen definierten Bereich im Inneren des Hohlkörpers zu immobilisieren, ist es vonnöten ein Magnetfeld, welches durch eine magnetische Vorrich¬ tung erzeugt wird, am Hohlkörper anzubringen. Vorzugsweise ist diese Vorrichtung bewegbar angeordnet, wodurch der Bereich der Immobilisierung flexibel gewählt werden kann. In einer bevorzug¬ ten Ausführungsform ist die magnetische Vorrichtung zumindest annähernd senkrecht zum tubulären Hohlkörper bewegbar angeord¬ net. Weiters erlaubt eine derartige Anordnung die Verwendung eines Permanentmagneten, der vom Hohlkörper wegbewegt werden kann, wenn das Magnetfeld nicht mehr am Hohlkörper erwünscht ist.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die magne¬ tische Vorrichtung einen Elektro- oder Permanentmagneten.

Ein Elektromagnet weist den Vorteil auf, dass das Magnetfeld mit Hilfe eines Stromkreises gesteuert werden kann. Dennoch eignen sich auch Permanentmagneten besonders gut zur Verwendung in der erfindungsgemäßen Vorrichtung.

Vorzugsweise ist an mindestens einer Einlassöffnung oder an mindestens einer Auslassöffnung oder an mindestens einen damit verbundenen tubulären Hohlkörper ein Filter oder eine Filterkom¬ bination angebracht.

Die bevorzugte Verwendung von Filtern an den Einlass- bzw. Auslassöffnungen oder an den daran verbundenen tubulären Hohl¬ körpern weist eine Vielzahl von Vorteilen auf. So können bei¬ spielsweise feste Stoffe aus der Probe, bevor diese in die Vor¬ richtung gelangen und die Analyse stören, entfernt werden. Fer¬ ner können durch entsprechende Filter auch weitere unerwünschte Probenbestandteile (z.B. Leukozyten in Voll-Blut) entfernt

werden. Auch weitere die Analyse störende Substanzen können durch den Einsatz von Substanz-spezifischen Filtern (vgl. Af¬ finitätssäule in der Chromatographie) aus der Probe entnommen werden. Somit kann die Probenvorbereitung teilweise bzw. zur Gänze entfallen, wodurch der Einsatz der erfindungsgemäßen Vor¬ richtung z.B. in der Notfallmedizin besonders vorteilhaft ist.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der Filter ein Plasmapherese-Filter.

Besonders geeignete Filter für die Immunplattform sind jene, deren Aufbau dazu geeignet ist, Zellbestandteile aus Vollblut abzutrennen. Derartige Filter werden in der Blutreinigung für Dialyseautomaten oder in Lateral Flow Assays (z.B. Fa. Schlei¬ cher & Schuell, „AccuFlow Plus") verwendet.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist am mit der Aus¬ lassöffnung des Verteilers verbundenen Hohlkörper ein Detektor angeordnet, wobei der Detektor aus der Gruppe bestehend aus einem Photometer, Fluorometer, Szintillisationsdetektor, CCD-De¬ tektor und Kombinationen davon, ausgewählt ist.

Die Anordnung eines Detektors am Hohlkörper, der an der Aus¬ lassöffnung angebracht ist, hat sich als besonders vorteilhaft erwiesen, da es dadurch ermöglicht wird, die Bindung eines Analyten an Partikel direkt im Hohlkörper zu analysieren. Es ist bei einer derartigen Ausführungsform essentiell, dass das zu messende Signal den Hohlkörper an der Position des Detektors durchdringen kann. Beispielsweise ist der Hohlkörper trans¬ parent, wenn eine Farbreaktion oder Fluoreszenz gemessen wird. Dennoch kann der Detektor auch außerhalb der erfindungsgemäßen Vorrichtung bzw. nicht am Hohlkörper positioniert sein. Dabei wird der an den Partikeln gebundene Analyt als Suspension in weitere Gefäße überführt und anschließend in einem separaten De¬ tektor bestimmt.

Vorzugsweise ist die erfindungsgemäße Vorrichtung als Kassette ausgebildet.

Durch die Ausbildung der Vorrichtung als Kassette wird es ermöglicht die Vorrichtung flexibel mit anderen weiteren Analy¬ sengeräten (z.B. Blutgasautomaten) zu komibinieren. Die er¬ findungsgemäße Kassette kann dabei lediglich aus tubulären Hohl¬ körpern (in denen gegebenenfalls bereits funktionalisierte magnetische Partikel vorhanden sind) bestehen, welche in eine Vorrichtung eingeführt wird, die entsprechend der Erfindung

einen Verteiler, einen Verdränger und mindestens eine magne¬ tische Vorrichtung zur Verfügung stellt. Durch das Vorsehen ent¬ sprechender Verbindungselemente an der Kassette und in der Vor¬ richtung kann die Kassette durch wenige Handgriffe eingebracht werden. Alternativ dazu, kann die Kassette zusätzlich einen Ver¬ teiler oder einen Verdränger oder eine magnetische Vorrichtung oder Kombinationen davon aufweisen.

Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung mindestens eines Analyten in einer Probe mit einer erfindungsgemäßen Vorrichtung umfassend die Schritte:

- Bereitstellen einer Probe,

- Inkubation der Probe mit magnetischen analytbindenden Partikeln innerhalb oder außerhalb des mit der Auslassöffnung des Verteilers verbundenen tubulären Hohlkörpers,

- gegebenenfalls Einbringen der Proben-Partikel-Suspension in den mit der Auslassöffnung des Verteilers verbundenen Hohl¬ körper, falls die Inkubation nicht im Hohlkörper durchgeführt wurde,

- Waschen der Partikel zur Entfernung von nicht-gebundenen Probenbestandteilen,

- gegebenenfalls Einbringen von Mitteln zur Detektion der an den Partikeln gebundenen Analyten in den Hohlkörper, und

- Detektion der an den Partikeln gebundenen Analyten, wobei die Partikel während oder zwischen den Schritten oder durchge¬ hend durch eine magnetische Vorrichtung zur Immobilisierung an einer inneren Begrenzung des Hohlkörpers immobilisiert werden.

Erfindungsgemäß können die magnetischen Partikel während des gesamten Verfahrens oder aber nur beispielsweise beim Wechseln der Lösungen oder beim Waschen der Partikel am Hohlkörper immo¬ bilisiert werden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt die Detekti¬ on innerhalb oder außerhalb des mit der Auslassöffnung des Ver¬ teilers verbundenen Hohlkörpers.

Die Detektion von an magnetischen Partikeln gebundenen Analyten kann wie oben beschrieben mit verschiedensten Detekto¬ ren durchgeführt werden, je nachdem welcher Analyt mit welchem Detektionsmittel detektiert werden soll. Dabei kann die Detekti¬ on entweder im Hohlkörper direkt erfolgen oder nachdem die mit Analyt beladenen Partikel aus diesem Hohlkörper in ein Gefäß

(z.B. in eine Küvette für ein Photometer oder eine Mikrotiter- platte) überführt wurde.

Zur weiteren Charakterisierung des Analyten kann dieser von den Partikeln abgetrennt und weiteren Analysen, wie z.B. Massen- spektrometrie, unterzogen werden. Diese Abtrennung kann bei¬ spielsweise durch Änderung der pH-Bedingungen, Salzkonzentration oder durch Zugabe einer kompetitiven den Analyten verdrängenden Substanz (z.B. Analoga) erfolgen (vgl. chromatographische Metho¬ den) .

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist die Probe aus der Gruppe bestehend aus Körperflüssigkeiten, insbesondere Blut, Blutserum und Speichel, Urin, Schweiß, Gewebeproben, Zellkultur- überstände, insbesondere eukaryotische und prokaryotische Kulturüberstände, umweltanalytische Lösungen und Punktions¬ flüssigkeiten verschiedener Organe, ausgewählt.

Aufgrund der Möglichkeit Analyten unterschiedlichster Art an die erfindungsgemäßen Partikel binden zu können und somit eine quantitative und qualitative Bestimmung durchzuführen, ist es dementsprechend möglich Proben verschiedenster Art einzusetzen. Als besonders geeignet zur Durchführung des hierin offenbarten Verfahrens erwiesen sich klinische Proben, da derartige Proben schnell, einfach und genau untersucht werden müssen, um einem Patienten die effizienteste Therapie in kürzester Zeit zur Verfügung zu stellen. Analyten aus festen Proben, wie z.B. aus Gewebeproben oder Suspensionen (e.g. Zellsuspensionen, Vollblut und u.ä), können daraus vor Beginn der Analysen extrahiert werden.

Eine Extraktion oder Separation kann dabei durch geeignete Lösungsmittel oder durch Homogenisieren und Entfernung der fes¬ ten Bestandteile (durch Zentrifugation oder Filtration) er¬ folgen, wobei eine Filtration unmittelbar an der erfindungsgemä¬ ßen Apparatur oder innerhalb dieser durchgeführt werden kann (z.B. durch Vorsehen von Filtern an der erfindungsgemäßen Vor¬ richtung) .

Vorzugsweise weisen die magnetischen analytbindenden Partikel mindestens eine chemische Modifikation auf.

Durch die chemische Modifikation der Partikel können diese funktionalisiert werden, so dass die Partikel in der Lage sind einen Analyten aus einer Probe spezifisch zu binden.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die che-

mische Modifikation einen analytspezifischen Bindungspartner.

Um den zu untersuchenden Analyten spezifisch zu binden, ist es vorteilhaft einen entsprechenden Bindungspartner zu identifi¬ zieren und auf die Partikel aufzubringen.

Dabei umfasst die chemische Modifikation einen Stoff ausge¬ wählt aus der Gruppe bestehend aus Proteinen, insbesondere Anti¬ körper, Antikörperfragmente, Protein A, Protein G und Lektine, Biotin, Streptavidin, Avidin, Phagen, Phagenproteine, Viren, vi¬ rale Proteine/Partikel, Nukleinsäuren, Oligonukleotide und Kom¬ binationen davon (siehe „Antibodies, a laboratory manual", Ed Harlow, David Lane; CoId Spring Harbor Laboratory Press, 1988) .

Entsprechende Protokolle bzw. Anleitungen, wie Bindungspart¬ ner an erfindungsgemäße magnetische Partikel gebunden werden können, sind dem Fachmann durchwegs bekannt und im Stand der Technik ausführlich behandelt (siehe z.B. US 4,628,037, EP 0180384, Schalkhammer, T.G.M. (ed.) 2002. Analytical Biotech- nology. Basel, Boston, Berlin:Birkhäuser Verlag; Iacob G et al (2001) Rev Med Chir Soc Med Nat Iasi. 105:69-75)

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfasst das Mittel zur Detektion des Analyten einen weiteren Bindungspartner des Analyten.

Um einen Analyten zu detektieren eignet sich besonders gut der Einsatz eines entsprechenden Bindungspartners, der gege¬ benenfalls einfacher bzw. in verstärktem Ausmaß detektierbar ist als der zu bestimmende Analyt.

Vorzugsweise ist dabei der weitere Bindungspartner mit einem Marker konjugiert.

Der Bindungspartner, der mit dem Analyten auf den Partikeln eine Bindung eingeht, kann mit einem Marker konjugiert sein. Derartige Marker sind z.B. aus der Immunologie (siehe ELISA, RIA und dergleichen) bekannt. Ein Marker dient vor allem dazu die Anwesenheit eines Konjugats direkt oder indirekt über eine wei¬ tere Reaktion anzuzeigen.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist der Marker ein Enzym, insbesondere Meerrettich-Peroxidase, ß-Galactosidase und alkalische Phosphatase, radioaktives Isotop, BrDU, Digitonin, Ki67, PCNA, Rutheniumverbindungen, wie Ru-Chelate, Tris(2,2'- bipyridine) ruthenium(II) (siehe z.B. WO92/14138), oder Kombina¬ tionen davon.

Die Mittel zur Detektion umfassen vorzugsweise ein Substrat,

welches vom Marker des konjugierten Bindungspartners umgesetzt wird, wobei das Substrat ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Luminol, Dixethane, Acridinester und Kombinationen davon, werden kann.

Die Verwendung eines Enzym-Markers, der ein Substrat um¬ setzt, kann zu einer Verstärkung des Detektionssignals führen und somit das Detektionsverfahren sensitiver machen.

Ferner kann die Anwesenheit eines Analyten an den Partikeln durch Verfahren wie PCR, ELISA oder PAP-APAAP in einfacher Weise fesgestellt werden.

Vorzugsweise ist das Volumen der Probe lμl bis 1ml, vorzugs¬ weise 2μl bis 500μl, insbesondere 5μl bis 200μl.

Erfindungsgemäß können mit der hierin offenbarten Vorrich¬ tung jegliche Probenvolumina analysiert werden, wobei aber in bestimmten Anwendungsgebieten (z.B. eine Blutabnahme bei einem Frühgeborenen in der Klinik) bevorzugt geringe Volumina einge¬ setzt werden. Die Verwendung geringer Volumina bis maximal 5ml, maximal 4ml, maximal 2ml, maximal ImI, maximal 500μl, maximal 200μl, im erfindungsgemäßen Verfahren wird vor allem durch die Bereitstellung einer entsprechenden Vorrichtung ermöglicht.

Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die erfindungsgemäße Vorrichtung in Kombination mit einem Blut¬ gasautomaten verwendet, wodurch die Einsatzmöglichkeit eines Blutgasautomaten bezüglich der Bestimmung von Analyten im Blut drastisch erweitert werden kann.

Die Vorrichtung gemäß der vorliegenden Erfindung kann in einfacher Weise mit Hilfe von Kapillaren, Verbindungsstücken und Ventilen an eine Ausgangsöffnung bzw. Ausgangskapillare eines Blutgasautomaten angeschlossen werden. Dabei kann die Vorrich¬ tung auch als Einweg- oder Mehrweg-Kassette gestaltet sein, die in einen Blutgasautomaten austauschbar eingebracht werden kann. Blutgasautomaten sind beispielsweise von den Firmen Roche („Ro¬ che COMPACT 3") und Osmetech („Osmetech OPTI CCA Blood Gas Analyzer") dem Fachmann hinreichend bekannt.

Die Erfindung wird weiters anhand der folgenden Figur und des folgenden Beispiels näher erläutert, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.

Fig. 1 zeigt eine Vorrichtung zur Bestimmung eines Analyten, die einen Verteiler 1 umfasst, der mehrere Einlassöffnungen 2-6, eine Eingangsöffnung 7 zum Anbringen eines Verdrängers 8 (Ver-

drängereingangsöffnung) und eine Auslassöffnung 9 aufweist. An der Auslassöffnung 9 ist ein tubulärer Hohlkörper 10 angebracht, an dem eine magnetische Vorrichtung 11 angeordnet ist. Ein De¬ tektor 12 zur direkten bzw. indirekten Bestimmung des an den magnetischen Partikeln immobilisierten Analyten ist ebenfalls entlang des Hohlkörpers 10 angeordnet.

Über einen Verteiler 1 werden, mittels eines Verdrängers 8 hintereinander die Probe und weitere benötigte Reagenzien, wie Puffer und dergleichen, angesaugt und gegebenenfalls mit den magnetischen Partikeln in der erfindungsgemäßen Vorrichtung in¬ kubiert. Um eine gleichmäßige Verteilung der Partikel und der Lösungen zu garantieren kann, die resultierende Suspension in einer Mischkammer vermischt werden.

Alternativ kann diese Suspension in den tubulären Hohlkörper 10 des Auslasses gepumpt und mit oder ohne Vor- und Zurückbewe¬ gung der Suspension vermischt werden.

Der zu bestimmende Analyt wird durch entsprechende Wechsel¬ wirkungen an die in der Lösung suspendierten magnetischen Partikel gebunden. Die magnetischen Partikel werden im Auslass¬ hohlkörper 10 durch Anlegen eines Magnetfeldes an dessen äußeren Begrenzung, innerhalb der Begrenzung festgehalten. Das gesamte Volumen der Suspension muss durch entsprechende Vor- und Zurück¬ bewegung mittels eines Verdrängers 8 am angelegten Magnetfeld vorbeigeführt werden, um die Magnetpartikel quantitativ zu immo¬ bilisieren.

Unter anhaltender Fixierung der magnetischen Partikel wird dann, mittels Verdränger 8, ein Waschvorgang durchgeführt. Dabei wird eine dem Assay entsprechende Menge Waschpufferlösung durch den Verteiler 1 angesaugt und durch den Auslasshohlkörper 10 ge¬ pumpt. Der Vorgang kann je nach Notwendigkeit ein oder mehrere Male wiederholt werden.

Eine optionale Optimierung des Waschvorgangs kann dadurch erreicht werden, dass das entsprechende Waschlösungsvolumen in den Auslasshohlkörper 10 gepumpt wird, die magnetische Partikel¬ fixierung durch Entfernung des außerhalb des Hohlkörpers 10 zugeführten Magnetfeldes aufgehoben wird und so eine Freisetzung der magnetischen Partikel in die Waschlösung erreicht wird. Eine darauf folgende Bewegung der neuerlich suspendierten Partikel durch leichtes Hin- und Herpumpen der resultierten Suspension mittels Verdränger und anschließendes Immobilisieren der magne-

tischen Partikel durch Anlegen eines Magnetfeldes ist Teil eines äußerst effektiven Waschvorgangs.

Danach kann der Vorgang der magnetischen Partikelfixierung und des oben beschriebenen allgemeinen Waschvorgangs wiederholt werden.

Nach finaler magnetischer Fixierung der Partikel wird im nächsten Schritt der überschüssige Waschpuffer durch Ansaugen einer durch die jeweilige Konstruktion vorgegebenen Menge Gas und nachfolgendem Ausstoßen aus dem Auslasshohlkörper 10 ent¬ fernt.

Anschließend wird eine für das vollständige Ablösen der magnetischen Partikel von der inneren Begrenzung des Hohlkörpers 10 notwendige Substratmenge durch den Verteiler 1 angesaugt. Das Substrat wird in den Hohlkörper 10 gepumpt und in Kontakt mit den fixierten Magnetpartikeln gebracht und über einen Detektor 12 (PMT, Diode, CCD, oder ähnlichem) die für den Analyten re¬ präsentative elektromagnetische Strahlung bestimmt.

Eine weitere Optimierung der Quantifizierung kann dadurch erreicht werden, dass der Magnet nach der Zufuhr der Substratlö¬ sung in den Hohlkörper 10 entfernt wird, wodurch die vorher magnetisch fixierten Partikel wieder freigesetzt werden und durch leichtes Hin- und Herpumpen der resultierten Suspension mittels Verdränger 8 mit dem Substrat gemischt werden. Für die anschließende, wie oben beschriebene, Quantifizierung wird die Suspension in ein Detektionsfenster oder aus dem Hohlkörper 10 in ein weiteres Gefäß gebracht.

Abschließend wird die gesamte Vorrichtung mit Waschpuffer und entsprechenden Reinigungslösungen (Waschen) für die nächste Messung vorbereitet.

Beispiel:

Material und Methoden:

Ein 8-Kanal-Verteiler (Hamilton, Art-N°86918) mit lOOμl Spritze (Hamilton, Art-N°81022) und Teflonkapillaren (Hamilton, Art-N°88907) mit Luer Anschlüssen verbunden, Mikrotiterplatte Weiß (Nunc, Art-N°437-591) , StabilZyme AP (SurModics, Art-N° SAOl-1000) , Streptavidin Magnetic Particles (Aureon Biosystems, Art-N°A010101) und Dynabeads M-280 Streptavidin (Dynal, Art-N° 112.06), Biotin-Peroxidase (Sciotec, 5mg/ml) , Peroxidase Sub¬ strat (Lumigen, Art-N°PSA-100) , Mediators PhL Luminometer (Aure- on, Art-N°G010001) , Neodymborat-Magnet (Magnet Sales, Art-N°

NIRD011SS/W) , Waschlösung ist TPBS.

Für die Positivkontrolle wurde Biotin-Peroxidase 1:1.000.000 mit StabilZyme AP verdünnt, wobei als Negativkontrolle StabilZy- me AP verwendet wurde. Die Streptavidin Magnetic Particles wurden 1:40 ebenfalls in StabilZyme AP verdünnt.

Zunächst wurden über die Spritze 5μl Streptavidin Magnetic Particles (Partikel) angesaugt und in den Verteiler gebracht. Der Verteiler wurde auf Position Auslass geschaltet und die Suspension in eine Kapillare, die an der Auslassöffnung ange¬ bracht ist, transportiert. Ein Magnet wurde in die Nähe der Ka¬ pillare gebracht, die magnetischen Partikel an der inneren Be¬ grenzung der Kapillare immobilisiert und die Flüssigkeit ausge¬ stoßen. Danach wurden über einen zweiten Einlass 5μl der Posi¬ tivkontrolle oder der Negativkontrolle angesaugt und durch Um¬ schalten auf den Auslass in die Kapillare eingebracht, der Magnet wurde entfernt und die Partikel durch Hin- und Herbewegen der Flüssigkeit wieder in Suspension gebracht und für 10 Minuten inkubiert. Der Magnet wurde wieder positioniert und die Partikel gefangen. Die Flüssigkeit wurde ausgestoßen und mit 25μl Wasch¬ lösung aus einem dritten Einlass bei angelegtem Magnetfeld ge¬ waschen. Mit weiteren 25μl Waschlösung wurden die Partikel bei entferntem Magneten gewaschen. Anschließend wurden die Partikel mit 25μl Substratlösung resuspendiert, die resultierende Suspension in eine Mikrotiterplatte ausgestoßen und im Luminome- ter mit 1 Sekunde Integrationszeit gemessen.

Ergebnisse:

Die Ergebnisse der Messungen sind in Tabelle 1 angeführt, welche in relativen Lichteinheiten (relative light units, RLU) angegeben wurden.

Tabelle 1