L'invention se rapporte à un dispositif apte à recevoir une culture cellulaire ou une suspension cellulaire, et adapté à la centrifugation desdites cellules.

Dans le domaine des analyses biologiques et de la thérapie cellulaire, de nombreux procédés de traitement du matériel biologique de départ (i.e. l'échantillon d'un patient) existent, et visent à récupérer les éléments nécessaires au but visé (i.e. analytique ou thérapeutique, respectivement). Le plus souvent, ces éléments nécessaires sont constitués par les cellules du patient.

Parmi les différentes étapes des procédés existants, il est connu d'utiliser la centrifugation comme moyen de séparation de cellules d'un liquide, en vue de leur utilisation ultérieure. A cette fin, lesdites cellules sont conditionnées dans un dispositif particulier, puis soumises à la centrifugation. Classiquement, après cette étape, on obtient deux phases :

une phase inférieure solide, appelée culot, qui contient les cellules; et une phase supérieure, liquide, appelée surnageant.

Notamment en fonction de la nature des cellules, de la force centrifuge utilisée et du type de liquide dans lequel les cellules sont en suspension, l'homogénéité du culot cellulaire peut varier.

En effet il peut arriver que, après centrifugation, des culots cellulaires non fermes soient formés. Dans de tels cas, les culots obtenus ne sont pas clairement distincts du surnageant. Cela est notamment le cas pour certains types cellulaires utilisés en thérapie. Une remise en suspension des cellules dans le surnageant ou à l'interface entre le surnageant et le culot peut alors avoir lieu lors de la manipulation ultérieure du dispositif utilisé pour la centrifugation, notamment l'utilisation d'une presse à plasma qui peut entraîner une séparation imparfaite des phases, et ainsi, une perte de rentabilité du procédé.

Il existe donc un besoin pour un dispositif capable de centrifuger et de concentrer une quantité maximale de culot cellulaire, de manière simple et facile, et ce, même pour les cas où les culots formés ne sont pas fermes.

L'invention vise à pallier les problèmes évoqués ci-dessus. En effet, le dispositif selon l'invention, par sa forme particulière, permet d'éviter ces problèmes. Il permet de récupérer après centrifugation, de manière aisée, aussi bien le surnageant que le culot cellulaire formé. Il permet en outre une meilleure concentration cellulaire après centrifugation.

A cet effet, l'invention propose un dispositif de traitement d'un fluide biologique comprenant des cellules en suspension dans un liquide, le dispositif de traitement étant destiné à être utilisé au cours d'une étape de centrifugation pour séparer les cellules du liquide, le dispositif de traitement comprenant :

- une poche adaptée pour recevoir le fluide biologique, la poche présentant des bords supérieur et inférieur écartés l'un de l'autre selon un axe longitudinal, la poche étant constituée de deux couches souples, superposées et solidarisées l'une à l'autre selon une zone de solidarisation, la zone de solidarisation étant prévue pour former entre les deux couches un espace intérieur pour recevoir le fluide biologique et au moins une ouverture adaptée pour mettre en communication l'espace intérieur avec un environnement extérieur,

- au moins un organe d'obturation disposé dans l'ouverture pour sélectivement ouvrir et fermer l'ouverture,

dans lequel l'espace intérieur présente :

- une partie supérieure formée au voisinage du bord supérieur et destinée à recevoir le liquide du fluide biologique surnageant après l'étape de centrifugation, et

- un goulot formé au voisinage du bord inférieur et destiné à recevoir un culot de cellules du fluide biologique après l'étape de centrifugation,

la partie supérieure et le goulot présentant respectivement des largeurs mesurées transversalement par rapport à l'axe longitudinal, la largeur du goulot étant inférieure à la largeur de la partie supérieure.

La présente invention se rapporte également à un procédé de fabrication d'un dispositif tel que décrit ci-avant, prévoyant les étapes consistant à :

- former une poche adaptée pour recevoir un fluide biologique comprenant des cellules en suspension dans un liquide et présentant des bords supérieur et inférieur écartés l'un de l'autre selon un axe longitudinal, en superposant et solidarisant deux couches souples l'une à l'autre selon une zone de solidarisation, la zone de solidarisation étant prévue pour former entre les deux couches un espace intérieur pour recevoir le fluide biologique et au moins une ouverture adaptée pour mettre en communication l'espace intérieur avec un environnement extérieur, l'espace intérieur présentant une partie supérieure formée au voisinage du bord supérieur et destinée à recevoir le liquide du fluide biologique surnageant après l'étape de centrifugation, et un goulot formé au voisinage du bord inférieur et destiné à recevoir un culot de cellules du fluide biologique après l'étape de centrifugation, la partie supérieure et le goulot présentant respectivement des largeurs mesurées transversalement par rapport à l'axe longitudinal, la largeur du goulot étant inférieure à la largeur de la partie supérieure,

- disposer au moins un organe d'obturation disposé dans l'ouverture pour sélectivement ouvrir et fermer l'ouverture.

Dans des modes de réalisation, l'invention peut comprendre une ou plusieurs des dispositions suivantes :

Le fluide biologique présent dans le dispositif selon l'invention peut être un échantillon de sang, de plasma, de la moelle osseuse mais également un échantillon de culture cellulaire ou une suspension cellulaire de tous types. Par exemple, le fluide biologique peut être un échantillon de cellules souches ou somatiques génétiquement modifiées ou non ; une culture de cellules immunitaires, telle qu'une culture de lymphocytes B et/ou de lymphocytes T ; ou encore des prélèvements de tissus adipeux ou des fractions vasculaires stromales, ainsi que les cellules qui en dérivent. Parmi les cellules souches ou somatiques, et les cellules immunitaires utilisables, on peut citer des myoblastes et/ou leurs précurseurs, des cellules souches mésenchymateuses, des cellules souches hématopoïétiques et leurs dérivés, des cellules dendritiques, des cellules natural killer (NK).

De préférence, le dispositif de traitement selon l'invention est tel que les couches sont constituées d'au moins un film en matériau thermosoudable, les couches étant thermo- soudées selon la zone de solidarisation formée par un cordon de soudure. Le matériau thermosoudable peut être choisi parmi les matériaux classiques connus de l'art antérieur, et en particulier parmi le polychlorure de vinyle (PVC), le polypropylène, l'éthylène- acétate de vinyle (EVA), le perfluoro ethylène propylène (FEP) et les polyoléfines.

De préférence, la zone de solidarisation comprend une restriction délimitant la partie supérieure selon l'axe longitudinal à distance du bord supérieur, la restriction présentant une convergence vers le goulot. De préférence, le goulot est formé dans le prolongement longitudinal du bord inférieur.

La forme et la taille du goulot permettent ainsi de récupérer le culot cellulaire. Cela est optimisé par la restriction convergeant vers le goulot. Cette dernière permet en effet d'améliorer la concentration des cellules lors de la centrifugation.

De préférence, la partie supérieure et le goulot présentent respectivement des volumes, le volume du goulot étant compris entre 5% et 100% du volume de la partie supérieure, de préférence de 5% à 50%, de préférence de 15% à 30%.

De préférence, la largeur du goulot est comprise entre 5% et 80% de la largeur de la partie supérieure, de préférence de 10% à 40%. Plus préférentiellement, la largeur du goulot est comprise entre 1 et 7 cm, de préférence entre 1 et 5 cm, de préférence entre 3 et 4 cm. Plus préférentiellement, la largeur de la partie supérieure est comprise entre 7 et 10 cm, de préférence entre 8 et 9 cm.

De préférence, la partie supérieure et le goulot présentent respectivement des longueurs mesurées selon l'axe longitudinal, la longueur du goulot est comprise entre 5% et 100% de la longueur de la partie supérieure, de préférence entre 10% et 50%. Plus préférentiellement, la longueur du goulot est comprise entre 1 et 9 cm, de préférence entre 4 et 5 cm. Plus préférentiellement, la longueur de la partie supérieure est comprise entre 8 et 15 cm, de préférence entre 9 et 12 cm. De préférence, la restriction convergeant vers le goulot est inclinée d'un angle a selon un axe perpendiculaire à l'axe longitudinal. Cet angle a est de préférence compris entre 10° et 80°, de préférence compris entre 20° et 40°. Plus préférentiellement, cet angle a est aux alentours de 30°. Le dispositif selon l'invention comprend au moins une ouverture. De préférence, ladite au moins une ouverture comprend une ouverture inférieure ménagée sur le bord inférieur dans le goulot.

De préférence, ladite au moins une ouverture comprend une ouverture supérieure ménagée sur le bord supérieur dans la partie supérieure. De préférence, le dispositif comprend au moins une ouverture supérieure ménagée sur le bord supérieur dans la partie supérieure, et au moins une ouverture inférieure ménagée sur le bord inférieur dans le goulot. Enfin, de préférence, la poche comporte un organe d'accrochage à un dispositif de centrifugation. Cet organe d'accrochage peut être, par exemple, une languette trouée, une pince, ou encore un dispositif de serrage entre deux plaques ou entre deux mousses, permettant un maintien de la poche.

De préférence, la poche comprend deux bords latéraux, lesdits bords latéraux s'étendant parallèlement, l'un par rapport à l'autre, entre les bords supérieur et inférieur, et le goulot est le long de l'un des bords latéraux.

Plus préférentiellement, l'organe d'accrochage est le long du bord latéral situé à l'opposé du bord latéral comprenant le goulot. Préférentiellement, selon ce mode de réalisation, le goulot est situé à l'extrémité du bord latéral la plus proche de l'axe de rotation de centrifugation. Ainsi, selon ce mode de réalisation, le goulot est situé vers l'intérieur, proche du rotor de centrifugation. Le dispositif de l'invention est en effet destiné à être placé dans un appareil de centrifugation pour être entraîné en rotation autour d'un axe de centrifugation. Par rapport à cet axe, le goulot a une position préférentielle. Le goulot est ainsi situé de préférence sur le bord latéral intérieur, le plus proche de l'axe de rotation de centrifugation.

L'invention se rapporte également à un procédé de fabrication d'un dispositif selon l'invention, prévoyant les étapes consistant à :

- former une poche adaptée pour recevoir un fluide biologique comprenant des cellules en suspension dans un liquide et présentant des bords supérieur et inférieur écartés l'un de l'autre selon un axe longitudinal, en superposant et solidarisant deux couches souples l'une à l'autre selon une zone de solidarisation, la zone de solidarisation étant prévue pour former entre les deux couches un espace intérieur pour recevoir le fluide biologique et au moins une ouverture adaptée pour mettre en communication l'espace intérieur avec un environnement extérieur, l'espace intérieur présentant une partie supérieure formée au voisinage du bord supérieur et destinée à recevoir le liquide du fluide biologique surnageant après l'étape de centrifugation, et un goulot formé au voisinage du bord inférieur et destiné à recevoir un culot de cellules du fluide biologique après l'étape de centrifugation, la partie supérieure et le goulot présentant respectivement des largeurs mesurées transversalement par rapport à l'axe longitudinal, la largeur du goulot étant inférieure à la largeur de la partie supérieure,

- disposer au moins un organe d'obturation disposé dans l'ouverture pour sélectivement ouvrir et fermer l'ouverture.

Ce procédé est de préférence tel que les couches sont constituées d'au moins un film en matériau thermosoudable et prévoyant, au cours de l'étape consistant à former la poche, de thermo-souder les couches selon la zone de solidarisation en formant un cordon de soudure.

L'invention a également pour objet un procédé de traitement d'un fluide biologique mettant en œuvre un dispositif de traitement selon l'invention.

De préférence, le procédé de traitement prévoit les étapes consistant à :

- placer dans l'espace intérieur de la poche un fluide biologique comprenant des cellules en suspension dans un liquide,

- séparer les cellules du liquide en soumettant le dispositif de traitement à une étape de centrifugation,

- récupérer le liquide du fluide biologique surnageant dans la partie supérieure, et

- récupérer un culot de cellules du fluide biologique dans le goulot.

De préférence, dans la première étape, le fluide biologique est placé dans l'espace intérieur de la poche. Puis une étape de centrifugation a lieu. Cette centrifugation peut être effectuée par toute centrifugeuse connue et disponible dans le commerce. A l'issue de la centrifugation, on obtient ainsi un surnageant constitué par le liquide du fluide biologique. Le culot est situé dans la partie inférieure de la poche, au niveau du goulot. La récupération au choix du culot ou du surnageant est ainsi aisée.

D'autres objets et avantages de l'invention apparaîtront à la lecture de la description qui suit de modes de réalisation particuliers de l'invention donnés à titre d'exemple non limitatif, la description étant faite en référence aux dessins annexés dans lesquels :

- la figure 1 est une représentation du dispositif selon l'invention.

Sur la figure, les mêmes références désignent des éléments identiques ou analogues. Le dispositif selon l'invention comprend une poche (1). Cette poche comprend elle- même un bord supérieur (10) et un bord inférieur (11), lesdits bords étant écartés l'un de l'autre selon un axe longitudinal.

En outre, la poche est constituée de deux couches souples, superposées et solidarisées l'une à l'autre selon une zone de solidarisation, la zone de solidarisation étant prévue pour former entre les deux couches un espace intérieur ((6) et (7)) pour recevoir le fluide biologique.

La poche comprend au moins une ouverture adaptée pour mettre en communication l'espace intérieur avec un environnement extérieur. De préférence, comme mentionné ci- avant, ladite ouverture comprend une ouverture inférieure (5) ménagée sur le bord inférieur dans le goulot. Selon une autre variante, de préférence, ladite ouverture comprend une ouverture supérieure (4) ménagée sur le bord supérieur dans la partie supérieure. Enfin, selon une autre variante, de préférence, la poche comprend au moins une ouverture supérieure (4) ménagée sur le bord supérieur dans la partie supérieure, et au moins une ouverture inférieure (5) ménagée sur le bord inférieur dans le goulot.

L'ouverture peut comprendre au moins un organe d'obturation (2) ou (3) pour sélectivement ouvrir et fermer l'ouverture. Enfin, l'espace intérieur présente :

- une partie supérieure (7) formée au voisinage du bord supérieur et destinée à recevoir le liquide du fluide biologique surnageant après l'étape de centrifugation, et

- un goulot (6) formé au voisinage du bord inférieur et destiné à recevoir un culot de cellules du fluide biologique après l'étape de centrifugation,

la partie supérieure (7) et le goulot (6) présentant respectivement des largeurs mesurées transversalement par rapport à l'axe longitudinal, la largeur du goulot étant inférieure à la largeur de la partie supérieure.

Grâce à ces dimensions, le goulot est ainsi adapté à recevoir le culot cellulaire lors de l'étape de centrifugation. La partie supérieure de l'espace intérieur, quant à elle, ne contiendra que le surnageant.

Une récupération optimale du culot est obtenue grâce à la présence d'une restriction (8) convergeant vers le goulot. Cette restriction renforce la délimitation entre le surnageant et le culot. La restriction (8) convergeant vers le goulot est typiquement inclinée d'un angle a compris entre 10° et 80°, par rapport à un axe perpendiculaire à l'axe longitudinal. La poche (1) selon l'invention peut comporter un organe d'accrochage (9), notamment à un dispositif de centrifugation.

De préférence, le volume de fluide biologique utilisé, présent dans l'espace intérieur ((6) et (7)), est compris entre 20mL et 3L.

Exemple 1 :

Le protocole suivant permet de montrer que l'utilisation de la poche selon l'invention, pour la centrifugation de cellules, offre une meilleure solution pour la récupération des culots cellulaires instables après centrifugation comparée à l'utilisation d'une poche classique de centrifugation (par exemple une poche Macopharma).

Cette étude peut être effectuée sur plusieurs types cellulaires : lymphocytes B et/ou T, UCB (Unit Cord Blood ou unité de sang de cordon) et cellules adhérentes. Le programme de centrifugation (vitesse, durée, accélération et frein) peut être adapté en fonction du type cellulaire.

La comparaison entre les 2 poches est réalisée sur la base des critères ci-dessous:

le rendement (nombre de cellules après récupération du culot après centrifugation / nombre de cellules avant centrifugation)

la viabilité cellulaire après utilisation de la poche

- le phénotypage selon les cellules utilisées et,

le volume restant après récupération des culots

Les résultats obtenus permettent de montrer que le rendement, le phénotypage ou le volume restant après centrifugation sont en faveur de l'utilisation de la poche selon l'invention. La viabilité cellulaire reste sensiblement la même quel que soit la poche utilisée.

Nous pouvons conclure que la poche asymétrique selon l'invention est une meilleure solution qu'une poche symétrique classique pour la centrifugation cellulaire et plus précisément pour des cellules qui donnent des culots instables.