DISPOSITIVO PARA TESTE DE COAGULAÇÃO SANGUÍNEA, PROCESSO DE PRODUÇÃO, MÉTODO DE AFERIÇÃO DE TEMPO DE COAGULAÇÃO

SANGUÍNEA E KIT

Campo da Invenção

[0001] A presente invenção descreve um dispositivo analítico que possui canais microfluídicos e permite a análise quantitativa e/ou semi-quantitativa de coagulação sanguínea. A presente invenção se situa nos campos da saúde, mais especificamente nos campos da medicina, da biomedicina e da biologia.

Antecedentes da Invenção

[0002] A coagulação sanguínea envolve uma série de fatores enzimáticos da cascata de coagulação que, na sequência, geram o coágulo que vai parar o sangramento. Essas reações podem estar desreguladas em certas condições. Através do teste de tempo de coagulação, é possível avaliar a atividade da cascata enzimática e, assim, avaliar o correto funcionamento desta. São inúmeros os distúrbios que resultam das disfunções da coagulação, como acidente vascular cerebral, embolia pulmonar, ataque cardíaco, doenças cardiovasculares e hemorragias.

[0003] O Acidente Vascular Cerebral (AVC) é a doença que mais mata o brasileiro e é a principal causa de incapacidade no mundo. Aproximadamente, 70% das pessoas não retorna às suas atividades normais após um AVC devido às sequelas (Sociedade Brasileira de Doenças Cerebrovasculares). A incidência anual de AVC é de 108 casos para cada 100 mil habitantes. Além disso, é responsável por um grande número de internações no Brasil, ou seja, elevado custo para o governo (Botelho, 2016).

[0004] Existe um medicamento trombolítico que tem potencial de reduzir significativamente as sequelas de um AVC. Entretanto, o medicamento deve ser administrado em até 4,5 h após o evento e um dos pré-requisitos é uma atividade coagulante dentro dos valores pré-estabelecidos (Manual de Rotinas para Atenção do AVC - Brasília 2013). O paciente que sofre um AVC, geralmente, tem seu atendimento inicial efetuado pelo Atendimento Pré- hospitalar que não possui tecnologia suficiente, pelo menos no Sistema Único de Saúde, para realizar este teste.

[0005] O teste de tempo de protrombina (TP) é realizado em laboratórios de análises clínicas para mensurar o tempo de ativação da cascata de coagulação, ou seja, o tempo em que o componente fibrinogênio, presente na cascata, é convertido em monômeros de fibrina, dando origem a um coágulo que contribui no controle de uma lesão quando há desequilíbrio na hemostasia (Hernaningsih et al., 2017). O resultado deste teste pode ser representado tanto em segundos quando em Razão Normatizada Internacional (RNI), um parâmetro que leva em consideração o reagente utilizado na técnica. Os fatores que levam ao desequilíbrio na coagulação, seja de forma lenta ou rápida, podem ser genéticos ou adquiridos e todos necessitam de monitoramento médico para evitar acidente vascular cerebral, embolia pulmonar, ataque cardíaco, doenças cardiovasculares e hemorragias (Li et al., 2014).

[0006] Pacientes em uso de anticoagulante oral com dose não adequada tem alto risco de sangramento ou de formação excessiva de trombos. Essa desregulação é comumente provocada pela alimentação, uso de álcool, tabagismo e interações do anticoagulante com outros medicamentos. Os anticoagulantes orais estão entre os fármacos com maior número de interações medicamentosas. Em números, é estimado que um milhão de prescrições de varfarina são feitas por ano nos Estados Unidos, fazendo com que ela figure entre os 15 fármacos mais prescritos, em termos de quantidade (Telles, 2012). Por isso, a avaliação do tempo de protrombina nestes pacientes é realizada, em média, uma vez ao mês.

[0007] Pacientes que fazem uso de anticoagulantes orais que possuem como mecanismo de ação a inibição da síntese de fatores da coagulação dependentes da vitamina K, como a varfarina, necessitam deslocar-se até um posto de coleta com frequência para fazer o acompanhamento da dose terapêutica do fármaco. A coleta é feita por venopunção, sendo invasiva, executada por técnico habilitado. Após a coleta é necessário, ainda, esperar a liberação do laudo com o resultado da análise e a consulta médica para o parecer médico e ajuste da dose terapêutica (Yamada et al., 2017). Em função desta demora, corre-se o risco de o profissional de saúde avaliar o paciente com base em um resultado não atual e fazer o ajuste de dose de forma inadequada.

[0008] As tecnologias que avaliam o TP encontradas na literatura avaliam a densidade ou impedância da amostra e utilizam equipamentos de leitura ou eletrodos juntamente com compostos fluorimétricos, tromboplastinas ou ativadores de coagulação (Crochemore et al., 2017). A técnica mais utilizada nos laboratórios de análises clínicas é a ótica mecânica, que detecta a mudança na densidade do coágulo e depende de um equipamento específico para ser executada (Bazaev et al., 2015).

Sumário da Invenção

[0009] Dessa forma, a presente invenção resolve os problemas do estado da técnica a partir do desenvolvimento de um dispositivo analítico para determinação do tempo de protrombina que utilize sangue total e possa ser utilizado na beira do leito ou por auto-monitoramento pelo paciente. O dispositivo apresenta vantagens como baixo custo, produtibilidade em massa, descartabilidade, facilidade no manuseio e rapidez na comparação com testes convencionais.

[0010] O dispositivo foi desenvolvido e validado conforme os critérios da Organização Mundial da Saúde para estas tecnologias (A guide to aid the selection of diagnostic test. Kosak. 2017).

[0011] Em um primeiro objeto, a presente invenção apresenta um dispositivo para teste de coagulação sanguínea compreendendo: i) um substrato de material poroso, em que o substrato compreende pelo menos uma região de entrada de amostra (a) com dimensões de 0,2 a 5,0 cm, fluidamente conectada a pelo menos um canal microfluídico (b) com 2,0 a 30,0 cm de comprimento;

ii) uma camada de um material com característica hidrofóbica.

[0012] Em um segundo objeto, a presente invenção apresenta um processo de produção de um dispositivo compreendendo:

i) fabricação dos canais microfluídicos (b) e da região de entrada de amostra (a) em um substrato de material poroso;

ii) uma etapa de deposição de uma camada de um material com característica hidrofóbica no substrato de material poroso.

[0013] Em um terceiro objeto, a presente invenção apresenta um método de aferição do tempo de coagulação sanguínea de um indivíduo compreendendo: i) Adicionar uma amostra de sangue do indivíduo na região de entrada de amostra (a) de um dispositivo conforme definido acima;

ii) Detectar o momento de cessamento do fluxo sanguíneo ao longo do percurso do canal microfluídico (b);

iii) Calcular o tempo que transcorre desde a adição de uma amostra de sangue na etapa i até a detecção do momento de cessamento do fluxo sanguíneo na etapa ii.

[0014] Em um quarto objeto, a presente invenção apresenta um kit compreendendo um dispositivo conforme definido acima e pelo menos uma lanceta.

[0015] Estes e outros objetos da invenção serão imediatamente valorizados pelos versados na arte e serão descritos detalhadamente a seguir.

Breve Descrição das Figuras

[0016] São apresentadas as seguintes figuras:

[0017] A Figura 1 mostra um esquema de como foi desenvolvido o dispositivo analítico da presente invenção. [0018] A Figura 2 mostra uma concretização do dispositivo analítico microfluídico desenvolvido em triplicata (A, B, C) para análise de resultados para validação. O dispositivo contém diâmetro de 10 cm de largura por 20 cm de comprimento. O poço circular de 2 cm para orifício da entrada de ar, depósito e fixação do reagente de TP e também local de entrada da amostra de sangue total está representado por (a); (b) refere-se ao percurso de fluxo da amostra em contato com reagente pré-fixado, canal retangular medindo 10 cm que conta com orifício ao seu fim para a saída de ar e serve para visualização do escoamento do fluxo da amostra e detecção de tempo, cronometrado a partir do primeiro contato com a amostra; e a posição (c) representa micro canais que são utilizados com guia de coagulação.

[0019] A Figura 3 mostra o Gráfico de Bland-AItman para o tempo, em se avalia a concordância entre a mensuração pelo uso do dispositivo e do equipamento padrão utilizado para essa técnica. A linha contínua apresenta a média das diferenças e as linhas tracejadas representam os limites inferiores e superiores (±2DP).

[0020] A Figura 4 mostra o gráfico de Bland-AItman para RNI, em que há uma comparação entre a mensuração pelo uso do dispositivo e do equipamento. A linha contínua apresenta a média das diferenças e as linhas tracejadas representam os limites superiores e inferiores (±2DP).

[0021] A Figura 5 mostra o teste visual em triplicatas iguais no dispositivo, de paciente em uso de anticoagulante oral sendo que todos os testes concordam no tempo e na corrida amostrai visual.

[0022] A Figura 6 mostra o teste visual de sangue de paciente em acompanhamento pós-operatório sendo que todos os testes concordam de maneira que o plasma flui mais no dispositivo.

[0023] A Figura 7 mostra os testes excluídos da análise estatística por problema no canal.

[0024] A figura 8 mostra o design do dispositivo 2 com as dimensões em milímetros. [0025] A figura 9 mostra a comparação entre a mensuração pelo uso do dispositivo e do equipamento. A linha sólida apresenta a média das diferenças; linhas tracejadas, os limites inferiores e superiores (±2DP).

Descrição Detalhada da Invenção

[0026] A presente invenção descreve um dispositivo analítico para determinação do tempo de protrombina à beira do leito como uma alternativa para os atuais testes utilizados que pode reduzir o custo e o tempo de análise, ao mesmo tempo em que facilita a execução, mantendo a segurança. Assim, a redução no tempo pode impactar de forma positiva o gerenciamento dos distúrbios de coagulação.

[0027] A barreira hidrofóbica é uma característica essencial do dispositivo, pois garante o fluxo lateral dos fluidos no canal microfluídico.

[0028] A presente invenção apresenta como vantagens o fato de ser acessível, uma vez que o dispositivo é de baixo custo. O dispositivo apresenta custo- benefício mais razoável para o usuário final e para os locais que investirem na ferramenta de análise. Além disso, o tempo de execução do teste não ultrapassa os 40 segundos, uma vez que este é o limite máximo de detecção do dispositivo da presente invenção. Sendo assim, é possível executar um elevado número de análises, se comparado ao processamento necessário em uma rotina laboratorial com tempo médio de 2 h sob urgência e até 24 h em caso de controle terapêutico.

[0029] Além disso, as análises executadas a partir do dispositivo da presente invenção dispensam o uso de equipamentos, uma vez que trata-se de um dispositivo que dependente de um observador para acompanhamento do fluxo amostrai e cronometragem. Por fim, o dispositivo analítico da presente invenção agiliza o procedimento de determinação do tempo de protrombina e diminui o volume amostrai.

[0030] Em um primeiro objeto, a presente invenção apresenta um dispositivo para teste de coagulação sanguínea compreendendo: i) um substrato de material poroso, em que o substrato compreende pelo menos uma região de entrada de amostra (a) com dimensões de 0,2 a 5,0 cm, fluidamente conectada a pelo menos um canal microfluídico (b) com 2,0 a 30,0 cm de comprimento;

ii) uma camada de um material com característica hidrofóbica.

[0031] Em uma concretização, o material poroso está impregnado com pelo menos um modulador de coagulação.

[0032] Em uma concretização, o modulador de coagulação é uma fonte de tromboplastina.

[0033] Em uma concretização, o material poroso possui taxa de vazão entre 100 a 200 mm de água por 30 min e porosidade entre 6 a 30 mícrons, em que os poros são homogeneamente distribuídos no material.

[0034] Em uma concretização, o material poroso tem uma porosidade de 11 mícrons e uma taxa de vazão de 130 mm de água por 30min.

[0035] Em uma concretização, o material poroso é papel cromatográfico, papel de filtro ou papel de nitrocelulose. Em uma concretização, o material poroso é papel cromatográfico.

[0036] Em uma concretização, a região de entrada de amostra (a) tem dimensões de 0,5 a 1 ,0 cm. Em uma concretização, a região de entrada de amostra (a) possui forma circular ou triangular.

[0037] Em uma concretização, o canal microfluídico (b) possui comprimento de 4,0 a 10,0 cm.

[0038] Em uma concretização, a camada de um material com característica hidrofóbica é cera, PDMS, polímeros, sílica, vidro ou metais. Em uma concretização o material com característica hidrofóbica é cera ou PDMS.

[0039] Em uma concretização, o dispositivo compreende uma camada externa de plástico ou vidro.

[0040] Em um segundo objeto, a presente invenção apresenta um processo de produção de um dispositivo compreendendo:

i) fabricação dos canais microfluídicos (b) e da região de entrada de amostra (a) em um substrato de material poroso;

ii) uma etapa de deposição de uma camada de um material com característica hidrofóbica no substrato de material poroso.

[0041] Em uma concretização, o processo compreende uma etapa adicional de impregnação de um modulador de coagulação no substrato de material poroso. Em uma concretização, o modulador é impregnado em um canal microfluídico.

[0042] Em uma concretização, o processo compreende uma etapa adicional de laminação do substrato.

[0043] Em um terceiro objeto, a presente invenção apresenta um método de aferição do tempo de coagulação sanguínea de um indivíduo compreendendo: i) Adicionar uma amostra de sangue do indivíduo na região de entrada de amostra (a) de um dispositivo conforme definido acima;

ii) Detectar o momento de cessamento do fluxo sanguíneo ao longo do percurso do canal microfluídico (b);

iii) Calcular o tempo que transcorre desde a adição de uma amostra de sangue na etapa i até a detecção do momento de cessamento do fluxo sanguíneo na etapa ii.

[0044] Em uma concretização, a etapa ii utiliza um sistema de detecção visual, óptica, digital ou elétrica para identificar o momento de cessamento do fluxo sanguíneo.

[0045] Em um quarto objeto, a presente invenção apresenta um kit compreendendo um dispositivo conforme definido acima e pelo menos uma lanceta.

[0046] Em uma concretização, o kit compreende um desinfetante.

[0047] Entende-se por lanceta, um material estéril para obter amostras de sangue para testes sanguíneos, em que as amostras de sangue são obtidas através do dedo ou de áreas alternativas.

[0048] Entende-se por desinfetante, qualquer material capaz de desinfetar uma seção da pele. Uma lista não exaustiva compreende algodão impregnado com álcool, swab de lenço umedecido com álcool etc.. [0049] Em uma concretização, o dispositivo apresenta um substrato único com barreiras de um material com características hidrofóbicas e um design específico que força um fluxo contínuo no decorrer do canal.

[0050] Em uma concretização, o dispositivo usa um ativador da cascata da coagulação para determinação de um teste laboratorial: tempo de protrombina. O resultado do dispositivo é dado em relação ao tempo exato de migração do sangue e não pela distância percorrida em um determinado tempo. Na concretização, em que é utilizado um modulador de coagulação, mais especificamente um ativador de coagulação, o resultado do teste de coagulação sanguínea é entregue em um prazo mais curto.

[0051] Na presente invenção, o termo “momento de cessamento” do fluxo sanguíneo se refere ao momento que a viscosidade do sangue modifica no decorrer do teste (resultado do processo de coagulação) e assim a velocidade modifica. Com a modificação da velocidade temos uma estabilização do fluxo capilar e assim é determinado o tempo de coagulação.

[0052] O dispositivo desenvolvido pode ser coberto para manter o fluxo da amostra, contudo é necessário que permaneça uma camada de ar entre o papel e o material utilizado para cobertura.

[0053] A camada de um material hidrofóbico permite que o sangue flua, de forma a facilitar a identificação do momento que o sangue cessa de fluir no canal microfluídico, ou seja, do momento de cessamento do fluxo sanguíneo.

[0054] O tamanho do poro é crucial porque ele deve permitir a passagem somente das células do sangue e deve reter os coágulos. Se o poro for muito pequeno ele irá reter as células também o que impacta na velocidade de fluidez dificultando o teste.

[0055] A presente invenção define as seguintes cláusulas:

[0056] Cláusula 1. Dispositivo para teste de coagulação sanguínea caracterizado por compreender:

i) um substrato de material poroso, em que o substrato compreende pelo menos uma região de entrada de amostra (a) com dimensões de 0,2 a 5,0 cm, fluidamente conectada a pelo menos um canal microfluídico (b) com 2,0 a 30,0 cm de comprimento;

ii) uma camada de um material com característica hidrofóbica.

[0057] Cláusula 2. Dispositivo, de acordo com a cláusula 1 , caracterizado pelo material poroso ser impregnado com pelo menos um modulador de coagulação.

[0058] Cláusula 3. Dispositivo, de acordo com a cláusula 2, caracterizado pelo modulador de coagulação ser uma fonte de tromboplastina.

[0059] Cláusula 4. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, caracterizado pelo material poroso possuir taxa de vazão entre 100 a 200 mm de água por 30 min e porosidade entre 6 a 30 mícrons, em que os poros são homogeneamente distribuídos no material.

[0060] Cláusula 5. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, caracterizado pelo material poroso ser papel cromatográfico, de filtro ou de nitrocelulose.

[0061] Cláusula 6. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, caracterizado pela região de entrada de amostra (a) ter dimensões de 0,5 a 1 ,0 cm.

[0062] Cláusula 7. Dispositivo, de acordo com a cláusula 6, caracterizado pela região de entrada de amostra (a) possuir forma circular ou triangular.

[0063] Cláusula 8. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, caracterizado pelo canal microfluídico (b) possuir comprimento de 4,0 a 10,0 cm.

[0064] Cláusula 9. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, caracterizado pela camada de um material com característica hidrofóbica ser cera, PDMS, polímeros, sílica, vidro ou metais.

[0065] Cláusula 10. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, caracterizado por compreender uma camada externa de plástico ou vidro.

[0066] Cláusula 1 1. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, caracterizado pela camada externa compreender um orifício para passagem de ar, na região de entrada de amostra (a) e na região distai do canal microfluídico (b).

[0067] Cláusula 12. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, caracterizado por compreender pelo menos 3 canais microfluídicos (b).

[0068] Cláusula 13. Dispositivo, de acordo com qualquer uma das cláusulas anteriores, caracterizado por compreender canaletas perpendiculares (c) ao canal microfluídico (b).

[0069] Cláusula 14. Processo de produção do dispositivo, conforme definido em qualquer uma das cláusulas anteriores, caracterizado por compreender: i) fabricação dos canais microfluídicos (b) e da região de entrada de amostra (a) em um substrato de material poroso;

ii) uma etapa de deposição de uma camada de um material com característica hidrofóbica no substrato de material poroso.

[0070] Cláusula 15. Processo de produção do dispositivo, de acordo com a cláusula 14, caracterizado pela etapa de fabricação ser realizada por método de impressão com uso de impressora a jato de cera.

[0071] Cláusula 16. Processo de produção do dispositivo, de acordo com a cláusula 14 ou 15, caracterizado pela etapa de deposição de uma camada de um material com característica hidrofóbica ser realizada por método de impressão com uso de impressora a jato de cera.

[0072] Cláusula 17. Processo de produção, de acordo com qualquer uma das cláusulas 14 a 16, caracterizado por compreender uma etapa adicional de impregnação de um modulador de coagulação na substrato de material poroso.

[0073] Cláusula 18. Processo de produção, de acordo com qualquer uma das cláusulas 14 a 17, caracterizado por compreender uma etapa adicional de laminação do substrato.

[0074] Cláusula 19. Processo de produção, de acordo com a cláusula 18, caracterizado pela etapa de laminação ser realizada em uma laminadora, em que o substrato é inserido dentro de um plástico, e dentro da laminadora o plástico adere à superfície da placa.

[0075] Cláusula 20. Método de aferição do tempo de coagulação sanguínea de um indivíduo caracterizado por compreender:

i) Adicionar uma amostra de sangue do indivíduo na região de entrada de amostra (a) de um dispositivo conforme definido em qualquer uma das cláusulas 1 a 13;

ii) Detectar o momento de cessamento do fluxo sanguíneo ao longo do percurso do canal microfluídico (b);

iii) Calcular o tempo que transcorre desde a adição de uma amostra de sangue na etapa i até a detecção do momento de cessamento do fluxo sanguíneo na etapa ii.

[0076] Cláusula 21. Método, de acordo com a cláusula 20, caracterizado pela etapa ii utilizar um sistema de detecção visual, óptica, digital ou elétrica para identificar o momento de cessamento do fluxo sanguíneo.

[0077] Cláusula 22. Kit caracterizado por compreender um dispositivo conforme definido em qualquer uma das cláusulas 1 a 13 e pelo menos uma lanceta.

[0078] Cláusula 23. Kit, de acordo com a cláusula 22, caracterizado por compreender um swab de lenço umedecido com álcool.

[0079] Cláusula 24. Kit, de acordo com a cláusula 22 ou 23, caracterizado por ser para Point of Care.

[0080] Cláusula 25. Kit, de acordo com qualquer uma das cláusulas 22 a 24, caracterizado por compreender um dispositivo de processamento de imagem. Nessa concretização, o dispositivo de processamento de imagem pode ser utilizado para auxiliar na identificação do momento de parada do fluxo sanguíneo.

[0081] Cláusula 26. Uso de um dispositivo conforme definido em qualquer uma das cláusulas 1 a 13, caracterizado por ser para detectar o tempo que o sangue demora a coagular quando em contato com uma fonte de tromboplastina.

[0082] Cláusula 27. Uso de um dispositivo, de acordo com a cláusula 26, caracterizado por ser para calcular o tempo de protrombina.

Exemplos

[0083] Os exemplos aqui mostrados têm o intuito somente de exemplificar uma das inúmeras maneiras de se realizar a invenção, contudo sem limitar, o escopo da mesma.

[0084] As dimensões geométricas citadas nessa invenção foram padronizadas para fabricação dos dispositivos validados, porém podem ser ajustadas conforme a quantidade amostrai utilizada em cada teste, lavando em consideração o princípio de canal microfluídico. Como por exemplo, se a quantidade amostrai for menor de 20 mI, o canal analítico terá menos que 5 cm, porque a proporcionalidade do canal em relação a quantidade amostrai pode ser referenciada por essa invenção.

Exemplo 1 - Desenvolvimento do dispositivo 1

[0085] Primeiramente foi realizado o desenvolvimento do dispositivo analítico com canal microfluídico. Desenhou-se os canais em Autocad 3D conforme diâmetros testados previamente e analisados de acordo com o melhor desempenho em fluidez da amostra, reagentes e homogeneização (Figura 1 ).

[0086] O dispositivo compreende diâmetro de 10 cm de largura por 20 cm de comprimento. O poço circular de 2 cm para orifício da entrada de ar, depósito e fixação do reagente de TP e também local de entrada da amostra de sangue total (a). O dispositivo também apresenta um percurso de fluxo da amostra em contato com reagente pré-fixado, canal retangular medindo 10 cm que conta com orifício ao seu fim para a saída de ar e serve para visualização do escoamento do fluxo da amostra e detecção de tempo, cronometrado a partir do primeiro contato com a amostra (b); e apresenta canais microfluídicos que são utilizados com guia de coagulação (c). Todas as paredes dos canais de ligação contam com a capilaridade - barreira adquirida pela material hidrofóbico- que contribui para o fluxo da amostra somente pelo canal designado (Figura 2).

[0087] Imprimiu-se os dispositivos em papel cromatográfico Whatman® (o mais utilizado para aplicações de rotina com retenção e taxa de fluxo médias, cobrindo uma vasta gama de aplicações laboratoriais) por impressora Colorqube® a jato de cera da Xerox®, incubados por 90 segundos à 140 °C para fixação da cera no papel, que tem importante aplicabilidade como barreira hidrofóbica, permitindo que a amostra percorra apenas o canal delimitado por ela.

[0088] Após a produção do dispositivo, foi feita a laminação para submeter pressão sobre o canal, e utilizando um furador, uma entrada e saída de ar no canal, permitindo assim que a amostra escoasse dele. A impregnação à 37 °C de 10uL reagente de TP foi feita 20 minutos antes dos testes potenciais de guia para coagulação e diagnóstico.

Exemplo 2 - Análise do Tempo de Protrombina (TP)

[0089] O estudo realizado para validação do sistema foi um estudo transversal que fornece informações de prevalência, é útil para descrever variáveis e seus padrões de distribuição e todas as medições são realizadas em um único momento, sem período de seguimento. A hipótese é de que dispositivo analítico microfluídico para avaliação do TP se correlacionar com o equipamento automatizado para determinação do TP.

[0090] Amostras de sangue total foram obtidas nos laboratórios de um hospital da região do Vale do Rio dos Sinos, RS, Brasil. Foram incluídos no estudo pacientes que apresentaram solicitação de TP entre abril e junho de 2018. Excluíram-se as amostras que apresentaram algum interferente já identificado para o teste do TP (hemólise, proporção entre anticoagulante de amostra não respeitadas no tubo).

[0091] Para o cálculo do tamanho amostrai foi utilizado o software (PASS 16, 2018). O cálculo foi realizado com base na sensibilidade. Foram utilizados como referência para esse cálculo uma sensibilidade de 80%, poder de 81 %, nível de significância de 0,0044 e prevalência de TP alterado de 50% na população-alvo. Assim o número de indivíduos obtido no cálculo foi de 98 amostras (BUJAN; ADNAN, 2017), somando 10% de perda amostrai. O número de indivíduos pesquisados resultou em 108 amostras.

[0092] A coleta de sangue venoso é cotidianamente realizada pelos profissionais do HFSNH em tubo de Citrato de Sódio tamponado 0,109 mol/L e 0,105 mol/L (3,2%), na proporção de nove partes de sangue para uma parte de solução de Citrato, conforme recomendado pelo Instituto de Normas Clínicas e de Laboratório (CLSI).

[0093] Antes da centrifugação para separação do plasma utilizado na realização do teste padrão de TP no equipamento de laboratório, separou-se uma alíquota (30 pL) par execução do teste no dispositivo proposto. Por isso, incluiu-se no estudo somente as amostras que tiveram um volume mínimo de 2 mL, considerando que estas possuíam as concentrações ideais para os testes.

[0094] O teste no dispositivo inicia no momento em que a amostra de sangue total estiver em contato com o papel, nesse momento deve-se iniciar a cronometragem. A cronometragem é pausada na primeira parada do volume de 10 pL da amostragem ou quando o observador não é mais capaz de observar o escoamento fluxo da amostra, determinado previamente devido à proporção em relação ao volume do reagente impregnado. O reagente impregnado é a tromboplastina. Todos os testes são feitos em triplicata, conforme indicado pelo Ministério da Saúde (Brasil, 2012b). Portanto, cada dispositivo conta com três canais comparativos.

Exemplo 3 - Resultados

[0095] Para a avaliação, foi feita a impregnação de 10 pL do reagente de TP da Bioclin® lote 0029, contendo extrato de cérebro de coelho 2,6%, cloreto de cálcio 23 mmol/L, tampão tricina 75 mmol/L e azida sódica 0,05%, que afeta o processo de coagulação, tornando-o mais rápido, e reverte o estado atual da amostra no tubo com anticoagulante.

[0096] O volume de amostra utilizado para o teste foi na proporção de 1 :1 , ou seja, 10 mI_ de sangue foram utilizados. O volume e o método utilizados foram os que melhor responderam aos testes de amostra em contato com reagente solúvel, reagente solúvel primeiro em contato com a amostra e reagente fixado em temperatura de 37 °C, apresentando melhor desempenho.

[0097] Para validação, 108 amostras foram testadas inicialmente. Do total, 36 foram excluídas por não apresentarem resultados totais em triplicata devido à falta de fluxo necessário de sangue dentro do canal. Sendo assim, 72 amostras foram incluídas na avaliação.

[0098] A amostra testada caracterizou-se por aspectos como idade e gênero dos pacientes. Os resultados foram avaliados em dois aspectos: tempo de coagulação e RNI. Foram feita, também, análises entre observadores e métodos (dispositivo e equipamento padrão ouro). A tabela 1 apresenta os resultados individuais dos testes que foram feitos por dois avaliadores, mas somente um deles foi realizado em duplicata. Todas as amostras foram analisadas pelo teste padrão (equipamento) em realização única. O RNI da análise do dispositivo microfluídico foi calculado com base na média dos tempos encontrados pelo avaliador, que realizou a análise em duplicata. A análise em duplicata serviu, assim, para comparação entre o dispositivo e o teste padrão para a correlação entre os observadores.

[0099] Não houve diferença estatisticamente significativa entre as médias dos resultados de TP e o RNI (teste t p=0,08 e p=0,61 , respectivamente). Os resultados de TP do dispositivo e do equipamento apresentaram fortes concordâncias e são estatisticamente significativos (r=0,890 (0,9), r=0,897 (0,9) e p< 0,001 , respectivamente). Assim, as análises de Bland-AItman apresentaram graficamente (figuras 2 e 3) que os diferentes métodos testados possuem boa concordância. Não houve diferença significativa na comparação entre o TP identificado pelos dois observadores envolvidos no estudo. Esse dado é apresentado tanto pela correlação de Sperman forte e estatisticamente significativa (r=0,93, p=14 segundos) k=0,77 que representa uma concordância substancial. Tabela 1. Resultados individuais dos testes

Exemplo 4 - Análises estatísticas

[0100] Para validação, foram feitas análises estatísticas de correlação entre avaliadores do resultado do dispositivo microfluídico e concordância com o resultado da mesma amostra pelo método tradicional do laboratório.

[0101] Foram realizados os testes estatísticos de: coeficiente de correlação de Spearman, para determinar a correlação entre os dados de tempos e RNI entre dispositivo e equipamento; de Bland-AItman, para determinar a concordância destas medidas de forma gráfica e o teste de Kappa, para determinar a concordância dos resultados normal (até 14 segundos) ou alterado (>14 segundos).

[0102] Não houve diferença estatisticamente significativa na comparação entre TP identificado pelos dois observadores envolvidos no estudo. Esse dado é apresentado tanto pela correlação de Sperman forte e estatisticamente significativa (r = 0,93, p<0,001 ) quanto pela concordância de Kappa (K= 0,77) que representa uma concordância substancial. E também pelos resultados a análise de concordância de dados quantitativos (Bland-AItman) escrita a seguir

[0103] A figura 3 mostra o Gráfico de Bland -Altman para o tempo, em que há uma comparação se avalia a concordância entre a mensuração pelo uso do dispositivo e do equipamento padrão utilizado para esta técnica. O teste t de uma amostra p= 0,8 mostra que não há diferença estatisticamente significativa entre as duas medidas, ou seja, as duas formas de mensuração concordam, uma vez que quanto maior o valor de p, menor a diferença.

[0033] A figura 4 mostra o gráfico de Bland-AItman para RNI , em que há uma comparação avaliação da concordância entre a mensuração pelo uso do dispositivo e do equipamento. O teste t de uma amostra p= 0,61 mostra que não há diferença estatisticamente significativa entre as duas medidas, ou seja, as duas formas de mensuração concordam entre si.

[0104] As comparações para cálculo de sensibilidade e especificidade foram feitas levando em consideração o resultado quantitativo do teste padrão, que é considerado normal quando o resultado estiver entre 10 e 14 segundos e alterado quando estiver fora desse intervalo.

[0105] O padrão ouro para os cálculos de sensibilidade e especificidade foi o TP no equipamento Tcoag®. O resultado do dispositivo foi calculado com base na porcentagem de coagulação, interpretado como atividade de coagulação menor que 100% (TP menor que 10 segundos), 100% (TP entre 10 à 14 segundos) e acima de 100% (TP maior que 10 segundos), e RNI = (TP paciente / TP normal), relação normatizada internacional, relação de tempos entre o TP do paciente e o TP do controle normal, ideal para controle terapêutico.

[0106] Os valores de“normalidade” de RNI são usualmente inferior a 1 ,0 e pacientes que já apresentaram distúrbios de coagulação e estão em uso de terapia de anticoagulação oral tem como alvo terapêutico (ou seja, faixa de resultado desejado para avaliar a eficácia da terapia) valores entre 2,0 e 3,0. No geral, quanto menor o valor de RNI menor a coagulação e maior o TP, quanto maior o valor de RNI maior coagulação e menor o TP, portanto o resultado de RNI é inversamente proporcional ao tempo de protrombina (TP).

[0107] Um alto tempo de protrombina (TP > 14 segundos) pode representar distúrbios coagulatórios como hemofilias e doenças do fígado, enquanto um baixo tempo de protrombina (TP<10 segundos) pode representar distúrbios como risco de formação de coágulos.

[0108] Esses valores estão apresentados com seus respectivos intervalos de confiança de 95%, e as médias de tempo e RNI calculadas a partir do teste t, que é uma análise estatística cujo objetivo é verificar a hipótese das diferenças entre duas médias sob a hipótese nula de que elas são iguais, a partir da probabilidade do erro. Em estudos de validação, é o mais utilizado. (RIBEIRO; CARDOSO, 2009). Ainda é apresentada a estatística descritiva dos pacientes quanto à idade e sexo. Todos os dados foram passados e analisados no Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) v. 22, exceto as análises de Bland-AItman, feitas em Excel.

Considerações visuais [0109] A especificidade e sensibilidade dos dispositivos também compreende a avaliação visual pela condição da amostra em atingir os mesmos resultados na triplicata, sendo alvo de exclusão quando não atingir. Houve diferença visual significativa no comportamento sanguíneo de pacientes em controle terapêutico em pós-operatório, conforme pode ser visto nas Figuras 5 e 6. Enquanto na Figura 7, é mostrado teste visual que foi excluído das análises estatísticas por demonstram problema no canal.

[0110] A fluidez da amostra no dispositivo está relacionada ao estado de coagulação do paciente. Quanto mais o sangue fluir menos ativadas estão as reações enzimáticas que fazem a coagulação acontecer, ou seja, mais anticoagulado o paciente se encontra. Ao contrário, quanto menos o sangue fluir mais ativadas estão estas reações e mais pró-coagulado está o paciente. Assim, a qualidade do teste independe da velocidade de corrida sobre o papel. Exemplo 5 - Desenvolvimento do dispositivo 2

[0111] A metodologia de fabricação do dispositivo não foi alterada, os canais do dispositivo microfluídico são desenhados em Autocad 3D, imprime-se os dispositivos em papel cromatográfico Whatman® por impressora Colorqube® a jato de cera da Xerox® e em seguida o papel é exposto à calor para gerar a barreira hidrofóbica necessária para o direcionamento do fluxo. Na sequência é feita a plastificação do dispositivo com laminadora.

[0112] Em relação ao design algumas modificações foram feitas:

[0113] O tamanho do dispositivo foi reduzido. Levando em consideração a quantidade de amostra depositada no canal o tamanho foi reduzido, uma vez que foi identificado que para o funcionamento do dispositivo não era necessário 10 cm. Assim este passou a medir 5,5 cm (Figura 8).

[0114] Foram adicionadas mini canaletas acima do design. Estas facilitaram a identificação da parada do fluxo sanguíneo no canal (Figura 8), que é a forma de identificar o tempo de protrombina (coagulação sanguínea).

[0115] A forma geométrica do reservatório de entrada da amostra foi alterada. Inicialmente era um reservatório circular (Figura 2) e este foi modificado para forma triangular (Figura 8). Essa modificação impactou em melhorias na entrada da amostra no canal.

Exemplo 6 - Validação do dispositivo 2

[0116] Foram feitas novas validações clínicas com o design modificado. Trata- se de um estudo multicêntrico, aprovado pelo comité de ética em pesquisa Brasileira da Universidade proponente e do laboratório de dois Hospital da região do Vale do Rio dos Sinos onde os testes foram conduzidos. As amostras de sangue total foram obtidas nos laboratórios de dois Hospitais da Região do Vale do Rio dos Sinos, Rio Grande do Sul/Brasil. Foram incluídos no estudo 145 pacientes que apresentaram solicitação de Tempo de Protrombina (TP) de junho a novembro de 2019. Não foram incluídas as amostras que apresentaram algum interferente já identificado para o teste do TP (hemólise, proporção de anticoagulante e amostra não respeitadas no tubo).

[0117] O funcionamento do dispositivo segue igual conforme descrito na primeira versão do dispositivo. São depositados 10 pL de reagente para tempo de protrombina (contendo como componentes chaves extrato de cérebro de coelho e cloreto de cálcio) sobre o papel e é aguardado 1 minuto para absorção deste. Na sequência 10 mI de sangue são depositados sobre o dispositivo e a cronometragem é iniciada. O tempo de protrombina é determinado quando o fluxo sanguíneo no dispositivo é modificado a ponto de reduzir significativamente a sua velocidade e ser possível assim identificar a parada deste. Essa estabilização de fluxo do sangue é explicada pela formação de coágulos que bloqueiam os poros do papel impedindo o fluxo capilar.

[0118] Para validação os testes foram realizados em triplicata, conforme indicado pelo Ministério da Saúde. (BRASIL, 2012b). Para fins de comparação foi realizada uma média das três medidas de tempo de protrombina. As análises de Bland-AItman e Coeficiente de Correlação Intraclasse (ICC) foram utilizadas para avaliar a concordância a partir da natureza quantitativas das variáveis tempo de protrombina e RNI. A relação foi feita tendo como“teste” tempo avaliado pelo dispositivo microfluídico e como padrão ouro a técnica de turbidimetria através do equipamento TCoag®.

[0119] Os resultados de RNI e Tempo de Protrombina apresentaram excelentes concordâncias segundo o resultados de ICC, para RNI 0,89 IC 95% (0,86 - 0,92) e para tempo 0,88 IC 95% (0,84 - 0,91 ). As análises gráficas de Bland-AItman reforçam visualmente a concordância entre os métodos. (Figura 9).

[0120] Os versados na arte valorizarão os conhecimentos aqui apresentados e poderão reproduzir a invenção nas modalidades apresentadas e em outras variantes e alternativas, abrangidas pelo escopo das reivindicações a seguir.