Melioidose) und Burkholderia mallei (Erreger des Rotzes)

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Diagnose von Infektionen mit Burkholderia pseudomallei (Erreger der Melioidose) und Burkholderia mallei und hiermit in Verbindung stehende Peptid- und Proteinsequenzen.

Hintergrund der Erfindung

Das Umweltbakterium Burkholderia pseudomallei ist der Erreger der oft tödlich verlaufenden Infektionskrankheit Melioidose, die vor allem/gehäuft in den sub tropischen und tropischen Gebieten beim Menschen und bei Tieren vorkommt.

Infektionen werden durch Kontakt mit dem Erreger in der Umwelt erworben. Die Krankheit ist ein bedeutendes Problem für das Gesundheitssystem, da neueste Schätzungen von mehr als 165.000 weltweit Infizierten pro Jahr aus gehen, von denen 89.000 sterben. Diese Zahlen unterscheiden sich massiv von den gemeldeten Fällen, was unter anderem an der unzureichenden Sensi- tivität der aktuell verwendeten diagnostischen Tests sowohl für den Erreger nachweis als auch den Nachweis einer Antikörperantwort gegen den Erreger liegt.

Burkholderia mallei, der Krankheitserreger der weltweit vorkommenden Tier seuche Rotz, ist ein naher Verwandter von B. pseudomallei. Er unterscheidet sich unter anderem dahingehend, dass es kein Umweltreservoir gibt und er ein deutlich kleineres Wirtsspektrum hat. Infektionen werden von Tier zu Tier oder auch vom Tier auf den Menschen übertragen. Der spezifische Erregernachweis leidet unter ähnlichen Problemen wie bei B. pseudomaller, im Falle der Serolo gie sind Sensitivität, Spezifität und Standardisierung problematisch. Dem Test der Komplementbindungsreaktion kommt hierbei eine spezielle Bedeutung zu, da er der einzige durch die World Organisation for Animal Health (OIE) zuge lassene Test für den internationalen Tierhandel ist. Seine mäßige diagnosti sche Leistung ist insofern problematisch, als dass falsch positive Ergebnisse potenziell zum Keulen der Tiere führen und somit auch die Besitzer finanziell schädigt (Rennpferde etc.). Weiterhin führen falsch-negative Ergebnisse zur potenziellen Wiedereinführung der Krankheit in nicht-endemischen Ländern.

Figuren

Figur 1 zeigt die Sequenzen SEQ ID No. 1-4.

Figur 2 zeigt die Sequenzen SEQ ID No. 5-8.

Figur 3A und 3B zeigen Ergebnisse eines Lateral Flow Assay zur Diagnose von Burkholderia pseudomallei Infektionen.

Figur 4A und 4B zeigen Ergebnisse eines Lateral Flow Assay zur Diagnose von Burkholderia mallei Infektionen.

Kurzdarstellung der Erfindung

Es besteht somit Bedarf nach weiteren diagnostischen Tests zur Diagnose von Infektionen mit Burkholderia pseudomallei (Erreger der Melioidose) und Burk holderia mallei (Erreger des Rotzes).

Aufgabe der frühen Erfindung war es, solche weiteren diagnostische Tests be reitzustellen, die vorzugsweise einige Nachteile des Standes der Technik über winden.

Gelöst wird die Aufgabe durch ein Verfahren zur Diagnose von Burkholderia pseudomallei Infektionen und/oder Burkholderia mallei Infektionen umfassend die Schritte

- Bereitstellen einer Blut- oder Serumprobe eines Patienten enthaltend Antikörper

- Inkontaktbringen der Blut- oder Serumprobe mit mindestens 2 Antige nen ausgewählt aus der Gruppe Al bis A8, wobei

• Al ein Peptid ist, das eine Sequenz mit mindestens 98% Se quenzhomologie zu SEQ ID. No. 1 aufweist • A2 ein Peptid ist, das eine Sequenz mit mindestens 98% Se quenzhomologie zu SEQ ID. No. 2 aufweist

• A3 ein Peptid ist, das eine Sequenz mit mindestens 98% Se quenzhomologie zu SEQ ID. No. 3 aufweist

• A4 ein Peptid ist, das eine Sequenz mit mindestens 98% Se quenzhomologie zu SEQ ID. No. 4 aufweist

• A5 ein Peptid ist, das eine Sequenz mit mindestens 98% Se quenzhomologie zu SEQ ID. No. 5 aufweist

• A6 ein Peptid ist, das eine Sequenz mit mindestens 98% Se quenzhomologie zu SEQ ID. No. 6 aufweist

• A7 ein Peptid ist, das eine Sequenz mit mindestens 98% Se quenzhomologie zu SEQ ID. No. 7 aufweist

• A8 ein Peptid ist, das eine Sequenz mit mindestens 98% Se quenzhomologie zu SEQ ID. No. 8 aufweist

- Bestimmung der Bindung von Antikörpern der Blut- oder Serumprobe mit den mindestens 2 Antigenen, wobei mindestens A3 zur Diagnose von Infektionen mit Burkholderia mallei und mindestens A8 zur Diagno se von Infektionen mit Burkholderia pseudomallei gemessen wird.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Studien deuten stark darauf hin, dass die Antikörperantwort von verschiede nen Individuen außerordentlich divers ausfällt. Trotzdem war es erfindungs gemäß möglich, Antigene zu identifizieren, die einen zuverlässigen Test erlau ben.

Das erfindungsgemäße Verfahren erreicht hervorragende Sensitivitäten und Spezifitäten, bevorzugt oberhalb von jeweils 98%.

Die Sensitivität gibt den Anteil der korrekt als positiv klassifizierten Objekte an der Gesamtheit der tatsächlich positiven Objekte an.

Die Spezifität gibt den Anteil der korrekt als negativ klassifizierten Objekte an der Gesamtheit der in Wirklichkeit negativen Objekte an. Die Experimente zeigen eine Sensitivität von 90-92% und Spezifität von 97- 100%.

Erfindungsgemäß werden mindestens 2 Antigene eingesetzt. Im Rahmen die ser Anmeldung ist ein Antigen als ein Peptid definiert, dass eine mindestens 98%ige Sequenzhomologie zu einer spezifischen Sequenz aufweist. Soweit im Folgenden auf ein Antigen Al bis A8 Bezug genommen wird, bedeutet Al die Gruppe aller Sequenzen, die eine mindestens 98%ige Sequenzhomologie zur SEQ ID No. 1, A2 die Gruppe aller Sequenzen, die eine mindestens 98%ige Sequenzhomologie zur SEQ ID No. 2 aufweisen etc.

Peptid im Sinne dieser Anmeldung ist ein Polymer von Aminosäuren ohne exakte Größenbeschränkung. Die Begriffe "Peptid" oder "Protein" werden in diesem Text synonym verwendet.

Mit den erfindungsgemäßen Antigenen kann geprüft werden, ob es Antikörper in der Probe gibt.

Die Bindung zwischen den Antigenen und entsprechenden Antikörpern kann in dem Fachmann bekannter Art und Weise nachgewiesen werden. Beispiele sind Immunoassays wie ELISA oder Lateral Flow Assays also auch Proteinmikro- arrays, partikelbasierte Assays wie Turbidimetrie oder Luminex Assays. Es ist vorteilhaft, wenn diese ökonomisch sind und dezentral einsetzbar sind. Die Verwendung in Form eines Lateral Flow Assay ist besonders bevorzugt.

Wenn eine Diagnose von Burkholderia mallei Infektionen erfolgen soll, werden bevorzugt Antigene aus der Gruppe Al, A2, A3 und A4 verwendet, wobei in einer zumindest A3 gemessen wird. Bevorzugt werden mindestens zwei Anti gene, mehr bevorzugt drei oder vier Antigene aus der Gruppe Al, A2, A3 und A4 eingesetzt.

Wenn eine Diagnose von Burkholderia pseudomallei Infektionen erfolgen soll, werden bevorzugt Antigene aus der Gruppe A5, A6, A7 und A8 verwendet, wobei zumindest A8 gemessen wird. Bevorzugt werden mindestens zwei Anti- gene, mehr bevorzugt drei oder vier Antigene aus der Gruppe A5, A6, A7 und A8 eingesetzt.

In einer Ausführungsform der Erfindung werden mindestens 3 oder genau 3 Antigene bestimmt.

In einer Ausführungsform der Erfindung werden mindestens 4 oder genau 4 Antigene bestimmt.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden mindestens 5 oder genau 5 Antigene bestimmt.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden mindestens 6 oder genau 6 Antigene bestimmt.

In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung werden mindestens 7 oder genau 7 Antigene bestimmt.

In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden alle 8 oder genau 8 Antigene bestimmt.

Grundsätzlich können erfindungsgemäß auch weitere Antigene die gleiche Messung einbezogen werden.

Während es möglich ist, dass weitere Antigene gemessen werden, ist es erfin dungsgemäß bevorzugt, dass keine Antigene gemessen werden, die nicht un ter die Definition von A1-A8 fallen.

Während es erfindungsgemäß genügt, dass die Antigene eine 98-prozentige Sequenzhomologie zu den entsprechenden SEQ ID No. 1 bis 8 aufweisen, ist es bevorzugt, dass die Sequenzhomologie mindestens 99 % beträgt. Bevor zugt werden Antigene eingesetzt, die exakt die entsprechende Sequenz auf weisen.

Die Sequenzen A2 und A6 haben eine hohe Ähnlichkeit zueinander. Es ist da her möglich, Peptide einzusetzen, die gleichzeitig das Kriterium 98 % Se- quenzhomologie zu beiden Sequenzen erfüllen. Dies gilt dann als Messung so wohl von A2 als auch A6.

Dem Fachmann sind Verfahren zur Bestimmung der Sequenzhomologie be kannt. Sequenzhomologie im Sinne dieser Anmeldung ist prozentuale Identität zwischen zwei Aminosäurecodesequenzen bestimmt mit den Algorithmen von E. Myers und W. Miller (CABIOS, 4: 11-17 (1989)), welcher in das ALIGN- Programm (Version 2.0) eingeht, mit einer PAM120 Wichtungsresttabelle, ei nem Gap-Längen-Penalty von 12 und einem Gap Penalty von 4.

Einige der Sequenzen A1-A8 weisen Übereinstimmungen miteinander auf. In einer bevorzugten Ausführungsform werden nur Antigene zusammen verwen det, die eine Sequenzhomologie kleiner als 90 % zueinander aufweisen.

Ein Verfahren mit mehreren Antigenen erlaubt den gleichzeitigen Nachweis von zwei oder mehr erregerspezifischen Antikörpern gegen Burkholderia pseu domallei bzw. Burkholderia mallei, was die Sensitivität der Tests wie oben be schrieben gegenüber der Bestimmung eines Antikörpers deutlich erhöht. Dabei erhöht jedes zusätzliche positive Testergebnis die Zuverlässigkeit des Ergeb nisses, da ein falsch-positives Ergebnis unwahrscheinlicher wird.

Der Großteil der kodierten Proteine im Genom von B. pseudomallei bzw. B. mallei kommt als Variante in beiden Erregern vor. Aus diesem Grund bietet es sich an, einen serologischen Test zu entwickeln, der beide Erreger abdeckt. Da sich das Expressionsprofil der Erreger aber unterscheidet, war es überra schender Weise möglich, einen Test zu konstruieren, der mittels Detektion von unterschiedlichen komplementären Proteinantigenen die Unterscheidung der Krankheiten Rotz und Melioidose zulässt.

Die getroffene Auswahl der bis zu acht Antigene erlaubt es daher die Erkran kungen Rotz und Melioidose zu unterscheiden, ein Novum im Bereich der Tests für diese beiden Krankheiten, also eine Differentialdiagnose. Der erfindungsgemäße Test ist dem Komplement-Fixierungstest, dem derzeit vorgeschriebenen Test für Rotz, klar überlegen.

Das Verfahren ist auch ein nützliches Werkzeug, um das immer noch unzu reichend untersuchte weltweite Vorkommen der Erreger aufzuklären. Da so wohl B. pseudomallei als auch B. mallei auf der Liste potenzieller Biowaffen stehen, sind spezifische Antikörpernachweise auch für Post-Expositions- Untersuchungen wertvoll.

Weiterhin kann der Test zum Nachweis der Immunität eingesetzt werden. Bevorzugte Kombinationen von Antigenen sind wie folgt.

Wenn zwei Antigene gemessen werden, sind dies bevorzugt

- A2, A3

- A3, A4

- A4, A8

- A5, A8

- A6, A8.

Wenn drei Antigene gemessen werden, sind dies bevorzugt

- A2, A3, A4

- A5, A6, A8

- A3, A4, A5

- A3, A4, A6.

Wenn vier Antigene gemessen werden, sind dies bevorzugt

- Al, A2, A3, A4

- A5, A6, A7, A8

- A2, A3, A4, A5.

Wenn fünf Antigene gemessen werden, sind dies bevorzugt - A2, A3, A4, A5, A6

- A2, A3, A4, A5, A8

- A2, A4, A5, A6, A8

- A3, A4, A5, A6, A8.

Wenn sechs Antigene gemessen werden, sind dies bevorzugt

- A2, A3, A4, A5, A6, A8.

Besonders bevorzugte Kombinationen sind:

- A5, A8

- A5, A6, A8

- A3, A4, A5

- A5, A6, A7, A8

- A2, A3, A4, A5

- A2, A3, A4, A5, A6

- A2, A3, A4, A5, A8

- A2, A4, A5, A6, A8

- A3, A4, A5, A6, A8

- A2, A3, A4, A5, A6, A8.

Beispiele

Die Erfindung wird an den folgenden Beispielen näher erläutert:

Aufbau des Verfahrens als Lateral Flow Assays (LFA)

Ein Lateral Flow bzw. Dipstick Test, der direkt vor Ort bei dem erkrankten Pa tienten bzw. Tier durchgeführt werden kann, bietet große Vorteile in Hinblick auf die Standardisierung und kombiniert diese mit einer hervorragenden diag nostischen Performance. Für die Tests werden die Antigene auf einer Membran immobilisiert. Patienten-Antikörper im Serum werden mit goldmarkiertem Se- kundär-Antikörper markiert, was eine Auswertung der Tests mit freiem Auge ermöglicht. Anschließend diffundieren die markierten Antikörper über die Testmembran, wobei es im Falle von spezifischen Antikörpern gegen die ge spotteten Antigene zu einer Akkumulation der Antikörper auf den Testbanden kommt, welche sich somit rötlich färbt. Im Falle von mindestens einer positi ven Antigen-Testbande wird der Test als positiv bewertet.

Beispiel 1:

Ein LFA, bei dem die 4 Antigene A5-A8 auf die Membran immobilisiert wurden, wurde mit humanen Seren zum Nachweis eine Burkholderia pseudomallei In fektion mit 75 Seren von erkrankten Personen, 100 Seren von gesunden Per sonen und 60 Seren von Patienten, bei denen eine andere Infektion vorlag, validiert. Dazu wurden die Seren in verschiedenen Verdünnungen auf den LFA aufgegeben und das Ergebnis nach 10 Minuten ausgewertet. Das Vorhanden sein einer oder mehrerer Testbanden wurde als positives Ergebnis bewertet und die Abwesenheit aller 4 Testbanden als negatives Ergebnis. Bei einer Pro benverdünnung von 1: 100 wurde eine Sensitivität von 92 % und eine Spezifi tät von 97 % (bei gesunden Patienten) und 100 % (bei Patienten mit anderen Infektionen) erhalten. Die Kontrollen bestehen aus gesunden Personen aus Thailand (n = 100) und deutschen Patienten, die an anderen Infektionen lei den (n = 60)

Die Ergebnisse sind in Figur 3 gezeigt.

Zu sehen sind die Linienintensitäten der 4 verschiedenen Testlinien (T1-T4) eines Lateral Flow Assay zum Nachweis der Melioidose bei dem die Antigene A5-A8 immobilisiert wurden und verschiedenen Proben vermessen wurden (0 = keine Testlinie, G10 = sehr intensiv gefärbte Testlinie). Die Signalstärken des Lateral Flow Assays bei Anwendung von Seren verschiedener Melioidose- Patienten und der Kontrollen ist in Figur 3A für alle vier Proteinantigene ge trennt für drei Bewerter (El, E2, E3) gezeigt. Die semi-quantitativen Ergebnis se für die einzelnen Antigene wurden durch Vergleichen der Testlinien- Intensität (0-10) erhalten. Figur 3B zeigt den Gesamtassay (positiv, wenn mindestens eine Testbande ein Signal zeigt). Beispiel 2:

Ein LFA bei dem die 4 Antigene A1-A4 auf die Membran immobilisiert wurden, wurde mit equinen Seren zum Nachweis eine Burkholderia mallei Infektion mit 30 Seren von erkrankten Pferden und 50 Seren von gesunden Pferden vali diert. Dazu wurden die Seren in verschiedenen Verdünnungen auf den LFA aufgegeben und das Ergebnis nach 10 Minuten ausgewertet. Das Vorhanden sein einer oder mehrerer Testbanden wurde als positives Ergebnis bewertet und die Abwesenheit aller 4 Testbanden als negatives Ergebnis. Bei einer Pro benverdünnung von 1: 100 wurde eine Sensitivität von 90 % und eine Spezifi tät von 100 % erhalten.

Die Ergebnisse sind in Figur 4 gezeigt.

Gezeigt sind die Linienintensitäten der 4 verschiedenen Testlinien eines Lateral Flow Assay zum Nachweis von Rotz bei Pferden bei dem die Antigene immobi lisiert (A1-A4) wurden und verschiedenen Proben vermessen wurden (0= kei ne Testlinie, G10 = sehr intensiv gefärbte Testlinie)

Die Signalstärken des Lateral Flow Assays bei Anwendung von Seren verschie dener positiver Pferdeseren und der Kontrollen ist in Figur 4A für alle vier Pro teinantigene getrennt für drei Bewerter (El, E2, E3) gezeigt. Die semi quantitativen Ergebnisse für die einzelnen Antigene wurden durch Vergleichen der Testlinien Intensität (0-10) erhalten. Figur 4B zeigt den Gesamtassay (po sitiv, wenn mindestens eine Testbande ein Signal zeigt).