STREPTOCOCCUS AGALACTIAE (SGB)

CAMPO DE APLICACIÓN

La presente invención se refiere a un kit de diagnóstico y método para la determinación del patógeno Streptococcus agalactiae (SGB), en mujeres embarazadas desde la semana 34 hasta el parto a través de un antígeno inmunogénico derivado del gen de la proteína inmunogénica de superficie (SIP), presente en todos los serotipos de Streptococcus agalactiae (SGB).

La detección oportuna de este patógeno permite aplicar medidas profilácticas que impiden su transmisión al recién nacido durante el parto. En particular la presente invención tiene relación con un kit de diagnóstico que comprende una combinación de partidores y una sonda derivadas de la secuencia de la proteína SIP de SGB para una técnica basada en PCR (por sus siglas en inglés poiymerase chain reaction) o sus variaciones, y un método para el uso de dicho kit.

ESTADO DEL ARTE

El patógeno Streptococcus agalactiae, también conocido como Streptococcus Grupo B (SGB), es una cocácea Gram positiva que coloniza el tracto gastrointestinal y genitourinario. En la actualidad se conocen diez serotipos de SGB: la, Ib, II, III, IV, V, VI, VII, VIII y IX, siendo el serotipo III el más frecuente en casos de sepsis y meningitis neonatal, debido a su alto contenido de ácido siálico en su polisacárido capsular.

El SGB está ubicado en el tracto genitourinario y gastrointestinal, por lo que, en mujeres embarazadas y que sean portadores existe gran riesgo de que pueda ser traspasada al recién nacido, provocando enfermedades en el recién nacido como neumonía y meningitis, además de sepsis neonatal de estadio temprano (EONS) y sepsis neonatal de estadio tardío (LONS).

La sepsis neonatal se ha convertido en un problema de salud pública a nivel mundial. Esto se evidencia sobre la base de estudios que indican que el 50% de los recién nacidos y lactantes que sobreviven a una enfermedad invasiva quedan con secuelas neurológicas permanentes y de un 2 a 6% fallecen.

Para prevenir la sepsis neonatal, se realiza un tamizado a mujeres embarazadas en las semanas 35 a 37 de gestación, a través de técnicas microbiologicas y de PCR. Esta técnica microbiológica tiene un tiempo de respuesta de aproximadamente cuatro a cinco días y una baja sensibilidad, por tanto, aun cuando el resultado sea negativo, puede haber portación.

Actualmente, el test de CAMP corresponde a la prueba fundamental para el diagnóstico clínico de SGB como parte de los ensayos microbiologicos. La hemolisis característica de este test se basa en la interacción entre la enzima esfingomielinasa de Staphylococcus aureus y el factor CAMP producido por SGB. Al igual que el ensayo de betahemólisis, los tiempos de entrega de resultados son poco eficientes en tiempo y sensibilidad.

Otro grupo de metodologías corresponden a las del tipo directo, las cuales comprenden aglutinación con látex y enzimoinmunoanálisis (EIA). Pero, al igual que las técnicas microbiológicas, la sensibilidad de estas pruebas es excesivamente baja para ser utilizada como tamizado en la práctica clínica.

Por el contrario, desde 1986 se han desarrollado técnicas que mejoran la sensibilidad y tiempo de respuesta a ciertas determinaciones, pudiendo resolver los inconvenientes antes planteados de tiempo de espera. Este tipo de técnicas corresponde a PCR y de manera más actual a quantitative-PCR (qPCR) o PCR en tiempo real. Actualmente la qPCR es el método más rápido, específico y sensible para detectar y cuantificar ácidos nucleicos debido a que posee un alto rango de detección y es capaz de detectar diferencias de una sola copia de ADN.

En general las técnicas que utilizan qPCR entregan resultados en horas y tienen mayor sensibilidad. En el caso específico de identificación de SGB a través del test de CAMP, la técnica se basa en la detección del gen cfb (por sus siglas en inglés complement factor B), responsable de la producción del factor CAMP. Otra fuente de determinación comprende la detección del gen de la proteína SIP. La proteína SIP es producida por todos los serotipos de SGB β-hemolíticos o γ-hemolíticos (es decir, cepas que carecen de hemolisis). Por lo que, el desarrollo de partidores y sondas a partir de su secuencia reduce la incertidumbre. Por ello, se han desarrollado metodologías en base a biología molecular donde se emplean una serie de secuencias de SGB. Tal como en el documento US6004754 que divulga una secuencia de ADN recientemente identificada de Streptococcus agalactiae. En dicho documento, también se describen métodos, partidores y sondas de oligonucleótidos, además de equipos para la detección específica de especies de SGB.

La secuencia de la proteína SIP también ha sido empleada para la prevención de mastitis bovina, como lo indica el documento CN102304185. En este documento se describe que la proteína de fusión SIP-TRAP (por sus siglas en inglés TNF receptor associated protein) se obtiene insertando un gen de fusión que se forma conectando el gen SIP de streptococcus agalactiae y el gen TRAP de staphylococcus aureus en un vector y realizando expresión y purificación. La proteína SIP-TRAP proporcionada por el documento CN102304185 puede servir como un inmunógeno para mejorar la resistencia de la vaca o la oveja a la infección con streptococcus agalactiae y staphylococcus aureus, lo que simplifica el proceso de operación inmune y tiene un buen efecto inmunitario.

Otra forma de uso de la secuencia de la proteína SIP, ha sido para el desarrollo de test rápido para detección de SGB, como en el caso del documento WO2017075937, que divulga un papel de prueba de detección rápida de oro coloidal para streptococcus agalactiae en un método de doble anticuerpo. Estas nuevas tecnologías imprimen ventajas deseables respecto de las técnicas microbiológicas mayoritariamente empleadas, ya que aumentan sensibilidad, especificidad y disminuyen el tiempo de respuesta. Por ello, resulta ventajosa la creación de un kit y métodos para ser empleados en técnicas PCR y sus variantes basado en la secuencia del gen de la proteína SIP por estar presente en todos los serotipos de SGB, que permitan mayor especificidad, sensibilidad y disminuyan el tiempo de resultados del test.

DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 muestra la curva de amplificación para 3 muestras del serotipo la se observa que tanto SIP como CFB amplifican.

En la Figura 2, de manera similar a la figura 1 , pueden ser observadas las curvas para las 3 muestras del serotipo Ib.

En la Figura 3 se observa el caso de 20 muestras del serotipo II y sólo la mitad de las muestras que amplificaron con la secuencia CFB.

Se observan las curvas de amplificación para las muestras del serotipo III en la Figura 4, serotipo IV en la Figura 5, serotipo V en la Figura 6, serotipo VI en la Figura 7 y serotipo VII en la Figura 8 muestran una amplificación del 100% tanto con los partidores y sondas de secuencias SIP como de CFB.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

La presente solicitud hace referencia a un kit y un método de detección de SGB que puede realizarse desde la semana 34 de embarazo hasta el momento del parto donde el resultado del test es entregado en alrededor de 3 a 5 horas permitiendo aplicar una terapia a tiempo para evitar el traspaso de SGB en el momento del parto al recién nacido.. Este método consiste en una sonda (SEQ N° 2) y dos partidores (SEQ N° 1 y SEQ N° 3) del gen SIP que son específicos para SGB y su uso en ensayos de diagnóstico.

Las secuencias para la sonda y los dos partidores se describen a continuación:

En una primera etapa del desarrollo de estos dos partidores y de la sonda, fue realizada la clonación y secuenciacion del gen SIP que reveló un marco de lectura abierto de 1 .305 nucleótidos que codifican un polipéptido de 434 residuos de aminoácidos, N ^e de acceso GenBank AF151361 ). La proteína madura es una proteína de 53 kDa que se expresa en cada cepa de SGB. Cada uno de los partidores tiene un tamaño de 22 bases, mientras que la sonda tiene 33 bases. El largo de estas cadenas se mantiene dentro de parámetros normales que va de 18 a 22 bases, siendo sus valores de hairpin de 2 estructuras (ΔΘ mayores que -10) para la SEQ N° 1 , 3 estructuras (AG mayores que -10) para la SEQ N° 3 y 3 estructuras (ΔΘ mayores que -10) para la SEQ N° 2. En relación a los Hairpin, el valor de los Kcal/mol se encuentra en un rango de ΔΘ menor a -2 Kcal/mol.

El número de dímeros para las secuencias corresponde a 1 1 dímeros (ΔΘ mayores que - 10) para la SEQ N° 1 , 12 dímeros (ΔΘ mayores que -10) para la SEQ N° 3 y 18 dímeros (ΔΘ mayores que -10) ^' para la SEQ N° 2. Respecto de los heterodímeros, el número para las SEQ N°1 y SEQ N°3 es de 14 heterodímeros (ΔΘ mayores que -10).

En relación a las bases, la SEQ N°1 tiene una relación guanina citosina del 50%, mientras que la SEQ 3 del 54,5%. En el caso de la sonda (SEQ N° 2), tal relación es de 58,1 %. Tanto para la sonda como los partidores la relación está dentro del rango de 40% a 60%. En relación a la temperatura de Fusión de Oligonucleótidos (Tm) es de 55,6°C para la SEQ N°1 , 57,2°C para la SEQ N° 3 y 67,5°C para la SEQ N° 2. Para el caso de los partidores están dentro del rango de 52°C a 58°C que se considera normal. Tabla 1

La sonda y los partidores fueron sometidas a una evaluación bioinformática en BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) para identificar sus valores esperados (valor E) y score (valor S). Encontrándose que, el valor E para la SEQ N° 1 y SEQ N° 3 fue de 0,016 y de la SEQ N° 2 fue 2x10 ⁷ . Los valores E reportados son menores a 0,1 siendo significativos, por tanto, no existen muchas secuencias similares a estas. Para el caso del valor S, tanto la SEQ N° 1 como la SEQ N° 3 obtuvieron 44,1 y la SEQ N ° 2 obtuvo 61 ,9.

Tabla 2

Valor S Valor E Porcentaje de Identidad SEQ N° 1 44, 1 0,01 6 1 00%

SEQ N° 3 44, 1 0,01 6 1 00%

SEQ N° 2 61 ,9 2x1 0 ⁷ 1 00%

A diferencia de otras técnicas basadas en biología molecular, la matriz que contiene el analito no requiere de un pretratamiento o actividades que exhiban mayor complejidad o requieran de un nivel de conocimiento en la técnica.

Específicamente, la presente invención comprende un kit de diagnóstico para la determinación de Streptococcus agalactiae (SGB) a través de metodologías basadas en PCR y sus variantes que comprende:

A. un partidor forward que contiene la SEQ N°1 ;

B. una sonda que contiene la SEQ N°2; y

C. un partidor reverse que contiene la SEQ N°3.

En donde el partidor forward contiene una secuencia que posee una similitud de al menos 90% con la SEQ N° 1 , la sonda contiene una secuencia que posee una similitud de al menos 90% con la SEQ N° 2, y el partidor reverse contiene una secuencia que posee una similitud de al menos 90% con la SEQ N° 3. En el cual la concentración del partidor forward está entre 0,5 a 1 ,0 μΜ; la concentración de sonda está entre 0,5 a 1 ,0 μΜ y la concentración del partidor reverse está entre 0,5 a 1 ,0 μΜ. Además, la presente invención comprende un método in vitro para detectar la presencia de Streptococcus agalactiae (SGB), que comprende:

a) tomar la muestra desde el tracto genitourinario de la paciente y suspender la muestra en un medio de transporte;

b) extraer muestra suspendida y colocarla en un tubo de PCR;

c) agregar al tubo de la etapa (b) mezcla maestra para PCR;

d) agregar la mezcla de la etapa (c) una SEQ N° 1 , una SEQ N° 2 y una SEQ N° 3; e) cargar el tubo con la mezcla de la etapa (d) en un termociclador y someterla a un programa de temperatura.

En donde el medio de transporte de la etapa (a) se selecciona de entre medio Stuart, Amies sin carbón activado, Amies con carbón activado y Cary Blair.

Luego, en la etapa (b) se extraen entre 0,1 μΙ_ y 10 μΙ_ de muestra suspendida en el medio de transporte.

Específicamente, en la etapa (c) se agregan entre 5 y 25 μΙ_ de la mezcla maestra para PCR, donde dicha mezcla maestra para PCR comprende al menos un fluoroforo y al menos un desactivador, el fluoroforo de la mezcla maestra se selecciona de 6-Carboxifluoresceína (6-FAM), tetraclorofluoresceína (TET). Además, la mezcla maestra para PCR comprende un desactivador que se selecciona de Black Hole Quencher® (BHQ) y tetrametilrodamina (TAMRA). En relación a las SEQ N° 1 , SEQ N° 2 y SEQ N° 3 de la etapa (d), ellas se encuentran suspendidas en agua para PCR o ultrapura, medio libre de nucleasas, medio para biología molecular y buffer tris( idroximetil)aminometano-ácido etilendiaminotetraacético (Buffer Tris-EDTA). Dichas secuencias SEQ N° 1 , SEQ N° 2 y SEQ N° 3 están en una concentración entre 0,5 a 1 ,0 μΜ, y en una realización preferente el agua de suspensión corresponde a agua ultrapura, y se agregan al tubo de PCR entre 0,1 y 10 μΜ de cada una de dichas secuencias SEQ N° 1 , SEQ N° 2 y SEQ N° 3. Finalmente, el programa de temperatura utilizado en el termociclador comprende:

i. 1 ciclo de 1 segundo entre 15 a 30°C;

ii. 1 ciclo de 10 minutos entre 90°C a 98 ^e C; y

Ni. 30 a 40 ciclos de 15 segundos a 95°C y 45 segundos entre 55°C a 63°C. EJEMPLOS

Los siguientes ejemplos se presentan para proporcionar a los expertos en la técnica una descripción completa de los partidores y sondas, además de las actividades preanalíticas y analíticas de la invención y no pretenden limitar el alcance de lo que los inventores consideran. Se han hecho esfuerzos para asegurar la exactitud con respecto a los parámetros usados (por ejemplo, cantidades, temperatura, etc.) pero algunos errores y desviaciones experimentales deben tenerse en cuenta.

Ejemplo 1 : Determinación a través de qPCR

Se llevó a cabo un procedimiento de qPCR para la determinación de SGB con un kit que comprende las SEQ N° 1 , SEQ N° 2 y SEQ N°3.

Para la toma de muestra, se utiliza una tórula de algodón estéril que se pasa por el tracto genitourinario de la paciente embarazada. Luego esta torula ya con la muestra es suspendida en un medio de transporte Stuart.

A continuación, se extrajeron 7 desde la muestra original suspendida en el medio Stuart, para luego agregar:

- 10 L de mezcla maestra para qPCR.

- Se añadieron 1 \JL de SEQ N° 1 ; 1 \JL de SEQ N° 2 y 1 \JL de SEQ N° 3.

La solución final alcanzó un volumen total de 20 la que se cargó en un termociclador y se sometió al siguiente programa de temperatura:

I. 1 ciclo de 1 segundo a 25°C;

II. 1 ciclo de 10 minutos a 95°C; y

III. 40 ciclos de 15 segundos a 95°C y 45 segundos a 63°C.

Las SEQ N° 1 , SEQ N° 2 y SEQ N°3 reconocieron los serotipos de SGB dando resultados positivos, amplificando la señal. Ejemplo 2 determinación a través de qPCR MULTIPLEX

Se llevó a cabo un procedimiento de qPCR MULTIPLEX para la determinación de SGB con un kit que comprende las SEQ N° 1 , SEQ N° 2 y SEQ N°3, en conjunto con sondas y partidores de CFB y un control positivo de SGB serotipo III, un control negativo de Escherichia coli, y un control sin templado (NTC), en 25 muestras de mujeres con 35 a 37 semanas de embarazo. El procedimiento se llevó a cabo bajo las siguientes condiciones:

Se extrajeron 2 desde la muestra original suspendida en un medio Stuart y luego se añadieron 10 \JL de Master MIX MULTIPLEX. En seguida se añadieron 1 \JL de SEQ N° 1 , 1 L de SEQ N° 2 y 1 L de SEQ N° 3. También se agregaron 1 de partidor reverse CFB, 1 L de partidor forward CFB y 1 de sonda CFB, y finalmente se añadieron 2 de agua de PCR. La solución final alcanzó un volumen total de 20 μί, la que se cargó en un termociclador y se sometió al siguiente programa de temperatura:

i. 1 ciclo de 1 segundo a 25°C;

¡i. 1 ciclo de 10 minutos a 95°C; y

Ni. 40 ciclos de 15 segundos a 95°C y 45 segundos a 60°C.

Con este procedimiento fueron analizadas 25 muestras de mujeres con 35 a 37 semanas de embarazo. Las 25 muestras fueron divididas en un grupo de 13 y otro de 12 muestras. De estas muestras se obtuvieron los siguientes resultados: 1 1 fueron SIP y CFB positivas; 10 fueron SIP positivas y CFB negativas; y 4 fueron SIP negativas y CFB positivas.