D'OLIGONUCLEOTIDES ET ©LIGÛPJUtLEOTIDES OiTEI IUS La présente Invention concerne le domaine technique des marqueurs de biomolécules. Plus précisément, la présente invention concerne de nouveaux dérivés de diaminophénothiazinium de la même famille que le bleu de méthylène, et de structure adaptée pour pouvoir être incorporés dans des oligonucléotides, directement lors de leur synthèse. L'invention a également pour objet les procédés de croissance des oligonucléotides utilisant de tels dérivés, les oligonucléotides ainsi obtenus et des supports de synthèse pour oligonucléotides sur lesquels des dérivés de diaminophénothiazinium sont greffés.

Le bleu de méthylène est une molécule aux propriétés multiples, C'est, entre autres, une molécule électroactive qui a la propriété de passer d'un état réduit à un état oxydé sous l'action d'un potentiel d'oxydation, en libérant 2 électrons (Farjami, E.; Ciima, L; Gothelf, K. V.; Ferapontova, E. E. Analyst 2010, 135, 1443-1448), Le bleu de méthylène est également une molécule colorée, qui absorbe à la longueur d'onde de 665 nm en milieu aqueux et une molécule fluorescente, dont la longueur d'onde d'excitation est de 665 nm et celle d'émission est de 682 nm.

Pour toutes ces raisons, le bleu de méthylène est un marqueur biologique très efficace, que ce soit pour réaliser une détection optique ou une détection éiectrochimique de l'entité biologique marquée.

Dans les années 80 des synthèses en phase solide des biomolécules et notamment des peptides et des oligonucléotides ont été développées. Le procédé chimique actuellement le plus utilisé pour la synthèse des oligonucléotides est connu sous le nom de « la méthode aux phosphoramidites ». Cette méthode consiste à ajouter, d'une manière séquentielle, un seul nucléotide à la fois, à une chaîne croissante d'oligonucléotides. Un groupe protecteur des fonctions hydroxyle dans des conditions de synthèse des oligonucléotides tels, que par exemple, un groupe diméthoxytrstyle, est placé à l'extrémité 5' d'une chaîne croissante d'oligonudéotide qui est elle-même accrochée par son extrémité 3' à un support solide, Ce groupe protecteur est éliminé grâce à un traitement acide, par exemple avec de l'acide trichloroacétique, et l'extrémité 5' de l'oligonucléotide ainsi libérée est ensuite couplée avec un synthon nucléotidique substitué à son extrémité 3' avec un dérivé phosphoramidite, ce qui permet d'accroître la chaîne nucléotidique. L'agent d'activation de la réaction de couplage est, par exemple, le tétrazole qui réagit avec la fonction phosphoramidite du synthon, formant in situ un intermédiaire très réactif vis- à-vis de la fonction alcool déprotégée présente à l'extrémité 5' de oligonudéotide fixé au support. Il est également possible d'utiliser à la place d'un groupe phosphoramidite, un groupe phosphodiester (Reese CB,, TItmas R.C, Yau L _s Tetrahedron Let 1978, 30, 2727-2730; Efimov, VA, Burgakova, AA, Dubey, I.Y., Polushin, M, M., Chakhmakhcheva, G,G,, Orchinnikov, YA, MucL Acids, Res., 1986, 14, 6525-6540) ou hydrogénophosphonate (Froehler, B.C., Hatteucci, H.D, Tetrahedron Let. 1986, 27, 469-472). Pour plus de détails sur ces techniques, on pourra se référer à Current Protocols in ucleic Acid Chemîstry, Volume 1, Editors : S, L Beaucage, D. E. Bergstrom, G, D. Glick, R. A. Jones, John Wiley & Sons, Inc., 2004 ; Protocols for oligonucleotides and analogs, Volume 20, Editor: S. Agrawal, Methods in molecular bîology, Humana Press, 1993. Il est intéressant d'introduire à ce stade des synthons nucléotidiques modifiés contenant, par exemple, un marqueur de type fluorescent ou électrochimique.

Dans les synthétiseurs automatiques, la séquence d'une réaction peut être répétée un grand nombre de fois, par exemple, jusqu'à 150 fois. Dès qu'un oligonucléotide de séquence voulue est synthétisé, il est libéré du support par un traitement basique qui permet également d'éliminer les différents groupements protecteurs. L'oisgonucléotide obtenu peut alors être purifié par HPLC ou par électrophorèse sur gel. La chimie de synthèse des oligonuciéotides en phase solide nécessite donc une étape finale de déprotection des nucléotides formant i'oligonucléotide et de décrochage du support, en milieu basique, typiquement dans une solution aqueuse de H ₄ OH 30% en volume ou de K ₂ C0 ₃ à 0,05M. Ces traitements ne sont pas compatibles avec un greffage préalable du bleu de méthylène sur oligonucléotide lors de sa synthèse, car le bleu de méthylène est une phénothiazine substituée par deux diméthylamines qui n'est pas stable en milieu basique. En effet, les groupements diméthylamine se clivent rapidement en milieu basique entraînant la perte des propriétés électrochimiques et colorantes (Mills A,, Hazafy D Parkinson 1, Tuttle T., Hutchings M G,, Effeet of alkali on méthylène blue (CL Basic Blue 9) and other thiazine dyes, Dyes and Pigments 2011, 88, (2), 149-155).

A ce jour, les stratégies proposées pour greffer un dérivé de bleu de méthylène sur une biomolécule du type oligonucléotide font intervenir un couplage post-synthèse sur la biomolécule, c'est-à-dire un couplage lors d'une étape finale sur la biomolécule déjà formée. Un dérivé ester activé du bleu de méthylène a été synthétisé pour être couplé sur une biomolécule porteuse de fonctions aminé primaire (Jahnchen X, Purwanto M G. M,, Weisz K., NMR studies on self-complementary oligonuciéotides conjugated with méthylène blue, Biopolymers 2005, 79, (6), 335-343; Farami, Anal, Ghem. 2011; Hansen, 30C, 2010). Les travaux de Ro e et al. (Aaron Rowe, Kelly N Chuh, Arica A Lubin, Erin A Miller, Brett M Cook, Daniel N Hollis, and Kevin W, Plaxco, Anal. Chem, 2011, 83 (24), 9462-9466) prévoient quant à eux de greffer sur un oligonucléotide déjà formé du bleu de méthylène grâce à un lien peptidique ou un lien hydrazone. Un dérivé 8-amino bleu de méthylène a également été décrit pour effectuer un couplage sur un polymère porteur de fonctions acide (Uwe Moller, Frank Schubert, and DIeter Cech, Bioconjugate, 1995, 6, 174-178),

D'une manière générale, il a été considéré dans l'art antérieur que le bleu de méthylène devait être couplé en toute dernière étape de la synthèse, pour limiter les risques de dégradation rencontrés dans des milieux trop agressifs utilisant une base ou un agent réducteur utilisé dans les synthèses de biomolécules, et notamment dans le cas de la synthèse des ollgonucléotides.

Dans le cadre de l'invention, les inventeurs proposent des nouveaux dérivés de diaminophénothiazinium qui peuvent être directement intégrés dans des biomolécules, et en particulier dans des ollgonucléotides lors de leur synthèse.

Dans ce contexte, la présente invention concerne des dérivés de diaminophénothiazlnium de formule (I) :

dans laquelle :

- un des groupes R R ₂ , 3 et ¾ _; représente -A1-OR7, avec Ai qui représente une chaîne alkylène linéaire ou ramifiée comprenant de 2 à 12 carbones, les atomes d'oxygène et d'azote étant séparés par au moins deux atomes de carbone consécutifs et R ₇ qui représente un groupe phosphoré capable de réagir avec un hydroxyle libre dans des conditions de synthèse des ollgonucléotides, ledit groupe formant , de préférence, avec OAi auquel il est lié un groupe phosphoramidite, phosphodiester ou hydrogénophosphonate,

~ ies autres groupes Ri, R2, 3 et R«, identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre :

o un groupe -Â G s, avec A2 qui représente une chaîne alkylène linéaire ou ramifiée comprenant de 2 à 12 carbones, les atomes d ^f oxygène et d'azote étant séparés par au moins deux atomes de carbone consécutifs, et s qui représente un groupe protecteur des fonctions hydroxyle dans des conditions de synthèse des oligonucléotides, de préférence choisi parmi les groupes trityle, 4-Q-monométhQxytrityle, 4,4 -0- diméthoxytrityle, tert-butyldiméthylsilyle, acétyle, trifluoroacétyle, 9~phénylxanthen~9~yle et fi uorény I méthyloxyca rbony le,

o un groupe alkyie de 2 à 12 atomes de carbone,

o ou bien i et f¾ ou f¾ et i¾ sont liés entre eux pour former avec l'atome d'azote auquel ils sont liés un groupe pipérïdinyle ou pyrrolidinyle,

- R5 et ¾ identiques ou différents, représentent, indépendamment l'un de l'autre, un atome d'hydrogène, de chlore, brome, iode ou fluor, ou un groupe alkyie de 1 à 12 atomes de carbone, un groupe alcényle de 2 à 12 atomes de carbone, un groupe aicynyie de 2 à 12 atomes de carbone, un groupe acyle ou un groupe phényle,

- X ^" représente un anion, de préférence choisi parmi CI ^" , Γ, QO-f, Oi, Dans le cadre de l'invention, les groupements diméthylamine du bleu de méthylène ont été remplacés par des chaînes plus longues et plus encombrées, afin d'obtenir un dérivé de bleu de méthylène qui une fois intégré à un oligonucléotide, est plus stable, notamment en conditions basiques. Un tel dérivé est donc compatible avec une utilisation dans la synthèse des oligonucléotides supportées qui nécessitent en étape finale un traitement basique pour libérer l'oligonucléotide formé du support de synthèse et/ou déprotéger les nucléotides.

De plus, il a également été constaté que ces modifications chimiques n'affectaient pas, de manière problématique, les propriétés oxydo- réductrices, des dérivés de diaminophénothiazinium ainsi obtenus, confirmant ainsi leur intérêt pour le marquage des oligonucléotides, voire d'autres biomolécules telles que les peptides.

Selon des modes de réalisation préférés, notamment en termes de stabilité, Ai et A ₂ (lorsqu'il est présent) sont des chaînes alkylène linéaires ou ramifiées, dans lesquelles de 2 à 6 atomes de carbone consécutifs séparent les atomes d'oxygène et d'azote.

Dans le cadre de l'invention, il est possible que trois des groupes R _if i¾, R ₃ et R4 représentent un groupe ~-Â2~QRs tel que défini dans l'invention. Dans ce cas, il est possible de greffer plusieurs nucléotides sur un même dérivé de diaminophénothiaziniurn, ce qui permet de synthétiser des oligonucléotides ramifiés. Selon d'autres modes de réalisation, au moins un des groupes Ri, R ₂ , 3 et R4, ne représente pas un groupe -A ₂ -GRs et le ou lesdits groupes Ri, ¾ _/ R3 o R différent s) de -A1-OR7 et de ~Â ₂ -ORs représente(nt) un groupe alkyle de 2 à 12 atomes de carbone, de préférence de 4 à 12 atomes de carbone. Dans ce cas, les dérivés de dîaminophénothiazinium peuvent répon re à Tune des formules données ci-après :

Ai, A ₂ , s, Re, R7, Rs et X ^" sont tels que définis pour les composés de formule (I),

Ri et R _¾ identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle de 2 à 12 atomes de carbone, de préférence de 4 à 12 atomes de carbone, ou Ri et R ₂ sont liés entre eux pour former avec l'atome d'azote auquel ils sont liés un groupe pipéridinyle ou pyrrolidinyle;

is laquelle :

- Ai, . _s R.5 Re _f R _f -, s et X ^~ sont tels que définis pour 5s composés de formule (I),

- F½ et R4, identiques ou différents, représentent Indép sndamment l'un de l'autre un groupe aSkyle de 2 à 12 atomes 1

préférence de 4 à 12 atomes de carbone ; et

~ formule (le) :

dans laquelle ;

- A _i; R _5f R ₆ , R7 et X ^" sont tels que définis pour les composés (I),

- Ri et ¾, Identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle de 2 à 12 atomes de carbone, de préférence de 4 à 12 atomes de carbone, ou i et R ₂ sont liés entre eux pour former avec l'atome d'azote auquel ils sont liés un groupe pipéridinyie ou pyrroiidinyle,

R3 représente un groupe alkyle de 2 à 12 atomes de carbone, de préférence de 4 à 12 atomes de carbone. Quel que soit le composé de formule (I), (la), (îb) ou (le) précédemment décrit, R ₅ et ¾ représentent, par exemple, un atome d'hydrogène, comme dans le cas du bleu de méthylène.

Le groupe R ₇ peut être du type -~P(NR'aR'b)R'c (et forme donc un phosphoramîdite avec -OÂr), -P(0)(OH)(OR'd) (et forme donc un phosphodiester avec -OAr) ou ™P(0)(OH)H (et forme donc un hydrogénophosphonate avec -OAr), dans lesquels R¾, R ^f b _f R'c et R'd sont, par exemple, des groupe alkyle ou phényle éventuellement substitué. De manière avantageuse, dans les composés de formule (ï), (la), (îb) et (le) précédemment décrits, un des groupes Ri, 2, R3 et ¾ représente un groupe -A ₁ -OR7 dans lequel R ₇ représente un groupe ~P[f ( ⁱ Pr) ₂ .](OCH2CH ₂ O ) (avec ^! Pr = isopropyle) et forme donc un pbosphoramidite avec OAi et Ai est tel que précédemment défini, R ₇ peut plus généralement représenter un groupe -P{ [(C2-Ci2)alkyle] ₂ }(OCH2CH2C-IM). R ₇ peut également représenter un groupe tel que le 0"(2-chlorophénylphosphate) ou le L 2-(i~méthylimidazol~ 2-yl)phénylphosphate, de manière à former un phosphodiester avec OAi, R ₇ peut également représenter un groupe™P(0)(OH)H,

De tels dérivés de diaminophénothiazinium pourront être préparés selon des techniques bien connues de l'homme de l'art, notamment par analogie avec les techniques décrites dans les exemples. Pour l'essentiel, il est possible de former des dérivés aminés de phénothiazinium par réaction, notamment à température ambiante, d'un sel de phénothiazinium, tel que le tétraiodure de phénothiazinium, avec une dialkyla ine, une dihydroxyalkylamine ou une alkyl(hydroxyalkyl)amine dans un alcool tel que le méthane! ou un solvant chloré tel que le dichlorométhane.

Le rapport molaire amine/sel de phénothiazinium sera environ égal à 2 lorsque l'on souhaite greffer une seule aminé sur le cycle et sera supérieur à 2 lorsque Ton souhaite greffer deux aminés identiques de part et d'autre du cycle phénothiazinium (cas des composés de formule (îb) dans lesquels Ai ^~ A2 et R ₂ =R4). Pour les composés dans lesquels il est nécessaire de greffer deux aminés différentes de part et d'autre du cycle phénothiazinium (cas des composés (la) et des composés (Ib) dans lesquels Ai est différent de A ₂ et/ou R ₂ est différent de ¾), une nouvelle réaction sera réalisée avec une autre aminé dans des conditions analogues. Au moins une des aminés utilisées est substituée par un groupe hydroxyalkyle. Un couplage est ensuite réalisé sur la fonction hydroxyie avec au moins un dérivé halogéné, et en particulier un dérivé chloré CI~R ₇ ou Cl- e, pour obtenir ia fonction™0-R ₇ ou -G~Rg désiré, Un tel couplage est réalisé dans des conditions bien connues de Thomme de Tant, notamment en présence de diisopropyiéthylamine dans l'acétonitrile. Deux couplages successifs pourront être réalisés pour obtenir deux fonctionnalisations différentes,, dans le cas où au moins deux fonctions hydroxyie sont présentes.

Les dérivés seion l'invention pourront être intégrés dans un oligonucléotide, dans un procédé de synthèse supportée classique, à la place d'un nucléotide,

Le terme « oligonucléotide » désigne un enchaînement d'au moins 2 nucléotides (désoxyribonucléotides ou ribonucléotides, ou les deux), naturels ou modifiés, susceptibles de s'hybrider, dans des conditions appropriées d'hybridation, avec un oligonucléotide au moins partiellement complémentaire. Par « nucléotide », on entend un composé organique consistant en une base purine ou pyrimidine liée à un ose (ribose ou deoxyribose) et à un groupe phosphate. Par « nucléotide modifié », on entend, par exemple, un nucléotide comportant une base modifiée et/ou comportant une modification au niveau de la liaison internucléotidique et/ou au niveau du squelette. A titre d'exemple de base modifiée, on peut citer l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino~5-désoxyuridine, la diamino-2, 6-purine et la bromo-5-désoxyuridine, Pour illustrer une liaison internucléotidique modifiée, on peut mentionner les liaisons phosphorothioate, M-alkylphophoramidate, alkylphosphonate et alkylphosphotriesfer.

La présente invention a également pour objet un procédé de marquage d'un oligonucléotide par un dérivé de diaminophénothiazinium seion llnvention, qui comprend la croissance d'un oligonucléotide greffé sur un support solide, et le remplacement d'un ou piusieurs nucléotides par un ou plusieurs desdits dérivés de dlaminophénothiazinium selon l'invention, avant que l'oiigonucléotide ne soit détaché du support solide. Au moins une substitution par un dérivé de dlaminophénothiazinium peut être effectuée en positions 3 ^! ou 5', sur le premier ou le dernier nucléotide, respectivement. Il est également possible de réaliser l'insertion d'un dérivé de diaminophénothiazinium à l'intérieur de la chaîne nucléotidique, le remplacement d'un synthon nudéotidique phosphoramidite, phosphodiester ou hydrogénophosphonate par un dérivé de dlaminophénothiazinium selon l'invention, étant alors réalisée avant la fin de la croissance de l'oiigonucléotide. Dans le cadre de l'invention, il est possible d'insérer le dérivé de dlaminophénothiazinium à n'importe quelle place sur la chaîne nudéotidique, étant donné que ce dernier peut être introduit directement lors de la croissance des oligonucléotides. ïl est possible d'incorporer un dérivé de dlaminophénothiazinium selon llnvention sur n'importe quelle position d'une séquence oligonucléotidique. De plus, il est possible d'incorporer un nombre important de dérivés de dlaminophénothiazinium au sein d'une séquence oligonucléotidique, par synthèse supportée. Selon un mode de réalisation particulier, au moins deux insertions, par exemple consécutives, sont effectuées, Il convient de noter qu'un tel processus de marquage était déjà décrit dans la demande WO 03/068787 dans le cas de dérivé ferrocène. Néanmoins, le remplacement d'un marqueur du type ferrocène par un dérivé de dlaminophénothiazinium va pouvoir apporter une amélioration notable, en termes de performance du marquage. En effet, les marqueurs selon l'invention transfèrent deux électrons par vague d'oxydation, au lieu d'un électron transféré dans le cas du ferrocène. Les dérivés de diaminophénothiazinium sont également plus stables vis-à-vis des conditions oxydantes et plus sensibles à leur environnement stérique et ionique, dans le milieu. i l

La présente Invention a également pour objet les oligonucléotides marqués susceptibles d'être obtenus par le procédé de marquage selon l'Invention ou à partir des supports décrits ci-après.

Les dérivés de diaminophénothiazinlum selon l'Invention sont très réactifs et peuvent aussi être utilisés pour réagir efficacement avec un autre type de biomolécule, polymère ou un support plan ou particulaire, porteur de fonctions alcool ou aminé notamment.

L'invention concerne également les supports de synthèse d'oligonucléotides, comprenant au moins un dérivé de diaminophénothiazinlum greffé de manière covalente en surface du support et répondant à la formule :

dans laquelle :

- R ₅ , R ₅ et X ^" sont tels que définis pour les composés de formule (I),

- R'i et R' _2f identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle de 2 à 12 atomes de carbone, de préférence de 4 à 12 atomes de carbone, ou Ri et R ₂ sont liés entre eux pour former avec l'atome d'azote auquel ils sont liés un groupe pipéridinyle ou pyrrolidinyle,

- ki et Ai", identiques ou différents, représentent, indépendamment l'un de l'autre, une chaîne Ai telle que définie pour les composés de formule (I), et

- R ₉ représente un groupe protecteur des fonctions hydroxyle dans les conditions classiquement utilisées dans la synthèse des oligonucléotides, de préférence choisi parmi les groupes trityle, 4-0- monométhoxytrityle, 4 _f 4 ^f -0~diméthoxytrityle _i tert-butyldiméthylsilyle, acétyle, trifluoroacétyle, 9-phénylxanthen-9-yle et fluorénylméthyioxycarbonyle; et

- Rio représente -CO-Â3-CO~ H-Support, avec A ₃ qui représente une chaîne alkylène linéaire ou ramifiée comprenant de 1 à 6 atomes de carbone ; ou

dans laquelle :

- R ₅ , R ₆ et X ^' sont teis que définis pour les composés de formule (I),

- R ^f ₂ et R' ₄ , identiques ou différents, représentent indépendamment l'un de l'autre un groupe alkyle de 2 à 12 atomes de carbone, de préférence de 4 à 12 atomes de carbone,

- Ai' et Ai", identiques ou différents, représentent, indépendamment l'un de l'autre, une chaîne Ai telle que définie pour les composés de formule (I), et

- R ₉ représente un groupe protecteur des fonctions hydroxyle dans les conditions classiquement utilisées dans la synthèse des oligonucléotides, de préférence choisi parmi les groupes trityie, 4-0- monométhoxytrityle, 4,4'-0-diméthoxytrityle _i tert-butyldiméthylsilyle, acétyle, trifluoroacétyle, 9~phénylxanthen-9-yle et fluorénylméthyioxycarbonyle ; et

- Rio représente -CO-Aa-CO-NH-Support, avec A3 qui représente une chaîne alkylène linéaire ou ramifiée comprenant de 1 à 6 atomes de carbone.

Le support peut notamment être choisi parmi les résines, en particulier parmi les résines à base de polystyrène, polyacrylamide, polyéthylèneglycol, cellulose, polyéthylène, polyester, latex, polyamide, polydiméthylacrylamide, les polymères hydrophiles synthétiques ou naturels, les verres et silices à porosité contrôlée, les billes de verre, les gels de silice. Ce type de support comporte généralement des fonctions aminé de surface qui vont être modifiées pour faire apparaître des fonctions acide de surface qui vont alors pouvoir être couplées à des fonctions hydroxyalkylamino portées par l'hétérocycle pour conduire aux supports (Sa) et (Sb) ci-dessus.

Certaines définitions utilisées dans la description de l'invention sont rappelées.

Par « alkyle », on entend un groupe hydrocarboné monovalent saturé, linéaire ou ramifié, A titre d'exemples de groupe alkyle, on pourra citer les groupes méthyle, éthyle n-propyle, isopropyle, n-butyle, isobutyle, sec- butyle, t-butyle, n-pentyle, n-hexyle,

Par « alcényle », on entend un groupe hydrocarboné monovalent

Insaturé comprenant au moins une double liaison, linéaire ou ramifié.

Par « alcynyle », on entend un groupe hydrocarboné monovalent insaturé comprenant au moins une triple liaison, linéaire ou ramifié.

Par « alkylène », on entend un groupe hydrocarboné bivalent saturé, linéaire ou ramifié. A titre d'exemple de groupe alkylène comprenant de 2 à

12 atomes de carbone, on peut citer ~(CH ₂ )2~, ~CH ₂ ~CH(€H ₃ K ~(CH ₂ )3-, -{Ch^-v -( H2)s- _? -(thye-, -(CHi)?-, -(CH2)8- _f -(O^g-, -(£¾)ιο-, -{CH ₂ )ir,

~(CH2)i ₂ ~ _f -CHj-CHCCHsCHs)-, H ¾2~CH(CH2CH3)- ...

« Les atomes d'oxygène et d'azote étant séparés par au moins deux atomes de carbone consécutifs » signifie qu'une chaîne alkylène linéaire comprenant au moins deux atomes de carbone séparent l'atome d ^f oxygène de l'atome d'azote (on a donc au moins l'enchaînement - -C-C-O-}, les autres atomes de carbone, dans le cas d'une chaîne alkylène ramifiée comprenant plus de 2 atomes de carbone, pouvant alors se trouver sur les ramifications,

A titre d'exemple de groupe protecteur des fonctions hydroxyle dans des conditions de synthèse des olîgonudéotides, est par exemple choisi parmi les groupes trityle, 4-O-monométhoxytrityle, 4,4 ^f -0-dsméthoxytrityle, tert-butyldiméthylsilyle, acétyle, trifluoroacétyle, 9~phénylxanthen~9-yle (pixyle) (le groupement protecteur pixyle est décrit notamment dans le document Chattopadhyaya et Reese, Chem. Soc. Chem, Comm. _f 1978, 639- 640) et fluorénylméthyloxycarbonyle (Fmoc).

A titre d'exemple de conditions de synthèse des oligonucléotides, on peut notamment se référer à Current Protocols in ucieic Acid Chemistry, Volume i, Editors : S. L Beaucage, D, E. Bergstrom, G. D, G!ick, R. A. Jones, John Wiley & Sons, Inc., 2004 ; Protocols for oligonucléotides and analogs.

D'une manière générale, un procédé de synthèse d'oligonucléotide sur support solide comprend les étapes suivantes qui correspondent au premier cycle du procédé :

1) Disposer d'un support sur lequel un nucléoside porteur d'une fonction -OH protégée, par exemple par un groupe trityie, 4-0- monométhQxytrityle, 4,4'-0~diméthoxytrityle, tert- butyldiméthylsilyle, acétyle, trifluoroacétyle, 9-phénylxanthen-9-yle ou fluorénylméthyloxycarbonyle,

2) Déprotéger la fonction hydroxyie, par un traitement acide, par exemple grâce à une solution d'acide trichloroacétique ou acide dichloroacétique, à une concentration de 2 à 3% en masse dans un solvant tel que le dichlorométhane,

3) Ajouter une solution d'un synthon nucléotidique porteur d'une fonction phosphoramidite et d'une fonction hydroxyle protégée, par exemple à une concentration de 0,05 à 0,2 M (-mol/L), en présence d'un agent de couplage, tel que le tétrazole, éthylthiotétrazole, le 4,5-dicyanoimidazole, le saccharin 1-méthylimidazole ou le 5- benzylthiotétrazole, par exemple à une concentration de 0,2 à 0,5 M, dans un solvant tel que l'acétonitrile, ,

4) Bloquer les fonctions hydroxyles n'ayant pas réagi avec les fonctions phosphorées réactives, par action d'anhydride acétique ou d'anhydride phénoxyacétique qui correspond à des conditions plus douces, éventuellement en présence de méthylimidazole ou de diméthylamlnopyridlne _f dans un solvant tel que le tétrahydrofurane ou un mélange tétrahydrofurane/pyridine ou tétrahydrofurane/lutidine ;

5} oxydation du phosphore par action d'une solution diode,, par exemple à une concentration de 0,02 à 0,1 M _f par exemple dans un mélange fétrahydrofurane/pyridine/eau, ou par action d'un péroxyde, par exemple le tert-butylhydropéroxyde, le cumène hydropéroxyde, le péroxyde d'hydrogène ou le bis-triméthylsilyl péroxyde, par exemple à une concentration de 1 à 2 H dans un mélange décane/dichlorométhane, ou par action d'un oxydant non- aqueux comme le (10-camphorsulfonyl)-oxaziridine _f par exemple à une concentration de 0,1 à 0,5 M dans Tacétonltrile.

De manière classique, les aminés des synthons nucléotidlques utilisés sont protégées, afin d'éviter toutes réactions parasites avec les fonctions phosphorées des synthons nucléotidlques mis en réaction au cours de la synthèse de l'oligonucléotide (étape 3). Ces techniques de protection sont bien connues de l'homme du métier. Notamment, dans le cas de l'adénosine, la fonction aminé exocycllque pourra être protégée par un groupe phénoxyacétyle, dans le cas de la cytidine, la fonction aminée exocycllque pourra être protégée par un groupe acétyle, dans le cas de la guanosine, la fonction aminée exocycllque pourra être protégée par un groupe isopropylphénoxyacétyle...

Toutes ces étapes peuvent être réalisées à température ambiante (22°€). Les nucléotides sont protégés tout au long de la synthèse nucléotldique, selon des méthodes bien connues de l'homme de l'art,

En général, les étapes 2), 3), 4) et 5) sont suivies d'un rinçage pour éliminer les réactifs n'ayant pas réagi.

Les étapes 2) à 5) sont répétées autant de fois que nécessaire, avec les synthons nucléotidlques sélectionnés qui peuvent varier d'un cycle à l'autre, pour avoir la séquence d'oligonucléotide souhaitée. Dans le cas où un synthon nucléotidique porteur d'une fonction phosphodiester est utilisé, à l'étape 3), le synthon nucléotidique porteur d'une fonction phosphodiester est couplé en présence de i- mésitylènesulfonyl-S-nitro-l^^-triazole (MSNT) et de 1-méthylsmidazole. Il n'y a pas d'étape d'oxydation 5), De plus, en fin de synthèse, préalablement au traitement basique final, un traitement avec une solution de syn-2- nltrobenzaldoxime et de 1,1,3,3-tétraméthylguanidine dans du dioxane aqueux est réalisé, comme par exemple décrit dans le chapitre 4 du livre édité par Gait, M., Oligonucleotide synthesss. A practical approach (1984) IRL Press, Oxford,

Dans le cas où un synthon nucléotidique porteur d'une fonction hydrogénophosphonate est utilisé, à l'étape 3), le synthon nucléotidique porteur d'une fonction hydrogénophosphonate est couplé en présence de chlorure de pivaloyle en solution dans j'acétonitriie. Les étapes 2) à 4) sont répétées autant de fois que nécessaire pour avoir la séquence d'oligonucléotide souhaitée. L'étape d'oxydation 5) est réalisée en toute fin de synthèse.

Ensuite, une étape finale en milieu basique est réalisée, par exemple, soit grâce à une solution basique de soude, d'ammoniaque, ou de carbonate de potassium ou d'une solution de méthylamine et d'ammoniaque ou d'une solution de diisopropylamine et de B-mercaptoethanol, soit grâce à de l'ammoniac ou de la méthylamine en phase gazeuse. Ce traitement basique permet de déprotéger les nucléotides présents dans l'oligonucléotide formé et, dans le cas de la méthode utilisant des synthons phosphoramidites ou hydrogénophosphonates, permet également le décrochage du support de l'oligonucléotide formé. Dans le cas de la méthode utilisant des synthons phosphodiesters, ce décrochage se produit lors du traitement avec un mélange de syn-2-nitroben∑aldoxime et de 1,1,3,3-tétraméthylguanidine. Plus précisément, on pourra utiliser soit une solution basique de soude par exemple à une concentration de 0,1 à 0,5 M des nucléotides, dans un solvant tel qu'un mélange eau/méthanol, à une température de 15 à 80 °C, soit grâce à une solution d'ammoniaque par exemple à une concentration de 20 à 40% massique, à une température de 15 à 65 °C, soit une solution de carbonate de potassium par exemple à une concentration de 0,02 à 0,1 M, dans un solvant tel que le méthanol, à une température de 15 à 30 °C, soit une solution de méthyiamîne et d'ammoniaque (ÂMÂ) par exemple à une concentration de 10% à 20% massique chacun, dans un solvant tel que l'eau, à une température de 15 à 65 °C, soit une solution de 10% dilsopropylamsne/0,25 M B-mercaptoethanol dans un solvant tel que le méthanol, à une température de 45 à 65 °C, soit de l'ammoniac ou de la méthylamine en phase gazeuse, par exemple à une température de 15 à 30 °C, De préférence, un traitement basique avec une solution de carbonate de potassium à une concentration de 0,02 à 0,1 H, dans le méthanol, à une température de 15 à 30 °C, est réalisé.

Dans le cadre du procédé selon l'invention, il est possible d'utiliser à l'étape 1) du premier cycle un support (Sa) conforme à l'invention, ce qui va permettre d'introduire à l'extrémité 3 ^f de Toligonucléotide synthétisé un dérivé de diaminophénothiazinium.

Il est également possible lors de n'importe quel cycle d'utiliser un dérivé de diaminophénothiazinium (I), et notamment (la) ou (Ib) à l'étape 3) à la place du synthon nucléotidique porteur d'une fonction phosphoramidite et d'une fonction hydroxyle protégée. Ceci permet d'intégrer un dérivé de diaminophénothiazinium à l'intérieur de Toligonucléotide, à la place d'un nucléotide. L'utilisation à l'étape 3) du dernier cycle d'un dérivé de diaminophénothiazinium (le) va permettre l'introduction à l'extrémité 3' du groupement diaminophénothiazinium.

Bien entendu, toutes ces possibilités peuvent être combinées pour incorporer différents groupements diaminophénothiazinium au sein de l'oligonucléotide formé.

Les exemples donnés ci-après, en référence aux figures annexées, illustrent l'invention mais n'ont aucun caractère limitatif. La Figyre î montre les potentiels d'oxydo-réduction du bleu de méthylène et d'un composé selon l'invention Incorporé à un oligonucléotide conformément à l'exemple 1.

La Figyre 2 montre évolution des pourcentages d'absorbance en fonction du temps de différents dérivés de bisaminophénylthiazinium, en milieu basique.

dimé (dibutylamin iéthanolamino) phénothiazînium t préparé conforme -des

Une solution diode (15.2 g, 60 mmol) dans le e (450 mL) est ajoutée goutte à goutte pendant 2h30 à une solution le phénothiazine (4,0 g, 20 mmol) dans le chloroforme (120 mL), dans î ballon de IL sous agitation magnétique dans un bain de glace. Après la fin de l'addition, le mélange est agité dans un bain de glace pendant toute la nuit

Le mélange réactionnel est filtré sur verre fritte. Le solide est lavé avec 900mL de chloroforme pour éliminer l'excédent diode. Le solide est séché sous pression réduite pendant 2h. Une poudre gris-pourpre est obtenue avec un rendement quantitatif (14,5 g, 20 mmol).

.RMN... ¹ H (DMSO-d6) : δ (ppm) = 8.06 (d, 2H); 7.92 (d, 2H); 7,73 (t, 2H); 7,61 (t, 2H)

(ESI- ) : masse calculée - 198.0, masse mesurée = 198,0

Le tétraiodure de phénothiazinium (14.5 g, 20 mmol) est dissous dans 290 mL de méthanol à température ambiante. La dibutylamine (6.7 mL _? 40 mmol, 2 éq) est ajoutée goutte à goutte à la solution de phénothiazinium, sous agitation magnétique. Le mélange réactionnel est contrôlé par CCN dans un éluant constitué d ^f un mélange CH2CI2/CH3OH 95/5 (v/v),

Après 2h de réaction, le mélange est filtré sur verre fritte. Un précipité est récupéré sur le frltté, après lavages avec 3 fois 30 mL de méthanol. Le solide est séché sous pression réduite pendant ih30. Une poudre gris- pourpre est obtenue avec un rendement de 53% (7.45 g, 10.5 mmol).

Bi H (CD ₃ C ) : δ (ppm) = 8.25-7.55 (m, 7H, H arom.); 3.85 (m, 4H, 2xlM~ CH ₂ ); 1.80 (m, 4H, 2xCH ₂ ); 1.50 (m, 4H, 2xCH _z -CHQ; 1.01 (m, 6H _f 2xCH ₃ ) SM (ESI+) : masse calculée ~ 325.2, masse mesurée - 325.2

Le iodure de (dïbutylamino)phénothiazinium (7,45 g ₍ 10.5 mmol) est dissous dans 150 mL de méthanol à température ambiante (22°C). Une solution de diéthanolamine (2.22 g, 21 mmol, 2 éq) diluée dans le méthanol (35 mL) est préparée puis ajoutée goutte à goutte par une ampoule à brome à la solution de phénothiazinium, sous agitation magnétique à température ambiante. Le mélange réactionnel est contrôlé par CCN dans un éluant constitué d'un mélange CH2CI2/CH3OH 9/1 (v/v),

Après 3h de réaction, le mélange est concentré à Tévaporateur rotatif, Le produit est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant CH2CI2 CH3OH, 95/5, v/v), Un solide pourpre est obtenu avec un rendement de 49% (2.85 g, 5,13 mmol).

RMN ^l (CD ₃ CN) : δ (ppm) - 7.90-7.22 (m, 6H, H arom.); 3.87 (m, 8H, 4x - CH ₂ ); 3,63 (m, 4H, 2xÇH _z -OH); 1.71 (m, 4H _# 2xN-CH?~CH _z ); 1.45 (m, 4H _f 2xCH2~CH ₃ ); 1.01 (m, 6H, 2xCH ₃ )

8M (ESI+) : niasse calculée = 428.2, masse mesurée ~ 428.3

Le iodure de (dibut lamino)-(diéthanolamino) phénothiazsnsum (2,85 g, 5.13 mmol) est introduit dans un ballon de 500 mL préalablement séché à l'étuve. L'acétonitrile anhydre (300 mL) est ajouté sous atmosphère d ^f argon. La diisopropyléthylamine DIPEA (900 μΐ, 5.13 mmol, 1 éq) est ajoutée puis une solution de chlorodiméthoxytrityle (1.56 g, 4.62 mmol, 0.9 éq) dans 80 mL d'acétonitrile anhydre est additionnée goutte à goutte à la seringue, Le milieu réactionnel est agité à température ambiante, La réaction est suivie par CCM dans DCM/MeOH/TEA 89/10/1, v/v/v.

Après lh30, la réaction est arrêtée par l'ajout de 1 mL de méthanol. La solution est concentrée à l'évaporateur rotatif. Le produit est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant CHjC /CHsOH/Eta , 94/5/1, v/v/v). Un solide pourpre est obtenu avec un rendement de 52% (2.28 g, 2,66 mmol).

RMN.^H (CD ₃ C ) : δ (ppm) - 7.90-6.75 (m, 19H, H arom,); 3.75 (m, 4H, 2xN~CH ₂ ); 3.66 (s, 6H, 2xOCH ₃ ) ; 3.66-3.45 (m, 8H, 2x ~CH ₂ et 2xCH _r QH); 1.70 (m, 4H, 2xN-CH _? -CH _z ); 1.45 (m, 4H _f 1.01 (m, 6H, 2xCH ₃ ) S (ESI+) ; niasse calculée = 730.4, masse mesurée ~ 730.7 Le lodure de diméthoxytrity!-{dibuty!amino}~(diéthano!amino) phénothîazinium (2,28 g _f 2,66 mmol) est co-évaporé deux fois dans 20 mL d'acétonitrile anhydre, puis repris dans 50 mL d'acétonitrile anhydre, La diisopropyléthylamine (930 μΙ_, 532 mmol, 2 éq) est ajoutée sous atmosphère d'argon, puis la chlorophosphîne (710 pL, 3.19 mmol, 1.2 éq) est additionnée goutte à goutte à ia seringue. Le milieu réactionnel est agité à température ambiante. La réaction est suivie par CCM dans CH ₂ a2/CH ₃ aM/Et ₃ 49/49/2, v/v/v.

Après 30 min de réaction, la solution est concentrée à l'évaporateur rotatif. Le produit est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant £¾(¾/ EtaN, 99/1). Une huile pourpre est obtenue avec un rendement de 26% (743 mg, 0.70 mmol).

RMN ³¹ P (CD ₃ CN) ; δ (ppm) = 149.3

SM (ESI+) : masse calculée = 930.5, masse mesurée = 930.5

Cet exemple illustre l'incorporation de l'iodure de diméthoxytrityl-

(dibutylamino)-(diéthanolamino) phénothîazinium phosphoramldite (composé 1.1) dans la synthèse d'un oligonucléotide de formule : 5 - d(XGGGA GGGAGÂAGACGTCCÂAAAÂCTTTCCCYY)-3 ^f

Dans cette séquence, A représente l'adénosine, C la cytidine, G la guanosine, T la thym!dine, X le (dibutylamino)-(diéthanolamino) phénothîazinium et Y le 1,2-dithiane qui permettra le greffage de l'oHgonucléotide sur une surface d'or pour les caractérisations électrochimiques. La synthèse est effectuée en utilisant les synthons phosphoramidites correspondants protégés en position 5' par un groupe diméthoxytntyle. Pour l'adénosine, la fonction aminée exocyclique est protégée par le groupement phénoxyacétyle. Pour la cytidine, la fonction aminée exocyci!que est protégée par le groupement acétyle, Pour la guanosine, la fonction aminée exocycllque est protégée par le groupement isopropylphénoxyacétyle.

La synthèse a été effectuée au moyen d'un synthétiseur automatique d'olïgonucléotides Applied Biosysterns D Â/RNÂ 394 en utilisant :

- 1 poiole d'une molécule dïalcool dithiane (4-0~dirnéthoxytrityl cydodithioerythritol) greffée sur un support « Controiled Pore Glass » fonctionnalisée par des chaînes aminées, la liaison entre le 4-0- dirnéthoxytrityl cyclodithioerythritol et l'aminé étant réalisée par un radical succinyl comme décrit dans l'article de P, Liepold, T. Kratzmûller, N. Persike, M. Bandilla, M. Hinz, H, ieder, H. Hillebrandt, E. Ferrer, G. Hartwich, Anal. Bioanal. Chem. (2008) 391:1759-1772.

- 15 pmoles de (dibutylamino)-(dié hanolamino) phénothiazinium ou de synthons d'adénosine, cytidine, guanosine, thymidine ou dithiane par cycle de synthèse suivant la séquence préalablement programmée,

Dans une première étape, le groupement Diméthoxytrityle de la molécule dithiane greffée sur la CPG est clivé par un traitement à l'acide trichloroacétique à 3% massique dans le dichlorométhane, à température ambiante pendant 120s, libérant une fonction hydroxyle.

Dans une deuxième étape, un synthon porteur d'une fonction phosphorarnidite et d'une fonction hydroxyle protégée par un groupement diméthoxytrityle, à une concentration de 0.1 H dans Tacétonitrile est couplé, en présence de tétrazole à une concentration de 0.45 M dans i'acétonitrile, à température ambiante, pendant 30s pour les phosphoramldites A, T, C et G, 360s pour le dithiane phosphorarnidite et 60s pour le (dibutylamino)- (diéthanolamino) phénothiazinium phosphorarnidite,

Dans une troisième étape, les fonctions hydroxyles qui n'ont pas réagi à étape précédente sont bloquées par une solution d'anhydride phénoxyacétique/pyridine/tétrahydrofurane (1:1:8), en présence de méthyli idazole à 16% massique dans le tétrahydrofurane, à température ambiante pendant 20s.

Dans une quatrième étape, le phosphite triester est oxydé en phosphate triester par une solution d'iode à une concentration de 0,02 M dans un mélange eau/pyridine/tétrahydrofurane (l:2:7) _f à température ambiante pendant 30s.

Les quatre étapes sont répétées autant de fois que nécessite la séquence programmée,

A la fin de la synthèse,, Toligonudéotide est désolidarisé du support par traitement au carbonate de potassium à 0,05 M dans le méthanol anhydre (lmL), à température ambiante pendant 6h. La solution est ensuite neutralisée par ajout de 1.5mL d'acétate de tétraéthylammonium 2 M dans l'eau, puis filtrée sur filtres Âmicon 3K (Millipore) pour éliminer les sels et composés issus de la déprotection de l'ollgonucléotide.

L'ollgonucléotide est purifié par chromatographie liquide à haute performance (CLHP) sur une colonne phase inverse Licrospher RP18. L'élution de Toligonucléotide marqué par le dérivé phénothiazinium est suivie par absorption visible à 677nm. Les fractions correspondantes sont recueillies et concentrées dans un évaporateur SpeedVac.

Le produit est analysé par spectrométrie de masse MÂLDI-ToF par co- cristallisation dans une matrice d'acide 3-hydroxypicolinique, La masse mesurée (18813 Da) correspond à la masse calculée (18814 Da) ce qui prouve que le dérivé phénothiazinium n'a pas été dégradé dans les conditions de synthèse et de déprotection de l'ollgonucléotide.

Une comparaison des propriétés oxydo-réductrices du diméthylamino phénothiazinium (bleu de méthylène) et du synthon (dibutylamino)- (diéthanolamino) phénothiazinium incorporé sur un oligonucléotide est effectuée en utilisant une cellule électrochimique constituée d'une électrode de travail en or, d'une contre-électrode en platine et d'une électrode de référence au calomel saturé, La technique utilisée est la voltamétrie cyclique. Le tampon utilisé est un tampon a ₂ HP04/ H ₂ P04 20mM KC1 250mM de pH 6,7.

Le bleu de méthylène (courbe en pointillés) est étudié en solution (concentration 15.βμΜ). Le synthon modifié (courbe en trait plein) est étudié après greffage sur l'électrode d'or d'une solution contenant 2 nmol de oligonucléotîde marqué. On observe Figure i que les deux courbes montrent des potentiels de réduction et d'oxydation similaires,

Le tétraiodure de phénothiazinium (145 mg, 0.2 mmol) est dissous dans 4 mL de méthanol à température ambiante, La butylbutanolamine (115 μί, 1 mmol; 5 éq) est ajoutée goutte à goutte à la solution de phénothiazinium, sous agitation magnétique. Le mélange réactionnel est contrôlé par COI dans un éluant constitué d'un mélange CH2CI2/CH3OH 9/1 (v/v).

Après 2h de réaction; la solution est concentrée à l'évaporateur rotatif. Le produit est purifié par chromatographie sur gel de silice (éluant CHzCl^CHsOH, 95/5; v/v). Une huile pourpre est obtenue avec un rendement de 41% (50 mg, 0.08 mmol).

M id (CD3CIM) 1 δ (ppm) - 7.90-7.23 (m _f 6H, H arom.); 3.60 (m _f 8H, 4xM- CH ₂ ); 3.00 (m, 4H, 2xCH ₂ ~QH); 1,90-1,55 (m, 12H, 6xCH ₂ ); 1,50-1.32 (m, 4H, 2xCH _r CH ₃ ); 0.99 (m, 6H, 2xCH ₃ )

SM (ESI+) : masse calculée = 484.3, masse mesurée ~ 484.3

Ce composé est préparé comme à l'exemple 1, 4) et 5), E EMPLE 3 - ETUDE IDE STABILITE

Il a été démontré qu'en incorporant une dibutylamine et une diéthanolamine ou deux butylbutanolam ne, un important gain de stabilité dans une solution de K2CO3 (0 _f 05H) dans du méthanol est obtenu par rapport au composé iodure de bls(diméthylamino)phénothiazinlum (sel de bleu de méthylène) comme illustré sur la Fîgyre 2,

Le TABLEAU ci-dessous met également en évidence les gains de stabilité obtenus avec des aminés autres que les diméthylamines présentes sur le bleu de méthylène.

TABLEAU

Molécules Stabilité après traitement dans K2CO3 G _f Û5 M/MeQH

4h 17h

Bleu de méthylène Ra~Rb~Rc~Rd~ méthyie 5% 0%

Ra-Rb-Rc-Rd- éthyîe 84% 67%

Ra-Rb=Rc-Rd- (2-éthyl)hexyle 92% 74%

Ra ^~ Rb ^~ Rc ^~ Rd ^~ butyle 92% 78%

Ra=Rc~butyle et Rb~Rd~butanol 91% 66%

Ra=Rb=butyle et Rc=Rd=éthanol 73% 25%

Ra=Rb=butyle et Rc-Rd-propanol 89% 58%

Ra-Rb=butyîe et Rc~Rd~hexanol 92% "76% ^"