Eine wichtige Anwendung proteomischer Studien ist die Bestimmung des Unterschieds der Häufigkeiten bestimmter Proteine oder Proteiniso- formen zwischen zwei oder mehr experimentell interessanten Regimen, beispielsweise der Häufigkeit von Proteinen aus Kontrolizellen, Gewe- ben oder Organismen, im Vergleich zu der entsprechenden Häufigkeit aus pharmakologisch behandelten Zellen, Geweben oder Organismen.

Die Proteinintensität für Proteinspots von unterschiedlichen Gelen aus unterschiedlichen experimentellen Regimen in der Untersuchung wer- den typischerweise verglichen, um zu bestimmen, ob die Menge an Pro- tein in diesen Proteinspots sich zwischen den experimentellen Regimen unterscheidet. Dies ist ein Prinzip differentieller Darstellung, die auch als Multicolouranalyse bezeichnet wird. Die Zuordnung von Proteinspotko- ordinaten und die Identifizierung entsprechender Proteinspots auf ver- schiedenen 2D-Gelen wird Matchingverfahren (matching procedure) ge- nannt und ist wegen des nicht reproduzierbaren Verhaltens verschiede- ner Gele, die durch 2D-PAGE erzeugt werden, potentiell problematisch. Deshalb ist das Matchingverfahren ein zeitaufwändiger Schritt und ist derzeit nur wenig automatisierbar.

Es kann beispielsweise durch Messen der verschiedenen Proben in ver- schiedenen experimentellen Systemen eine grobe Multicolouranalyse

durchgeführt werden. Hierbei können beispielsweise Proteine aus unter- schiedlichen Proben in jeweils separaten 2-D-PAGE-Experimenten be- handelt werden, gefolgt von einem Nachweis der Spots, die Proteinen in den verschiedenen 2D-PAGE-Gelen entsprechen, und Vergleich der für jede Proben von jedem Gel oder jeder Gruppe von replizierten Gelen erhaltenen Spotmuster. Die Spotmuster werden typischerweise in gra- phie chen Gel-Bilddateien gespeichert, wie z. B. TIFF-Dateien. Her- kömmliche Softwareprogrammalgorithmen richten diese Gel-Bilddateien zueinander aus, so dass Pixel in allen Bildern mit Pixeln aus anderen Bildern verglichen werden können. Typischerweise wird ein"zusam- mengesetztes Gel-Bild" (composite gel image) aus replizierten 2D- PAGE-Gel-Bildern für eine Probe hergestellt, das Mittelwerte der Spotin- tensitäten von allen Replikatgelen für eine bestimmte Probe enthält. Die Kompositgele aus verschiedenen Proben werden typischerweise mitein- ander verglichen, um Unterschiede in Proteinhäufigkeiten zwischen den Proben aufzuzeigen. Die beiden Haupteinschränkungen dieses Ansat- zes sind Spotmatching, das die korrekte Zuordnung der entsprechenden Spots ermöglicht und die quantitative Auswertung der Spots, die einen Vergleich der Proteinmengen in Spots aus verschiedenen 2D-Gelen er- möglicht.

Um eine feinere differentielle Darstellung zu erzeugen, werden Analy- satmoleküle aus verschiedenen Proben typischerweise mit Reagenzien markiert bzw. modifiziert, so dass die Proben vermischt und gemeinsam analysiert werden können. So kann das aufwändige und fehlerträchtige Matchingverfahren vermieden werden. Anschliessend können die Prote- ine von jeder Probe aufgrund ihrer Markierung unabhängig vom Vorhan- densein der Proteine aus der (den) anderen Probe (n) nachgewiesen werden.

Ein Beispiel sind die DIGE-Fluoreszenzreagenzien auf Basis von Cye- Farbstoffen, die von Amersham Biosciences (Freiburg, Deutschland) angeboten werden. Proteine aus beiden Proben werden mit unterschied-

lichen Fluoreszenzreagenzien separat markiert, dann vermischt und gemeinsam der Elektrophorese in 2D-PAGE unterzogen. Die verschie- denen Fluoreszenzgruppen in jeder Probe werden durch unterschiedli- che Wellenlängen angeregt und emittieren Licht bei unterschiedlichen Wellenlängen. Durch Verwendung geeigneter Lichtfilter ist es möglich, Bilder von Proteinen jeder Probe zu erhalten, unabhängig von der Verteilung der Proteine aus der anderen Probe. Diese Bilder können dann durch entsprechende Softwarepakte analysiert werden.

Ein weiterer Ansatz für eine feinere differentielle Darstellung ist die Mar- kierung von Analysatmolekülen aus verschiedenen Proben mit radioaktiv strahlenden Isotopen. Die radioaktive Markierung von Analysatmolekü- len und ihr Nachweis durch geeignete Detektoren ist um mehrere Grös- senordnungen empfindlicher als andere Verfahren, beispielsweise das oben genannte Verfahren unter Verwendung von Cye-Farbstoffen.

Ein Analyseverfahren, bei dem Analysatmoleküle mit radioaktiv strah- lenden Isotopen markiert werden, ist beschrieben in : Monribot-Espagne C, Boucherie H, Differential gel exposure, a new methodology for the two-dimensional comparison of protein samples.

Proteomics, 2002, 2 : 229-240.

Bei der Markierung von Analysatmolekülen mit radioaktiv strahlenden Isotopen ist es notwendig, die radioaktive Strahlung bzw. die Aktivität der Isotope zu bestimmen. Die Kerne radioaktiver Isotope sind instabil.

Sie neigen dazu unter Freisetzung von Partikeln oder Photonen spontan zu zerfallen. Durch radioaktive Substanzen werden mehrere verschie- dene Arten von Partikeln freigesetzt. Von allgemeiner Bedeutung sind das Elektron, das Positron, das Alphateilchen und das Neutron. Die E- mission dieser Partikel ist häufig, aber nicht immer, begleitet von der Ausstrahlung von Gammastrahlen. Eine andere Art des radioaktiven Zerfall ist der spontane Einfang eines Elektron der K-Schale durch

den Kern, was als K-Elektroneneinfang bekannt ist. Strahlungsdetekto- ren sind Geräte, die entwickelt wurden, um diese verschiedenen Arten von Strahlung nachzuweisen.

Die folgenden räumlich auflösenden Detektoren werden zur quantitati- ven Analyse von radioaktiven Molekülen verwendet, die in einem Array odef auf einer Oberfläche, wie einem DNA-Array oder einem 2D-PAGE- Proteingel, vorhanden sind und ersetzen zu diesem Zwecke einen pho- tographischen Film. Von den vier zitierten Beispielen beruhen die Detek- tortypen 2,3 und 4 auf den obigen Prinzipien.

1. Autoradiographie mit Phosphorimagern, die gemäss der Prinzipien von Geräten arbeiten, die eine Bildplatte verwenden, wie die derzeit von den Firmen Fuji Photo Film Co. Ltd (Tokio), Packard Bioscience GmbH (Dreieich Deutschland), AGFA-Gevaert N. V. (Mortsel, Belgien) oder Amersham Biosciences (Freiburg, Deutschland) angebotenen Geräte.

Amemiya Y, Miyahara J. Imaging plate illuminates many fields. Nature, 1988,336 : 89-90.

Miyahara, J. The imaging plate : a new radiation image sensor. Che- mistry Today, 1989, 223 : 29-36.

2. PPAC-lonisationsgaskammern (parallel plate avalanche chamber), die mit Mikrokanalplattenanalysatoren (Microchannel Plate Analysers) zum Nachweis von Betapartikeln gekoppelt sind, wie der Beta Imager, der von BioSpace Measures (Paris), und ein ähnliches Gerät, das von Packard Bioscience (Dreieich, Deutschland) vertrieben wird.

Bei diesen Imagern wird Licht von den PPAC durch eine Linse in eine Mehrfaserbildverstärkerröhre fokussiert, von der das Signal durch eine CCD-Kamera erfasst wird.

Laniece P, Charon Y, Dumas S, Mastrippolito R, Pinot, L, Tricoire H, Valentin L. HRRI : a high resolution radioimager for fast, direct quantifica- tion in in situ hybridization experiments. Biotechniques, 1994,17 : 338- 345.

Crumeyrolle-Arias M, Latouche J, Laniece P, Charon Y, Tricoire H, Va- lean L, Roux P, Mirambeau G, Leblanc P, Fillion G, et al."In situ"char- acterization of GnRH receptors : use of two radioimagers and compari- son with quantitative autoradiography. J. Recept Res, 1994,14 : 251-265.

Jeavons, AG. Method and apparatus for quantitative autoradiography analysis. 11. August 1992. USA-Patent 5138168. Inhaber : Oxford Posi- tion Systems Limited.

Decristoforo C, Zaknun J, Kohler B, Oberladstaetter M, Riccabona G.

The use of electronic autoradiography in radiopharmacy. Nucl. Med.

Biol, 1997,24 : 361-365.

3. Geräte wie der Micro Imager (BioSpace Measures, Paris), bei dem eine Szintillationsfläche zum Nachweis von Beta-Gamma-und Alpha- partikeln mit Mikrokanalplattenanalysegeräten gekoppelt ist. In diesen Imagern tritt Licht von der Szintillationsfläche in eine Mehrfaserbildver- stärkerröhre ein, von der das Signal durch eine CCD-Kamera eingefan- gen wird.

Laniece P, Charon Y, Dumas S, Mastrippolito R, Pinot, L, Tricoire H, Valentin L. HRRI : a high resolution radioimager for fast, direct quantifica- tion in in situ hybridization experiments. Biotechniques, 1994,17 : 338- 345.

Crumeyrolle-Arias M, Latouche J, Laniece P, Charon Y, Tricoire H, Va- lentin L, Roux P, Mirambeau G, Leblanc P, Fillion G, et al."In situ"char-

acterization of GnRH receptors : use of two radioimagers and compari- son with quantitative autoradiography. J. Recept Res, 1994,14 : 251-265.

Jeavons, AG. Method and apparatus for quantitative autoradiography analysis. 11. August 1992. USA-Patent 5138168. Inhaber : Oxford Posi- tion Systems Limited.

Decristoforo C, Zaknun J, Kohler B, Oberladstaetter M, Riccabona G.

The use of electronic autoradiography in radiopharmacy. Nucl. Med.

Biol. 1997,24 : 361-365.

4. Szintillationskristallarrayimager, die einen räumlich auflösenden Pho- tomultiplier verwenden, wie die MPD-Imager (Multi Photon Detection), die von BioTraces Inc. (Herndon VA, USA) und ProteoSys AG (Mainz, Deutschland) vertrieben werden.

Drukier AJ, Sagdejev IR, Ultralow background multiple photon detector.

2. Februar 1999. USA Patent 5,866, 907. Inhaber : BioTraces, Inc. (Hern- don, VA).

Im Gegensatz zu den obigen Detektortypen 2,3 und 4 ist eine Phospho- rimagerbildplatte (Phosphorimager Imaging Plate, Phosphorimager-IP) ein filmartiger Strahlungsbildsensor, der speziell konstruierten Phosphor enthält, der die Strahlungsenergie aufnimmt und speichert, damit sie zu einem späteren Zeitpunkt wieder freigegeben und in einem geeigneten Phosphorimagerauslesegerät gemessen werden kann. Ein Phosphori- magergerät ist ein kombiniertes System bestehend aus einem Phospho- rimagerauslesegerät und einer Phosphorimagerbildplatte, das nachfol- gend als Phosphorimager bezeichnet wird. Ein Phosphor ist ein Pulver oder eine kristalline Substanz, die nach Einwirkung von Photonen be- stimmter Eigenschaften oder chemischer Reaktionen Licht emittiert.

Lichtemission (Lumineszenz) von einem Phosphor kann momentane (Fluoreszenz), verzögerte (Phosphoreszenz) oder photostimulierte Lu-

mineszenz (PSL) sein. Der Phosphor der Phosphorimager-IP nutzt das PSL-Phänomen, das weder Fluoreszenz noch Phosphoreszenz ist. PSL verwendet eine Substanz, welche die Energie einer ursprünglichen Sti- mulation, beispielsweise die Energie eines Photons, das von einem ra- dioaktiv zerfallenden Atom emittiert wird, in den Elektronenorbitalen von Atomen des Phosphors speichert. Diese Energie wird als Licht emittiert, wenn der Phosphor durch Licht mit einer größeren Wellenlänge als die der ersten Stimulation stimuliert wird. Auf diese Weise speichert der Phosphor Information über die Menge an Strahlung, der er ausgesetzt war, und gibt diese Information als Licht ab, das in einem geeigneten Gerät, wie einem im Handel erhältlichen Phosphorimager, quantitativ analysiert werden kann.

Die Bestrahlung von Proben im Phosphorimager wird in ähnlicher Weise durchgeführt wie die Belichtung eines Photofilms. Die bestrahlte Phosphorimager-IP wird während der Beförderung, mit einem fokussier- ten Laserstrahl abgetastet (beispielsweise einem He-Ne-Laser). Die bei Bestrahlung der Phosphorkristalle mit dem Laserlicht freigesetzte PSL wird in einem Photomultiplierrohr (PMT, photomultiplier tube) durch ei- nen Lichtsammelleiter gesammelt und in elektrische Signale umgewan- delt.

Von den Typen radioaktiver Messgeräte wie sie oben diskutiert wurden (Phosphorimagers, PPAC-lonisationsgaskammerdetektoren, Szintillati- onskristallarrayimager mit einem räumlich auflösenden Photomultiplier, durch eine CCD-Kamera abgebildete Szintillatorfläche), können Szintilla- tionskristallarrayimager verschiedene Isotope unter Verwendung von Energie und Partikeltyp (beta/gamma) durch Analysieren der nachge- wiesenen Impulsform verschiedener emittierter Partikel differenzieren.

PPAC-lonisationsgaskammerdetektoren (z. B. Beta Imager) und von ei- ner CCD-Kamera abgebildete Szintillationsflächen (z. B. Micro Imager) erfordern den Nachweis der äußerst schwachen Betapartikel von H-3 zusätzlich zu einem anderen Isotop, um verschiedene Radioisotope zu

unterscheiden, wie es der Hersteller in seiner Beschreibung angibt. Die- se Detektoren können mit H-3 markierte Proteine nicht direkt aus einem 2D-PAGE-Gel nachweisen, weil die Polyacrylamidmatrix die schwachen H-3 Betapartikel absorbiert. Analysatmoleküle müssen aus dem Polyac- rylamidgel entfernt werden, beispielsweise durch Blotting auf eine Membran, damit sie durch PPAC-lonisationsgaskammerdetektoren nachgewiesen werden können. Dies ist zeitaufwändig und funktioniert beispielsweise für Proteine mit unterschiedlichem Molekulargewicht nur mit variabler Effizienz. Mit stärkeren betaemittierenden Isotopen, wie S- 35, markierte Analysatmoleküle können durch lonisationsgaskammern effizient sichtbar gemacht werden, während sie sich noch in einer Poly- acrylamidgelmatrix befinden, und brauchen nicht geblottet zu werden.

Szintillationskristallarrayimager, die einen räumlich auflösenden Photo- multiplier verwenden und lonisationsgaskammern belegen jedoch ein Gerät für die gesamte Zeit der radioaktiven Bestrahlung. Deshalb sind Analysen, beispielsweise in Protein-oder Genomstudien, die einen ho- hen Durchsatz erfordern sehr teuer.

Nachfolgend werden weitere herkömmliche differentielle Nachweisver- fahren beschrieben, die jedoch nicht zu einem differentiellen Nachweis von Analysatmolekülen auf einer Trägerfläche verwendbar sind.

Die quantitative Bestimmung von der in einer Materialprobe vorhande- nen Konzentration von zwei unterschiedlichen Elementen unter Verwen- dung von zwei Messungen mit einem Detektor ist beschrieben in : Sastri et al., Anal. Chem., 1981,53 : 765-770.

Bei diesem Verfahren wird jedoch lediglich die Konzentration der Ele- mente in der Materialprobe, nicht jedoch deren Ortsverteilung, bei- spielsweise auf der Probenoberfläche, berechnet. Das hier beschriebe- ne Verfahren eignet sich daher nicht zur differentiellen Analyse von Ana- lysatmolekülen, die mit unterschiedlichen Isotopen markiert werden.

Die hyperspektrale Verarbeitungssoftware MultiSpecO der Purdue Uni- versity (Purdue Research Foundation, West Lafayette, IN) verwendet Spektralmessungen von Bildern, um verschiedene Merkmale von Satelli- tenbildern zu extrahieren bzw. zu identifizieren. Das MultiSpecK)- Konzept sieht vor, die spektrale Besetzung von Pixeln von einem Bild in eine Reihe von Bildern zu zerlegen, die alle von einem Stammbild abge- teilt sind, für das die primären Daten alle gleichzeitig aufgezeichnet wurden. Bei diesem Verfahren werden folglich, ausgehend von einem Stammbild, verschiedenen von diesem Ursprungsbild abgeleitete Bilder durch mathematische Verfahren erzeugt.

David Landgrebe, Information Extraction Principles and Methods for Multispectral and Hyperspectral Image Data, Chapter 1 of Information Processing for Remote Sensing, herausg. von C. H. Chen, veröffentlicht von der World Scientific Publishing Co., Inc, 1060 Main Street, River Edge, NJ 07661, USA, 2000.

Da die radioaktive Markierung von Analysatmolekülen oft das Mittel der Wahl ist, um die in vielen Untersuchungen, beispielsweise biologischen Untersuchungen, erforderliche analytische Leistung zu erreichen, und da der differentielle Nachweis von Analysatmolekülen aus zwei oder mehr Proben in einer Analyse wünschenswert ist, besteht ein großer Bedarf einen derartigen differentiellen Nachweis mit radioaktiv markierten Ana- lysaten oder anderen Molekülen durchzuführen.

Aufgabe und Lösung Aufgabe der Erfindung ist es daher eine Verfahren bereitzustellen, wel- ches differentielle Analysen, beispielsweise in Protein-oder Genomstu- dien, mit hoher analytischer Leistung und hohem Durchsatz bei ver- gleichsweise geringen Kosten ermöglicht und die beschriebenen Nachteile des Standes der Technik überwinden hilft.

Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1. Bevorzugte Weiterbildungen der Erfindung sind in den ab- hängigen Ansprüchen 2 bis 19 aufgeführt. Der Wortlaut sämtlicher An- sprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht. zon Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird die Ortsverteilung von min- destens zwei Mengen von Punktstrahlungsobjekten mit jeweils mengen- spezifischem Strahlungstyp auf einer gemeinsamen Trägerfläche mit folgenden Schritten bestimmt : a) Ermitteln einer ersten Ortsverteilung der Strahlungsintensität der Trägerfläche, b) Verändern der Strahlungs- intensität mindestens eines mengenspezifischen Strahlungstyps mit ei- nem zugehörigen Veränderungsfaktor, c) Ermitteln mindestens einer zweiten Ortsverteilung der Strahlungsintensität der Trägerfläche und d) Berechnung der Ortsverteilungen jeder der mindestens zwei Mengen von Punktstrahlungsobjekten einzeln aus der ersten und der mindestens zweiten ermittelten Ortsverteilung.

Unter Ortsverteilung von Punktstrahlungsobjekten ist beispielsweise die Strahlungsintensität und/oder die Anzahl der jeweiligen Punktstrah- lungsobjekte pro Flächeneinheit über dem Ort bzw. über der zu untersu- chenden Trägerfläche zu verstehen. Es werden die Ortsverteilungen von mindestens zwei Mengen von Punktstrahlungsobjekten mit jeweils men- genspezifischem Strahlungstyp untersucht. Ein Punktstrahlungsobjekt ist ein Objekt, beispielsweise ein Atom bzw. dessen Isotop und/oder ein Molekül bestehend aus Gruppen von Atomen bzw. Isotopen, das seine spezifische Strahlung nach allen Seiten, d. h. über den Raumwinkel, gleichmäßig oder zumindest idealisiert gleichmäßig abgibt. Bei dem mengenspezifischen Strahlungstyp kann es sich beispielsweise um Al- pha-, Beta-, Gamma-und/oder Röntgenstrahlung und/oder um Licht mit einer spezifischen Wellenlänge handeln. Die mindestens zwei Mengen bestehen jeweils aus Punktstrahlungsobjekten mit gleichem, mengen-

spezifischen Strahlungstyp und befinden sich gemeinsamen auf der Trägerfläche. Die Trägerfläche ist ein im wesentlichen flächiges Gebilde, beispielsweise ein 2D-PAGE-Gel.

In dem ersten Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens wird eine erste Ortsverteilung der Strahlungsintensität, d. h. die Strahlungsleistung pro% Flächeneinheit, der Trägerfläche ermittelt.

In dem zweiten Schritt b) wird die Strahlungsintensität mindestens eines mengenspezifischen Strahlungstyps mit einem zugehörigen Verände- rungsfaktor, der bekannt ist oder bestimmt bzw. berechnet werden kann, verändert. Die Veränderung kann eine Reduktion oder eine Verstärkung der Intensität des mengenspezifischen Strahlungstyps sein. Der Verän- derungsfaktor wird in % angegeben, wobei 0% eine vollständige Unter- drückung der Strahlungsintensität, 100% ein Gleichbleiben der Strah- lungsintensität und Werte größer als 100% eine Verstärkung der Strah- lungsintensität bedeuten.

Es können alle Intensitäten der mengenspezifischen Strahlungstypen, nur ein Teil der Intensitäten der Strahlungstypen oder nur eine Intensität eines Strahlungstyp durch einem zugehörigen Veränderungsfaktor ver- ändert werden. Das Verhältnis bzw. die Verhältnisse der Veränderungs- faktoren der mengenspezifischen Strahlungstypen weist bzw. weisen vorzugsweise einen Wert bzw. Werte ungleich 1 auf, d. h. die Verände- rungsfaktoren der mengenspezifischen Strahlungstypen unterscheiden sich vorteilhafterweise untereinander.

In einem weiteren Schritt c) wird nach der Veränderung der Strahlungs- intensitäten mindestens eine zweite Ortsverteilung der Strahlungsinten- sität der Trägerfläche ermittelt.

In einem vierten Schritt d) werden die Ortsverteilungen jeder der mindes- tens zwei Mengen von Punktstrahlungsobjekten einzeln aus der ersten und der mindestens zweiten ermittelten Ortsverteilung berechnet.

Durch die Berechnung wird auf Basis der ermittelten mindestens zwei Ortsverteilungen die Ortsverteilung jeder Menge von Punktstrahlungsob- jekten auf der Trägerfläche separat ermittelt, unabhängig von der Vertei- lung der anderen Mengen von Punktstrahlungsobjekten auf der Träger- fläche. Die Auftrennung in die mengenspezifischen Ortsverteilungen er- folgt nicht bereits durch den Detektor, sondern erst durch Berechnung auf Basis der ermittelten Ortsverteilungen, die eine Überlagerung der detektierten Signale der einzelnen Strahlungsquellen darstellen.

In einer vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird der Verände- rungsschritt b) und der Schritt c) zur Ermittlung der mindestens zweiten Ortsverteilung der Strahlungsintensität der Trägerfläche mit einem un- terschiedlichen Veränderungsfaktor mindestens einmal wiederholt. Dies ist notwendig, wenn mehr als zwei Mengen von Punktstrahlungsobjekten analysiert werden sollen, da zur Bestimmung der einzelnen Ortsvertei- lung einer Menge mindestens eine Ortsverteilung bei zugehöriger Ver- änderung der Intensität des mengenspezifischen Strahlungstyps ermit- telt werden muss.

Werden nur zwei Mengen von Punktstrahlungsobjekten analysiert, kann durch eine derartige Wiederholung die Genauigkeit des Verfahrens ver- bessert werden. Dies wird insbesondere dadurch erreicht, dass die Ver- änderungsfaktoren durch unterschiedliche Mechanismen, beispielsweise mit Hilfe eines Absorbers und/oder nachfolgend durch radioaktiven Zer- fall, realisiert werden.

In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird eine er- mittelt Ortsverteilung der Strahlungsintensität durch eine zugehörige

Pixelmatrix dargestellt, wobei ein Pixelwert der Matrix die Strahlungsin- tensität eines zugehörigen Orts auf der Trägerfläche repräsentiert.

Bei der Ermittlung der Ortsverteilungen der Strahlungsintensität der Trä- gerfläche, beispielsweise mit einem geeigneten ortsauflösenden Detek- tor, wird die Ortsverteilung der Strahlungsintensität der Trägerfläche in eirRe Matrixanordnung von Pixelwerten umgesetzt, wobei die Pixelwerte proportional zu der vom Detektor ermittelten Strahlungsintensität sein können. Jedes Pixel wird einer definierten Region der Fläche zugeord- net.

In einer weiteren vorteilhaften Weiterbildung der Erfindung wird die Orts- verteilung jeder der mindestens zwei Mengen von Punktstrahlungsobjek- ten einzeln auf Basis der Pixelmatrizen bestimmt.

Bei einem rein illustrativen Beispiel kann die Berechnung, bei einer Ana- lyse von zwei Mengen A und B von Punktstrahlungsobjekten und einem Veränderungsfaktor von 0%, d. h. einer vollständigen Unterdrückung, für den Strahlungstyp der Menge A und einem Veränderungsfaktor von 100%, d. h. einem Gleichbleiben, für den Strahlungstyp der Menge B, wie folgt durchgeführt werden.

Durch die vollständige Unterdrückung des Strahlungstyps A in der zwei- ten ermittelten Ortsverteilung erhält man direkt die überlagerungsfreie Ortsverteilung für den Strahlungstyp B. Durch Subtraktion der zweiten ermittelten Ortsverteilung, bei der nur Signalanteile des Strahlungstyps der Menge B vorhanden sind, von der ersten ermittelten Ortsverteilung, bei der beide Signalanteile vorhanden sind, erhält man die Ortsvertei- lung des Strahlungstyps der Menge A ohne Signalanteile des Strah- lungstyps B.

Das genannte Verfahren ermöglicht, unter Verwendung desselben bzw. eines gleichartigen Detektors, eine Multicolourmessung, d. h. eine ge-

trennte, überlagerungsfreie Darstellung der Ortsverteilung der einzelnen Punktstrahlungsquellen, ermöglicht. Herkömmliche Verfahren erfordern für eine Multicolourdarstellung die originalen Einfarbenbilder von Analy- satmolekülen von jeder Probe. Bei der vorliegenden Erfindung werden die Einfarbenbilder jedes Isotops niemals als solche gemessen, sondern werden aus den mindestens zwei ermittelten Ortsverteilungen bzw. Bil- derh berechnet.

In der Praxis werden die den unterschiedlichen Strahlungstypen zuzu- rechnenden Signalkomponenten vorteilhafterweise um einen Faktor von weniger als 100 % oder 95 % verändert bzw. reduziert. Eine Möglichkeit zur Berechnung der überlagerungsfreien Ortsverteilung der beiden Mengen von Punktstrahlungsobjekten wird nachfolgend ausgeführt.

Für einen exemplarischen Pixelwert der Pixelmatrix der ersten ermittel- ten Ortsverteilung gilt : A+B=X (1) Für den Pixelwert der zweiten ermittelten Ortsverteilung gilt : MA + NB = Y (2) : Wobei A = der Signalbeitrag des Strahlungstyps A in der ersten ermittelten Ortsverteilung B = der Signalbeitrag des Strahlungstyps B in der ersten ermittelten Ortsverteilung X = Pixelwert entsprechend der Strahlungsintensität in der ersten ermittelten Ortsverteilung Y = Pixelwert entsprechend der Strahlungsintensität in der zweiten ermittelten Ortsverteilung M = Veränderungsfaktor für den mengenspezifischen Strahlungstyp A

N = Veränderungsfaktor für den mengenspezifischen Strahlungstyp B A und B sind unbekannt und gesucht.

X und Y sind die gemessenen Intensitäten.

M Fnd N können durch Kalibrierung oder Berechnung bestimmt werden.

Das Verhältnis der Veränderungsfaktoren zweier Strahlungstypen ist definiert als das Verhältnis des Veränderungsfaktors des Strahlungtyps mit dem kleineren Veränderungsfaktor und dem des Strahlungstyps mit dem grösseren Veränderungsfaktor (M/N mit N2M). Entsprechend wer- den die Verhältnisse der Veränderungsfaktoren bei mehr als zwei Strah- lungstypen definiert.

Durch Lösen des Gleichungssystems bestehend aus den Gleichungen (1) und (2) können die Werte für A und B berechnet werden. Diese Be- rechnung kann analog für alle Pixel der Pixelmatrix durchgeführt wer- den.

Ist die Strahlungsintensität bzw. der Signalbeitrag eines Strahlungstyps an einem Ort bekannt, kann dadurch auch die Anzahl der Punktstrah- lungsobjekte pro Flächeneinheit an dem Ort berechnet werden, da die Strahlungsintensität und die Anzahl der Punktstrahlungsobjekt pro Flä- cheneinheit zueinander proportional sind.

In einem allgemeineren Fall mit einer Anzahl P von Mengen von Punkt- strahlungsobjekten, bei dem es notwendig ist, P Ortsverteilungen zu er- mitteln, kann das Problem unter Verwendung einer Matrixdarstellung formuliert werden : F*X=I wobei :

X = ein Vektor mit P Elementen, bestehend aus den Signalbeiträgen der Strahlungstypen der P Mengen von Punktstrahlungsobjekten in der ersten ermittelten Ortsverteilung I = ein Vektor mit P Elementen, bestehend aus den Pixelwerten der P ermittelten Ortsverteilungen F = eine Matrix mit P*P Elementen, bestehend aus den P*P Verän- derungsfaktoren, die für die P ermittelten Ortsverteilungen für die P verschiedenen Mengen von Punktstrahlungsobjekten berech- net oder bestimmt wurden.

Die einzelnen Signalbeiträge der Strahlungstypen des Vektors X können durch Inversion der Matrix F gemäss folgender Gleichung berechnet werden : X= F-1* 1 In einer Weiterbildung der Erfindung wird die Ortsverteilung jeder der mindestens zwei Mengen von Punktstrahlungsobjekten einzeln auf Ba- sis von Intensitäten bestimmt, die sich durch die Summation von Pixel- werten definierter, insbesondere benachbarter, Elemente der Pixelmatrix ergeben. Anstatt den Algorithmus wie oben beschrieben für eine pixel- weise Analyse zu verwenden, können auch die aufsummierten Pixelin- tensitäten bestimmter Bereiche verwendet werden, die für die erste und die zweite ermittelte Ortsverteilung errechnet werden können. Dies ist besonders bei stark verrauschten Signalen oder in solchen Fällen emp- fehlenswert, bei denen die räumliche Verteilung der Signale auf dem De- tektor für die verschiedenen Mengen von Punkstrahlungsobjekten ver- änderlich ist.

Vorzugsweise werden mehr Messungen der Ortsverteilungen unter ver- änderten Bedingungen durchgeführt als minimal notwendig wären. In diesem Fall wird ein Optimierungsprozess verwendet, um die einzelnen

Ortsverteilungen der Punktstrahlungsobjekte zu bestimmen. Hierdurch kann die Genauigkeit der Methode verbessert werden.

In einer Weiterbildung der Erfindung besteht eine Menge von Punkt- strahlungsobjekten aus mindestens einem strahlenden, insbesondere radioaktiv strahlenden, Typ von Isotopen. Als Isotope können beispiels- wetse 1-125 und/oder 1-131 verwendet werden.

In einer Weiterbildung der Erfindung besteht eine Menge von Punkt- strahlungsobjekten aus lichtemittierenden, insbesondere fluoreszieren- den, phosphoreszierenden und/oder lumineszierenden, Substanzen.

In einer Weiterbildung der Erfindung ist für mindestens eine Menge un- terschiedlicher Punktstrahlungsobjekte an mindestens einem Ort auf der Trägerfläche mindestens ein Kalibrierungspunkt mit bekannter Strahlung vorhanden. Die Kalibrierung dient der Bestimmung bzw. der Berechnung der jeweiligen Veränderungsfaktoren, die zur Berechnung der gesuchten einzelnen Ortsverteilungen benötigt werden.

Eine Kalibrierungspunkt kann eine einzelne Signalquelle sein, beispiels- weise ein einzelnes radioaktives Isotop. Die Kalibrierung dient hier dem Zweck, den absoluten oder relativen Prozentanteil der Veränderung bzw. Reduktion von Signalintensitäten zu berechnen, die von den unter- suchten Strahlungsquellen bzw. Isotopen herrühren.

Die Kalibrierung kann durch Einbringen eines radioaktiven Ausgangs- stoffes für eines oder mehrere der untersuchten Isotope in der Messung durchgeführt werden. Das von diesem Kalibrierungsstoff gemessene Signal sollte bevorzugt keine bzw. vernachlässigbare Anteile von allen anderen radioaktiven Quellen außerhalb des Kalibrierungsstoffes enthal- ten. Bevorzugt ist die spezifische Aktivität des Kalibrierungsstoffes vor der Messung bekannt. Bevorzugt ist der Kalibrierungsstoff für alle unter- suchten Isotope verfügbar. Eine Kalibrierung ist auch unter Verwendung

einer oder mehrerer radioaktiver Stoffe möglich, die räumlich gemein- sam lokalisiert, bekannte Mengen aller zu messenden Isotope enthalten.

In diesem Fall müssen die spezifischen Aktivitäten bzw. Strahlungsin- tensitäten jedes Isotops im Kalibrierungsstoff bekannt sein. Mit Hilfe ge- eigneter Algorithmen ist es auf Basis von mehreren ermittelten Ortsver- teilungen möglich, den Beitrag jedes Isotops zum jeweiligen Pixelwert deOrtsverteilung zu berechnen, wobei in einer Ortsverteilung eine oder mehrere Strahlungsintensitäten der Isotope im Signal verändert werden.

Offensichtlich müssen im letzteren Fall andere Faktoren bekannt sein, beispielsweise der differentielle Grad des radioaktiven Zerfalls etc..

Wenn ein Absorber verwendet wird, hängen die Veränderungsfaktoren vom Absorbermaterial, seiner Dicke und seinem Massenabsorptionsko- effizienten für die Arten von absorbierten radioaktiven Partikeln ab.

Wenn differentielle Bilder produziert werden, indem beide Isotopen zerfallen, können die Veränderungsfaktoren durch Messen der relativen Intensitäten der Kalibrierungsstoffe für beide Isotope bestimmt werden.

Oder sie können unter Verwendung von Informationen bezüglich der ex- akten Zeit und Dauer jeder Bestrahlung und der Zerfallsratenkonstanten für jedes Radioisotop berechnet werden.

In einer Weiterbildung der Erfindung liegt das Verhältnis der Verände- rungsfaktoren der mengenspezifischen Strahlungstypen zwischen 5% bis 90%, vorzugsweise zwischen 10% bis 70%, insbesondere zwischen 15% und 50%. Durch die Möglichkeit mit Veränderungsfaktoren zu ar- beiten, die einen Strahlungstyp nicht vollständig unterdrücken, steigt die Zahl der verwendbaren Strahlungsquellen bzw. Detektoren deutlich an.

Insbesondere bei einer Realisierung der Veränderungsfaktoren durch radioaktiven Zerfall von unterschiedlich strahlenden Isotopen besteht die Möglichkeit, auch ohne vollständigen Zerfall eines Isotopentyps, die ge- trennten Ortsverteilungen der Isotope zu berechnen.

In einer Weiterbildung der Erfindung wird der Veränderungsfaktor durch Verwendung mindestens eines Absorbers realisiert. Ein Absorber redu- ziert die Intensität der durch das Material hindurchtretenden Strahlung (Partikel oder Photonen). Der Absorber kann aus Metall, Metalllegie- rung, Kunststoff, Plexiglas, Teflon und/oder einem anderen geeigneten Material bestehen. Für die Funktion der Erfindung ist es wesentlich, das die emittierten Strahlungstypen, beispielsweise Photonen von 1- 125-Isoptopen und Beta-Partikel von ! soptopen, die das Signal auf dem Detektor erzeugen, vom Absorber mit unterschiedlichen Verände- rungsfaktoren bzw. Reduktionsfaktoren absorbiert bzw. gedämpft wer- den. Zu diesem Zweck sind Absorber aus Elementen mit niedriger A- tomzahl effektiver, beispielsweise Aluminiumfolie oder dünnes Plexiglas, da diese Absorber Beta-Partikel stärker absorbieren als Photonen. Des weiteren können Absorber aus einer sehr dünnen Schicht aus Elemen- ten mit hoher Atomzahl verwendet werden, da diese Absorber Photonen stärker absorbieren als Beta-Partikel. Die Absorberdicke spielt bei der Absorptionseffizienz eine Schlüsselrolle.

In einer Weiterbildung der Erfindung wird der Veränderungsfaktor durch radioaktiven Zerfall der jeweiligen Punktstrahlungsobjekte der mindes- tens zwei Mengen realisiert, wobei vorzugsweise die jeweiligen Punkt- strahlungsobjekte der mindestens zwei Mengen unterschiedliche Halb- wertszeiten aufweisen. Die Veränderung bzw. Reduktion der Strahlungs- intensität kommt hier nicht durch einen Absorber, sondern durch einen Unterschied in der Zerfallsrate der Punktstrahlungsobjekte zustande. Die Isotope 1-125 und 1-131 sind beispielsweise für diesen Zweck gut geeig- net, da ihre Halbwertszeiten sich um einen Faktor von fast 7,5 unter- scheiden. Es können jedoch für die Erfindung auch andere Isotope ver- wendet werden.

In einer Weiterbildung der Erfindung wird der Veränderungsfaktor durch eine unterschiedliche Empfindlichkeit eines zur Ermittlung einer Ortsver- teilung der Strahlungsintensität der Trägerfläche verwendeten Detektors

für den jeweils mengenspezifischen Strahlungstyp realisiert. Die Verän- derungsfaktoren der Strahlungsintensitäten der mengenspezifischen Strahlungstypen ergeben sich hierbei durch die unterschiedlichen Emp- findlichkeiten der verwendeten Detektoren für die von den mindestens zwei Mengen von Punktstrahlungsobjekten abgestrahlte Strahlung. Die unterschiedlichen Empfindlichkeiten werden vorzugsweise so gewählt, das das Verhältnis der Veränderungsfaktoren vorzugsweise größer als 5% ist.

In einer Weiterbildung der Erfindung werden die Ortsverteilungen der Strahlungsintensität mit einem ortsauflösenden Detektor für Alpha-, Be- ta-, Gamma-und/oder Röntgenstrahlung ermittelt.

In einer Weiterbildung der Erfindung werden die Ortsverteilungen der Strahlungsintensität mit einem sogenannten Phosphor-Imager-Detektor ermittelt. Ein derartiger Phosphor-Imager-Detektor wird auch als Phosphorimager Imaging Plate oder Phosphorimager-IP bezeichnet. Der Phosphor-Imager-Detektor arbeitet vorzugsweise auf Basis von photo- stimulierter Lumineszenz. Vorteilhafterweise wird eine unterschiedliche Empfindlichkeit eines zur Ermittlung einer Ortsverteilung der Strahlungs- intensität der Trägerfläche verwendeten Phosphor-Imager-Detektors für den jeweils mengenspezifischen Strahlungstyp dadurch erzielt, dass der Phosphor des Phosphor-Imager-Detektors zusätzlich Atome mit hoher Ordnungszahl Z, insbesondere Blei, das beispielsweise in einer bleihal- tigen Verbindung enthalten sein kann, und/oder Atome mit niedriger Ordnungszahl Z enthält. Wenn bei der Herstellung des Phosphor- Imager-Detektors Atome mit hoher bzw. niedriger Ordnungszahl Z in den Phosphor-Imager-Detektor eingebracht werden, erhöht bzw. ernied- rigt sich dessen Nachweisempfindlichkeit beispielsweise für Gamma- Strahlung. Das heißt, das Verhältnis der Empfindlichkeiten für verschie- dene Strahlungstypen ändert sich. Dabei werden zusätzliche Atome ein- gebaut, die nicht für die Lichtspeicherung im Phosphor-Imager-Detektor notwendig sind, die Absorptionseffizienz des Phosphor-Imager-

Detektors aber verändern. Auf diese Weise kann zwischen Alpha-, Beta- , Gamma-und Neutronenstrahlung und Strahlung verschiedener Ener- gie unterschieden werden. Insbesondere kann das Verhältnis der Emp- findlichkeiten für Gamma-Strahlung zu dem für Beta-Strahlung, insbe- sondere für Beta-Strahlung mit Energien größer als 20 keV, die den Phosphormantel des Detektors durchdringen kann, verändert werden durch : 1) Einbau von Elementen mit hoher Ordnungszahl Z, 2) Einbau von Elementen mit niedrigem Ordnungszahl Z.

In einer Weiterbildung werden die erste Ortsverteilung der Strahlungsin- tensität der Trägerfläche durch einen ersten Phosphor-Imager-Detektor und die mindestens zweite Ortsverteilung der Strahlungsintensität der Trägerfläche durch einen mindestens zweiten Phosphor-Imager- Detektor gleichzeitig ermittelt, wobei die Empfindlichkeit des ersten Phosphor-Imager-Detektors und die Empfindlichkeit des mindestens zweiten Phosphor-Imager-Detektors für den jeweils mengenspezifischen Strahlungstyp unterschiedlich ist. Das heißt, bei der Messung werden mindestens zwei Phosphor-Imager-Detektoren bzw. Phosphorimager- lPs verwendet, die ein unterschiedliches Verhältnis der Empfindlichkei- ten für die Strahlung der verschiedenen Punktstrahlungsobjekte besit- zen. Dies ermöglicht, die Messungen bzw. die Ermittlungen der jeweili- gen Strahlungsintensitäten kurz hintereinander bzw. gleichzeitig durch- zuführen. Die unterschiedlichen Empfindlichkeiten der verschiedenen IP- Materialien ermöglichen die Berechnung der Ortsverteilung der jeweili- gen Punktstrahlungsobjekte, selbst wenn kein ausreichender Unter- schied durch den Zerfall der verwendeten Isotope entstanden ist. Selbstverständlich kann diese Vorgehensweise auch mit einer Wartezeit zwischen den Messungen kombiniert werden, um so zusätzlich einen Zerfall der Isotope zu nutzen.

In einer Weiterbildung der Erfindung werden der erste und der mindes- tens zweite Phosphor-Imager-Detektor an gegenüberliegenden Seiten der Trägerfläche angebracht. Hierbei werden unter Verwendung von Phosphorimager-IPs unterschiedlicher Empfindlichkeit zwei Messungen gleichzeitig bzw. simultan an der Vorder-und Ruckseite der zu messen- den Proben bzw. Trägerflächen durchgeführt. Die unterschiedlichen Errpfindlichkeiten der verschiedenen IP-Materialien ermöglicht es, dar- aus die Ortsverteilung der Punktstrahlungsobjekte zu berechnen.

In einer Weiterbildung der Erfindung werden die Ortsverteilungen der Strahlungsintensität mit einem sogenannten Flach-Detektor ermittelt.

Derartige Flach-Detektoren oder Flat-Panel-Detectors ermöglichen die Anfertigung digitaler Röntgensofortbilder. Sie wandeln Röntgenstrahlen direkt in eine Matrix digital kodierter Pixel um, wodurch sich die Detekti- onseffizienz und die Auswertegeschwindigkeit erhöht.

Wenn der Veränderungsfaktor durch eine unterschiedliche Empfindlich- keit eines zur Ermittlung einer Ortsverteilung der Strahlungsintensität der Trägerfläche verwendeten Detektors für den jeweils mengenspezifi- schen Strahlungstyp realisiert werden soll, können beispielsweise ein Phosphor-Imager-Detektor und ein Flach-Detektor verwendet werden, um beispielsweise jeweils eine Messung der Ortsverteilung der Strah- lungsintensität der Trägerfläche durchzuführen. Aus den mit den unter- schiedlichen Detektoren gemessenen Ortsverteilungen kann die Ortsverteilung der Punktstrahlungsobjekte einzeln berechnet werden.

In einer Weiterbildung der Erfindung wird die erste und die mindestens zweite Ortsverteilung der Strahlungsintensität mit einem gleichartigen Detektor ermittelt. Prinzipiell ermöglicht ein Detektor keine klare Diskri- minierung zwischen unterschiedlichen Strahlungstypen, beispielsweise Betapartikeln oder Photonen, die beispielsweise von zwei verschiede- nen Isotopen stammen, oder Strahlung von Isotopen mit unterschiedli- chen Halbwertszeiten. Mit Hilfe des genannten Verfahrens ist unter Ver-

wendung desselben bzw. eines gleichartigen Detektors eine Multico- lourmessung möglich, d. h. eine getrennte, überlagerungsfreie Messung der Ortsverteilung der einzelnen Typen von Punktstrahlungsquellen.

Gleichartige Detektoren sind hierbei Detektoren desselben Typs oder gleicher Bauart, die sich beispielsweise nicht oder nur unwesentlich in ihrer Empfindlichkeit für spezifische Strahlungstypen unterscheiden.

Dies vereinfacht den Aufbau einer Analysevorrichtung und spart somit Kosten.

In einer Weiterbildung der Erfindung werden mindestens zwei zu analysierende Stoffe mit jeweils einer Menge von Punktstrahlungsobjekten markiert, die so markierten Stoffe gemischt und das Gemisch anschließend auf die Trägerfläche, insbesondere in Form eines flächenartigen Analysemittels, aufgetragen. Bei den zu analysierenden Stoffen kann es sich vorteilhafterweise um Peptide, Proteine und/oder Oligonukleotide handeln, wobei beispielsweise eine erste und eine zweite Proteinprobe, die jeweils aus einer Vielzahl verschiedener Proteine bestehen können, mit jeweils unterschiedlichen Isotopen markiert werden. Nach der Markierung werden die Proteine der beiden Proben gemischt und gemeinsam auf ein Analysemittel, insbesondere ein Proteingel, Nukleinsäure-Array, Protein-Array, ELISA- Array und/oder ein Blot aufgetragen. Auf dem Analysemittel erfolgt anschließend eine gemeinsame Auftrennung der zu analysierenden Stoffe bzw. Proteine der unterschiedlichen Proben anhand von spezifischen Eigenschaften, die beispielsweise durch das Analysemittel bestimmt werden. Im Anschluss an die Auftrennung wird nun die Ortsverteilung der Punkstrahlungsobjekte für jede Menge von Punktstrahlungsobjekten einzeln durch das erfindungsgemäße Ver- fahren berechnet. Über die Ortsverteilung der spezifischen Punkstrah- lungsobjekte kann nun auf die Ortsverteilung der zu untersuchenden Proteine der jeweiligen Proben getrennt voneinander geschlossen wer- den.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

Vorteilhafte, nachfolgend beschriebene Ausführungsformen der Erfin- dung sind in den Zeichnungen dargestellt, in denen zeigen : Fig. 1A mit einem Phosphorimager ermittelte Ortsverteilung der Strah- lungsintensität eines mit Hilfe eines 2D-Gels aufgetrennten Gemisches aus 2 Proteinproben, wobei eine Probe mit Isoto- pen des Typ 1-125 und die andere Probe mit Isotopen des Typs 1-131 markiert wurde, Fig. 1B mit dem Phosphorimager ermittelte Ortsverteilung der Strah- lungsintensität des 2D-Gels von Fi. 1A nach einer Wartezeit von 82 Tagen, Fig. 1C mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahren berechnete Orts- verteilung der Strahlungsintensität der Proteinprobe, die mit 1- sotopen des Typs 1-125 markiert wurde, Fig. 1D mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahren berechnete Orts- verteilung der Strahlungsintensität der Proteinprobe, die mit 1- sotopen des Typs 1-131 markiert wurde, Fig. 1E Differenz der Ortsverteilungen von Fi. 1C und Fig. 1 D, wobei die Proteinprobe, die mit Isotopen des Typs I-125 markiert wurde, blau und die Proteinprobe, die mit Isotopen des Typs I-131 markiert wurde, orange dargestellt ist, Fig. 1F mit dem Phosphorimager ermittelte Ortsverteilung der Strah- lungsintensität des 2D-Gels von Fi. 1A nach einer Wartezeit von 23 Tagen, Fig. 1G mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahren berechnete Orts- verteilung der Strahlungsintensität der Proteinprobe, die mit 1-

sotopen des Typs 1-125 markiert wurde, wobei zur Berechnung als zweite ermittelte Ortsverteilung die Ortsverteilung von Fig.

1 F verwendet wurde, Fig. 1H mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahren berechnete Orts- verteilung der Strahlungsintensität der Proteinprobe, die mit 1- sotopen des Typs 1-131 markiert wurde, wobei zur Berechnung als zweite ermittelte Ortsverteilung die Ortsverteilung von Fig.

1 F verwendet wurde, Fig. 11 Differenz der Ortsverteilungen von Fi. 1G und Fig. 1H, wobei die Proteinprobe, die mit Isotopen des Typs 1-125 markiert wurde, blau und die Proteinprobe, die mit Isotopen des Typs 1-131 markiert wurde, orange dargestellt ist, Fig. 2A mit einem Phosphorimager ermittelte Ortsverteilung der Strah- lungsintensität von mit Isotopen des Typs 1-125 und Isotopen des Typs 1-131 markierten Proteinproben aus Rinderserumal- bumin unterschiedlicher Verdünnungsstufen und Mischung- verhältnissen ohne Verwendung eines Absorbers, Fig. 2B mit dem Phosphorimager ermittelte Ortsverteilung der Strah- lungsintensität von Fig. 2A unter Verwendung eines Absorbers, Fig. 2C mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahren berechnete Orts- verteilung der Strahlungsintensität der Isotope des Typs 1-125, Fig. 2D mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahren berechnete Orts- verteilung der Strahlungsintensität der Isotope des Typs 1-131, Fig. 2E Differenz der Ortsverteilungen von Fi. 2C und Fig. 2D, wobei die Isotope des Typs 1-125 blau und die Isotope des Typs 1-131 o- range dargestellt sind.

Erste Ausführungsform In einer ersten Ausführungsform der Erfindung werden zwei Proteinpro- ben, die jeweils aus einer Vielzahl von unterschiedlichen Proteinen be- stehen, mit jeweils unterschiedlichen Isotopen des Elements Jod mar- kiett. Die erste Probe wird mit 1-125, die zweite Probe mit 1-131 markiert.

Zur Kalibrierung der Masseskala werden spezielle Massenreferenzprote- ine mit 1-125 markiert. 1-125 weist eine Halbwertszeit von 60,14 Tagen auf und zerfällt durch Elektronenfang, wodurch Röntgenstrahlen und Gammastrahlen im Bereich von 27 keV bis 35 keV entstehen. 1-131 weist eine Halbwertszeit von 8,06 Tagen auf und zerfällt durch die ver- schieden Mechanismen der Beta-Emission.

Die Proben werden anschließend gemischt und mit Hilfe eines 2D-Gels aufgetrennt. Zur Bestimmung der Veränderungsfaktoren werden auf der linken Seite des Gels Kalibrierungspunkte für beide Isotopentypen auf- gebracht. Sie dienen zur Berechnung der Veränderungsfaktoren die bei der Berechnung der einzelnen Ortsverteilungen benötigt werden.

Nach der 2-dimensionalen Auftrennung, wird die Phosphorimager-IP während einer vorbestimmten Zeit mit der Probe bzw. der Strahlung der Probe beaufschlagt. Die Phosphorimager-IP ist sowohl für energiearme Röntgenstrahlen, Gammastrahlen und Betapartikel empfindlich. Die rela- tiv hochenergetischen Photonen des 1-131 Zerfalls werden von einer Phosphorimager-IP mit nur geringer Effizienz absorbiert bzw. detektiert.

Die Phosphorimager-IP integriert die Strahlungsintensitäten beider Strahlungsquellen auf. Anschließend wird die Ortsverteilung der gespei- cherten Strahlungsenergie der Phosphorimager-IP mit einem Lesegerät abgelesen und in eine Pixelmatrix bzw. ein Bild abgebildet, welche in Fig. 1A gezeigt ist. Die so ermittelte Ortsverteilung bzw. die Pixelmatrix enthält Anteile, die sowohl von 1-125 als auch von 1-131 stammen. Nach einer Wartezeit von 82 Tagen wird die Ortsverteilung der Probe wie o-

ben beschrieben erneut bestimmt. Diese Ortsverteilung ist in Fig. 1 B ge- zeigt. Aufgrund der unterschiedlichen Halbwertszeiten der beiden Isoto- pe hat die Strahlungsintensität bzw. die Aktivität von 1-125 um einen Faktor von ca. zwei abgenommen. Im Gegensatz dazu beträgt die Strahlungsintensität von dem auf dem Gel verbleibendem 1-131 weniger als 1 % der ursprünglichen Strahlungsintensität. In Fig. 1B sind folglich fas ausschließlich Signalanteile von 1-125 vorhanden.

Die unterschiedliche Veränderung der Strahlungsintensitäten wird in dieser Ausführungsform ausschließlich durch die inhärenten Eigenschaf- ten des unterschiedlichen radioaktiven Zerfall der beiden Isotope, nicht jedoch durch einen Absorber bewirkt.

Anschließend wird anhand des erfindungsgemäßen Verfahrens die Ortsverteilung der einzelnen Isotope getrennt berechnet. Zur Berech- nung wurde die Intensität über einen Bereich von 4X4 benachbarten Pi- xeln herangezogen bzw. summiert, wobei ein Gauss-Filter verwendet wurde. Die Ausrichtung der ermittelten Ortsverteilungen zueinander er- folgt anhand von entsprechenden Referenzpunkten, die an jeweils glei- chen Orten der Ortsverteilung vorhanden sind. Fig. 1C zeigt die be- rechnete Ortsverteilung der Strahlungsintensität bzw. der Isotopenmen- ge der Proteinprobe, die mit Isotopen des Typs 1-125 markiert wurde und Fig. 1 D zeigt die berechnete Ortsverteilung der Strahlungsintensität der Proteinprobe, die mit Isotopen des Typs 1-131 markiert wurde. Fig. 1E zeigt die Differenz der Ortsverteilungen von Fi. 1 C und Fig. 1 D, wobei die Proteinprobe, die mit Isotopen des Typs 1-125 markiert wurde, blau und die Proteinprobe, die mit Isotopen des Typs 1-131 markiert wurde, orange dargestellt sind. Schwarz bedeutet, dass eine gleiche Anzahl beider Isotope vorhanden ist.

Die Ortsverteilung der Strahlungsintensität kann selbstverständlich auch ohne einen ortsauflösenden Detektor bestimmt werden. Hierzu wird die zu untersuchende Trägerfläche durch geeignetes Auftrennen, beispiels-

weise Zerschneiden, in kleinere Stücke zerteilt und die Strahlungsinten- sität dieser Stücke durch einen herkömmlichen"Single-Source"-Detektor bestimmt. Die Bestimmung des Strahlungstyps und der Strahlungsinten- sität kann beispielsweise unter Verwendung von Gamma-und/oder Be- ta-Spektorskopie erfolgen.

Zweite Ausführungsform In einer zweiten Ausführungsform der Erfindung, wird bei gleicher Vor- gehensweise wie in der ersten Ausführungsform die Wartezeit zwischen der Ermittlung der ersten und der zweiten Ortsverteilung von 82 Tagen auf 23 Tage reduziert. Fig. 1 F zeigt die mit dem Phosphorimager ermit- telte Ortsverteilung der Strahlungsintensität des 2D-Gels von Fig. 1 A nach einer Wartezeit von 23 Tagen. Durch den noch nicht vollständigen Zerfall von 1-131 tragen nun beide Isotope zu der ermittelten Ortsvertei- lung bei. Die Veränderungsfaktoren sind folglich für beide Isotope we- sentlich größer als 0 %. Gleichermassen ist das Verhältnis der Verände- rungsfaktoren wesentlich größer als 0%.

Fig. 1G zeigt die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahren berechnete Ortsverteilung der Strahlungsintensität der Proteinprobe, die mit Isoto- pen des Typs 1-125 markiert wurde, Fig. 1 H zeigt die analog berechnete Ortsverteilung der Strahlungsintensität der Proteinprobe, die mit Isoto- pen des Typs 1-131 markiert wurde, wobei zur Berechnung in beiden Fällen als zweite ermittelte Ortsverteilung die Ortsverteilung von Fig. 1F verwendet wurde.

Fig. 11 zeigt die Differenz der Ortsverteilungen von Fi. 1G und Fig. 1 H, wobei die Proteinprobe, die mit Isotopen des Typs 1-125 markiert wurde, blau und die Proteinprobe, die mit Isotopen des Typs 1-131 markiert wurde, orange dargestellt ist. Schwarz bedeutet, dass eine gleiche An- zahl beider Isotope vorhanden ist.

Die Ergebnisse dieser Ausführungsform decken sich mit den Ergebnis- sen der Ausführungsform 1, die aufgrund der fast vollständigen Unter- drückung von 1-131 als Referenzergebnisse dienen können. Das erfin- dungsgemäße Verfahren liefert folglich zuverlässige Messergebnisse selbst dann, wenn bei der Ermittlung der zweiten Ortsverteilung ein Strahiungstyp nicht vollständig unterdrückt ist.

Dritte Ausführungsform In dieser Ausführungsform der Erfindung wird ein Absorber verwendet, um die entsprechenden Veränderungsfaktoren zu realisieren, d. h. um differentielle Messungen der die zwei Isotope 1-125 und 1-131 enthalten- den Probe vorzunehmen. Es wird analog zur ersten Ausführungsform der Erfindung ein zweidimensionales Gel hergestellt, das die mit den zwei Isotopen 1-125 und 1-131 markierten Proteine enthält. Die Phospho- rimager-IP wird während einer vorbestimmten Zeit der Ortsverteilung der Strahlungsintensität des 2D-Gels ausgesetzt. Anschließend wird die Phosphorimager-IP durch das Phosphorimagerauslesegerät abgelesen.

Die Strahlungsintensität über der Fläche des 2D-Gels wird in einer Mat- rix abgebildet, wobei die Werte der einzelnen Elemente der Matrix bzw. der Pixel die Strahlungsintensität des zugeordneten Bereichs auf der Phosphorimager-IP abbilden. Es entsteht eine Matrix bzw. ein Bild, des- sen Signalanteile sowohl von 1-125 als auch von 1-131 herrühren.

Um die Signalanteile zu separieren ist es notwendig, die Intensität eines Strahlungstyps durch geeignete Mittel zu verändern bzw. zu reduzieren und ein zweites Bild bzw. eine zweite Ortsverteilung zu ermitteln.

Durch Einbringen eines Absorbers bekannter Dicke zwischen die Probe und die Phosphorimager-IP während der Bestrahlung kann die Strah- lungsintensität selektiv für jeden Strahlungstyp mit unterschiedlichen

Veränderungsfaktoren reduziert werden. Ein derartiger Absorber kann aus Metall, Metalllegierung, Kunststoff, Plexiglas, Teflon oder einem an- deren geeigneten Material bestehen. Der Absorber muss, um die erfin- dungsgemäße Funktion zu erzielen, den von den Strahlungsquellen e- mittierten Strahlungstyp (in dieser Ausführungsform Photonen von 1-125 und Beta-Partikel von 1-131), der das Signal auf dem Detektor erzeugt, mifgeweils unterschiedlichen Veränderungsfaktoren absorbieren.

Bei dieser Ausführungsform kann mit Hilfe des Absorbers die Intensität des von 1-131 stammenden Signals relativ zum Signal von 1-125 signifi- kant verringert werden. Zu diesem Zweck sind Absorber aus Elementen mit niedriger Atomzahl effektiver (Beispiel : Aluminiumfolie, dünnes Pie- xiglas usw. ). Die Absorberdicke spielt bei der Absorptionseffizienz eine Schlüsselrolle.

Das Ermitteln der ersten und der mindestens zweiten Ortsverteilung der Strahlungsintensität kann mit Hilfe einer"sandwichartigen"Anordnung aus Phosphorimager-IP, Gel, Absorber, Phosphorimager-IP gleichzeitig erfolgen. Alternativ könnten die Bilder nacheinander, mit oder ohne Ab- sorber gemacht werden, was bei der Erfindung bevorzugt wird. Offen- sichtlich können auch andere radioaktive Isotope für die hier offenbarte Erfindung verwendet werden.

Vierte Ausführungsform In einer vierten Ausführungsform der Erfindung wird, wie in der dritten Ausführungsform, ein Absorber verwendet, um die Strahlungsintensität der unterschiedlichen Strahlungstypen unterschiedlich zu verändern.

In dieser Ausführungsform werden zwei Proben aus Rinderserumalbu- min einmal mit 1-125 und einmal mit 1-131 markiert. Die Proben werden jeweils vier Mal in 10-er-Stufen verdünnt. Es entstehen also von jeder

Probe jeweils 5 Verdünnungsstufen, von unverdünnt bis auf 1/10000 verdünnt. Die Strahlungsintensitäten unterscheiden sich folglich um den Faktor 10000. Jede Verdünnungsstufe der ersten Probe wird mit jeder Verdünnungsstufe der zweiten Probe gemischt. Es entstehen so insge- samt 25 Proben mit unterschiedlichen Mischungsverhältnissen, die je- weils in einem Volumen von 1 ul auf ein quadratisches Filterpapier von 3mMn Seitenlänge aufgetragen werden. Die Filterpapiere werden in einer Matrixanordnung auf einem flächigen Träger angeordnet. Die Konzent- ration von 1-125 nimmt von unten nach oben ab. Die Konzentration von 1-131 nimmt von links nach rechts ab.

Eine Phosphorimager-IP wird während 24 Stunden mit der Strahlung des flächigen Trägers beaufschlagt. Die Phosphorimager-IP integriert die Strahlungsintensitäten beider Strahlungsquellen der Proben auf. An- schließend wird die Ortsverteilung der gespeicherten Strahlungsenergie der Phosphorimager-IP mit einem Lesegerät abgelesen und in eine Pi- xelmatrix bzw. ein Bild abgebildet, welche in Fig. 2A gezeigt ist. Die so ermittelte Ortsverteilung bzw. die Pixelmatrix enthält Anteile, die sowohl von 1-125 als auch von 1-131 stammen. Direkt nach der Ermittlung dieser ersten Ortsverteilung wird eine zweite Ortsverteilung ermittelt, wobei ein Absorber zwischen dem flächigen Träger und der Phosphorimager-IP angeordnet wird. Diese zweite Ortsverteilung ist in Fig. 2B gezeigt. Der Absorber besteht aus einer 900 pm dicken Plastikschicht. Die Strah- lungsintensitäten der auf dem flächigen Träger angeordneten Proben wurden für beide ermittelten Ortsverteilungen unter Verwendung der gleichen Bereiche aufintegriert bzw. aufsummiert. Auf Basis dieser integ- rierten Strahlungsintensitäten wird aus den beiden ermittelten Ortsvertei- lungen mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens die Ortsverteilung der einzelnen Isotope getrennt berechnet. Fig. 2C zeigt die berechnete Ortsverteilung der Strahlungsintensität bzw. der Isotopenmenge der Pro- teinproben, die mit Isotopen des Typs 1-125 markiert wurden und Fig. 2D zeigt die berechnete Ortsverteilung der Strahlungsintensität der Protein- proben, die mit Isotopen des Typs 1-131 markiert wurden. Fig. 2E zeigt

die Differenz der Ortsverteilungen von Fig. 2C und Fig. 2D, wobei die Proteinproben, die mit Isotopen des Typs 1-125 markiert wurden, blau und die Proteinproben, die mit Isotopen des Typs 1-131 markiert wurden, orange dargestellt sind. Schwarz bedeutet, dass eine gleiche Anzahl beider Isotope vorhanden ist.

Diunverdünnte, mit 1-125 markierte Probe unten rechts und die unver- dünnte, mit 1-131 markierte Probe oben links wurden verwendet, um die Zerfallskonstanten zu berechnen, die zur Berechnung der Ortsverteilun- gen benötigt werden.

Das berechnete Ergebnis stimmt in engen Fehlergrenzen mit dem theo- retisch zu erwartenden Ergebnis überein. Dies zeigt, dass das erfin- dungsgemäße Verfahren auch bei Veränderungsfaktoren, die deutlich über 0% liegen, funktioniert.

Mögliche Variationen der Ausführungsformen Bei den obigen Ausführungsformen der Erfindung werden Analysatmo- leküle (Proteine) mit chemisch identischen Radioisotopen (radioaktivem lod) markiert. Dieses Verfahren ist äußerst nützlich zur Durchführung differentieller Analysen, weil die Unterschiede der Intensitätsverteilung der Strahlung zwischen den beiden Proben durch Unterschiede zwi- schen den Proben selbst bedingt sind. Dies gilt auch für beispielsweise mit P-33 und P-32 markierte Proteine.

Mit einer Kombination von mit C-14, S-35 oder P-33 markierte Proteine erzeugen unterschiedliche 2D-PAGE-Bilder, weil Kohlenstoff, Schwefel und Phosphat jeweils in unterschiedlicher Chemie in den Proteinen vor- handen ist. So haben einige Proteine kein Cystein oder Methionin und tragen deshalb keinen Schwefel, und werden doch durch eine Kinase phosphoryliert, so dass sie effizient Phosphat tragen. Andere Proteine

können viele schwefelhaltige Aminosäuren aufweisen, und doch nicht phosphoryliert werden. Trotzdem ist die vorliegende Erfindung auch ge- eignet, die synthetischen Bilder zu extrahieren, die der Verteilung beider Isotopen entsprechen, wenn eine Kombination dieser Isotopen erfin- dungsgemäß verwendet wird. Tatsächlich ist die Erfindung auf die diffe- rentielle Messung jeglicher Radioisotope anwendbar, die auf einer Ober- fläche oder einer ähnlichen Fläche verteilt sind, auch solche mit unter- schiedlichen Oberflächenstrukturen, die für Phosphorimageranalyse ge- eignet sind.

Die für die Erfindung geeigneten radioaktiven Isotope weisen signifikan- te Unterschiede in der Zerfallsrate, der Energie emittierter Partikel, der Art der emittierten Partikel oder einer Kombination davon auf. Eine hohe Isotopenreinheit ist wünschenswert, aber nicht notwendig.

Eine hohe chemische Reinheit der Radioisotope ist wünschenswert, a- ber nicht notwendig. Es ist möglich, die Erfindung auf Proben anzuwen- den, die mit verschiedenen Mischungen von Isotopen markiert sind, wie z. B. die Markierung einer Probe mit 95 % 1-131, 5 % 1-125 und Markie- rung der anderen Probe mit 5 % 1-131, 95 % 1-125. Die Markierungsmi- schung kann offensichtlich recht komplex sein, ohne von der Idee oder dem Rahmen der Erfindung abzuweichen, und könnte beispielsweise Spurenmengen vieler Isotope enthalten, von denen einige nicht kovalent in die Analysatmoleküle eingebracht werden, wie K-40.

Die vorliegende Erfindung ist unabhängig vom Verfahren des Einbrin- gens radioaktiver Isotope in die Analysatmoleküle. Beispielsweise kön- nen Proteine durch metabolische Aufnahme, durch Radioiodation postharvest, durch Alkylierung mit radioaktiven Reagenzien (jeglicher Chemie) oder durch andere Verfahren markiert werden.

Eine andere Anwendung von Phosphorimagern ist die Messung von DNA und Nukleinsäurearrays. In solchen Anwendungen, wie der Häufig-

keitsanalyse von mRNA, können P-33, P-32, S-35, C-14, H-3 und ande- re Isotope alle auf herkömmliche Art in Hybridisierungsmoleküle einge- bracht werden. Durch die Prinzipien der Erfindung kann ein Phosphori- mager verwendet werden, um Zweifarbenanalysen dieser Systeme durchzuführen. Wegen der einfachen Chemie von DNA-artigen Polyme- ren, können die Starhlungsintensitäten von Hybridisierungsmolekülen, di% diese Radioisotope enthalten, alle identisch sein, wenn dieselbe Probe unabhängig markiert und für jedes Isotop gemessen wird. Die o- ben beschriebenen Prinzipien gelten offensichtlich auch für Proteinar- rays oder alle anderen Arrays oder semiplanaren Verteilungen von Ana- lysatmolekülen, die für Phosphorimageranalyse geeignet sind.

Es ist erkennbar, dass Anwendungen der Erfindung im Bereich der me- dizinischen Bildgebung implementiert werden können, wo zwei oder mehr differentielle Bilder erzeugt werden, um synthetische Bilder von zwei oder mehr Signalquellen zu extrahieren. Ein Beispiel könnte den Nachweis gewisser radioaktiver Spurenelemente kombiniert mit Röntgen des Körpers unter Verwendung geeigneter Absorber gemäss der Erfin- dung betreffen, und im Bereich der Medizin von großem Vorteil sein.

Offensichtlich ist die vorliegende Erfindung nicht auf Phosphorimager-IP und nicht auf radioaktive Messungen beschränkt. Die Erfindung kann auch auf Fälle angewendet werden, bei denen sichtbares Licht und nicht Radioaktivität mehrfach gemessen wird und beide Signalanteile algo- rithmisch extrahiert werden. Beispielsweise kann eine Enzymreaktion Licht ähnlicher Wellenlänge produzieren wie jenes, das von einem fluo- rophoren oder lumineszenten Molekül emittiert wird. Indem die Intensi- tätsverteilung des Lichts ermittelt wird, das durch die chemische Reakti- on und das Fluorophor gemeinsam emittiert wird, und die Intensitätsver- teilung des Lichts, das durch das Fluorophor emittiert wird, nachdem die enzymatische Reaktion eine reduzierte Lichtmenge produziert, können die Beiträge des fluoreszent und enzymatisch produzierten Lichts im ur- sprünglichen Bild bestimmt werden. Bei dieser Implementierung ist wich-

tig, dass die Reduktion der Intensität beider Lichtquellen bekannt ist o- der genau kalibriert werden kann.

Alle in dieser Offenbarung zitierten Publikationen und Patentanmeldun- gen werden durch Bezugnahme zum Bestandteil der Offenbarung der Erfindung gemacht.

Terminologie, Material une Methoden Nachfolgend wird die verwendete Terminologie erläutert und eine Über- sicht über die herkömmlichen Materialien und Methoden gegeben.

Ein Bild wird durch eine Matrix dargestellt, wobei die Matrixzellenwerte beispielsweise der Intensität eines Signals entsprechen, das durch einen Detektor an einem entsprechenden Ort auf der abgebildeten Oberfläche erfasst wird. Die Bilder können in den üblichen Dateiformaten für Bilder gespeichert werden.

Unter einer Mehrfarbenanalyse ist zu verstehen, dass mehrere Proben jeweils separat markiert, vermischt und gemeinsam separiert werden.

Die Auswertung erfolgt dann für jede Probe einzeln, unbeeinflusst von der Existenz der jeweils anderen Proben. Es gibt verschiedene Verfah- ren, um Mehrfarbengleichungen zu erzeugen.

Genomik bedeutet die quantitative Untersuchung von Nukleinsäuren o- der nukleinsäureähnlichen Polymeren.

Proteomik wurde definiert als die Untersuchung aller Proteine, die durch die Genome der untersuchten Zellen exprimiert werden. Das Akronym PROTEOM bedeutete PROTEine, die von einem GenOM exprimiert werden.

Wasinger VC, Cordwell SJ, Cerpa-Poljak A, Yan JX, Gooley AA, Wilkins MR, Duncan MW, Harris R, Williams KL, Humphery-Smith I. (1995) Pro- gress with gene-product mapping of the Mollicutes : Mycoplasma genita- lium. Electrophoresis, 16,1090-4.

Hier bedeutet Proteomik speziell die Untersuchung von Molekülen, bei denen mindestens ein Teil in ein Ribosom (ein Protein) translatiert wur- de, wie es Fachleuten bekannt ist, oder eine Gruppe solcher Proteine.

Proteomik umfasst auch die Untersuchung von posttranslationalen Pro- teinmodifikationen, Proteinsynthese und Abbauraten, Proteinabbaupro- dukte und Kombinationen davon.

Hier bezieht sich Molekularprofil oder Profil eines biologischen Systems, wie einer Zelle, einer Gruppe von Zellen, einem Gewebe oder einem Organismus, auf ein Muster von Änderungen in der Genexpression oder Proteinexpression oder Lipidzusammensetzung oder Metabolitenproduk- tion von kleinen Molekülen oder Temperatur oder Metabolitensekretion von kleinen Molekülen, Änderungen in Zuckerhäufigkeit oder-typen, o- der Änderungen in posttranslationalen Proteinmodifikationen, oder Än- derungen in der Proteinproteolyse, oder Änderungen in der lonensekre- tion durch ein oder mehrere Zellabteile, oder in der lonenaufnahme durch ein oder mehrere Zellabteile zwischen zwei oder mehr untersuch- ten biologischen Systemen. Allgemeiner ausgedrückt ist das Molekular- profil eines biologischen Systems ein Mass für die Atome, die dieses System bilden, und insbesondere ihrer chemischen, räumlichen und zeitlichen Beziehungen zueinander.

Array bedeutet eine geordnete Platzierung oder Anordnung. Der Begriff wird hier verwendet, um eine geordnete Platzierung von Oligonukleiden (einschliesslich RNA, cDNA und genomischer DNA) oder von Liganden für Analysatmoleküle, wie Affinitätsreagenzien für Proteine, Lipide und Zucker oder Moleküle, die solche funktionellen Gruppen enthalten (z. B. enthält ein Glycoprotein mindestens eine Zuckergruppe oder z. B. ent-

hält ein Lipoprotein mindestens eine Lipidgruppe) zu bezeichnen. Die angeordneten Moleküle sind auf einer Oberfläche positioniert, beispiels- weise einem Chip, und werden verwendet, um komplementäre Oligo- nukleotide einzufangen (einschliesslich RNA, cDNA und genomische DNA) oder Substrate für den Liganden. Da das Oligonukleotid oder der Ligand in jeder Position in der Anordnung bekannt ist, kann die Sequenz (einer Nukleinsäure) oder eine physikalische Eigenschaft (eines Prote- ins) durch die Position, in der die Nukleinsäure oder das Substrat an das Array binden, bestimmt werden.

Proteinseparationsverfahren Die Anwendung der Elektrophorese für präparative Zwecke ist eine e- tablierte Technik und es gibt verschiedene Typen von Elektrophoresege- räten für präparative und analytische Zwecke. Diese Geräte und ihre begleitenden Prinzipien können in drei Kategorien eingeteilt werden.

Andrews AT. (1986) Electrophoresis : Theory, Techniques, and Bio- chemical and Clinical Applications. Oxford University Press.

Westermeier R. (1977) Electrophoresis in Practice : A Guide to Methods and Applications of DNA and Protein Separations. John Wiley and Sons, Weinheim. a) Zonenelektrophorese b) Isotachophorese c) Isoelektrisches Fokussieren Isotachophorese verwendet hydrophile Matrices und zeigt typischerwei- se hohe Auflösung, aber geringe Ladekapazitäten. In Kombination mit freier Elektrophorese kann das Verfahren für mikropräparative Zwecke angewendet werden.

Weber G, Bocek P. (1998) Stability of continuous flow electrophoresis.

Electrophoresis, 19,3094-3905.

Isoelektrisches Fokussieren (IEF, isoelectric focussing) wird entweder in Flüssigkeitsdichtegradienten, in Gelgradienten oder in Mehrkammerge- räten durchgeführt, mit einem Separationsgelmedium auf Basis von IEF- lmobilin.

Righetti PG. (1990) Immobilized pH gradients : theory and methodology.

In : Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology. Bd. 20 (Hrsg. RH Burdon, PH Knippenberg). S. 397. Elsevier, Amsterdam.

Righetti PG, Bossi A, Wenisch E, Orsini G. (1997) Protein purification in multicomponent electrolyzers with isoelectric membranes. J. Chroma- togr. B Biomed. Sci. Appl., 699,105-15.

Zonenelektrophorese umfasst Glycin, Bicin und Tricin gepufferte SDS- PAGE (sodium dodecylsulfate poyacrylamide gel electrophoresis) Prote- ingelsyteme, die üblicherweise in der Proteinanalyse verwendet werden und in den oben genannten Literaturzitaten diskutiert werden.

Derzeitige Proteomiktechniken umfassen üblicherweise die Verwendung von 2D-PAGE (zweidimensionaler Polyacrylamidgelelektrophorese), wodurch Proteine zunächst durch Unterschiede im pl durch IEF in der ersten Dimension getrennt werden. Diese Proteine werden dann an- schliessend durch das Molekulargewicht in einem SDS-PAGE-Gel in der zweiten Dimension getrennt.

Während 2D-PAGE derzeit das Verfahren ist, das die höchste Trennleis- tung für biochemische Reinigungen ergibt, übersteigt die Zahl der Prote- ine und ihrer modifizierten Isoformen, die in eukaryotischen Zellen, Ge- weben und Organismen vorhanden sind, die Trennkapazität des besten 2D-PAGE-Systems. Die Häufigkeiten verschiedener Proteine und Prote- inisoformen in komplexen eukaryotischen Zellen, Geweben und Orga-

nismen schwankt auch stark. Die häufigsten Proteine in einer eukaryoti- schen Zellen können mit mehr als 108 Kopien pro Zelle vorhanden. Bei- spiele häufiger Proteine umfassen bestimmte Cytoskelettproteine oder Albumin in Leber und Blutserum. Einige Proteine können signifikante biologische Effekte ausüben, wenn sie in sehr geringen Mengen vor- handen sind, vielleicht nur mit ein paar Molekülen pro Zelle. Obwohl die geEngste Menge, bei der Proteine biologische Aktivität ausüben können, kaum verstanden ist, könnte diese Kategorie Beispiele umfassen wie Telomerase und DNA-Polymerase bei der Progression von präkanzerö- sen bis kanzerösen Zellen. Andere Fälle, wenn Moleküle geringer Häu- figkeit in Proteinmischungen biologisch relevant sind, sind im Blut, wo ein paar Moleküle Cytokin pro Liter von Bedeutung sein können oder Knochenmark, wo nur eine Metastasenkrebszelle unter Billionen anderer Zellen fatale biologische Konsequenzen für den Patienten haben kann.

Zur Diskussion der Anzahl von Proteinen und Proteinisoformen, die in eukaryotischen Zellen zu erwarten sind, und einige Implikationen für 2D- PAGE in Proteomik siehe Vuong et al.

Vuong GL, Weiss SM, Kammer W, Priemer M, Vingron M, Nordheim A, Cahill MA. Improved sensitivity proteomics by post harvest alkylation and radioactive labelling of proteins. 2000, Electrophoresis 21 : 2594- 2605.

Die Reproduzierbarkeit von 2D-PAGE ist auch notorisch gering, so dass typischerweise mehrere Replikate jedes Gels erforderlich sind, um mit Softwarepaketen eine mittlere Näherung der Zusammensetzung des ty- pischen 2D-PAGE-Musters des untersuchten Systems zusammenzustel- len. Es sind einige Softwarepakete im Handel erhältlich. Eine wichtige Anwendung proteomischer Studien ist, den Unterschied in der Häufigkeit bestimmter Proteine oder Proteinisoformen zwischen zwei oder mehr experimentell interessanten Regimen zu bestimmen, wie Proteinen von Kontrolizellen, Geweben oder Organismen, im Vergleich zu entspre-

chenden Häufigkeiten aus pharmakologisch behandelten Zellen, Gewe- ben oder Organismen.

Eine Reihe anderer Verfahren sind zur Proteintrennung verfügbar, die ohne darauf beschränkt zu sein Hochdruckflüssigkeitschromatographie, Dünnschichtchromatographie, FPLC, Gelfiltrationschromatographie, lo- neaustauschchromatographie, Mikrofluidsysteme wie Kapillare- lektrophorese und auf Chips gestützt Mikrofluidik, Affinitätsreagenzien mit Mikroaffinitätsarrays und Elektrophorese umfassen. Die folgenden Literaturstellen beschreiben den Stand der Technik von Trennverfahren, die in der Proteomikforschung eingesetzt werden.

Daniel C. Liebler. Introduction to Proteomics : Tools for the New Biology.

300 Seiten 1. Aufl. (Nov. 2001) Humana Press ; ISBN : 0896039927.

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Paweletz CP, Charboneau L, Bichsel VE, Simone NL, Chen T, Gillespie JW, Emmert-Buck MR, Roth MJ, Petricoin III EF, Liotta LA. Reverse phase protein microarrays which capture disease progression show acti-

vation of pro-survival pathways at the cancer invasion front. Oncogene 2001, 20 : 1981-1989.

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Proteinnachweis in der Proteomik Proteine können durch eine Vielzahl von Verfahren nachgewiesen wer- den, die in den obigen Literaturstellen beschrieben sind, welche, ohne darauf beschränkt zu sein, umfassen : 91) Verbindung von Farbstoffen oder Anfärbemitteln wie A- midschwarz, Sulforhodamin B, Agalmaschwarz oder verschiedene Silberanfärbeverfahren (obige Literaturzitate).

2) Spektroskopischer Nachweis von aromatischen Aminosäuren oder Peptidbindungen.

3) Nichtkovalente Assoziation von Fluoreszenzreagenzien.

4) Kovalente Bindung von Fluoreszenzreagenzien, wie Monobrom- bimanthiolyt, Naphthalen-2, 7-disulfonsäure, Fluorescen, Cye- Farbstoffderivate oder eine Reihe anderer Reagenzien, die den Fachleuten bekannt sind. Das Einbringen von fluoreszierenden Gruppen in Proteinmoleküle kann z. B. durch Alkylierung von A- minogruppen wie Lysin oder der Aminoendgruppe, durch Alkyle- rung von Cysteingruppen oder durch andere Verfahren erreicht werden.

5) Metabolisches Einbringen von radioaktiven Isotopen, darunter H- 3, C-14, S-35, P-32 und P-33 gefolgt von radioaktivem Nachweis.

6) Radioaktive Markierung postharvest, wie Proteiniodierung (Vuong et al, siehe oben und dort genannte Zitate), gefolgt von radioakti- vem Nachweis.

7) Immunnachweis, wo Antikörper oder rekombinant produzierte Af- finitätsmoleküle spezifisch mit interessierenden Proteinen in Wechselwirkung treten, nach einer Reihe von Standardprotokol- len, wie sie bei Harlow und Lane, Antibodies, A Laboratory Manual (Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY, 1988) gelehrt werden oder wie sie bei Hudson und Souriau, Expert Opin.

Biol. Ther. 1 : 845-855 (2001) und bei Manoutcharian et al., Curr.

Pharm. Biotechnol. 2 : 217-223 (2001) erwähnt sind. Antikörper

können mit radioaktiven Molekülen radiomarkiert werden oder ko- valent gebunden werden, was ihren Nachweis mit radioaktiven Detektoren erlaubt, wie es bei Manoutcharian et al. oben be- schrieben ist.

8) Markieren (tagging) ist eine andere Art, Veränderung in der Prote- inexpression nachzuweisen und zu bestimmen. Beispielsweise kann das Gen, das für das Protein kodiert, technisch hergestellt (engineered) werden, um ein Hybridprotein zu produzieren, das eine nachweisbare Markierung (tag) enthält, so dass das Protein durch Erkennen der Markierung spezifisch nachgewiesen werden kann. Es sind Systeme erhältlich, die die direkte Bildgebung und quantitative Analyse von radioaktiven Markierungen erlauben, z.

B. in Gelen, auf denen Proteine aufgetrennt wurden. Es können Unterschiede in der Expression durch Erkennen von Unterschie- den in der Menge der vorhandenen Markierung in Test-und Kon- trollproben bestimmt werden.

In Fällen, wo Probenmaterial äusserst beschränkt ist, wie bei gewissen Biopsie-oder Asservationsmethoden zur Gewebegewinnung aus Patien- ten in klinischen Situationen, oder wo die Untersuchung Nachweis der Analysatmoleküle mit der geringsten Häufigkeit umfassen sollte, sind die empfindlichsten Nachweisverfahren höchst wünschenswert. Von den oben genannten Verfahren ist der Nachweis von radioisotopmarkierten Proteinen durch geeignete Detektoren um mehrere Grössenordnungen empfindlicher als irgendein anderes Verfahren und deshalb das Mittel der Wahl.

Bildanalysensoftware Es existieren einige aufwändige Softwarepakete für die Verarbeitung von graphischen oder digitalen Daten, die aus biologischen Studien er- halten sind, wie Proteingelanalyse oder Nukleinsäurearrayanalyse. Bei-

spiele für Proteomanalyse umfassen die Produkte Phoretix 2C von Non- Linear Dynamics (Newcastle upon Tyne, UK), Delta 2D von Decodon GmbH (Greifswald, Deutschland), 3Z von Compugen (Tel-Aviv, Israel), Gellab ll+ von Scanalytics (Faifax, VA), Biolmage von Genomic Soluti- ons (Ann Arbor, MI), Melanie 3 von GeneBio (Genf), das Programm Keppler von Large Scale Biology Corporation (Vacaville, CA), der Java- fäh7ge Browser des Programms CAROL (Freie Universität, Berlin), der Gelbildkomparator Flicker 2D gel image comparator (Lemkin PF. Com- paring two-dimensional electrophoretic gel images across the Internet.

Electrophoresis, 18 : 461-470 (1997) und Bildanalyseprodukte, die von Amersham Biosciences (Freiburg, Deutschland) verkauft werden.

Proteinidentifikation in der Proteomik Massenspektrometrie gewinnt in der Proteomik zunehmend Bedeutung, nicht nur zur Identifizierung von Proteinen, die durch 2D-PAGE getrennt wurden, sondern auch für den Direktnachweis und die relative Quantifi- zierung von Proteinen unabhängig von 2D-PAGE. Andere Verfahren zur Proteinidentifizierung umfassen Edman-Abbau, Aminosäureanalyse und andere Verfahren, die den Fachleuten bekannt sind. Viele dieser Verfah- ren beinhalten das Erfassen von Daten aus dem untersuchten Protein und Vergleich dieser Parameter mit einer Liste von Parametern, die durch theoretische Analyse von Nukleinsäure-und Proteindatenbanken vorhergesagt sind.

Anderson NL, Matheson AD, Steiner S. Proteomics : applications in basic and applied biology. Curr. Opin. Bioltechnol. 2000,11 : 408-412.

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Genomik Es sind im Stand der Technik eine Reihe von Verfahren zum Nachwei- sen und Vergleichen der Ausprägung der Genexpression bei Zellen, Or- ganismen oder Viren oder anderer transkriptionsaktiver Systeme be- kannt.

Ein Standardverfahren für solche Vergleiche ist der Northern Blot. Bei dieser Technik wird RNA aus der Probe extrahiert und auf eine Reihe von für die RNA-Analyse geeigneten Gelen aufgebracht, die dann zur Auftrennung der RNA nach der Grösse durchgeführt werden.

Sambrook, J. et al., 1989. Molecular Cloning, A Laboratory Manual. Cold Spring Harbour Laboratory Press, Cold Spring Harbour, NY. 2. Aufl.

Die Gele werden dann geblottet (wie oben bei Sambrook beschrieben) und auf Proben für interessierende RNAs hybridisiert. Die Proben kön- nen radioaktiv oder nicht radioaktiv sein. Beispielsweise kann Hybridisie- rung mit der Probe durch Chemilumineszenznachweis der gebundenen Proben mit dem Genius System (Boehringer Mannheim Corporation, Mannheim, Deutschland) gemäss den Angaben des Herstellers betrach- tet und analysiert werden. Es kann eine gleiche Beladung der RNA in den Bahnen beispielsweise durch Anfärben der Ribosomen-RNA-

Banden mit Ethidiumbromid bewertet werden. Alternativ können die Proben radiomarkiert und autoradiographisch mit einer Probe für ein Gen und einem photographischen Film oder einem Phosphorimager o- der gemäss der vorliegenden Erfindung mit Proben für mehr als ein Gen nachgewiesen werden.

Di RNA kann durch eine Reihe von Methoden verstärkt und dann nachgewiesen werden. Beispielsweise offenbart Marshal, US-Patent Nr.

5,686, 272 die Verstärkung von RNA-Sequenzen mit der Ligaseketten- reaktion LCR (ligase chain reaction). LCR ist von Landegren et al., Science, 241 : 1077-1080 (1988) ; Wu et al., Genomics, 4 : 560-569 (1989) ; Barany, in PCR Methods and Application, 1 : 5-16 (1991) ; und Barany, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 : 189-193 (1991) beschrieben.

Auch kann die RNA durch Reverstranskription in komplementäre DNA (cDNA) umgewandelt und dann durch LCR, Polymerasekettenreaktion (PCR, polymerase chain reaction) oder andere Verfahren verstärkt wer- den. Ein Beispiel eines Verfahrens zur Durchführung der Re- verstranskription von RNA ist im US-Patent Nr. 5,705, 365 offenbart. Es wird Auswahl geeigneter Primer und PCR-Protokolle gelehrt, beispiels- weise bei Innis, M. et al., Hrsg. PCR Protocols 1990 (Academic Press, San Diego CA). Differentielle Expression von Messenger-RNA (mRNA) kann auch durch Reverstranskription von mRNA in cDNA verglichen werden, die dann durch Restriktionsenzyme gespalten und elektrophore- tisch getrennt werden, so dass ein Vergleich der cDNA-Fragmente mög- lich ist, wie es bei Belavsky, US-Patent Nr. 5,814, 445 gelehrt ist.

Typischerweise werden Primer am 5'-Ende mit Biotin oder einem der vielen Fluoreszenzfarbstoffe markiert. Proben werden üblicherweise mit einem Enzym markiert, wie Rettich-Peroxidase (HRP, horse radish pe- roxidase) und alkalischer Phosphatase, siehe Levenson und Chang, Nonisotropically Labelled Probes and Primers in : Innis et al., können a- ber auch z. B. mit Biotinpsoralen markiert werden. Ausführliche Bei- spielprotokolle zum Markieren von Primern und zum Synthetisieren von

enzymmarkierten Proben sind bei Levenson und Chang angegeben. Die Proben können auch mit radioaktiven Isotopen markiert werden. Ein bei- spielhaftes Protokoll zum Synthetisieren radioaktiv markierter DNA-und RNA-Proben ist in Sambrook ausgeführt. Es sind eine Reihe von Rea- genzien zum Einbringen verschiedener Radionuklide in DNA-Proben verfügbar, darunter Enzymprecursorsubstrate mit 3H, 14C, 32P, 35S un anderen Elementen, die in natürlich vorkommenden Nukleinsäuren nicht vorhanden sind, wie z. B. radioaktives lod. Ferner können Primer hergestellt werden, die einen grossen Bereich von anderen radioaktiven Elementen enthalten, die kovalent an den Primer gebunden werden, wie es den Fachleuten bekannt ist. Es sind eine Reihe von Verfahren zum Nachweis von PCR-Produkten bekannt. Allgemein ist ein Schritt enthal- ten, der Hybridisierung der Probe und des PCR-Produkts erlaubt, der gefolgt ist ein einem oder mehreren Entwicklungsschritten, um einen Nachweis zu ermöglichen.

Wenn eine radioaktiv markierte Probe verwendet werden soll, können PCR-Produkte, mit denen die Probe hybridisiert ist durch Autoradiogra- phie nachgewiesen werden. Als ein Beispiel kann biotinyliertes dUTP (Bethesda Research Laboratories, MD) bei der Verstärkung verwendet werden. Die markierten PCR-Produkte können dann auf einem Agarose getrennt werden, durch Southern-Transfer auf einen Nylonfilter gebracht und beispielsweise durch ein Detektorsystem mit Streptavidin/alkalischer Phosphatase nachgewiesen werden. Ein Protokoll zum Nachweis ein- gebrachter biotinylierter dUTP ist z. B. bei Lo et al., Incorporation of Bio- tinylated dUTP, in : Innis et al. beschrieben. Schliesslich können die PCR-Produkte auf Agarosegels aufgegeben werden und Nukleinsäuren durch einen Farbstoff nachgewiesen werden, wie Ethidiumbromid, das spezifisch Nukleinsäuren erkennt.

Sutcliffe, US-Patent Nr. 5,807, 680 lehrt ein Verfahren zum simultanen Identifizieren differentiell exprimierter mRNAs und Messung relativer Konzentrationen. Die Technik, die die Bildung von cDNA mit Ankerpri-

mern gefolgt von PCR umfasst, ermöglicht die Sichtbarmachung nahezu aller mRNA, die in einem Gewebe exprimiert ist, als deutliches Band auf einem Gel, dessen Intensität grob der Konzentration an mRNA ent- spricht.

Eine andere Gruppe von Techniken verwendet die Analyse der relativen Tråskriptexpressionswerte. Jüngst wurden vier solcher Ansätze entwi- ckelt, um umfassende Analyse mit hohem Durchsatz zu ermöglichen.

Zunächst kann cDNA durch Reverstranskription aus RNA in der Probe erhalten werden (wie in den obigen Zitaten beschrieben) und einer ein- fachen Sequenzierung der 5'-und 3'-Enden unterzogen werden, um ex- primierte Sequenzmarker (EST, expressed sequence tags) für die im Test exprimierten Gene und Kontrollproben zu definieren. Aufzählen der relativen Repräsentation der Marker von verschiedenen Proben ergibt eine Abschätzung der relativen Repräsentation des Gentranskripts in den Proben.

Zweitens wurde eine Variation von ESTs entwickelt, die als SAGE (serial analysis of gene expression) bekannt sind, die eine quantitative und gleichzeitige Analyse einer grossen Zahl von Transkripten ermöglicht.

Die Technik verwendet die Isolierung kurzer diagnostischer Sequenz- marker und Sequenzieren, um Muster der Genexpressionscharakteristik einer Zielfunktion aufzuzeigen, und wurde verwendet, um Expressions- werte zu vergleichen, z. B. von tausenden von Genen in normalen und tumorösen Zellen. Siehe Velculescu, et al., Science 270 : 368-369 (1995), Zhang et al., Science 276 : 1268-1272 (1997).

Drittens wurden Ansätze auf Basis des differentiellen Displays entwi- ckelt. In diesen Ansätzen können durch spezifische Sequenzbegrenzer definierte Fragmente als einzige Identifikatoren für Gene verwendet werden, wenn sie mit Informationen über die Fragmentlänge in dem exprimierten Gen gekoppelt sind. Die relative Repräsentation eines exprimierten Gens in einer Zelle kann dann durch die relative Repräsen-

tation des dem Gen zugeordneten Fragments abgeschätzt werden. Bei- spiele einiger Ansätze sind Restriktionsenzymanalyse von differentiell exprimierten Sequenzen (READS, restriction enzyme analysis of diffe- rentially expressed sequences) verwendet von Gene Logic Inc., und Ge- samtgenexpressionsanalyse (total gene expression analysis) von Digital Gene Technologies Inc. CLONTECH, Inc. (Palo Alto, CA) vertreiben das DeXaX Differential Display Kit zur Identifizierung differentiell exprimierter Gene durch PCR. Ein anderes Verfahren ist das GeneCalling-System der CuraGen Corp., New Haven CT, das kombiniert Genidentifzierung mit Datenbankabfrage eines Restriktionsendonukleaseabdrucks, bestä- tigt durch vergleichende PCR unter Verwendung genspezifischer Oligo- nukleotide, wodurch Genisolationsprozeduren optimiert werden.

Viertens wird in bevorzugten Ausführungsformen der Nachweis durch eine einer Reihe von Techniken zur Hybridisierungsanalyse durchge- führt. In diesen Ansätzen wird RNA aus der interessierenden Probe ei- ner Reverstranskription unterzogen, um makrierte cDNA zu erhalten. Die cDNA wird dann hybridisiert, typischerweise mit Oligonukleotiden oder cDNAs bekannter Sequenz, die auf einem Chip oder einer anderen Flä- che in bekannter Folge angeordnet werden. Die Lage des Oligonukleo- tids, das mit der markierten cDNA hybridisiert, gibt Sequenzinformatio- nen zur cDNA, während die Menge der markierten RNA oder cDNA eine Abschätzung der Menge der relativen RNA oder cDNA in der ursprüngli- chen Probe gibt. Ferner ermöglicht die Technik gleichzeitige Hybridisie- rung mit zwei oder mehr verschiedenen nachweisbaren Markern, wie zwei oder mehr radiaktiven oder fluoreszierenden Markern, gemäss dem Anspruch 1 der vorliegenden Erfindung. Die Hybridisierungsergebnisse ergeben einen direkten Vergleich der relativen Expression der Proben. Der Stand der Technik wird als Übersicht von King und Sinha, JAMA 286 : 2280-2208 (2001) und Jain, Science, 294 : 621-623 (2001) und de- ren Literaturzitate gegeben.

Es sind im Handel eine Reihe von Kits zur Hybridisierungsanalyse er- hältlich. Diese Kits ermöglichen eine Identifizierung spezifischer RNA- oder cDNA-Moleküle auf hochdichten Formaten, darunter Filter, Mikro- skopieplättchen, Mikrochips und Techniken der Massenspektrometrie.

Beispielsweise vertreibt Affymetrix, Inc. (Santa Clara, CA) GeneChipO Probearrays, die tausende unterschiedlicher Oligonukleotidproben be- kalter Sequenzen, Längen und Lokationen im Array für hochpräzise Sequenzierung von Genen enthält. Synthetische Oligonukleotidarrays kombiniert mit PCR-Verfahren können Transkriptionsverhältnisse bei einer Kopie pro Zelle in komplexen biologischen Proben nachweisen, und eine Tintenstrahloligonukleotidarraytechnik kann zur genauen An- wendung eingesetzt werden. Siehe Hughes, T. R., et al., Nature Biotech- nology, 19 : 342-347 (2001). CLONTECH's AtlasO cDNA- Expressionsarray ermöglicht Messung der Expressionsmuster von 588 ausgewählten Genen. Der Gene Discovery Modul von Hyseq Inc. (Sun- nyvale, CA) ermöglicht Screening von RNA mit hohem Durchsatz, ohne vorherige Sequenzinformationen bei einer Empfindlichkeit von 1 mRNA- Kopie pro Zelle. Incyte Pharmaceuticals Inc. (Palo Alto, CA) bietet Mik- roarrays an, die beispielsweise geordnete Oligonukleotide von mensch- lichem Krebs und Signaltransduktionsgene enthält. Von anderen Firmen verwendete Techniken werden z. B. in Service, R. ; Science 282 : 396- 399 (1998) und in Clarke P. A. Biochem. Pharmacol., 62 : 1311-1136 und deren Zitaten diskutiert.

Messung radioaktiver Strahlung Die ersten elektrischen Geräte, die zum Strahlungsnachweis entwickelt wurden, waren lonisationsdetektoren. Diese Instrumente beruhen auf dem direkten Einfang von Elektronen und lonen, die in einem Gas durch Strahlung erzeugt werden. Es gibt zwei grundsätzliche Typen von De- tektoren, die als lonisationskammer und Proportionalzähler bekannt sind.

Ein anderes Nachweisgerät ist der Szintillationsdetektor. Er beruht auf der Tatsache, dass gewisse Materialien, wenn sie von einem Nuklear- partikel oder von Strahlung getroffen werden, eines oder mehrere Pho- tonen, d. h. eine Szintillation emittieren. Diese Szintillationen können bei Kopplung an ein Verstärkungsgerät, wie einen Photomultiplier, in elektri- sche Impulse umgewandelt werden, die dann analysiert und elektronisch gezählt werden können, um eine Information über die einfallende Strah- lung zu liefern.

Auch Halbleiterdetektoren sind verbreitet verwendete Nachweisgeräte, die auf kristallinen Halbleitermaterialien beruhen, vor allem auf Silizium und Germanium. Diese Detektoren werden auch als Feststoffdetektoren bezeichnet. Das Funktionsprinzip von Halbleitern ist analog zu dem von Gasionisationsgeräten. Anstelle eines Gases ist das Medium ein festes Halbleitermaterial. Der Vorteil von Halbleiterdetektoren im Vergleich zu lonisationskammern ist ihre größere Energieauflösung.

Das folgende Lehrbuch beschreibt die Prinzipien von radioaktiven Nachweismethoden : Knoll, G. F. : Radiation detection and measurements, 802 S., 3. Aufl. De- zember 1999, John Wiley and Sons, ISBN 0471073385.