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Patent Searching and Data


Title:
DIFFRACTION MICROSCOPE METHOD AND DEVICE
Document Type and Number:
WIPO Patent Application WO/2016/050460
Kind Code:
A1
Abstract:
According to one aspect, the invention relates to a device (100, 200, 300, 400, 500) for measuring the distance, with respect to a reference plane (PREF), of a point of light (Pi) of an object (O). The device comprises a two-dimensional detector (30) comprising a detection plane (PDET) and an imaging system (10) capable of forming an image of a point of light (Pi) situated on an object plane of interest (11) in an image plane (11') arranged close to the detection plane (PDET) or to a conjugate plane (P'DET) of the detection plane. The device further comprises a separator element (20) able to form, from a beam emitted by a point of light of the object plane of interest (11) and emerging from the imaging system (10), at least two mutually coherent beams, having a region of special superposition in which the beams interfere, and signal processing means (50) able to determine, from the interference pattern formed in the detection plane and resulting from the optical interference between said mutually coherent beams, the distance from the point of light to the conjugate plane of the detection plane in the object space of the imaging system (10), said conjugate plane of the detection plane forming the reference plane (PREF).

More Like This:
Inventors:
BON PIERRE (FR)
FORT EMMANUEL (FR)
LEVEQUE-FORT SANDRINE (FR)
Application Number:
PCT/EP2015/070503
Publication Date:
April 07, 2016
Filing Date:
September 08, 2015
Export Citation:
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Assignee:
CENTRE NAT RECH SCIENT (FR)
UNIVERSITÉ PARIS SUD (FR)
International Classes:
G01B9/04; G01B9/02; G02B21/00
Foreign References:
US6031611A2000-02-29
Other References:
RUAN Y ET AL: "Tomographic diffractive microscopy with a wavefront sensor", OPTICS LETTERS, OPTICAL SOCIETY OF AMERICA, US, vol. 37, no. 10, 15 May 2012 (2012-05-15), pages 1631 - 1633, XP001575578, ISSN: 0146-9592, [retrieved on 20120507], DOI: 10.1364/OL.37.001631
POPESCU G ET AL: "DIFFRACTION PHASE MICROSCOPY FOR QUANTIFYING CELL STRUCTURE AND DYNAMICS", OPTICS LETTERS, OPTICAL SOCIETY OF AMERICA, US, vol. 31, no. 6, 15 March 2006 (2006-03-15), pages 775 - 777, XP001241133, ISSN: 0146-9592
AMARDEEP S.G. SINGH ET AL: "Lateral shearing digital holographic imaging of small biological specimens", OPTICS EXPRESS, vol. 20, no. 21, 8 October 2012 (2012-10-08), pages 23617, XP055194975, ISSN: 1094-4087, DOI: 10.1364/OE.20.023617
B. HAJJ ET AL.: "Accessing the third dimension in localization-based super-resolution microscopy", PHYS. CHEM. CHEM. PHYS., vol. 16, 2014, pages 16340 - 16348
A BACKER ET AL.: "A bisected pupil for studying single-molecule orientational dynamics and its application to three-dimensional super-resolution microscopy", APPLIED PHYSICS LETTERS, vol. 104, 2014, pages 193701
S. ABRAHAMSSON ET AL.: "fast multicolor 3D imaging using aberration-corrected multifocus microscopy", NATURE METHODS, vol. 10, no. 1, 2013
G. SHTENGEL ET AL.: "Interferometric fluorescent super-resolution microscopy resolves 3D cellular ultrastructure", PROC. NATL ACAD SCI U S A, vol. 106, 2009, pages 3125
J. PRIMOT ET AL.: "Extended Hartmann test based on the pseudoguiding property of a Hartmann mask completed by a phase chessboard", APPLIED OPTICS, vol. 39, no. 31, 2000, pages 5715 - 5720
Attorney, Agent or Firm:
OSHA LIANG SARL (FR)
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Claims:
REVENDICATIONS

1. Dispositif (100, 200, 300, 400, 500) de mesure de la distance, par rapport à un plan de référence (PREF), d'un point lumineux (Pi) d'un objet (O), comprenant :

- un détecteur bidimensionnel (30) comprenant un plan de détection (PDET); - un système d'imagerie (10) adapté à former une image d'un point lumineux

(Pi) situé sur un plan objet d'intérêt (1 1) dans un plan image (1 1 ') situé à proximité du plan de détection (PDET) OU d'un plan (P'DET) conjugué du plan de détection;

- un élément séparateur (20) permettant de former à partir d'un faisceau émis par un point lumineux du plan objet d'intérêt (1 1) et émergeant du système d'imagerie (10) au moins deux faisceaux cohérents entre eux, présentant une région de superposition spatiale dans laquelle les faisceaux interfèrent;

- des moyens de traitement du signal (50) permettant de déterminer à partir de la figure d'interférence formée sur le plan de détection et résultant des interférences optiques entre lesdits faisceaux cohérents entre eux, la distance du point lumineux à un plan conjugué du plan de détection dans l'espace objet du système d'imagerie (10), ledit plan conjugué du plan de détection formant le plan de référence (PREF).

2. Dispositif selon la revendication 1 , dans lequel la période (Λ) des franges de la figure d'interférence ainsi formée est plus petite que la résolution du système d'imagerie.

3. Dispositif selon l'une des revendications précédentes, dans lequel l'élément séparateur comprend un réseau de diffraction (21) proche du plan d'imagerie (1 1 ').

4. Dispositif selon la revendication 3, dans lequel le réseau de diffraction est un réseau de diffraction bidimensionnel.

5. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 3 ou 4, dans lequel le réseau de diffraction est un réseau en transmission, respectivement en réflexion, qui ne transmet pas, respectivement ne réfléchit pas, l'ordre zéro.

6. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre une optique relai (40) permettant de former un plan conjugué du plan de détection dans l'espace image du système d'imagerie.

7. Dispositif selon l'une quelconque des revendications précédentes appliqué à l'imagerie microscopique tridimensionnelle, dans lequel le système d'imagerie comprend un objectif de microscope (12).

8. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 6 appliquée à la télémétrie passive, dans lequel système d'imagerie comprend un objectif photo ou vidéo adapté à travailler à l'infini.

9. Méthode pour la mesure de la distance, par rapport à un plan de référence (PREF), d'un point lumineux (Pi) d'un objet d'intérêt (O), comprenant :

- la formation d'une image du point lumineux (Pi) situé sur un plan image (11 ') situé à proximité du plan de détection (PDET) d'un détecteur bidimensionnel (30) ou d'un plan (P'DET) conjugué du plan de détection;

- la formation, au moyen d'un élément séparateur (20), à partir d'un faisceau (Β') émis par le point lumineux (Pi) et émergeant du système d'imagerie (10) d'au moins deux faisceaux cohérents entre eux (ΒΊ, B'2) et présentant une région de superposition spatiale dans lesquels les faisceaux cohérents entre eux interfèrent;

- la détermination, à partir de la figure d'interférence formée sur le plan de détection (PDET) et résultant des interférences optiques entre lesdits faisceaux cohérents entre eux, de la distance du point lumineux (Pi) à un plan conjugué du plan de détection dans l'espace objet du système d'imagerie (10), ledit plan conjugué du plan de détection formant le plan de référence (PREF).

10. Méthode selon la revendication 9, dans laquelle la distance du point lumineux (Pi) au plan de référence est obtenue à partir de la mesure de la période (Λ) des franges de la figure d'interférence.

Description:
METHODE ET DISPOSITIF DE MICROSCOPE DIFFRACTIVE

ÉTAT DE L'ART

Domaine technique de l'invention La présente invention concerne une méthode et un dispositif optique de télémétrie pour la détermination de la position tridimensionnelle d'un objet, et s'applique notamment à l'imagerie microscopique tridimensionnelle en biologie mais aussi à la télémétrie optique passive (sans mesure de temps de vol).

Etat de l'art Quelques années seulement après leur introduction, les techniques de microscopie dites de super résolution ont pris un essor considérable dans le domaine de l'étude des spécimens biologiques, notamment pour l'étude de la structure et de la dynamique spatiale des assemblages protéiques (complexes moléculaires de quelques nanomètres à une centaine de nanomètres) au sein de la cellule. A l'heure actuelle, il est possible de fonctionnaliser pratiquement n'importe quelle protéine dans un organisme en lui ajoutant un marqueur fluorescent, ce dernier pouvant être directement synthétisé par la cellule, ou constitué par un composé fluorescent ajouté au sein de l'échantillon. Il s'ensuit la formation d'émetteurs capables d'émettre un nombre de photons compris entre quelques centaines de milliers et quelques millions avant d'être photo détruits. Les techniques de super résolution, connues sous les acronymes de PALM pour « Photo -Activated Localisation Microscopy » ou (d)STORM pour « (direct) Stochastical Optical Reconstruction Microscopy » par exemple, combinent localisation nanométrique et contrôle du nombre d'émetteurs simultanément actifs, afin d'obtenir des images bidimensionnelles d'échantillons cellulaires avec une résolution de 10-50 nm, soit bien inférieure à la limite classique de la diffraction.

Cependant, ces techniques sont aujourd'hui principalement mises en œuvre pour l'imagerie bidimensionnelle ; accéder à l'organisation 3D de structures cellulaires à l'échelle nanométrique continue de présenter de nombreuses difficultés. L'article de revue de B. Hajj et al. (« Accessing the third dimension in localization-based super-resolution microscopy », Phys. Chem. Chem. Phys. , 2014, 16, 16340 - 16348) présente une synthèse des techniques utilisées pour la microscopie de super résolution à trois dimensions et regroupe ces techniques en plusieurs catégories : les techniques basées sur le contrôle de la forme de la PSF (acronyme de l'expression anglo-saxonne « Point Spread Function » et représentant la réponse impulsionnelle du système d'imagerie), celles basées sur une approche dite « multi plans » et les techniques utilisant l'interférométrie.

Les techniques basées sur le contrôle de la forme de la réponse impulsionnelle (PSF) du système d'imagerie comprenant l'objectif de microscope visent à casser la symétrie axiale de la PSF de telle sorte qu'il y ait une relation bijective entre la section latérale de la PSF et la position axiale de l'émetteur par rapport au plan focal du système d'imagerie. Très récemment, il a été décrit (voir A Backer et al, « A bisected pupil for studying single- molécule orientational dynamics and its application to three-dimensional super-resolution microscopy », Applied Physics Letters 104, 193701 (2014)) un masque de phase particulier agencé dans un plan pupillaire de l'objectif de microscope, et permettant de diviser la section latérale de la PSF en deux lobes, la positon relative des deux lobes permettant de déterminer la position axiale de l'émetteur. Cependant, dans cette technique comme dans les autres techniques de ce type, il n'est pas possible d'étudier simultanément une densité importante de molécules car dès que la densité de particules augmente, on observe une superposition des lobes ou plus généralement des PSF élargies. De plus les aberrations optiques naturellement introduites par l'échantillon dans le cas d'une imagerie en profondeur tendent à supprimer la relation bijective entre la forme de la PSF et la position axiale, ce qui limite l'utilisation de ces techniques dans les premières couches de cellules.

L'approche multi plans consiste à imager simultanément le signal d'un émetteur dans des plans axialement séparés. L'article de S. Abrahamsson et al. (« fast multicolor 3D imaging using aberration-corrected multifocus microscopy », Nature Methods, Vol. 10 No.l (2013)) décrit ainsi par exemple l'agencement d'un réseau particulier permettant de générer neuf images sur un détecteur unique correspondant à neuf ordres de diffraction. Cependant, une limitation des techniques multi plans est la division du « budget photons » de l'émetteur selon un nombre donné d'images, entraînant une perte de sensibilité et donc de précision.

La précision axiale en microscopie de super résolution peut être améliorée de façon significative en faisant interférer les ondes émises par un émetteur au foyer de deux objectifs de microscope (voir G. Shtengel et al. "Interferometric fluorescent super-resolution microscopy résolves 3D cellular ultrastructure" Proc. Natl Acad Sci U S A 106, 3125 (2009)). Cette dernière technique qui met en œuvre un système de mesure dit « 4pi », c'est-à-dire utilisant deux objectifs tête bêche afin de collecter la lumière dans quasiment 4pi stéradian, combiné à une triple détection interférométrique des photons émis, est celle qui offre aujourd'hui la meilleure précision de localisation axiale, mais au prix d'une complexité expérimentale considérable qui la relègue à une utilisation très minoritaire dans les laboratoires de biologie. Cette technique est par ailleurs sensible aux aberrations différentielles résultant de la traversée de l'échantillon vers l'avant ou vers l'arrière dans un montage 4pi, et ce pour tout type d'échantillon.

La présente invention met en œuvre une technique interférométrique qui ne présente pas les inconvénients des techniques précédemment décrites ; notamment elle permet une imagerie plein champ adaptée à la détection de continuums d'émetteurs fluorescents mais ne nécessitant qu'un seul détecteur. Elle s'applique en microscopie de super résolution mais aussi en microscopie classique et trouve également des applications en télémétrie optique passive, c'est-à-dire pour la détermination de la distance d'un objet dans une scène sans analyse de temps de vol.

RÉSUMÉ DE L'INVENTION

Selon un premier aspect, l'invention concerne un dispositif de mesure de la distance, par rapport à un plan de référence, d'un point lumineux d'un objet, comprenant :

- un détecteur bidimensionnel comprenant un plan de détection ;

- un système d'imagerie adapté à former une image d'un point lumineux situé sur un plan objet d'intérêt dans un plan image situé à proximité du plan de détection ou d'un plan conjugué du plan de détection;

- un élément séparateur permettant de former à partir d'un faisceau émis par un point lumineux du plan objet d'intérêt et émergeant du système d'imagerie au moins deux faisceaux cohérents entre eux, présentant une région de superposition spatiale dans laquelle les faisceaux interfèrent;

- des moyens de traitement du signal permettant de déterminer à partir de la figure d'interférence formée sur le plan de détection et résultant des interférences optiques entre lesdits faisceaux cohérents entre eux, la distance du point lumineux à un plan conjugué du plan de détection dans l'espace objet du système d'imagerie (10), ledit plan conjugué du plan de détection formant le plan de référence.

Au sens de la présente description, la notion de « point lumineux » d'un objet ou « point source » s'étend également de façon plus large à une zone élémentaire d'un objet dans laquelle tous les points d'émission sont cohérents entre eux spatialement et forment ensemble un point image unique sur le détecteur. Ainsi, dans le cas de l'application à la microscopie de super résolution, un point source pourra être un émetteur fluorescent ou « quantum dot » dont les dimensions spatiales sont inférieures à la tâche de diffraction du système d'imagerie. Dans d'autres applications macroscopiques au contraire, un point source pourra englober une zone plus étendue et spatialement cohérente d'un objet formant sur le plan de détection un « point image » dont les dimensions dont nettement supérieures à celles de la réponse impulsionnelle (ou PSF) du système d'imagerie.

Le dispositif ainsi décrit permet notamment de reconstruire en 3D un objet sans besoin de mettre en œuvre de moyens d'illumination contrôlée de l'objet ; ainsi, le dispositif décrit permet par exemple de reconstruire en 3D un objet émettant sa propre lumière (cas d'un émetteur fluorescent en microscopie) ou un objet réémettant de la lumière sans pour autant que l'on ait un contrôle sur son illumination (scène de la vie de tous les jours).

L'élément séparateur tel que défini dans le dispositif selon la présente description permet d'imprimer au sein du « point image », c'est-à-dire l'image d'un point lumineux de l'objet formée sur le plan de détection, une modulation dont la période dépend de la courbure relative de l'onde issue du point lumineux, permettant in fine d'aboutir à une cartographie d'élévation relative de l'objet. L'élément séparateur couplé au détecteur se comporte ainsi comme un senseur de courbure de l'onde issue des différents points lumineux de l'objet qui imprime une modulation au sein de chaque point image sans en dégrader la résolution. Avantageusement, l'élément séparateur permet d'imprimer une modulation au sein du point image dont la période est suffisamment petite pour former au moins deux franges au niveau du point image et obtenir une précision de mesure suffisante.

Avantageusement, et notamment dans le cas des applications de microscopie de super résolution, la période des franges de la figure d'interférence formée sur le plan de détection (« interfrange ») est plus petite que le diamètre de la réponse impulsionnelle du système d'imagerie (ou PSF), qui est la plus petite image formée à partir d'un point lumineux sur le plan de détection.

Selon une variante, l'élément séparateur comprend un réseau de diffraction proche du plan d'imagerie, par exemple un réseau de diffraction bidimensionnel. Selon une variante, le réseau de diffraction est un réseau en transmission, respectivement en réflexion, qui ne transmet pas, respectivement ne réfléchit pas, l'ordre zéro. Selon une variante, le dispositif est appliqué à l'imagerie tridimensionnelle ; le système d'imagerie comprend alors un objectif de microscope.

Selon une variante, le dispositif comprend en outre une optique relai permettant de former un plan conjugué du plan de détection dans l'espace image du système d'imagerie.

Selon un deuxième aspect, l'invention concerne une méthode pour la mesure de la distance, par rapport à un plan de référence, d'un point lumineux d'un objet d'intérêt, comprenant :

- la formation d'une image du point lumineux dans un plan image proche du plan de détection d'un détecteur bidimensionnel ou d'un plan conjugué du plan de détection;

- la formation, au moyen d'un élément séparateur, à partir d'un faisceau émis par le point lumineux et émergeant du système d'imagerie d'au moins deux faisceaux cohérents entre eux et présentant une région de superposition spatiale dans lesquels les faisceaux cohérents entre eux interfèrent;

- la détermination, à partir de la figure d'interférence formée sur le plan de détection et résultant des interférences optiques entre lesdits faisceaux cohérents entre eux, de la distance du point lumineux à un plan conjugué du plan de détection dans l'espace objet du système d'imagerie, ledit plan conjugué du plan de détection formant le plan de référence.

Selon une variante, la distance du point lumineux au plan de référence est obtenue à partir de la mesure de la période des franges de la figure d'interférence.

BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS

D'autres avantages et caractéristiques de l'invention apparaîtront à la lecture de la description, illustrée par les figures suivantes :

Figures 1A et 1B, des schémas illustrant deux exemples de dispositif de télémétrie selon la présente description ;

Figures 2A à 2D, des schémas illustrant le principe de la méthode mise en œuvre selon un exemple ; Figure 3, des courbes montrant selon deux exemples particuliers la valeur de l'interfrange (pseudo-période de la modulation) en fonction de la position axiale du point source par rapport au plan de référence ;

Figures 4A et 4B, des schémas illustrant des dispositifs de télémétrie selon deux autres exemples;

Figure 5, un schéma illustrant un exemple de dispositif selon la présente description, appliqué à l'imagerie microscopique tridimensionnelle ;

Figures 6A à 6C, des images illustrant différentes étapes de la méthode de télémétrie dans une application de microscopie de super résolution mise en œuvre avec un montage du type de celui de la figure 5 et avec un échantillon biologique comprenant des cellules CHO (« Chinese Hamster Ovary ») et un marquage des protéines de tubuline du cytosquelette de ces cellules ;

Figures 7A à 7C, des images montrant l'allure de la figure d'interférence obtenue pour un émetteur fluorescent unique {quantum dot), à différentes positions axiales, dans une configuration similaire (montage et échantillon) à celle mise en œuvre pour l'obtention des images 6A à 6C;

Figures 8A, 8B, respectivement une image de fluorescence standard et une image de l'échantillon biologique obtenue dans une configuration similaire (montage et échantillon) à celle mise en œuvre pour l'obtention des images 6A à 6C; - Figure 9, un schéma d'un dispositif selon la présente description, appliqué à la télémétrie optique passive dans une scène.

Par soucis de cohérence, les éléments identiques sont repérés par les mêmes références dans les différentes figures.

DESCRIPTION DÉTAILLÉE

Les figures 1A et 1B illustrent deux exemples de dispositif de télémétrie selon la présente description, adaptés pour la mesure de la distance, par rapport à un plan de référence donné, d'un point lumineux Pi (ou « point source ») d'un objet d'intérêt O dans une scène. Le dispositif de télémétrie 100 schématisé sur la figure 1A comprend généralement un détecteur bidimensionnel 30 avec un plan de détection P DET relié à des moyens de traitement du signal 50, et un système d'imagerie 10 adapté pour former une image d'un point lumineux Pi d'un plan objet d'intérêt 11, dans un plan image 11 ' situé à proximité du plan de détection 31 du détecteur. Dans le dispositif de télémétrie 200 schématisé sur la figure 1B, le plan image 11 ' est à proximité d'un plan P' DET conjugué du plan de détection P DET , le dispositif comprenant en outre une optique relai 40 permettant de former dans l'espace image du système d'imagerie 10 un plan conjugué du plan de détection.

La proximité du plan image avec le plan de détection (ou le conjugué du plan de détection) dépend de la précision recherchée pour la mesure de distance.

En effet, pour une position donnée du plan de détection P DET (OU du plan conjugué P' DET du plan de détection par l'optique relai 40), on peut définir dans l'espace objet du système d'imagerie 10 une zone de mesure définie de part et d'autre d'un plan objet P REF dit « plan de référence » et correspondant au plan conjugué du plan de détection dans l'espace objet du système d'imagerie. La zone de mesure correspond à la zone dans laquelle la précision de mesure de la distance d'un point lumineux par rapport au plan de référence est satisfaisante en fonction de l'application envisagée.

Ainsi par exemple, dans les applications en microscopie tridimensionnelle, lorsqu'on recherche une précision de localisation d'un émetteur par rapport au plan de référence bien en-dessous de la profondeur de champ objet du système d'imagerie, la zone de mesure pourra présenter une longueur totale L m inférieure à quatre fois la profondeur de champ objet dz du système d'imagerie et avantageusement inférieure à deux fois la profondeur de champ objet dz du système d'imagerie pour s'assurer d'une bonne précision de mesure.

Pour un système d'imagerie 10 d'ouverture numérique NA, on peut déterminer la profondeur de champ objet dz par

dz =— 2 (1)

NA 2 '

Avec λ la longueur d'onde moyenne de la lumière collectée et n l'indice d'immersion du système d'imagerie, c'est-à-dire l'indice du milieu situé juste avant le premier dioptre (dans le sens de propagation de la lumière) du système d'imagerie 10 ; typiquement n=l pour un système d'imagerie immergé dans l'air, par exemple pour des applications de télémétrie passive et n¾1.5 pour un système d'imagerie immergé dans une huile à immersion, par exemple pour des applications en microscopie de super-résolution.

En conséquence, dans le cas par exemple des applications en microscopie tridimensionnelle, le plan de détection (ou le conjugué du plan de détection) et le plan image 11 ' conjugué du plan objet d'intérêt 11 par le système d'imagerie 10 pourront se trouver éloignés l'un de l'autre d'une distance inférieure à deux fois la profondeur de champ image du système d'imagerie, et avantageusement d'une distance inférieure à une fois la profondeur de champ image du système d'imagerie, afin de bénéficier d'une bonne précision dans la mesure de la distance du point lumineux.

Dans d'autres applications au contraire, comme par exemple dans les applications de télémétrie passive, la distance entre le plan de détection (ou le conjugué du plan de détection) et le plan image 11 ' conjugué du plan objet d'intérêt 11 par le système d'imagerie 10 peut être allongée à dix fois, voire vingt fois la profondeur de champ image, au détriment de la précision de localisation qui devient dès lors de l'ordre de la profondeur de champ ; ce mode de fonctionnement est principalement intéressant pour la mesure de télémétrie passive, où chercher à savoir où se situe l'objet axialement sans super-résolution est suffisant.

Ainsi dans l'exemple des figures 1 A et 1B, on pourra mesurer non seulement la distance d'un point lumineux Pi situé sur dans un plan objet d'intérêt 11 sensiblement confondu avec le plan de référence P REF niais aussi la distance de points lumineux P 2 et P 3 situés de part et d'autre de ce plan de référence, à condition qu'ils se trouvent dans la zone de mesure de longueur L m définie en fonction de la précision recherchée.

Pour la détermination de la distance d'un point lumineux Pi au plan de référence P REF , le dispositif de télémétrie comprend un élément séparateur 20 permettant de former à partir d'un faisceau B' émis par le point lumineux Pi et émergent du système d'imagerie 10, au moins deux faisceaux cohérents entre eux (non représentés sur les figures 1A et 1B) et présentant une région de superposition spatiale dans laquelle lesdits faisceaux cohérents entre eux interfèrent.

L'élément séparateur 20 sera décrit plus en détails par la suite et peut comprendre par exemple un réseau, avantageusement un réseau bidimensionnel, situé proche du plan de détection P DET (exemple de la figure 1 A) ou du plan P ' DET conjugué du plan de détection P DET (exemple de la figure 1B). L'élément séparateur 20 peut comprendre également une lame séparatrice ou un cube séparateur, comme cela sera illustré au travers d'exemples dans la suite de la description.

L'élément séparateur est agencé de telle sorte que le plan de détection ou le plan conjugué du plan de détection se trouve dans la zone de superposition spatiale des faisceaux cohérents entre eux et issus de l'élément séparateur. Ainsi, sur le plan de détection du détecteur, se forme pour chaque point source Pi une image qui est la convolution de la réponse impulsionnelle du système d'imagerie (PSF) avec une figure d'interférence résultant de l'interférence des faisceaux issus de l'élément séparateur.

Par le choix des paramètres de l'élément séparateur (par exemple le pas du réseau dans le cas d'un élément séparateur de type réseau de diffraction, ou l'indice optique et l'épaisseur de la lame séparatrice dans le cas d'un élément séparateur de type lame séparatrice), il est possible de fixer l'interfrange de la figure d'interférences et d'imprimer au sein de l'image une modulation dont la période est avantageusement plus petite que le diamètre φ de la réponse impulsionnelle du système d'imagerie, donné par :

φ ^ = 2τ = 0,61— NA (2) '

où r est le rayon de la PSF, NA est l'ouverture numérique du système d'imagerie et gy son grandissement. Comme cela sera détaillé par la suite, la période de la modulation (autrement dit l'interfrange de la figure d'interférences) dépend de la position relative du point source par rapport au plan de référence P REF qui est le plan conjugué du plan de détection P DET dans l'espace objet du système d'imagerie 10. L'élément séparateur ainsi décrit associé au détecteur, se comporte donc comme un senseur de la courbure relative de l'onde émise par chaque point source de l'objet, ce qui permet de déterminer in fine une cartographie d'élévation relative de l'objet.

Les figures 2A à 2D illustrent plus en détails le principe de la méthode mise en œuvre selon un exemple particulier dans lequel l'élément séparateur comprend un réseau 21.

Le réseau 21 est avantageusement un réseau de diffraction bidimensionnel. Deux mesures de positionnement axial (e.g. mesures de distance par rapport au plan de référence) indépendantes (une suivant chacun des axes du réseau) peuvent ainsi être obtenues pour un point source unique, ce qui augmente la précision de localisation axiale tout en rendant possible des mesures sur des images présentant une distribution quelconque de sources (continuum de fluorophores, scène de la vie de tous les jours...).

Le réseau 21 est selon une variante un réseau en transmission adapté pour transmettre l'intégralité de l'énergie lumineuse incidente, i.e. un réseau de phase, lorsque le montage est en transmission, ou peut être selon une variante un réseau en réflexion adapté pour réfléchir l'intégralité de l'énergie lumineuse incidente lorsque le montage est en réflexion. L'une ou l'autre de ces variantes permet de maximiser le rapport signal à bruit de la localisation 3D.

Avantageusement, on choisira un réseau en transmission ou en réflexion qui ne transmet pas, respectivement ne réfléchit pas, l'ordre 0. Ceci permet de rendre les interférences formées par les ordres diffractés indépendantes de la longueur d'onde lumineuse. Supprimer l'ordre zéro peut être obtenu par exemple en ajustant à π [2π] la modulation du déphasage introduit sur une période, par exemple par gravure du substrat du réseau ou modification locale de l'indice du substrat. Une autre possibilité pour supprimer l'ordre 0 consiste à supprimer l'ordre 0 dans l'espace de Fourier du réseau, mais dans ce cas, on introduit une perte de photons et donc une perte de rapport signal à bruit.

Le pas p du réseau est avantageusement choisi afin de former plus d'une frange par

« point image » d'un point source de l'objet, le point image étant confondu avec la réponse impulsionnelle du système d'imagerie, ou PSF, dans les applications de microscopie de super résolution par exemple. Typiquement on pourra choisir le pas du réseau compris entre le tiers du rayon du point image et trois fois le rayon du point image, afin d'avoir un échantillonnage latéral suffisant des franges et limiter le sur-échantillonnage. Typiquement, on pourra choisir un pas p de l'ordre du diamètre du point image, pour avoir 2 franges par point image ; et dans le cas de l'application de microscopie de super résolution, un pas p compris entre r/3 et 3r, avantageusement de l'ordre de 2r, où r est le rayon de la PSF donné par l'équation (2) ci- dessus.

Les figures 2A à 2D illustrent, à titre d'exemple et de façon schématique, la propagation des ondes dans le cas d'un dispositif de mesure comprenant un réseau de diffraction 21 et l'intensité lumineuse mesurée selon une direction latérale dans le plan de détection dans le cas de deux points sources positionnés à deux positions axiales différentes.

Pour faciliter la démonstration théorique, on suppose dans cet exemple un réseau unidimensionnel de pas p et l'on suppose que le réseau ne diffracte que les ordres +1 et -1. Un tel réseau de diffraction est par exemple un réseau d'amplitude complexe tel que décrit par exemple dans J. Primot et al. (« Extended Hartmann test based on the pseudoguiding property of a Hartmann mask completed by a phase chessboard », Applied Optics, Vol. 39, Issue 31, pp. 5715-5720 (2000)). En pratique cependant, on pourra préférer un réseau qui diffracte tous les ordres sauf l'ordre zéro, un tel réseau étant plus simple à fabriquer (réseau de phase avec un motif en échiquier « phase chessboard » par exemple, tel que décrit dans l'article cité de Primot et al.) et permettant de ne pas perdre de photons.

Comme cela apparaît sur les figures 2B et 2D, on observe une variation de Γ interfrange Λ en fonction de la distance du point source par rapport au plan de référence (i.e. le plan conjugué du plan de détection dans l'espace objet du système d'imagerie). La relation entre l'interfrange (période de la modulation) et la distance du point source considéré au plan de référence peut être déterminée de façon théorique à partir des paramètres du réseau de diffraction choisi, comme cela est exposé ci-dessous selon un exemple. Dans l'exemple montré sur les figures 2 A et 2C, le réseau 21 est situé à une distance d du plan de détection P DET - Dans cet exemple, le réseau permet de former deux faisceaux diffractés cohérents entre eux notés ΒΊ et B' 2 et correspondant respectivement aux ordres +1 et -1. Le réseau 21 diffracte la lumière selon l'ordre +1 avec un angle a par rapport à la propagation de la lumière directe (i.e. ordre 0 du réseau, indiqué en pointillés simples sur les figures). On note ε sur les figures 2A et 2C le décalage latéral entre le point d'impact sur le plan de détection de l'ordre diffracté 1 et le point d'impact (théorique) de l'ordre 0. Le décalage latéral correspond au-demi décalage latéral entre les points d'impact les deux « répliques » formées par les deux faisceaux cohérents entre eux ΒΊ et B' 2 .

Les vecteurs d'onde des ordres diffractés +1 et -1 correspondant aux faisceaux ΒΊ et B' 2 respectivement sont notés :

avec sin(a) = - où À est la longueur d'onde.

On note E le champ électromagnétique scalaire provenant de l'image du point source dans le plan de détection du détecteur :

■ 27Γ , .

E{x) = A{x)e T s{x)

avec A(x) l'amplitude du champ et S(x) la surface d'onde sphérique liée à la courbure du front d'onde issu du point source que l'on peut approximer par S(x) =— , avec z la distance de l'image du point source au plan de détection. L' interféra gramme /(x) formé par les ordres +1 et -1 sur le plan de détection situé à une distance d du réseau peut être décrit par :

/(x) = i 0 (x) [l + cos ^ - [S(x— ε)— S(x + ε) + 2x sin(a)] j (3)

Avec i Q (X) « A 2 (x)

ε = d tan(a)~ d -

Par un développement de Taylor à l'ordre 1 de l'équation (3) on déduit:

= Î 0 (X) [l + cos ^- [x— On en conclut donc que le signal d'intensité mesuré présente une porteuse ί 0 ( ) 0 a PSF du système d'imagerie), modulée par un signal de période Λ = p/(2 [l — ^j) dépendant donc uniquement de la distance z entre l'image du point source et le détecteur (distance recherchée rapportée dans l'espace image du système d'imagerie) et de la distance d entre le réseau et le plan de détection (fixe et connue).

Dans le cas illustré ci-dessus, comme cela apparaît sur l'équation (5), le choix d'un réseau dans lequel l'ordre zéro est supprimé permet notamment de supprimer la dépendance du signal d'intensité avec la longueur d'onde et de s'affranchir ainsi d'effets de chromatisme.

L'approximation utilisée pour déterminer l'équation (5) ci-dessus tant à donner un pas de Λ→ ±∞ lorsque z→ d. Dans un cas réel, on peut considérer l'approche d'un faisceau gaussien ; dans ce cas S→ 0 (et donc Λ→ p/2) lorsque z→ d.

La figure 3 illustre l'évolution de Λ en fonction de z avec l'approche gaussienne dans le cas de deux valeurs de décalage latéral ε, respectivement ει = ΙΟμιη (courbe en trait plein) et ε 2 = 4 μιη (courbe en trait pointillé) avec un réseau de diffraction du type de celui décrit au moyen des figures 2A à 2D présentant un pas = 20 μτη . Les valeurs ει = ΙΟμιη et ε 2 = 4 μιη correspondent respectivement à des valeurs de la distance d entre le réseau et le plan de détection d = 200 μπι et d 2 = 80 μπι. Sur cette courbe, l'interfrange Λ mesuré est normalisé par la demi-période du réseau et la distance z normalisée en fonction de la profondeur de champ.

Ces deux courbes montrent tout d'abord qu'il est possible à partir de la valeur de l'interfrange de déterminer la distance z entre l'image d'un point source et le détecteur et donc d'en déduire dans l'espace objet du système d'imagerie, la distance entre un point source de l'objet et le plan de référence. Les courbes de la figure 3 illustrent d'autre part l'allure de la courbe en fonction de la valeur du demi-décalage latéral ε entre les répliques, le demi- décalage latéral étant proportionnel à la distance d entre le réseau et le plan de détection. Les courbes montrent qu'en jouant sur ε on peut agrandir la zone suivant l'axe optique où la mesure est possible mais on perd en précision de localisation.

Dans tous les cas, le réseau sera avantageusement placé à une distance suffisamment proche du plan de détection de façon à ce que le décalage latéral introduit entre les répliques soit inférieur au diamètre du point image, par exemple le diamètre de la PSF (φ, équation (2)) dans le cas de l'application à la microscopie de super résolution. Autrement dit, on cherchera à avoir : ε≤φ

soit d≤0.61 - g y - -^ (6)

L'inéquation (6) se traduit en fonction du choix de l'objectif de microscope à un rapport dlp typiquement inférieur à une valeur comprise entre 10 et 50 en fonction du choix de l'objectif de microscope ; ainsi pour de spas de réseaux typiquement compris entre 10 et 30 μιη, la distance d sera choisie inférieure à une valeur pouvant varier entre une dizaine de microns et 1 mm selon le choix de l'objectif de microscope.

Bien que décrit dans le cas d'un réseau unidimensionnel présentant deux ordres de diffraction, le principe illustré au moyen des figures 2A à 2D s'étend à d'autres exemples de réseaux de diffraction, et notamment un réseau bidimensionnel permettant deux mesures axiales indépendantes (une suivant chaque axe du réseau) pour chaque point source.

Comme illustré au moyen des figures 2 A à 2D et 3, le positionnement axial des points sources formant un objet peut ainsi être obtenu en mesurant la période ou la fréquence locale de F interféra gramme formée sur le plan de détection.

Avantageusement, le positionnement de chaque point source est déterminé en comparant la valeur mesurée de la période/fréquence locale de Γ interféra gramme formée sur le plan de détection à une courbe d'étalonnage de la période/fréquence en fonction du positionnement axial du point source. La courbe d'étalonnage peut être obtenue soit de façon théorique (comme la courbe montrée sur la figure 3 par exemple) soit de façon expérimentale par des mesures de fréquences obtenues sur des images de points sources dont le positionnement axial est connu.

En pratique, la mesure de la période/fréquence locale de Γ interféra gramme formée sur le détecteur peut être obtenue de plusieurs manières.

La mesure peut se faire dans l'espace directe (i.e. directement sur l'image) par ajustement automatique (fitting) local de l'image par une fonction décrivant l'interférogramme (voir l'équation (1) ci-dessus par exemple). Ceci permet de remonter à la période locale de l'interférogramme.

La mesure peut également se faire par transformée de Fourier locale pour trouver le pic principal dans l'espace de Fourier, c'est-à-dire la fréquence locale dans la zone d'image considérée.

Alternativement, il est également possible de procéder par une transformée en ondelettes (cas intermédiaire des deux précédents). Bien entendu, un réseau de diffraction tel que décrit précédemment peut être remplacé par tout système permettant de générer une fonction de phase et/ou d'absorption équivalente, comme par exemple un modulateur spatial de lumière (SLM) ou un miroir déformable. Avec un SLM cependant, la nécessité de travailler en lumière polarisée entraîne une perte de photons préjudiciable notamment dans les applications de microscopie. Avec un miroir déformable, la limite vient du nombre réduit d'actuateurs qui se traduit par une trop grande période du réseau équivalent.

D'autres types d'éléments séparateurs peuvent être intégrés dans le dispositif selon la présente description pour former le senseur de courbure ainsi décrit. Il suffit qu'un tel élément séparateur permette de séparer le faisceau incident émis par le point lumineux en au moins deux faisceaux cohérents entre eux présentant une région de superposition spatiale dans laquelle les faisceaux interfèrent.

Les figures 4A et 4B illustrent ainsi deux exemples de dispositifs de mesure selon la présente description. Dans l'exemple de la figure 4A, l'élément séparateur comprend une lame séparatrice, par exemple une lame semi-réfléchissante, pour former un montage interférométrique de type interféromètre de Murty et dans l'exemple de la figure 4B, l'élément séparateur comprend un cube séparateur pour former un montage interférométrique de type Mach-Zender.

Le dispositif de télémétrie 300 schématisé sur la figure 4A comprend comme dans l'exemple de la figure 1B un détecteur bidimensionnel 30 avec un plan de détection P D ET et un système d'imagerie 10 adapté pour former une image d'un point source Pi d'un plan objet d'intérêt 1 1 dans un plan image 1 1 ' proche d'un plan P'DET conjugué du plan de détection PDET, le dispositif comprenant en outre une optique relai 40 permettant de conjuguer le plan P'DET avec le plan de détection PDET- Dans l'exemple de la figure 4A, le dispositif de télémétrie 300 comprend par ailleurs une lame semi-réfléchissante 22 d'épaisseur e, par exemple une lame en verre d'indice n, agencée pour permettre une réflexion partielle sur chacune des interfaces air-verre de telle sorte à former deux faisceaux cohérents entre eux, référencés ΒΊ et B' 2 sur la figure 4 A, qui présentent une région de superposition spatiale dans laquelle les faisceaux peuvent interférer. Dans l'exemple de la figure 4A, la lame semi-réfléchissante est agencée de telle sorte à former un angle de 45° avec l'axe optique du système d'imagerie, pour former un interféromètre connu sous le nom d' interféromètre de Murty.

Comme dans la description théorique précédemment décrite sur la base de l'utilisation d'un réseau, Γ interféra gramme /(x) formé sur le plan de détection par l'image d'un point source à une distance z de l'image par le système relai d'imagerie (40) de la lame semi- réfléchissante (ici confondu avec le plan du détecteur) peut être décrit par :

/(x) « i 0 (x) [l + cos (y [S(x - ε) - S(x + ε)])] (7) /(x) « ί 0 ( ) [l + cos (γ^ )] (hypothèse Gaussienne)

Dans cet exemple cependant, le paramètre ε s'écrit:

V2

ε «— e pour n = 1.6

4

Avec n l'indice du verre constituant la lame de verre et e l'épaisseur de la lame. Le dispositif de télémétrie 400 schématisé sur la figure 4B comprend comme dans l'exemple de la figure 1B un détecteur bidimensionnel 30 avec un plan de détection P DET et un système d'imagerie 10 adapté pour former une image d'un point source Pi d'un plan objet d'intérêt 11 dans un plan image 11 ' proche d'un plan P' DET conjugué du plan de détection P DET , le dispositif comprenant en outre une optique relai permettant de conjuguer le plan P' DET avec le plan de détection P DET -

Dans cet exemple, l'optique relai comprend deux optiques 41, 42, entre lesquelles est agencé l'élément séparateur formé ici d'un interféromètre de Mach-Zender 23. L'interféromètre comprend dans cet exemple une lame séparatrice Si (ou d'un cube séparateur) permettant de former à partir du faisceau B' issu du point source Pi et émergent du système d'imagerie 10, deux faisceaux ΒΊ et B' 2 cohérents entre eux. Ces faisceaux se propagent dans deux bras indépendants contenant chacun un miroir à réflexion totale (M l s M 2 ). Les faisceaux sont recombinés grâce au cube (ou lame) séparateur S 2 . Les faisceaux sont symbolisés par souci de clarté sur la figure 4B par leur axe optique.

Comme dans l'exemple précédent, un décalage 2ε entre les faisceaux ΒΊ et B' 2 est généré. Le décalage peut être obtenu et ajusté soit par un déplacement d'une des lames séparatrices (Si, S 2 ) transversalement à l'axe optique ou par un basculement d'un des miroirs (Mi, M 2 ). On aboutit à la même équation (7) que pour le cas de l'interféromètre de Murty

Parmi les trois exemples d'éléments séparateurs décrits, le réseau de diffraction permet d'obtenir une plus grande stabilité de mesure du fait que les longueurs de propagation en espace libre des faisceaux cohérents entre eux et destinés à interférer sont moins importantes et du fait aussi que le nombre de paramètres libres influant sur la mesure sont moindres (notamment angle de la lame séparatrice dans le cas de Tinter féromètre de Murty et angles des miroirs et lames semi-réfléchissantes dans le cas de Tinter féromètre de Mach Zender). Le réseau de diffraction permet de plus également de travailler avec la totalité des photons provenant du point source, ce qui n'est pas le cas pour le montage Mach Zender par exemple. On préférera donc utiliser le réseau de diffraction comme élément séparateur. Comme expliqué précédemment, le réseau peut permettre en outre, en cas de suppression de Tordre 0, de former des interférences achromatiques à la différence des autres éléments séparateurs.

La figure 5 montre un schéma illustrant un exemple de dispositif selon la présente description, appliqué à l'imagerie microscopique tridimensionnelle, notamment pour l'imagerie de spécimens biologiques formés de complexes moléculaires. Les complexes moléculaires, dont les tailles moyennes sont typiquement de quelques nanomètres pour de petits complexes à environ 100 nanomètres pour les structures les plus imposantes, sont marqués selon des techniques connues par une sonde susceptible d'émettre un signal lumineux, par exemple une sonde fluorescente, formant ainsi des particules émettrices de dimensions inférieures à la limite de diffraction du système optique utilisé pour en former une image. Les particules que Ton cherche à localiser évoluent dans un milieu de support qui peut être liquide ou solide, par exemple sous forme de gel, par exemple un milieu biologique. Le milieu de support peut être agencé directement sur un porte - échantillon, déposé sur une plaque ou maintenu entre deux plaques, par exemple des plaques de verre. On appelle objet O (figure 5) le milieu de support et les particules émettrices y évoluant ainsi que la ou les plaque(s) de maintien le cas échéant.

Le dispositif d'imagerie tridimensionnelle 500 comprend dans l'exemple de la figure 5 un système d'imagerie 10 apte à former de la particule émettrice (i.e. le point source) une image sur un plan de détection P DET d'un détecteur 30, avantageusement un détecteur matriciel, par exemple une caméra CCD, CMOS, une caméra amplifiée de type EMCCD (abréviation de l'expression anglo-saxonne « Electron Multiplying Coupled Charge Display »), une caméra sCMOS, une matrice de photomultiplicateurs.

Le système d'imagerie 10 comprend dans cet exemple un objectif de microscope 12, corrigé par exemple pour une configuration optique de travail foyer - infini, associé à un objectif 13 dit lentille de tube, permettant de former une image sur un plan de détection intermédiaire 11 '. L'ensemble objectif de microscope et lentille de tube forme un système optique classique de microscope.

Le dispositif d'imagerie 500 comprend en outre des objectifs de relai 40 permettant de former un plan P ' DET conjugué du plan de détection P DET du détecteur 30 dans l'espace image du système d'imagerie 10, le plan image 11 ' étant situé à proximité du plan conjugué P' DET . Du fait de la très petite taille des particules émettrices (inférieure à la limite de diffraction du système d'imagerie), l'image, qui est la convolution de l'objet avec la réponse impulsionnelle du système d'imagerie ou PSF, est ici sensiblement confondue avec la réponse impulsionnelle. Une plateforme motorisée (non représentée) peut être présente et permet de déplacer l'échantillon O dans un plan XY perpendiculaire à l'axe optique de l'objectif de microscope. Un dispositif mécanique de mise au point axiale (non représenté) peut être présent et permet de régler la position axiale de l'échantillon par rapport au plan focal objet de l'objectif de microscopie 12 et d'imager ainsi la zone d'intérêt. Le support d'échantillon, la plateforme motorisée, le dispositif de mise au point axiale, l'objectif de microscope 12 et la lentille de tube 13 sont agencés dans un corps de microscope 60 de type connu. Le corps de microscope peut comprendre par ailleurs et de façon classique un oculaire, une source d'éclairage de l'échantillon associée à un condenseur.

Dans l'exemple de la figure 5, le corps de microscope est de type inversé (objectif de microscope positionné sous l'échantillon) mais il pourrait tout aussi bien s'agir d'un microscope droit (objectif de microscope au-dessus de l'échantillon).

Le dispositif d'imagerie 500 comprend également un élément séparateur 20, par exemple un réseau bidimensionnel proche du plan conjugué P ' DET pour la formation d'au moins deux faisceaux cohérents entre eux présentant une région de superposition spatiale au niveau du détecteur, pour la mise en œuvre de la méthode de détermination de la distance selon la présente description.

Comme décrit précédemment, le réseau est par exemple un réseau de phase permettant de supprimer l'ordre 0 et dont le pas est choisi pour former sur le détecteur des interférences de période inférieure à la résolution latérale du microscope. Il est agencé perpendiculairement à l'axe optique de façon à ce que les répliques cohérentes entre elles se superposent et puissent interférer entre elles.

Les figures 6A à 6C montrent des images obtenues à différentes étapes d'application de la méthode selon la présente description, dans une application de microscopie de super résolution mise en œuvre avec un dispositif du type de celui de la figure 5.

L'objet O est un échantillon biologique de cellules CHO (« Chinese Hamster Ovary ») fixées au paraformaldéhyde. Les protéines de tubuline du cytosquelette cellulaire ont été marquées fiuorescentes par anticorps spécifiques. Les sondes fluorescentes sont de type Alexa 647 et l'échantillon est observé au moyen d'un détecteur matriciel 30 de type CMOS par la technique dSTORM, dans laquelle le clignotement est obtenu par l'utilisation du produit de montage Vectashield (Vectro Labs) et l'utilisation d'un laser à 635 nm.

La figure 6A montre une image de fluorescence en début d'acquisition dSTORM ; la densité des molécules fluorescentes est encore importante, résultant en un continuum spatial de l'émission de fluorescence. Cependant, il est déjà possible de visualiser les interférences. La figure 6B montre un zoom sur une partie de l'image en cours d'acquisition dans laquelle la densité d'émetteurs est plus faible ; on observe ainsi la réponse d'un émetteur fluorescent unique (quantum dot) au sein duquel on distingue la modulation résultant de l'interférence des répliques cohérentes entre elles. La périodicité de cette modulation permet de déterminer le positionnement axial de l'émetteur par rapport au plan de référence, comme cela a été expliqué précédemment. Le positionnement latéral est obtenu en déterminant le centroid de l'imagette (ou point image) par barycentre ou idéalement par ajustement de l'imagette par une gaussienne décrivant la PSF du système d'imagerie 10, après suppression de la modulation par filtrage (passe-bas fréquentiel) de l'imagette. La figure 6C montre l'image en dSTORM 3D reconstruite par localisation 3D de chaque émetteur de fluorescence selon la présente description (comme en 6B) grâce au clignotement stochastique des émetteurs, l'échelle de gris représentant le positionnement axial des émetteurs. Ces images illustrent l'application de la présente méthode même sur des continuums de fluorescence sur lesquels des méthodes standard d'imagerie 3D (par exemple les techniques basées sur le contrôle de la forme de la PSF ne pourraient fonctionner).

Les figures 7 A, 7B, 7C montrent des mesures expérimentales de la distribution de lumière mesurée en utilisant un montage de type 500 en présence d'émetteurs fluorescents uniques (de type nanocrystal semi-conducteur, ou quantum dot) situés soit dans un plan conjugué du détecteur (7B) soit avant (7C), soit après (7 A) tout en restant dans la profondeur de champ (i.e. pas de variation de la dimension de l'image). On voit clairement Γ interfrange Λ changer en fonction du positionnement axial de l'émetteur (i) bien que l'on soit dans la profondeur de champ et (ii) sans que la taille de l'image de l'émetteur ne soit élargie par rapport à l'imagerie classique (cercle de confusion).

A titre de comparaison, les figures 8A et 8B représentent des images expérimentales d'un même échantillon biologique obtenues par une technique d'imagerie d'epi-fluo standard (8 A) et d'imagerie dSTORM 3D avec la technique proposée dans la présente description (8B) là encore sur une cellule CHO (Chinese Hamster Ovary) fixée au paraformaldéhyde. On observe clairement le gain en résolution latérale (8B) par rapport à 8A et également le positionnement axial permettant de suivre l'évolution spatiale 3D du cyto squelette. Outre les applications en microscopie tridimensionnelle, les déposants ont montré que la méthode de mesure de distance selon la présente description peut également s'appliquer à la télémétrie « passive » c'est-à-dire sans mesure de temps de vol, pour la mesure de distances d'objets dans une scène.

La figure 9 représente ainsi une scène avec plusieurs objets Oi, 0 2 , situés à différentes distances d'un dispositif de mesure de distance 600. Les objets sont éclairés en lumière naturelle et rétro diffusent la lumière naturelle de telle sorte que chaque point d'un objet Oi forme un point source Pi.

Le dispositif 600 comprend comme précédemment un détecteur 30 avec un plan de détection P DET , un système d'imagerie 10 adapté à former de la scène une image dans un plan image situé à proximité du plan de détection P DET , et un élément séparateur 20, par exemple un réseau de diffraction proche du plan de détection P DET , et permettant de former à partir d'un faisceau émis par le point lumineux et émergeant du système d'imagerie au moins deux faisceaux cohérents entre eux (« répliques ») présentant une région de superposition spatiale dans laquelle les faisceaux interfèrent. Le système d'imagerie 10 comprend par exemple un objectif photo ou vidéo adapté à travailler à l'infini

La reconstruction du positionnement axial des points source peut se faire dans un volume de quelques fois la profondeur de champ (~10x) du système d'imagerie. Les résolutions axiales sont de l'ordre de la profondeur de champ et jusqu'à 1/100 de cette dernière. En fonction de l'objectif photo ou vidéo utilisé (ouverture, focale) les valeurs absolues de la résolution axiale et de la profondeur de champ changent. Il peut être intéressant d'ajuster l'ouverture étant donnée une focale pour que la dynamique de mesure de positionnement axial des différents points de l'objet englobe la totalité des objets d'intérêt dans une scène donnée ; c'est-à-dire que les objets d'intérêt soient compris dans quelques fois la profondeur de champ. Egalement, si la focale et l'ouverture sont figées, la modification du décalage latéral ε (par exemple, dans le cas d'utilisation d'un réseau, en translatant suivant l'axe optique ce dernier par rapport au plan de détection) permet d'ajuster la dynamique de mesure de positionnement axial avec la technique décrite afin d'obtenir une reconstruction de la totalité des objets d'intérêt de la scène.

Dans ce mode de réalisation, la mesure de la variation de l'interfrange d'un point à un autre permet de remonter au profil 3D des constituants de la scène.

Bien que décrite à travers un certain nombre d'exemples de réalisation, la méthode optique de télémétrie selon l'invention et le dispositif pour la mise en œuvre de ladite méthode comprennent différentes variantes, modifications et perfectionnements qui apparaîtront de façon évidente à l'homme de l'art, étant entendu que ces différentes variantes, modifications et perfectionnements font partie de la portée de l'invention telle que définie par les revendications qui suivent.