CAMPO DE LA INVENCION

La presente invención está enfocada en la generación de proteínas de fusión que puedan ser usadas para el diagnóstico y/o' como vacunas contra las infecciones del tracto urinario (ITU) . Estas proteínas de fusión pueden ser diméricas o triméricas ; las cuales, están basadas en las adhesinas FimH, CsgA y PapG de Escherichia coli uropatogénica (UPEC) que es el principal agente causal de las infecciones del tracto urinario ITU.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Las ITU están distribuidas mundialmente , y actualmente no existe una vacuna eficaz que permita su erradicación o la disminución de la morbilidad. Las proteínas recombinantes generadas por tecnología de fusión para la incorporación de antígenos de uno o más patógenos han conferido una mayor respuesta inmune y protección en modelo animal contra las ITU (Asadi Karam et al., 2013; Habibi et al., 2015a, 2015b; Karam et al., 2013; Savar et al., 2014) . La vacunación con una proteína recombinante FimH fusionada con FliC, componente principal del flagelo, ha mostrado un aumento en la respuesta inmune celular y humoral contra las ITU en modelo murino. Niveles altos de anticuerpos IgGl e IgG2a y una estimulación de células T tipo Thl y Th2 [INF-γ e IL ( interleucina) -4] fueron identificados después de la inmunización subcutánea (Asadi Karam et al., 2013). La incorporación de ligandos para el receptor tipo "Toll" (TLR) puede dar como resultado una vacuna segura con mayor eficacia, siendo igual o mejor a las formuladas con adyuvante. Las proteínas de fusión que incluyen Patrones Molecular Asociados a Patógenos (PAMP) inducen una respuesta específica, potente y rápida en ausencia de adyuvante (Huleatt et al., 2007). El TLR4 es activado por la interacción con la proteína FimH mediante un correceptor manosilado, estimulando la vía MyD88-NFKB; la cual, permite la liberación de IL-6 e IL-8. Adicionalmente , la proteína FliC puede interaccionar como un PAMP y activar específicamente el TLR5, permitiendo la estimulación aumentada de la respuesta inmune (Bens et al., 2014) . Sin embargo, la mutación en el gen de fliC solo lleva a la perdida de movilidad y su posterior ascensión de Escherichia coli uropatogénica (UPEC) desde la vejiga a los ríñones (Lañe et al., 2007) . Por lo tanto, la inmunización con FliC no genera protección en la vejiga (Asadi Karam et al., 2013) . La adhesina FimH de la fimbria tipo 1 está relacionada con la interacción al uroepitelio, facilitando la adherencia, colonización e invasión en el tracto urinario (Ashkar et al., 2008; Martínez et al., 2000). Adicionalmente, una respuesta inmunogénica es generada por FimH, pero con limitada protección contra la colonización UPEC, probablemente por la expresión de otras fimbrias (Langermann et al., 2000; Snyder et al., 2005) . Por este motivo, decidimos fusionar ambas adhesinas, PapG de la fimbria P y CsgA de curli a la adhesina FimH que permita generar proteínas de fusión diméricas y triméricas. La adhesina PapG está relacionada a procesos de pielonefritis por la interacción de glicoesfingolípidos (GLS) presentes en las células de riñon; conjuntamente, puede promover la vía Tram/Trif -NFKB para la liberación de IL-6, IL-8 por la interacción a TLR4 usando un correceptor GLS (Fischer et al., 2006; Lañe and Mobley, 2007). La adhesina CsgA, otra proteína con propiedades de adherencia puede interaccionar con el complejo TLR1/TLR2 generando una mayor estimulación en la liberación de IL-6 e IL-8 mediante la vía MyD88 -NFKB (Rapsinski et al., 2015; Tükel et al., 2010). La interacción de receptores de reconocimiento de patrones con las proteínas de fusión generadas a partir de diferentes adhesinas (FimH, CsgA y PapG) , servirán como antígenos y como adyuvante para la activación rápida y eficiente del sistema inmune.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

Figura 1. Predicción de las estructuras secundarias y terciarias de las proteínas de fusión: A) proteína FC; B) proteína CP; C) proteína PF; D) proteína FCP; E) proteína CPF; F) proteína PFC.

Figura 2. A) Secuencia génica de la templado fimH-csgA- papG-fimH-csgA {fcpfc) ; B) Generación de los genes monoméricos y de fusión diméricos y triméricos; los cuales, se abrevian con la primera letra de fimH (f) , csgA (c) y papG (p) .

Figura 3. Generación de las proteínas de fusión. (A) Amplificados de los genes de fusión por PCR en colonia; B) Purificación de las proteínas de fusión por cromatografía de afinidad; (C) Identificación de las proteínas de fusión mediante ensayo de Western Blot .

Figura 4. Liberación de IL-6 estimulada por las proteínas de fusión.

Figura 5. Liberación de IL-8 estimulada por las proteínas de fusión.

Figura 6. Detección de anticuerpos IgG e IgA contra las proteínas de fusión en el suero de pacientes sanos (H-P) y con ITU (UTI-P) mediante ensayos de ELISA.

Figura 7. Detección de anticuerpos IgG e IgA contra las proteínas de fusión en orinas de H-P y UTI-P mediante ensayos de ELISA.

Figura 8. Los anticuerpos policlonales generados contra las proteínas de fusión reducen la adherencia bacteriana a células de vejiga humana. DESCRIPCIÓN DE LAS SECUENCIAS

SEQ. ID NO. 1. Secuencia de nucleótidos del gen templado fcpfc y de su traducción en aminoácidos.

SEQ. ID NO. 2. Secuencia de aminoácidos del templado fcpfc, correspondiente a la SEQ ID NO .1.

SEQ. ID NO. 3. Iniciador FimH- ^■ F

SEQ. ID NO. 4. Iniciador FimH- R

SEQ. ID NO. 5. Iniciador CsgA- ^• F

SEQ. ID NO. 6. Iniciador CsgA- ^■ R

SEQ. ID NO. 7. Iniciador PapG- F

SEQ. ID NO. 8. Iniciador PapG- R

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

La invención se enfocó en la generación de proteínas de fusión usando la adhesina FimH localizada en la parte distal de la fimbria tipo 1 y la adhesina PapG de la fimbria P; así como la proteína estructural CsgA de curli. Todas las adhesinas están presentes y son expresadas in vivo en UPEC; el cual, es el principal agente causal de las ITU. Inicialmente , la invención fue enfocada en un gen templado de fusión fcpfc y con la combinación de iniciadores se pudó generar los diferentes genes monoméricos, diméricos y triméricos para su clonación. Posteriormente, las proteínas de fusión FC(44.9 kDa) y FCP(82.1 kDa) fueron generadas basándose en un análisis bioinformático (estabilidad, plegamiento y antigenicidad) . Las proteínas de fusión FC y FCP pueden ser consideradas como biomoléculas potenciales para una vacuna funcional contra las ITU. Adicionalmente, las proteínas de fusión pueden ser utilizadas en vacunas sin adyuvantes, por su capacidad de estimular la liberación de IL-6 e IL-8 por las adhesinas FimH, CsgA y PapG. La determinación de anticuerpos en sueros y orinas de UTI-P contra las proteínas de fusión mostró altos niveles de anticuerpos del tipo IgA y en menor proporción el tipo IgG. Finalmente, los anticuerpos obtenidos de conejo contra las proteínas de fusión generaron protección contra la adherencia de UPEC a las células de vejiga in vitro.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN

Análisis de la estructura primaria, secundaria y terciaria de las proteínas. Las secuencias de las proteínas FimH, CsgA y PapG de la cepa de E. coli CFT073 fueron obtenidas de la base de datos NCBI (http:// www.ncbi.nlm.nih.gov/protein) con los números de acceso AAN83822.1, AAN79779.1 y AAN82031.1, respectivamente. La predicción del péptido señal fue realizada para cada una de las proteínas usando el servidos SignalP 4.1; adicionalmente cinco repeticiones de la secuencia EAAAK fue empleada para realizar la fusión de las proteínas FimH, CsgA y PapG (Li et al., 2016). El peso molecular, punto isoeléctrico teórico, composición de aminoácidos, la estimación de la vida media, índice alifático y "grand average of hydropathicity" (GRAVY) de las proteínas fueron determinados usando el programa ProtParam de ExPASy (Wilkins et al., 1999). El índice de adaptación de codones (CAI) y el contenido de guaninas y citosinas (GC) de los genes fueron determinados usando el programa OPTIMIZER (Puigbó et al., 2007). La predicción de la estructura secundaria de las proteínas fue generada con el programa GORIV (Sen et al., 2005). El modelado tridimensional (3D) de las proteínas fue realizado usando el servidos I-TASSER y visualizado con el programa PyMOL (Yang et al., 2015) . Las estructuras 3D fueron refinadas y minimizadas usando los programas KoBaMIN (http://csb.stanford.edu/kobamin/) y VegaZZ (NAMD) (Pedretti et al., 2Ό04). Los modelos 3D fueron validados por el programa "Protein Structure Analysis" (ProSA) que permitió determinar el Z-score y el gráfico de Ramachandran usando el programa PROCHECK (Laskowski et al., 1998; Wiederstein and

Sippl, 2007). Las estructuras 3D de las proteínas fueron comparadas con estructuras resueltas por rayos X del dominio de unión a mañosa de FimH (Protein Data Bank; 1TR7) y el dominio lectina de PapG (PDB; 1J8R) , el cual fue calculado el "Root Mean Square Deviation" (RMSD) usando el programa TM-align (Zhang and Skolnick, 2005) . Las estructuras secundarias y los modelos 3D se describen en la figura 1. Predicción de epítopos y presentación de antígenos. La respuesta inmune fue determinada teóricamente para establecer variantes de las proteínas con habilidad para generar una mejor respuesta. Las estructuras primarias y secundaria de las proteínas fueron empleadas para determinar epítopos lineales de células B con el servidor bcPred (http:// www.imtech.res.in/raghava/abcpred/) y péptidos con afinidad al complejo principal de histocompatibilidad (MHC) clase II fueron identificados con el programa NetMHCII (http:// www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIl/). La estructura 3D de las proteínas fueron utilizadas para determinar epítopos conformacionales usando el servidor Discotope (http://www.cbs.dtu.dk/services/DiscoTope/) .

Análisis y síntesis del gen plantilla de fusión. Las secuencias de fimH, csgA, y papG de la cepa de E. coli CFT073 fueron obtenidos con los números de accesos GQ487191.1, NC_004431.1 y AF447814.1, respectivamente. Las secuencias conservadas fueron comparadas con varias cepas de UPEC (UTI89, ABU83972, NA114, UPEC26-1, CF-088, CF-468, aislados IA2 y AD110) usando los programas BLAST

(htt : //blast .nebí .nlm.nih.gov/Blast . egi) y ClustalOmega (http : //www . ebi . ac . uk/Tools/msa/ clustalo/ ) . Las secuencias nucleotídicas consenso fueron fusionadas con los apropiados codones de las repeticiones EAAAK para generar un gen de fusión templado fcpfc. Los codones del templado fcpfc fue optimizado usando el programa OPTIMIZER

(http: //genomes. urv.es/ OPTIMIZER/) y la predicción de la estructura secundaria de los genes monoméricos, diméricos y triméricos fue utilizado el programa Mfold

(htt : //unafold. rna . albany.edu/ ?q=mfold/RNA-Folding-Form) . El gen templado de fusión optimizado se le adicionó dos sitios de corte, en el 5' BamHI y en el 3' SacI y este fue sintetizado químicamente por la casa comercial GenScript (Piscataway, NJ, USA) . Posteriormente, se clonó en el vector pUC57 y se utilizó para la amplificación de los genes monoméricos, diméricos y triméricos utilizando iniciadores específicos. La estrategia para la generación de los genes de fusión usando el templado fcpfc se describe en la Figura 2.

Clonación de los genes en el vector de expresión pLATE31. El diseño de los iniciadores para la amplificación de los genes monoméricos, diméricos y triméricos; los cuales, fueron específicos y con un sitio consenso fueron generados manualmente siguiendo el protocolo de "aLICator LIC Cloning and Expression handbook" (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) y sintetizados por la casa comercial IDT Technologies (Coralville, Iowa, USA) . La amplificación de los genes fueron generados a partir de "Polymerase Chain Reaction" (PCR) usando la ADN polimerasa Pfu de Thermo Fisher Scientific. Las condiciones de amplificación y clonación fueron determinadas a partir de protocolos del sistema aLICator. El vector de expresión pLATE31 fue usado para la clonación de los genes antes amplificados y la cepa E.coli BL21 (DE3) para la transformación de los vectores resultantes por electroporación . Adicionalmente , los genes en el vector de expresión fueron verificados por "next- generation sequencing" en un sistema NexSeq 500 (Illumina, San Diego, CA, USA) . Los iniciadores específicos de secuenciación fueron obtenidos del "aLICator LIC Cloning and Expression Kit" y las secuencias resultantes fueron analizadas por BLAST. La verificación por PCR en colonia de las transformantes de E. coli BL21 son mostradas en la Figura 3, apartado (A) .

Expresión y purificación de las proteínas. La cepa de E. coli BL21 transformada con su respectivo vector de expresión pLATE31 fueron plaqueadas en agar Luria Bertani (LB; Becton-Dickinson, Franklin Lakes, NewJersey, USA) e incubadas por 16 h a 30°C. Las probables colonias transformantes fueron verificadas por el método de "colony- blotting" usando un anticuerpo anti-6XHis (C-Term) HRP (Abcam; Cambridge, MA, USA) . La solubilidad fue realizada siguiendo los protocolos establecidos por el manual de "the QIAexpressionist" de Qiagen (Jacques-Schiesser-Str, Stockach, Germany) . La expresión y purificación de las proteínas fue realizada en 500 mL de medio LB suplementado con ImM IPTG e incubada por 5 h a 37°C. Posterior a la centrifugación a 5000 rpm por 10 min, el paquete celular fue resuspendido en amortiguador A (lOmM K ₂ HP0 ₄ , pH7.4 , 150mM NaCl y lmM EDTA) suministrado con fenil-metil-sulfonil fluoridina (PMSF; Sigma-AldrichCorp. , St.Louis, MO, USA) , lisado por sonicación y ultracentrifugado a 20,000 rpm por 20 min. El sobrenadante fue eliminado y el paquete resuspendido en amortiguador B (8M hidroxicloruro de guanidina, lOOmM NaCl y lOOmM K2HPO4, pH8) . Posterior a tres días de incubación a temperatura ambiente, los lisados fueron ultracentrifugados a 30,000 g. El sobrenadante fue incubado en una columna que contiene agarosa de ácido nitrilo triacetil-nickel (Qiagen) a 4°C por 1 h, lavada con amortiguador C (8.5M urea, 20mM Tris, pH7.5, 160mM NaCl y 20mM imidazol) y eluido con amortiguador D (8M urea, 50mM Na ₂ HP0 ₄ , pH8, lOOmM NaCl y 500mM imidazol) . Las proteínas colectadas fueron replegadas usando diálisis contra un gradiente de 7 a 1M de urea en amortiguador E (25mM Tris, pH7.5 , lOOmM NaCl y 0.5mM EDTA) ; la incubación fue generada a 4°C por 24h. Las proteínas replegadas fueron guardadas en amortiguador E a -70°C para su posterior uso.

Caracterización de las proteínas. Las proteínas fueron cuantificadas siguiendo el protocolo del kit 2D-Quant (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Bjórkgatan, Uppsala, Sweden) , separados por electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes SDS al 14% (SDS-PAGE) , visualizado por tinción de Coomassie e identificado por espectroscopia de masas usando un analizador 4800 MALDI TOF/TOF™ (Applied Biosystems/MDSSCIEX, Waltham, MA, USA) . La proteína CsgA fue tratada con 88% de ácido fórmico (Sigma- Aldrich Corp., St.Louis, MO, USA) antes del SDS-PAGE (Saldaña et al., 2009) . El peso molecular fue estimado usando la imagen del gel y el programa Image Lab versión 5.2 de Bio- Rad (Hercules, California, USA) . El estado de agregación de las proteínas fue determinado por dispersión dinámica de la luz (DLS) usando un equipo Zetasizer Helix (Malvern Instruments Ltd, Grovewood Road, Worcestershire , United Kingdom) . Geles que incluyeron las proteínas fueron transferidas en membradas de polivinildileno difluoridina (PVDF) para confirmar por ensayos de Western blot usando anticuerpos anti-6His (C-Terminal) HRP (Abcam; Cambridge, MA, USA) como se describe previamente (Ledesma et al., 2010). Los niveles de endotoxina (LPS) de las proteínas fueron determinados usando el sistema de Pierce™ LAL Chromogenic Endotoxin Quantitation de acuerdo a los protocolos establecidos por la casa comercial (Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA) . Las proteínas fueron tratadas con 50 g/mL de polimixina B (Sigma-Aldrich Corp., St . Louis, MO, USA) por 12 h a 4°C antes de los ensayos de bioactividad. La visualizaeión de las proteínas de fusión en geles de poliacrilamida y teñidas con azul de Coomassie son mostradas en la Figura 3, apartado (B) . Adicionalmente , la identificación de las proteínas de fusión por Western blot utilizando anticuerpos específicos contra la etiqueta de histidinas se visualizan en la Figura 3, apartado (C) .

Análisis de bioactividad . La expresión de TLR2 y TLR4 en las células de vejiga HTB5 [American Type Culture Collection (ATCC) , Manassas, VA, USA] fueron analizados por citometría de flujo usando los anticuerpos human TLR2 fluorescein-conjugated (R&DSystems, Inc., Minneapolis, USA) y human TLR4/MD2 complex phycoerythrin-conjugated (Santa Cruz Biotechnology Inc., Texas, USA). La activación de TLR por las diferentes proteínas fue determinada por la cuantificación de IL-6 e IL-8 liberadas en los sobrenadantes de las células HTB5. Las células HTB5 fueron cultivadas en placas de 24 pozos (Greiner, Germany) a densidad de 10 ⁵ células/pozo, incubadas con 1 mL de medio Eagle's mínimum essential médium (EMEM; ATCCR30-2003™) suplementado con 10% suero fetal bovino (SFB) de Gibco (Thermo Fisher Scientific; Waltham, MA, USA) . La inducción de citocinas por las células HTB5 fue detectada después de 6 h de incubación con 10jUg/mL de proteínas FimH, CsgA, PapG, FC y FCP usando el método de enzyme-1inked immunosorbent assays (ELISA) siguiendo los protocolos establecidos por BD Biosciences (SanJose, CA, USA). Adicionalmente, 100ng/mL de LPS (Sigma-Aldrich Corp., St. Louis, MO, USA) de E. coli 0111 :B4 y 100ng/mL de LTA (Sigma-Aldrich Corp., St . Louis, MO, USA) de S. aureus fueron usados como control para la inducción de TLR4 y TLR2 , respectivamente. La capacidad de estimular la liberación de IL6 e IL8 en células de vejiga humana por las proteínas de fusión son descritas en las Figuras 4 y 5, respectivamente.

Antigenicidad de las proteínas de fusión. Las muestras de sueros y orinas fueron obtenidos del Laboratorio Clínico Central del Hospital Infantil de México "Federico Gómez" (HIMFG) de 14 pacientes con ITU (UTI-P) y 14 pacientes sanos (H-P) . El criterio de inclusión de UTI-P fueron: síntomas de ITU, cultivo de orina con > 100,000 UFC/mL de E.coli, esterasa leucocitaria y/o nitrito en orina. Las muestras fueron centrifugadas a 7835 g por 5 min y filtradas con membrana de 0.22 m Durapore (Merck Millipore; Darmstadt, Germany) . Los títulos de anticuerpos IgG e IgA contra las proteínas FimH, CsgA, PapG, FC y FCP fueron determinadas por ELISA usando las muestras diluidas 1:50 del suero y 1:10 de la orina. El estudio fue aprobado por los comités de investigación (Dr. Onofre Muñoz Hernández), ética (Dra. Amparo Faure Fontenla) y bioseguridad (Dra. Herlinda Vera Hermosillo) del HIMFG bajo los números de apoyos HIM/2014/022 y HIM/2016/027. La evaluación de la capacidad antigénica de las proteínas de fusión en suero y orina de UTI-P se describe en las Figuras 6 y 7, respectivamente. Generación de anticuerpos policlonales en conejo. Conejos New Zealand de 5 a 6 meses de edad fueron obtenidos del bioterio del Instituto de Fisiología Celular de la UNAM. Los conejos fueron inmunizados vía subcutánea con 20C^g de las proteínas FimH, CsgA, PapG, FC y FCP adicionadas con adyuvante completo de Freund. Posteriormente, los conejos fueron inmunizados tres veces (días 21, 28 y 37) con lOO g de cada proteína en adyuvante incompleto de Freund y sangrados por punción cardiaca en el día 40. La sangre obtenida fue centrifugada a 7835 g por 5 min y el suero fue guardado a -70°C hasta su uso. Los sueros fueron absorbidos usando la cepa mutante CFT073 csgA: : Km/ fimH: : Cm generada por el grupo de trabajo, siguiendo el método de inactivación de genes en un solo paso (Datsenko and Wanner, 2000) . Los sueros con anticuerpos anti-PapG y anti-FCP fueron absorbidos con la misma cepa mutante crecida en condiciones donde no expresa la fimbria, P, la cual fue confirmada por RT-PCR. Los sueros fueron inactivados por calor a 56°C por 30 min y titulados por ELISA usando diluciones seriadas de 1:10 a 1:100,000 contra las proteínas específicas.

Ensayos de inhibición de la adherencia. Las células HTB5 fueron cultivadas en placas de 24 pozos a una de 10 ⁵ células/pozo en 1 mL de EMEM suplementado con 10% FBS hasta alcanzar una confluencia del 80%. Previamente, una alícuota de un cultivo de la cepa CFT073 fue crecida toda la noche en LB a 37°C y una alícuota (1:100 dilución) del cultivo fue incubado hasta obtener una DOeoonm de 1.0. Los cultivos bacterianos fueron tratados con 2.5% mañosa a 37°C por 1 h en agitación. Las monocapas de células fueron infectadas con

10 ⁷ bacterias con una MOI de 100 e incubadas por 3 horas a 37 °C en 5% de C0 ₂ . Un paso previo fue realizado para el ensayo de inhibición de la adherencia usando la cepa de UPEC CFT073 incubadas con anticuerpos policlonales generados en conejo anti FiraH, CsgA, PapG, FC y FCP a una concentración final de 50% a 37°C por 2 h. Las células infectadas fueron lavadas 3 veces con PBS estéril y posteriormente fueron tratadas con 1 mL de PBS con TritonX-100 al 0.1%. Las bacterias adheridas fueron contabilizadas (UFC/mL) usando el método descrito previamente (Hannan and Hunstad, 2016) . Los niveles de inhibición de E. coli CFT073 a células de vejiga por los anticuerpos generados contra las proteínas de fusión se describen en la Figura 8.

ENSAYOS Y RESULTADOS

Las proteínas de fusión activan la liberación de IL-6. Las células de vejiga humana HTB5 fueron tratadas con 10 g/mL de cada una de las proteínas de fusión, y la liberación de IL-6 en los sobrenadantes fue detectada por ELISA. La inducción máxima de IL-6 fue generada con la proteína de fusión FCP, la cual exhibió diferencias significativas (p ≤ 0.002) comparada con las proteínas FC, FimH, CsgA y PapG. La proteína FC también originó un incremento significativo (p ≤ 0.018) en el nivel de IL-6 comparado con las proteínas FimH, CsgA y PapG. Las barras representan el promedio ± desviación estándar (D.E) de tres experimentos independientes. Lipopolisacárido (LPS) y ácido lipoteicoico (LTA) en concentraciones de 100 ng/mL, fueron usados como controles . ^* Los resultados se describen en la Figura 4.

Las proteínas de fusión activan la liberación de IL-8. Las células HTB5 fueron tratadas con 10 g/mL de cada una de las proteínas de fusión, y la liberación de IL-8 en los sobrenadantes fue detectada por ELISA. Un incremento significativo (p ≤ 0.037) en la liberación de IL-8 fue inducido por la proteína FCP comparado con las proteínas FC, FimH, CsgA y PapG. La proteína FC también originó un incremento significativo (p ≤ 0.003) en la liberación de IL- 8 comparada con las proteínas FimH, CsgA y PapG. Las barras representan el promedio + D.E de tres experimentos independientes. LPS y LTA (100 ng/mL) fueron usados como controles. Los resultados son descritos en la Figura 5.

Detección de anticuerpos IgG e IgA en el suero de pacientes con ITU. Un incremento significativo (p ≤ 0.0011) en los anticuerpos IgG en sueros de UTI-P fue detectado comparado con los valores de anticuerpos IgG en suero de H- P. Los anticuerpos IgA en sueros de UTI-P fueron incrementados significativamente (p ≤ 0.0001) comparados con los anticuerpos IgA en sueros de H-P. Interesantemente, los valores de anticuerpos IgA en suero de UTI-P mostraron incrementos cuando se compararon con los anticuerpos IgG en sueros de H-P. Los ensayos de ELISA fueron realizados por triplicado usando tres diferentes muestras y 1 yg/mL de cada proteína. Los puntos representan valores individuales y las barras representan la mediana de los datos. Los resultados se describen en la Figura 6.

Detección de anticuerpos IgG e IgA en orinas de UP. Un incremento significativo (p = 0.0011) en los anticuerpos IgG en orinas de UTI-P fue detectado comparado con los valores de anticuerpos IgG en H-P. Los anticuerpos IgA en orinas de UTI-P fueron incrementados significativamente (p= 0.0003) comparado con los anticuerpos IgA en orinas de H-P. Interesantemente, los valores de anticuerpos IgA en la orina de UTI-P mostraron incrementos cuando se compararon con los anticuerpos IgG en la orina de H-P. Los ensayos de ELISA fueron realizados por triplicado usando tres diferentes muestras y 1 g/mL de cada proteína. Los puntos representan valores individuales y las barras representan la mediana de los datos. Los resultados se describen en la Figura 7.

Los anticuerpos policlonales contra las proteínas de fusión reducen la adherencia bacteriana. La cepa E. coli CFT073 fue incubada con los sueros de conejos inmunizados con las proteínas FimH, CsgA, PapG, FC, FCP (1:1, V/V) y las células de vejiga HTB5 (MOI 100) por 2 h. Los anticuerpos policlonales de conejo favorecieron la reducción en la adherencia bacteriana (UFC/mL, %) comparado con la adherencia basal de la cepa CFT073 y una mezcla de sueros preinmunes. Las barras representan el promedio ± D.E de tres experimentos independientes. **p = 0.0011, ***p = 0.0002 y ****p < 0.0001. Los resultados son descritos en la Figura 8.

CONCLUSIÓN

La invención está basada en el diseño de un gen templado de fusión fcpfc; el cual, permite generar diferentes proteínas de fusión, tales como: proteínas monoméricas, diméricas y triméricas. Los diferentes análisis bioinformáticos permitieron seleccionar a la proteína dimérica FC y la trimérica FCP. Estas proteínas pueden ser potenciales en un futuro para la generación de una vacuna contra las ITU por UPEC. Sin embargo, la posibilidad de generar variantes en las proteínas de fusión diméricas y triméricas permitirá obtener proteínas estables y con un plegamiento correcto para su evaluación como biomoléculas para el diagnostico y/o vacunas. REFERENCIAS

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